JP4855037B2 - 脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤 - Google Patents

Description

本発明は、小麦蛋白質の加水分解物を含有してなる脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤に関する。詳細には、小麦蛋白質の加水分解物を含み、脂肪蓄積抑制作用および脂肪分解促進作用を併せ持ち、肥満予防剤あるいは肥満改善剤として好適な、脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤、ならびに該脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤を含有してなる飲食品に関する。

これまで、種々の物質を有効成分とする痩身剤や脂質代謝改善剤などが開発されている。
たとえば、お茶などに含まれるカテキン類には、体脂肪や食事性脂肪の燃焼促進作用があることが知られており、カテキン類を高濃度で含む茶の抽出物およびその濃縮液を用いたダイエット飲料が提案されている（特許文献１）。また、リジン、プロリン、アラニン、アルギニンなどのアミノ酸にも脂肪分解作用があることが知られており、これらを含有する痩身剤が提案されている（特許文献２）。しかしながら、これらの成分には、苦味やえぐみなどの特有の味、臭いがあり、上記効果を充分に発揮するまでこれらの成分を継続的に摂取するのは困難であった。

また、Ｌ−グルタミンを多く含有するペプチド（以下、グルタミンペプチドともいう。）が高脂血症の血清脂質低下作用を示すことが見出され、このグルタミンペプチドを高脂血症の予防剤および／または治療剤として利用することが提案されている（特許文献３）。また、小麦赤粕の酵素分解物が脂質代謝を改善することが知られ、この酵素分解物を医薬品、健康食品、各種飲食品へ添加することが提案されている（特許文献４）。しかしながら、これらの成分に血中の脂質や肝臓中の脂質濃度を低下させる作用があることは明らかにされているが、脂肪細胞内の脂肪の新たな蓄積を抑制するかどうか、あるいはすでに蓄積している体脂肪を減少させることができるかといった作用は示されていない。したがって、これらの成分が、体脂肪の蓄積抑制および分解促進作用を有するか、さらには肥満の予防または改善に有効であるかについてはまったく不明であった。

したがって、体脂肪の新たな蓄積を抑制するとともにすでに蓄積している体脂肪を減少させ、優れた肥満予防作用あるいは肥満改善作用を奏し、副作用の心配がなく安全性が高い上に、簡便に摂取可能かつ長期間の継続的摂取が容易であって、肥満予防剤あるいは肥満改善剤として好適な、脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤、ならびにこれらの剤を含有する飲食品に対する要望はいまなお非常に高い。

一方、これらとは別に、前駆脂肪細胞が脂肪細胞に分化するのを抑制することによって、痩身効果を得ようとする試みがあり、コーヒー豆エキスやグロビン蛋白分解物などの細胞分化抑制活性を有する素材が知られている。しかしながら、近年、脂肪細胞は、アディポサイトカインなどの分泌器官として、その重要性が見直されてきており、強力な細胞分化抑制作用を有する成分の摂取は好ましくないと考えられる。さらに、脂肪細胞数の減少によって、血液中のトリグリセリド（ＴＧ）を貯蔵する場所が少なくなることは、ＴＧの血中濃度の増加にもつながると考えられる。

したがって、肥満の予防や改善を目的とした剤や飲食品には、脂肪細胞数を保ったままで、脂肪細胞内への新たな脂肪の蓄積を抑制するとともに脂肪細胞内に既に蓄積されていた脂肪量を減少させる作用を奏することが望まれる。
特開２００２−３２６９３２号公報 特開２００３−１１９１３３号公報 ＷＯ０３/０７４０７１公報 特開平８−８１３９０号公報

本発明は、体脂肪の新たな蓄積を抑制するとともにすでに蓄積している体脂肪を減少させる作用を有し、肥満予防剤あるいは肥満改善剤として好適な、脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤を提供することを課題としている。

また、本発明は、上記脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤を含有してなり、優れた肥満予防作用あるいは肥満改善作用を奏し、副作用の心配がなく安全性が高い上に、簡便に摂取可能で長期間の継続的摂取が容易な飲食品を提供することをもその課題としている。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、小麦蛋白質を加水分解して得られるペプチド混合物が、優れた脂肪蓄積抑制作用および脂肪分解促進作用を兼ね備えることを見出して本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の事項に関する。
本発明に係る脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤は、小麦蛋白質の加水分解物を含有してなることを特徴としている。

本発明では、前記小麦蛋白質の加水分解物は、分子量200〜2,000Ｄａのペプチド混合物を５０〜９０質量％の量で含有することが好ましい。
さらに、本発明の脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤は、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化抑制活性を有しない。

本発明の脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤は、肥満予防剤あるいは肥満改善剤として好適に用いられる。
また、本発明に係る飲食品は、前記の脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤を含有してなることを特徴としている。

本発明によれば、体脂肪の新たな蓄積を抑制するとともにすでに蓄積している体脂肪を減少させ、優れた肥満予防作用または肥満改善作用を奏し、副作用の心配がなく安全性が高い上に、風味がよく簡便に摂取可能で長期間の継続的摂取が容易な、脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤、肥満予防剤、肥満改善剤ならびに飲食品を提供できる。

本発明の脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤は、優れた脂肪蓄積抑制作用および脂肪分解促進作用を兼ね備え、体脂肪の新たな蓄積を顕著に抑制するとともに、蓄積脂肪を顕著に減少させることができ、かつ長期間服用しても副作用の心配がなく安全性が高い上に風味が良い。さらに、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を阻害しないため、分泌器官としての脂肪細胞の働きを損なうことがない。

そのため、本発明の脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤、肥満予防剤、肥満改善剤、ならびに飲食品は、日常生活において、長期間継続してしかも簡便に摂取することができ、摂取した場合には、体脂肪が新たに蓄積することを顕著に抑制し、かつすでに蓄積している体脂肪を顕著に分解し得るため、肥満症の予防および／または治療の他、体脂肪の減少や痩身、体脂肪の蓄積防止などにも有用である。

以下、本発明の好適な実施形態について具体的に説明する。
本発明に用いられる小麦蛋白質は、グルテンを主成分とするが、その他にアルブミン、グロブリン、グルテニン、グリアジンなどの小麦中に含まれていることが知られる他の蛋白質を含有していてもよく、さらに澱粉質や繊維質などの不純物を不可避的に含有していてもよい。また、本発明では、小麦蛋白質として、小麦由来のグルテンに予め化学的処理や酵素などによる生物的処理を施して、分子量を低下させたものやプロテアーゼとの親和性などを高めたものも使用できる。

本発明に用いられる小麦蛋白質の加水分解物は、上記小麦蛋白質を加水分解して得ることができ、通常の場合、約10,000Ｄａ以下の分子量分布を有するペプチド混合物を主成分としているが、原料として用いた小麦蛋白質に含まれていた不純物由来の水溶性多糖などの非ペプチド成分を２０質量％以下の量で含有していてもよい。該小麦蛋白質の加水分解物は、好ましくは分子量200〜2,000Ｄａのペプチド混合物を５０〜９０質量％、より好ましくは５５〜８５質量％の量で含有している。

ここで、上記分子量は、サイズ排除高速液体クロマトグラフィーによって測定され、測定条件などの詳細は後述する実施例に記載したとおりである。
小麦蛋白質の加水分解物が、上記範囲内の量で特定の分子量のペプチド混合物を含有していると、水に対する溶解性が高く、固形の形態だけでなく、液体の形態としても好適に利用でき、またアミノ酸特有の味や臭いがなく風味がよいため好ましい。

小麦蛋白質の加水分解方法としては、公知の加水分解方法を適宜採用できる。具体的には、（１）プロテアーゼを用いて加水分解する方法、（２）プロテアーゼとアミラーゼとを併用して加水分解する方法、（３）酸を用いて加水分解する方法などが挙げられる。

（１）プロテアーゼを用いて小麦蛋白質を加水分解する方法としては、たとえば、特許第３０８８４９１号に記載された方法が挙げられる。
具体的には、プロテアーゼを用いて小麦蛋白質を加水分解する場合、１種または複数種のプロテアーゼを作用させて加水分解物を生成させることができるが、酸性プロテアーゼ単独で用いる方法か、または酸性プロテアーゼと中性プロテアーゼを用いる方法が、目的物である小麦蛋白質の加水分解物を高収率で得ることができる点で好ましい。

酸性プロテアーゼと中性プロテアーゼを用いる場合、酸性プロテアーゼおよび中性プロテアーゼを同時に小麦蛋白質の加水分解処理に適用してもよいが、まず酸性プロテアーゼで処理した後、酸性プロテアーゼを失活させ、その後、中性プロテアーゼで処理すると、酸性溶液中で小麦蛋白質の分散性が向上して、加水分解の反応効率が上がるため好ましい。

プロテアーゼを用いて小麦蛋白質を加水分解する場合、使用するプロテアーゼの種類によって適宜調節する必要があるが、通常、水性媒体中における小麦蛋白質の濃度を１.０
〜２０質量％に調整して処理するのがよい。

酸性プロテアーゼとしては、ペプシン；麹菌由来の酸性プロテアーゼ、ペニシリウム起源のアスパルティックプロテアーゼなどの微生物起源の酸性プロテアーゼ；ヒイロタケ起源のアスパルティックプロテアーゼなどを使用することができる。そのうちでも、ペプシンや麹菌由来の酸性プロテアーゼを用いると、目的物である小麦蛋白質の加水分解物を高収率で得ることができ好ましい。

酸性プロテアーゼは、１種類を単独で用いても、または酸性プロテアーゼ同士が互いに悪影響を及ぼさない限りは複数種を併用してもよい。また、酸性プロテアーゼは、遊離の状態で使用しても、固定化して使用してもよく、いずれの場合も乾燥した小麦蛋白質１００ｇ当たり、酸性プロテアーゼを約５，０００〜２５０，０００ｕｎｉｔの割合で用いるのがよい。なお、本明細書中、プロテアーゼ活性（ｕｎｉｔ）は、基質として、米国メルク社製のハマーステインカゼイン１％溶液を用い、アンソン−萩原変法（赤堀四郎編“酵素研究法”第２巻、第２３７ページ、昭和３６年１月１０日、朝倉書店発行）により測定され、反応は３０℃で３０分間行い、１分間に１μｇのチロシン相当量を遊離するのに要する酵素量を１ｕｎｉｔとした。

酸性プロテアーゼを用いて処理する場合、通常、小麦蛋白質の加水分解度が３０〜６０％の状態になるまで行うとよい。
たとえば、酸性プロテアーゼとしてペプシンや麹菌由来の酸性プロテアーゼを用いる場合、小麦蛋白質を含有する水性媒体のｐＨを約１.５〜６.０にして、温度約３０〜７０℃で約２〜２５時間反応させると、加水分解度が３０〜６０％の状態になるので、その時点で酸性プロテアーゼを失活させて加水分解を停止させる。酸性プロテアーゼの失活は、溶液のｐＨを酸性プロテアーゼの活性ｐＨよりも高くするか、温度を高くする（通常、約７０〜９０℃）方法で行うことができる。

なお、本明細書中、小麦蛋白質の加水分解度とは、全蛋白質量に占める、０．７５Ｍトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）に溶解する蛋白質量の割合（ＴＣＡへの溶解率）を意味し、下記式で求められる。加水分解度（％）＝[（０．７５Ｍ ＴＣＡ溶解蛋白質量）／（全蛋白
質量）]×１００
中性プロテアーゼを用いて更に処理する場合には、中性プロテアーゼとして、サーモリシン、トリプシン、キモトリプシン、プロナーゼ、サチライシン、エスペラーゼなどを使用することができる。そのうちでも、サーモリシンやサチライシンを用いると、目的物である小麦蛋白質の加水分解物を高収率で得ることができ好ましい。

中性プロテアーゼは、１種類を単独で用いても、または中性プロテアーゼ同士が互いに悪影響を及ぼさない限りは複数種を併用してもよい。また、中性プロテアーゼは、遊離の状態で使用しても、固定化して使用してもよく、いずれの場合も乾燥した小麦蛋白質１００ｇ当たり、中性プロテアーゼを約１０，０００〜５００，０００ｕｎｉｔの割合で用いるのがよい。中性プロテアーゼによる処理は、小麦蛋白質の加水分解度が６０〜９０％の状態になるまで行うとよい。

たとえば、中性プロテアーゼとしてサーモリシンを用いる場合、小麦蛋白質を含有する水性媒体のｐＨを約７.０〜８.０にして、温度約３０〜７０℃で約１〜２５時間反応させると、加水分解度が６０〜９０％の状態になるので、その時点でサーモリシンを失活させるとよい。中性プロテアーゼの失活は、溶液のｐＨを中性プロテアーゼの活性ｐＨよりも低くするか、温度を高くする（通常、約８０〜１００℃）方法で行うことができる。

（２）プロテアーゼとアミラーゼとを併用して加水分解する方法としては、たとえば、特許第２９８５１９３号に記載された方法が挙げられる。
プロテアーゼとアミラーゼとを併用して小麦蛋白質を加水分解処理した場合には、アミラーゼが小麦蛋白質中に不純物として存在する澱粉質および繊維質を分解するため、目的物である小麦蛋白質の加水分解物を高純度かつ高収率で得ることができる。

プロテアーゼ処理は上記の方法に従って行えばよく、またプロテアーゼ処理とアミラーゼ処理とは、同時に行ってもよく、別々に行ってもよい。別々に行う場合には、プロテアーゼ処理を先に行った後でアミラーゼ処理を行ってもよく、アミラーゼ処理を行った後で
プロテアーゼ処理を行ってもよい。アミラーゼ処理は、プロテアーゼ処理と同時に行うか、あるいは別々に行うか、使用するプロテアーゼの種類やアミラーゼの種類などに応じて、最適のｐＨ、温度などの条件を適宜選択して行うことができる。

プロテアーゼとアミラーゼとを併用して小麦蛋白質を加水分解する場合、使用するプロテアーゼの種類やアミラーゼの種類によって適宜調節する必要があるが、通常、水性媒体中における小麦蛋白質の濃度を１.０〜２０質量％に調整して処理するのがよい。

プロテアーゼとしては、上述したものを使用できる。
アミラーゼとしては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、オリゴ糖生成アミラーゼなどを使用することができる。そのうちでも、α−アミラーゼを用いると、目的物である小麦蛋白質の加水分解物を高収率で得ることができ好ましい。

たとえば、上記のように酸性プロテアーゼおよび中性プロテアーゼを使用して、プロテアーゼ処理を行った後、α−アミラーゼを用いて処理を行う場合には、プロテアーゼ処理を行った後で、ｐＨを約４．５〜７．０に調整してアミラーゼ処理を行うとよい。

アミラーゼは、１種類を単独で用いても、アミラーゼ同士またはプロテアーゼの作用に悪影響を及ぼさない限りは複数種を併用してもよい。また、アミラーゼは、遊離の状態で使用しても、固定化して使用してもよく、いずれの場合も乾燥した小麦蛋白質１００ｇ当たり、アミラーゼを約０.１〜５.０ｇの範囲で用いるのがよい。アミラーゼによる処理は、任意の時点で終了させることができ、たとえば、α−アミラーゼを用いる場合、溶液の温度を約６０〜１００℃にすることで失活できる。

（３）酸を用いて小麦蛋白質を加水分解する方法としては、慣用の方法が採用できる。
たとえば、酸としては、鉱酸である硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、亜硫酸；有機酸であるシュウ酸、クエン酸、酢酸、ギ酸などが使用できる。

このような酸を用いて小麦蛋白質を加水分解する手順としては、通常、小麦蛋白質を含有する水性媒体に、酸規定度０.０１〜２規定の範囲になるように酸を加え、水性媒体の
温度を５０〜１００℃にして１０分〜６時間加水分解させる手順が挙げられる。加水分解を停止させたい場合には、塩基を加えて中和することで停止させることができる。

酸を用いて加水分解する場合、酸の種類や規定度により適宜調節する必要があるが、通常、水性媒体中における小麦蛋白質の濃度は、１.０〜８０質量％にして処理するのがよ
い。

なお、本発明に用いられる小麦蛋白質の加水分解物は好ましくは水溶性成分であり、上記のようにして小麦蛋白質の加水分解処理を行うことにより、水性媒体中に溶解した状態で得ることができるが、さらに加水分解後に遠心分離、ろ過、デカンテーションなどの適当な方法により該水性媒体中の不溶物を除去して精製することが望ましい。

本発明の脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤は、上記処理によって得た小麦蛋白質の加水分解物である水溶性成分が、水性媒体中に溶け込んだ溶液そのものでもよく、さらに適当な媒体によって希釈された溶液でもよいが、これらの溶液を、蒸発、凍結乾燥、熱風乾燥、真空乾燥、スプレードライなどの適当な方法によって処理し、溶媒を除去するか、または適当な担体に結合あるいは担持させた後、上記のような方法により溶媒を除去することで、固形物として得ることもできる。

この脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤は、小麦を原料としているため安全性が高くまた風味もよいことから、そのままでも充分に摂取することが可能であり、長期間の継続的摂取も容易である。

該脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤は、通常の場合、上記小麦蛋白質の加水分解物の乾燥質量として、成人１日当たり０．１〜４０ｇの範囲で投与される。一般的な１日当たりの投与量は、１〜１０ｇであるが、該小麦蛋白質の加水分解物は、小麦を原料としている安全性の高いものであるため、その投与量をさらに増やすこともできる。１日当たりの投与量は、１回で摂取してもよいが、数回に分けて摂取してもよい。

なお、本発明の脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤には、本来の脂肪蓄積抑制作用および脂肪分解促進作用を阻害しない限り、後述する添加剤のほか、他の脂肪蓄積抑制物質、脂肪分解促進物質、脂肪代謝改善物質などを単独または複数組み合わせて配合してもよい。

本発明の脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤の剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、液剤、懸濁剤、吸入剤などの経口製剤；坐剤などの経腸製剤；軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤などの皮膚外用剤；注射剤などが挙げられる。これらのうちでは、経口製剤が好ましい。

このような剤型の脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤は、慣用される賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料などの添加剤を剤型に応じて配合し、常法に従って製造することができる。なお、液剤、懸濁剤などの液体製剤は、服用直前に水または他の適当な媒体に溶解または懸濁する形であってもよく、また錠剤、顆粒剤は周知の方法で表面をコーティングしてもよい。

本発明の脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤が前記添加物や他の脂肪蓄積抑制物質、脂肪分解促進物質、脂肪代謝改善物質などを含む場合には、小麦蛋白質の加水分解物の含有量は、その剤型により異なるが、通常は、０．０００１〜９９質量％、好ましくは０．１〜８０質量％の範囲であり、脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤の投与量として上述した、成人１日当たりの小麦蛋白質の加水分解物（乾燥質量）の投与量を摂取できるよう、１日当たりの投与量が管理できる形にするのが望ましい。

本発明の脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤は、体脂肪の新たな蓄積を抑制するとともにすでに蓄積している体脂肪を減少させる作用を有するため、肥満予防剤あるいは肥満改善剤として好適に使用することができる。該脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤は、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を阻害しないため、これを肥満予防剤あるいは肥満改善剤として用いた場合には、分泌器官としての脂肪細胞の働きを損なうことがなく、健康的に肥満を予防または改善して痩身効果が得られるという利点がある。

さらに、該肥満予防剤あるいは肥満改善剤を、上述した１日当たりの投与量を管理できる形態で摂取することにより、該肥満予防剤あるいは肥満改善剤を用いる、肥満の予防方法または改善方法がそれぞれ提供される。

また、本発明の脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤を含有する飲食品としては、肥満予防作用または肥満改善作用により健康増進を図る健康食品、機能性食品、特定保健用食品等の他、上記脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤を配合できる、全ての飲食品が挙げられる。

具体的には、錠剤、錠菓、チュアブル錠、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、経管経腸栄養剤
などの流動食、ドリンク剤などの健康食品または栄養補助食品；緑茶、ウーロン茶や紅茶などの茶飲料、清涼飲料、ゼリー飲料、スポーツ飲料、乳飲料、炭酸飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料、発酵乳飲料、粉末飲料、ココア飲料、精製水などの飲料；バター、ジャム、ふりかけ、マーガリンなどのスプレッド類；マヨネーズ、ショートニング、カスタードクリーム、ドレッシング類、パン類、米飯類、麺類、パスタ、味噌汁、豆腐、牛乳、ヨーグルト、スープまたはソース類、菓子（たとえばビスケットやクッキー類、チョコレート、キャンディ、ケーキ、アイスクリーム、チューインガム、タブレット）などが挙げられる。

本発明の飲食品は、上記脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤のほかに、その飲食品の製造に用いられる他の飲食品素材、各種栄養素、各種ビタミン、ミネラル、食物繊維、種々の添加剤（たとえば呈味成分、甘味料、有機酸などの酸味料、安定剤、フレーバー）などを配合して、常法に従って製造することができる。

この飲食品において、小麦蛋白質の加水分解物の含有量は、飲食品の形態により異なるが、通常は０．０００１〜９０質量％、好ましくは０．１〜７０質量％の範囲であり、脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤の投与量として上述した、成人１日当たりの小麦蛋白質の加水分解物（乾燥質量）の投与量を摂取できるよう、１日当たりの投与量が管理できる形にするのが望ましい。

該飲食品を、上述した１日当たりの投与量を管理できる形態で摂取することにより、該飲食品を用いる、肥満の予防方法または改善方法が提供される。
下記の実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

なお、以下の例中、小麦蛋白質の加水分解物中のペプチド混合物の含有量および該ペプチド混合物の分子量は次の方法で測定した。
［小麦蛋白質の加水分解物中のペプチド混合物の含有量］
小麦蛋白質の加水分解物５０ｍｇを蒸留水１ｍＬに溶解してサンプル溶液を得て、該サンプル溶液と等量の１．５ｍｏｌ/Ｌのトリクロロ酢酸を、サンプル溶液に加えて充分に
撹拌した。次いで、これを１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を採取して、蒸留水で５０倍に希釈し、試料として測定に供した。

ペプチド混合物の含有量は、DC−Protein assay kit（BIO-RAD社製）を使用して該kit
に備え付けの試薬を添加して７５０ｎｍでの吸光度を測定し、アルブミンを用いた検量線より算出した。

［小麦蛋白質の加水分解物に含まれるペプチド混合物の分子量測定］
小麦蛋白質の加水分解物１０ｍｇを蒸留水１ｍＬに溶解し、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（使用カラム；Asahipak GS-320HQ (Shodex)）に供し、次に０．１％トリフルオロ酢酸溶液／４０％アセトニトリル水溶液を使用して１．０ｍＬ／分の流速で溶離させた。溶離してきた液の２２０ｎｍにおける紫外吸収を測定して、測定された吸光度を、分子量既知のＧｌｙ−Ｇｌｙ（分子量132.12Ｄａ）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（分子量189.17Ｄａ）、Glutathione（分子量612Ｄａ）およびBacitracin（分子量1422Ｄａ）から作成した検量線に当てはめて小麦蛋白質の加水分解物に含まれるペプチド混合物の分子量を決定した。

［製造例］
（１）反応釜に小麦グルテン（活性グルテン、Weston Foods Limited製）３００ｇ、水１９２０ｍＬ、クエン酸７．０ｇを仕込み、さらにクエン酸を用いてｐＨを４．０に調整
し、酸性プロテアーゼ（プロテアーゼＭアマノ、アマノエンザイム）０．４５ｇ（２０，０００ｕｎｉｔ）を加えて、この分散液を４５℃に加温し、５時間反応させた。

（２）ついで、水酸化ナトリウムを用いて分散液をｐＨ７．５に調整し、分散液の温度を８５℃にして１０分間保って酸性プロテアーゼを失活させた。
（３）次に、分散液の温度を６５℃に調整し、中性プロテアーゼ（サーモアーゼ、大和化成）０．４５ｇ（３２０，０００ｕｎｉｔ）を加えて５時間反応させた後、分散液の温度を９０℃にして２０分間保って中性プロテアーゼを失活させた。

（４）その後、分散液を遠心分離（８，０００Ｇ、３０分間）して不溶物を除去し、上清を回収して水溶性成分を得た。
（５）得られた水溶性成分を凍結乾燥し、固形の、小麦蛋白質の加水分解物約１６６ｇを得た。

（６）上記（５）で得られた固形の、小麦蛋白質の加水分解物中のペプチド混合物の含有量を測定したところ、約８０質量％であった。また、該小麦蛋白質の加水分解物に含まれるペプチド混合物の分子量を測定したところ、その分子量は約10,000Ｄａ以下に分布しており、該ペプチド混合物の７６質量％は分子量200〜2,000Ｄａの範囲にあった。したがって、（５）で得られた固形の、小麦蛋白質の加水分解物中には、分子量200〜2,000Ｄａのペプチド混合物が約６１質量％（＝80×0.76）含まれていた。

［実施例１］
錠剤の製造
製造例で得られた小麦蛋白質の加水分解物８４ｇ、結晶セルロース（旭化成）１０ｇおよびポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ）５ｇを混合し、これにエタノール３０ｍＬを添加して、湿式法により常法にしたがって顆粒を製造した。この顆粒を乾燥した後、ステアリン酸マグネシウム１．２ｇを加えて打錠用顆粒末とし、打錠機を用いて打錠し、１錠が１ｇの錠剤１００個を製造した。

［実施例２］
顆粒剤の製造
製造例と同様にして得られた小麦蛋白質の加水分解物１００ｇ、乳糖（ＤＭＶ）１００ｇおよび結晶セルロース（旭化成）４０ｇを混合し、これにエタノール１３０ｍＬを練合機に添加し、通常の方法により５分間練合した。練合終了後、１０メッシュで篩過し、乾燥機中にて５０℃で乾燥した。乾燥後、整粒し、顆粒剤２４０ｇを得た。

［実施例３］
シロップ剤の製造
精製水４００ｇを煮沸し、これをかき混ぜながら、白糖７５０ｇおよび製造例と同様にして得られた小麦蛋白質の加水分解物１００ｇを加えて溶解し、熱時に布ごしし、これに精製水を加えて全量を１０００ｍＬとしてシロップ剤を製造した。

［実施例４］
流動食の製造
約６５℃の純水７００ｇにカゼインナトリウム（ＤＭＶ）４０ｇ、マルトデキストリン（三和デンプン）１６０ｇおよび製造例で得られた小麦蛋白質の加水分解物５０ｇを添加して溶解させ、ついでビタミンミックスおよび微量ミネラルの各成分混合液を添加した。得られた混合液をホモミキサーに投入し、約８，０００ｒｐｍにて１５分間粗乳化した。得られた乳化液を約２０℃に冷却し、香料を添加後、最終メスアップを行った。この液をパウチへ本液２３０ｇ充填後、窒素置換を行いながらパウチを密封し、１２１℃で１５分
間殺菌を行って流動食を得た。

［実施例５］
パンの製造
小麦粉（強力粉）１６０ｇとドライイースト２ｇを混ぜた。これとは別に、製造例で得られた小麦蛋白質の加水分解物２０ｇ、砂糖２５ｇ、食塩３ｇ、脱脂粉乳６ｇを温湯７０ｇに溶かし、鶏卵１個を添加してよく混ぜた。これを上記の小麦粉とドライイーストの混合物に加え、よく手でこねた後、バター約４０ｇを加えてよくこね、２０個のロールパン生地を作った。次いで、これらのパン生地を発酵させた後、表面に溶き卵を塗り、オーブンにて１８０℃で約１５分焼き、ロールパンを作成した。外観、味、食感ともに良好であった。

［実施例６］
レトルトご飯の製造
お米２合を用いて一般的な水量に対し、製造例で得られた小麦蛋白質の加水分解物２ｇを加えて炊飯し、これを慣用の方法に従ってレトルト用パックに充填した後、窒素置換を行いながら密封し、１２１℃で１５分間殺菌を行ってレトルトご飯を得た。得られたレトルトご飯の米飯は、外観、味、食感ともに良好であった。

［実施例７］
パスタ用ソースの製造
パスタ用のミートソース一人前（１５０ｇ）を鍋に入れ、これに製造例で得られた小麦蛋白質の加水分解物５ｇを加えて加温した。このソースをパウチへ充填した後、窒素置換を行いながらパウチを密封し、１２１℃で１５分間殺菌を行って、パスタ用ミートソースを得た。

［試験例１］
細胞分化抑制活性確認試験
（１）脂肪細胞への分化・培養
３Ｔ３−Ｌ１細胞（マウス、繊維芽様細胞）を、２４ウェルプレートに播種し、分化誘導培地（０．５ｍＭ １−メチル−３−イソブチルキサンチン、０．２５μＭ デキサメタゾン、１０μｇ/ｍＬ インスリンを含む１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ培地）で２日間培
養し、脂肪細胞に分化誘導した。その後、成熟促進培地（５μｇ/ｍＬ インスリンを含
む１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ培地）に変えて７日間培養した。

この際、上記分化誘導培地および成熟促進培地に、製造例で得られた小麦蛋白質の加水分解物を１ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、培養終了後、細胞分化マーカーであるＧＰＤＨ（グリセロール−３−リン酸脱水素酵素）活性の測定を、ＧＰＤＨ測定キット（株式会社ホクドー製）を用いて行った。対照群として、小麦蛋白質の加水分解物を添加しない培地で培養したものを使用した。

（２）ＧＰＤＨ活性の測定
培養終了後、ウェルをＰＢＳ（−）で２回洗浄し、その後、酵素抽出液を０．５ｍＬ加え、ピペッティングにより、細胞をウェル底から剥がした。

ついで、剥がした細胞をサンプリングチューブに酵素抽出液ごと入れ、このサンプリングチューブを液体窒素に約１０分間浸し、内容物を凍結させた。その後、このサンプリングチューブを３７℃に設定したウォーターバスに浸し、内容物を融解させた。この凍結融解を計３回繰り返して行い、細胞を破砕させ、得られた破砕液を１２，８００Ｇ、４℃で、５分間、遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を検体として用いた。

反応基質溶液２００μＬを９６ウェルプレートに入れ、２５℃で約５分間加温した。ついで、この９６ウェルプレートに上記検体２００μＬを入れ、よく撹拌した後、３４０ｎｍでの吸光度の減少を経時的に（１分置きに１０分間）測定し、１分間当たりの吸光度の変化量を求めた。

求めた吸光度の変化量を、下記式に当てはめＧＰＤＨ活性を決定した。

その結果を、対照群を１００％としたときの相対値で表１に示す。

表１から明らかなように、小麦蛋白質の加水分解物を添加した培地で培養した３Ｔ３−Ｌ１細胞は、対照群に比べて１ｍｇ/ｍＬで１１５％のＧＰＤＨ活性を示した。したがっ
て該小麦蛋白質の加水分解物が前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化抑制活性を有しないことが明らかとなった。

［試験例２］
脂肪蓄積抑制作用確認試験
（１）脂肪細胞への分化・培養
３Ｔ３−Ｌ１細胞を、２４ウェルプレートに播種し、分化誘導培地（０．５ｍＭ １−メチル−３−イソブチルキサンチン、０．２５μＭ デキサメタゾン、１０μｇ/ｍＬ
インスリンを含む１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ培地）で２日間培養し、脂肪細胞に分化誘導した。その後、成熟促進培地（５μｇ/ｍＬ インスリンを含む１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥ
Ｍ培地）に変えて７日間培養した。

この際、上記分化誘導培地および成熟促進培地に、製造例で得られた小麦蛋白質の加水分解物を０.０１、０.１、１ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、培養終了後、細胞中に蓄積されている脂肪量の測定を行った。対照群として、小麦蛋白質の加水分解物を添加しない培地で培養したものを使用した。

（２）脂肪量測定用試薬の調製
脂肪細胞の蓄積脂肪量は、オイルレッドＯ染色液で細胞内の脂肪滴を染色し、その染色液を吸光度測定することにより測定した。

オイルレッドＯ染色液原液は、オイルレッドＯ染色液粉末０．５ｇを２−プロパノール
１００ｍＬに溶解し、３，０００ｒｐｍで５分程度遠心し、上清を０．５〜１．０μｍのシリンジフィルターでろ過し、調製した。オイルレッドＯ染色液は、測定時にこの原液６ｍＬに水４ｍＬを加え、１時間静置後、０．５〜１．０μｍのシリンジフィルターでろ過して使用した。

（３）脂肪量の測定
上記（１）で記載した通り、分化誘導培地および成熟促進培地で計９日間、細胞培養した後、培養液を除去し、１０％ホルマリン溶液５００μＬを添加して、４℃１時間で細胞をウェル上に固定した。ホルマリン除去後、蒸留水で洗浄し、オイルレッドＯ染色液３００μＬをウェルに添加し、室温で１５分間静置して細胞内の脂肪を染色した。染色液除去後、蒸留水で細胞を洗浄した。５００μＬの２−プロパノールをウェルに添加して細胞から色素を抽出し、抽出液の５４０ｎｍでの吸光度をプレートリーダーで測定した。

その結果を、対照群を１００％としたときの相対値で表２に示す。

表２から明らかなように、小麦蛋白質の加水分解物を添加した培地で培養した脂肪細胞は、対照群に比べて０.０１ｍｇ/ｍＬで９４％、０.１ｍｇ/ｍＬで８７％、１ｍｇ/ｍＬ
で８３％しか脂肪蓄積をせず、小麦蛋白質の加水分解物が脂肪蓄積抑制作用を示すことが明らかとなった。

［試験例３］
脂肪分解促進作用確認試験
３Ｔ３−Ｌ１細胞を、２４ウェルプレートに播種し、分化誘導培地（０．５ｍＭ １−メチル−３−イソブチルキサンチン、０．２５μＭ デキサメタゾン、１０μｇ/ｍＬ
インスリンを含む１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ培地）で２日間培養し、脂肪細胞に分化誘導した。その後、成熟促進培地（５μｇ/ｍＬ インスリンを含む１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥ
Ｍ培地）に変えて７日間培養した。

次いで、培地を除き、ＰＢＳで洗浄した。製造例で得られた小麦蛋白質の加水分解物１ｍｇ／ｍＬを含む１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ培地５００μＬをウェルに添加し、６時間培養した。対照群は小麦蛋白質の加水分解物を含まない培地で培養した。

ついで、培地を回収し、グリセロール測定キット（Ｆ−キットグリセロール、J.K.インターナショナル製）を用いて脂肪細胞から分解された培地中の遊離グリセロール量を測定した。

その結果を、対照群を１００％としたときの相対値で表３に示す。

表３から明らかなように、小麦蛋白質の加水分解物を含有した培地で培養した脂肪細胞は、対照群に比べて１ｍｇ/ｍＬで１１３％の遊離グリセロールを産生させた。したがっ
て該小麦蛋白質の加水分解物が脂肪分解促進活性を示すことが明らかとなった。

以上のことから、小麦蛋白質の加水分解物を含有してなる脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤、肥満予防剤、肥満改善剤、ならびに飲食品は、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を阻害することなく、脂肪細胞内の脂肪の蓄積を抑制し、かつ、脂肪細胞内に存在する脂肪の分解を促進する作用を奏することが明らかとなった。

Claims (5)

1. 酸性プロテアーゼと中性プロテアーゼとを用いて小麦蛋白質を加水分解することによって得られた、該小麦蛋白質の加水分解物を含有し、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化抑制活性を有しないことを特徴とする脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤。
2. 前記小麦蛋白質の加水分解物が、分子量200〜2,000Ｄａのペプチド混合物を５０〜９０質量％の量で含有することを特徴とする請求項１に記載の脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤。
3. 肥満予防剤であることを特徴とする請求項１または２に記載の脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤。
4. 肥満改善剤であることを特徴とする請求項１または２に記載の脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤。
5. 酸性プロテアーゼと中性プロテアーゼとを用いて小麦蛋白質を加水分解することを特徴とする、請求項１に記載の脂肪蓄積抑制および脂肪分解促進剤の製造方法。