JP3130080B2

JP3130080B2 - ペプチドおよびその製造方法

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Publication number: JP3130080B2
Application number: JP03171879A
Authority: JP
Inventors: 真一福留; 正明吉川
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 1990-12-27
Filing date: 1991-06-18
Publication date: 2001-01-31
Anticipated expiration: 2016-01-31
Also published as: GB2251435B; DE4142157B4; GB2251435A; FR2671086B1; GB9126329D0; US5268360A; FR2671086A1; DE4142157A1; US5338668A; JPH0586094A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は，オピオイド活性を有す
るペプチドおよびその塩，並びにその製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】食品中には高次の生命活動に関与する多
数の生体調節因子が存在することが広く知られるように
なっており，それらの生体調節因子を健康の増進，病気
の予防や治療，老化の予防等に積極的に利用することが
近年色々試みられるようになっている。そのような生体
調節因子としては神経系，消化吸収系，循環系，生体防
御・免疫系，内分泌系，細胞分化・増殖系等に作用する
種々の因子が知られている。それらのうちで，ある種の
食品蛋白質中には神経系に作用してモルヒネ様の麻酔，
鎮痛作用等（いわゆるオピオイド活性）を有するペプチ
ドが存在していることが明らかになっており，そのよう
なペプチドはオピオイドペプチドと一般に称されてい
る。

【０００３】食品から得られる外来性オピオイドペプチ
ドの最初の例は１９７９年にＢｒａｎｔｌらにより発見
された牛乳β−カゼイン由来の配列番号７で表されるペ
プチドであり，これはβ−ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（１
−７）と命名された。カゼイン由来のオピオイドペプチ
ドはその後も多数発見されており，例えば，配列番号８
で表されるβ−ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（１−５）
（Ｈｅｎｓｃｈｅｎ：１９７９）、β−ｃａｓｏｍｏｒ
ｐｈｉｎ（１−３）（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ：Ｌｏｔ
ｔｓｐｅｉｃｈら：１９８０），配列番号９で表される
α−ｃａｓｅｉｎｅｘｏｒｐｈｉｎ（Ｌｏｕｋａｓら：
１９８３）がある。一方，上記したβ−ｃａｓｏｍｏｒ
ｐｈｉｎ（１−７）の発見と同じ年（１９７９）にＺｉ
ｏｕｄｒｏｕらは小麦グルテンのペプシン分解物からグ
ルテンエクソルフィンと呼ばれるオピオイドペプチドを
単離したがその構造は未決定であった［Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２５４，２４４６（１９７９）］。また，
１９８７年にＧｒａｆらはカゼイン中に含まれるβ−カ
ゾモルフィンと呼ばれるオピオイドペプチドと構造が極
めて類似している配列番号１０で表されるペプチド（グ
リアドルフィン）を小麦蛋白の一種であるα−グリアジ
ン中に見出して化学合成したが，このペプチドはオピオ
イド活性を示さなかった［Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ，９，１１３（１９８７）］。

【０００４】オピオイドペプチドが消化管や消化管ホル
モン分泌に対して影響を有することが知られており，そ
して小麦グルテンの分解物を経口投与した場合に食物の
腸内滞留時間の延長，血中のインシュリンやソマトスタ
チン量の上昇等のオピオイド活性による影響が観察され
るという報告もあることから，小麦グルテンの加水分解
物からオピオイドペプチドを得ようとする試みはこれま
で色々なされてきたが，現在までに小麦グルテンに由来
するオピオイドペプチドを単離し，その構造を決定した
という報告は知られていない。

【０００５】

【発明の内容】上記のような状況下に本発明者らは小麦
蛋白の分解物からオピオイド活性を有するペプチドを得
るべく研究を進めてきた。その結果，小麦蛋白を酸性プ
ロテアーゼを使用して加水分解した後，中性プロテアー
ゼまたはアルカリ性プロテアーゼを使用して更に加水分
解して得られたペプチド混合物を高速液体クロマトグラ
フィーを用いた逆相クロマトグラフイーで分画すると，
そのうちの特定の画分がオピオイド活性を有するペプチ
ドからなることを見出した。

【０００６】特に，小麦蛋白を酸性プロテアーゼで加水
分解した後，更に中性プロテアーゼまたはアルカリ性プ
ロテアーゼ（特にサーモライシン等のバチルス起源の中
性プロテアーゼ，アスペルギルス起源の中性プロテアー
ゼまたはバチルス起源のアルカリ性プロテアーゼ）を使
用して更に加水分解を行ってペプチド混合物を形成さ
せ，そこから得られたオピオイド活性を有する画分を単
離，精製して，その構造を決定したところ，グリシン−
チロシン−チロシン−プロリンが配列した配列番号１で
表される新規なペプチド，グリシン−チロシン−チロシ
ン−プロリン−スレオニンが配列した配列番号２で表さ
れる新規なペプチド，チロシン−グリシン−グリシン−
トリプトファン−ロイシンが配列した配列番号４で表さ
れるペプチド，およびチロシン−グリシン−グリシン−
トリプトファンが配列した配列番号５で表されるペプチ
ドであることを見出した。

【０００７】更に，小麦蛋白を酸性プロテアーゼで加水
分解した後，中性プロテアーゼとしてトリプシンとキモ
トリプシンの両者を使用して加水分解処理を行ってペプ
チド混合物を形成し，そこから得られたオピオイド活性
を有する画分を単離，精製して，その構造を決定したと
ころ，チロシン−プロリン−イソロイシン−セリン−ロ
イシンが配列した配列番号６で表されるペプチドである
ことを見出した。

【０００８】また，配列番号３で表されるペプチドの
アミノ酸配列自体も，小麦グルテニンのアミノ酸配列中
に複数個存在することが報告されているところから［Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１３
（１９８５），８７２９−８７３７］，配列番号２のペ
プチドのＣ末端を延長して配列番号３で表されるペプチ
ドを化学的に合成したところ，この配列番号３で表され
るペプチドも配列番号１，配列番号２，配列番号４，配
列番号５および配列番号６で表されるペプチドと同様に
オピオイド活性を示すことを見出した。

【０００９】すなわち，本発明は，小麦蛋白を酸性プ
ロテアーゼを使用して加水分解した後，バチルス起源の
中性プロテアーゼおよびアスペルギルス起源の中性プロ
テアーゼから選ばれる１種または複数種の中性プロテア
ーゼ或いはアルカリ性プロテアーゼを使用して更に加水
分解し，得られる加水分解物から，オピオイド活性を有
する配列番号１，配列番号２，配列番号４または配列番
号５で表されるペプチドを回収することを特徴とする配
列番号１，配列番号２，配列番号４または配列番号５で
表されるオピオイドペプチドの製造方法である。

【００１０】そして，本発明は，小麦蛋白を酸性プロ
テアーゼを使用して加水分解した後，トリプシンおよび
キモトリプシンを用いて更に加水分解し，得られる加水
分解物からオピオイド活性を有する配列番号６で表され
るペプチドを回収することを特徴とする配列番号６で表
されるオピオイドペプチドの製造方法である。

【００１１】本発明の上記したオピオイドペプチドの
製造方法で使用する小麦蛋白は，グルテンのみからなっ
ていても，またはグルテンから主としてなっていてアル
ブミン，グロブリン等の小麦中に含有されることが知ら
れている他の蛋白質を含有しているものであってもよ
い。

【００１２】さらに，本発明は，配列番号１，配列番
号２，配列番号３または配列番号６で表されるペプチド
或いはその塩である。

【００１３】そして，本発明は，化学合成によって，
配列番号１，配列番号２，配列番号３または配列番号６
で表されるペプチド或いはその塩を製造する方法を包含
する。

【００１４】そして，上記６種類のペプチドのうち，配
列番号１，配列番号２，配列番号４および配列番号５で
表されるペプチドは，上記したようにグルテンを酸性プ
ロテアーゼで加水分解した後，更に上記したような微生
物起源の中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアー
ゼを使用して加水分解して得られたペプチド混合物中に
発見され回収したものである。また，配列番号６で表さ
れるペプチドはグルテンを酸性プロテアーゼで加水分解
した後，生体内に存在する中性プロテアーゼであるトリ
プシンとキモトリプシンで加水分解処理して得られるペ
プチド混合物中に発見され回収したものである。更に，
配列番号３で表されるペプチドはその存在を小麦グルテ
ニンの一次構造より見いだして化学的に合成したもので
ある。したがって，その場合には，それら６種類のペプ
チドを構成する８種類のアミノ酸Ｇｌｙ，Ｔｙｒ，Ｐｒ
ｏ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｒｐ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅは，天然
のグルテンに由来するために，いずれもＬ−アミノ酸で
ある。しかしながら本発明のペプチドは，それらのＬ−
アミノ酸からなるものに限定されず，配列番号１〜配列
番号６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであれ
ばどのような光学異性体であってもよい。例えば，アミ
ノ酸の全部がＤ−アミノ酸からなっていても，４〜８個
のアミノ酸のうちのいずれかがＬ−アミノ酸であって残
りがＤ−アミノ酸からなるペプチドも包含され，そのよ
うなペプチドは化学合成により製造することができる。

【００１５】また，本発明における「オピオイド活性を
有する剤」とは，鎮痛，麻酔，情動，呼吸，脈動，体
温，消化管機能，摂食，免疫，インシュリンやソマトス
タチン等のホルモンの分泌調節，電解質の吸収促進，心
筋の収縮調節等に関与するいわゆるオピオイド活性とし
て認識されている活性を有する剤をいう。

【００１６】下記の方法に限定されないが，本発明のペ
プチドの調製法の例を挙げると以下のとおりである。小麦グルテンの加水分解による方法小麦グルテンをプロテアーゼを使用して加水分解して水
溶性のペプチド混合物を調製する。この場合に，まず小
麦グルテンを希塩酸等の酸性溶液中に分散溶解させた状
態で酸性プロテアーゼで加水分解し，次いで中和または
アルカリ性にした後に中性プロテアーゼまたはアルカリ
性プロテアーゼで更に加水分解してペプチド混合物を調
製するのがよい。

【００１７】酸性プロテアーゼの例としては，ペプシ
ン，ヒイロタケ起源のアスパルティックプロティナー
ゼ，アスペルギルス起源のアスパルティックプロティナ
ーゼ，ペニシリウム起源のアスパルティックプロティナ
ーゼを挙げることができる。酸性プロテアーゼは，１種
類のみを使用しても，またはプロテアーゼ同士がお互い
に悪影響を及ぼさないかぎりは複数種を併用することも
できる。複数の酸性プロテアーゼを使用する場合は，複
数の酸性プロテアーゼを同時に存在下させて加水分解を
行っても，または１種類ずつ逐次に用いて加水分解を行
ってもよい。

【００１８】中性プロテアーゼとしては，バチルス起
源の耐熱性プロテアーゼ（例えばサーモライシン）およ
び／またはアスペルギルス起源の中性プロテアーゼを使
用するか，或いはトリプシンとキモトリプシンを併用す
る。また，アルカリ性プロテアーゼとしては，バチルス
起源のセリンプロテアーゼ等を挙げることができる。中
性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼは，１種
類のみを使用しても，またはプロテアーゼ同士がお互い
に悪影響を及ぼさないかぎりは複数種を併用することも
できる。複数の中性プロテアーゼを使用する場合は，複
数の中性プロテアーゼを同時に存在下させて加水分解を
行っても，または１種類ずつ逐次に用いて加水分解を行
ってもよい。

【００１９】上記したように，小麦蛋白を酸性プロテ
アーゼ加水分解した後，上記した微生物起源の中性プロ
テアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼを使用して更に
加水分解すると，配列番号１，配列番号２，配列番号４
または配列番号５で表されるペプチドを含有するペプチ
ド混合物を得ることができる。また，小麦蛋白を酸性プ
ロテアーゼ加水分解した後，中性プロテアーゼとしてト
リプシンおよびキモトリプシンからなる生体内プロテア
ーゼを使用して加水分解すると，配列番号６で表される
ペプチドを含有するペプチド混合物を得ることができ
る。この場合，トリプシンとキモトリプシンは同時に作
用させても，または逐次に作用させてもよい。

【００２０】配列番号１，配列番号２，配列番号４，
配列番号５または配列番号６で表されるペプチドを製造
するに当たって，酸性プロテアーゼとして，ペプシンを
使用すると，目的物を高収率で得ることができ好まし
い。また，配列番号１，２，４および５で表されるペプ
チドを製造するに当たって，中性プロテアーゼとしてバ
チルス起源のサーモライシンまたはアスペルギルス（特
にアスペルギルスオリゼー）起源の中性プロテアーゼを
使用すると，目的物を高収率で得ることができる。

【００２１】そして，酸性プロテアーゼ，中性プロテア
ーゼおよびアルカリ性プロテアーゼは，いずれもフリー
の状態で使用しても，または固定化して使用してもよ
い。プロテアーゼの使用量は，いずれの場合も乾燥した
グルテン１００ｇ当たり，プロテアーゼ約５，０００〜
１００，０００ｕｎｉｔｓの割合で用いるとよい。

【００２２】ここで本明細書中のプロテアーゼ活性（ｕ
ｎｉｔ）はすべて下記の方法により測定した。《プロテアーゼ活性（ｕｎｉｔ）の測定》基質として米国メルク社製のハマーステインカゼイン１
％溶液を用い，アンソン−萩原変法［赤堀四郎編 “酵
素研究法” 第２巻，第２３７頁（昭和３６年１月１０
日；朝倉書店発行）］により測定した。反応は３０℃で
３０分間行い１分間に１μｇのチロシン相当量を遊離す
るのに要する酵素量を１ｕｎｉｔとした。

【００２３】プロテアーゼ処理は，各々の状況（例えば
プロテアーゼの種類，プロテアーゼの使用形態等）に応
じて最適のｐＨ，温度，プロテアーゼ量，処理速度，処
理時間等の条件を選択して行うのがよい。例えば酸性プ
ロテアーゼとしてペプシンを使用して加水分解してから
サーモライシンで加水分解する場合，または酸性プロテ
アーゼとしてペプシンを使用して加水分解してからトリ
プシンとキモトリプシンで加水分解する場合は，グルテ
ンの水溶液または水性分散液のｐＨを約１．５〜５．０
として，温度約３０〜５０℃でペプシンにより加水分解
し，次いで液のｐＨを約６．０〜８．０とした後，サー
モライシン，またはトリプシンとキモトリプシンを温度
約３０〜５０℃で作用させて０．７５Ｍトリクロロ酢酸
への溶解率が約４０〜８０％になるまで加水分解を行う
とよい。

【００２４】目的とする加水分解状態が達成された時点
で加熱によりおよび／またはｐＨを調整して，プロテア
ーゼを失活させ，失活した酵素，未分解グルテン等の不
溶性固形物を遠心分離等の適当な手段で分離除去し，残
留液中に含まれているペプチド混合物を乾燥等により回
収する。次いで，このペプチド混合物を水等に溶解させ
た状態で高速液体クロマトグラフィー（例えば逆相カラ
ムを使用した高速液体クロマトグラフィー）等により処
理して上記ペプチドを純粋な形態で単離する。

【００２５】上記したペプチド混合物を含有する水溶液
からの配列番号１，配列番号２，配列番号４および配列
番号５で表されるペプチドの単離は，例えば，次の（ａ
_１）〜ｈ_１）の工程からなる方法で行うことができる。

【００２６】［配列番号１，配列番号２，配列番号４お
よび配列番号５で表されるペプチドの単離］（ａ_１）小麦グルテンをペプシンおよびサーモライシ
ンによって上記のようにして逐次に加水分解して得られ
たペプチド混合物を，高速液体クロマトグラフィー（使
用カラムは例えばナカライテスク社製のＯＤＳカラムで
あるＣｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ_１８−ＡＲに供して，０．
０５％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）と０．０５％ト
リフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）
で，Ｂ液の濃度が０％から４０％まで直線的に増加する
濃度勾配にて溶出し，アセトニトリル濃度が約２２．５
〜２３．５％の範囲のピーク画分（画分Ｉ），約２４〜
２５％の範囲のピーク（画分ＩＩ），約２８〜２９％の
範囲のピーク画分（画分ＩＩＩ）および約３４〜３５％
の範囲のピーク画分（画分ＩＶ）を各々分取し，これら
の画分のオピオイド活性を確認する；

【００２７】（ｂ_１）工程（ａ_１）で得たオピオイド活
性画分を上記工程（ａ_１）で使用したカラムと特性の異
なるカラムを使用した逆相クロマトグラフィー（使用カ
ラムは例えばナカライテスク社製のＣｏｓｍｏｓｉｌ
５Ｐｈ）に供して，工程（ａ_１）と同様にして溶出し
て，画分Ｉについてはアセトニトリル濃度約２４〜２５
％の範囲のピーク画分（画分Ｉ−１），画分ＩＩについ
てはアセトニトリル濃度約３３〜３４％の範囲のピーク
画分（画分ＩＩ−１），画分ＩＩＩについてはアセトニ
トリル濃度約３０〜３１％の範囲のピーク画分（画分Ｉ
ＩＩ−１）および画分ＩＶについてはアセトニトリル濃
度約３６〜３７％の範囲のピーク画分（画分ＩＶ−１）
を分取し，これらの画分のオピオイド活性を確認する；

【００２８】（ｃ_１）工程（ｂ_１）得たオピオイド活性
画分を工程（ａ_１）および（ｂ_１）で使用したカラムと
は特性の異なるカラムを使用した逆相クロマトグラフィ
ー（使用カラムは例えばナカライテスク社製のＣｏｓｍ
ｏｓｉｌ５ＣＮ−Ｒ）に供して，工程（ａ_１）および
（ｂ_１）と同様にして溶出し，画分Ｉ−１についてはア
セトニトリル濃度が約１８〜１９％付近の高吸収ピーク
画分（画分Ｉ−２），画分ＩＩ−１についてはアセトニ
トリル濃度が約２７％付近の高吸収ピーク画分（画分Ｉ
Ｉ−２），画分ＩＩＩ−１についてはアセトニトリル濃
度が約２６〜２７％の範囲のピーク画分（画分ＩＩＩ−
２），そして画分ＩＶ−１についてはアセトニトリル濃
度が約３２〜３３％の範囲のピーク画分（画分ＩＶ−
２）を分取して，これらの画分のオピオイド活性を確認
する；

【００２９】（ｄ_１）工程（ｃ_１）で得たオピオイド活
性画分のうち，画分Ｉ−２，画分ＩＩＩ−２および画分
ＩＶ−２については，上記（ａ_１）で使用したカラムに
供して，１０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４−Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝
液（ｐＨ７）（Ｃ液）と１０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４−Ｎａ_２
ＨＰＯ_４緩衝液を含有する５０％アセトニトリル溶液
（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の濃度を０％から１００％
まで直線的に増加する濃度勾配にて溶出し，画分Ｉ−２
については，アセトニトリル濃度が約１８％付近の高吸
収ピーク画分（画分Ｉ−３），画分ＩＩＩ−２について
は，約２１％付近の高吸収ピーク画分（画分ＩＩＩ−
３），画分ＩＶ−２については約２８％付近の高吸収ピ
ーク画分（画分ＩＶ−３）を分取して，これらのオピオ
イド活性を確認する；

【００３０】（ｅ_１）工程（ｄ_１）で得たオピオイド活
性画分のうち，画分ＩＶ−３については，上記（ａ_１）
で使用したカラムに供して，上記工程（ａ_１），
（ｂ_１）および（ｃ_１）と同様にして溶出し，アセトニ
トリル濃度が約３１％付近の高吸収ピーク画分（画分Ｉ
Ｖ−４）を分取してオピオイド活性を確認する；

【００３１】（ｆ_１）工程（ｅ_１）で得たオピオイド活
性画分のうち，画分ＩＶ−４については，上記工程（ａ
_１），（ｂ_１）および（ｃ_１）で使用したカラムとは特
性の異なるカラムを使用した逆相クロマトグラフィー
（使用カラムは例えば野村化学社製のＤｅｖｅｌｏｓｉ
ｌＰｈＡ−Ｔ−５）に供して，工程（ｄ_１）と同様に
して溶出し，アセトニトリル濃度が約２９％付近の高吸
収ピーク画分（画分ＩＶ−５）を分取して，オピオイド
活性を確認する；

【００３２】（ｇ_１）工程（ｃ_１）で得たオピオイド
活性画分（画分ＩＩ−２），工程（ｄ_１）で得たオピオ
イド活性画分（画分Ｉ−３）（画分ＩＩＩ−３），工程
（ｆ_１）で得たオピオイド活性画分（画分ＩＶ−５）か
ら溶媒を乾燥等により除去して回収する；そして

【００３３】（ｈ_１）工程（ｇ_１）で得た乾燥物のア
ミノ酸配列を，例えばアプライドバイオシステムス社製
のプロテインシーケンサー（４７７−Ａ型）等を使用し
て調べて，画分Ｉ−３は配列番号２，画分ＩＩ−２は配
列番号１，画分ＩＩＩ−３は配列番号５，そして画分Ｉ
Ｖ−５は配列番号４で表されるペプチドであることを確
認する。

【００３４】また，上記したペプチド混合物を含有する
水溶液からの配列番号６で表されるペプチドの単離は，
例えば次の（ａ_２）〜（ｆ_２）の工程からなる方法で行
うことができる。

【００３５】配列番号６で表されるペプチドの単離（ａ_２）小麦グルテンをペプシンで加水分解した後ト
リプシンおよびキモトリプシンによって加水分解して得
られたペプチド混合物を，高速液体クロマトグラフィー
（使用カラムは例えばナカライテスク社製のＯＤＳカラ
ムであるＣｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ_１８−ＡＲに供して，
０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）と０．０５
％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ
液）で，Ｂ液の濃度を０％から４０％まで直線的に増加
する濃度勾配にて溶出し，アセトニトリルの濃度が約３
１〜３２％の範囲のピーク画分（画分Ｖ）を分取し，こ
れらの画分のオピオイド活性を確認する；

【００３６】（ｂ_２）工程（ａ_２）で得たオピオイド活
性画分（画分Ｖ）を上記工程（ａ_２）で使用したカラム
と特性の異なるカラムを使用した逆相クロマトグラフィ
ー（使用したカラムは例えばナカライテスク社製のＣｏ
ｓｍｏｓｉｌ５Ｐｈ）に供して工程（ａ_２）と同様に
して溶出し，アセトニトリル濃度約３３％付近のピーク
画分（画分Ｖ−１）を分取し，この画分のオピオイド活
性を確認する；

【００３７】（ｃ_２）工程（ｂ_２）でオピオイド活性画
分（画分Ｖ−１）を工程（ａ_２）および（ｂ_２）で使用
したカラムとは特性の異なるカラムを使用した逆相クロ
マトグラフィー（使用カラムは例えばナカライテスク社
製のＣｏｓｍｏｓｉｌ５ＣＮ−Ｒ）に供して工程（ａ
_２）および（ｂ_２）と同様にして溶出し，アセトニトリ
ル濃度が約２７〜２８％の範囲のピーク画分（画分Ｖ−
２）を分取し，この画分のオピオイド活性を確認する；

【００３８】（ｄ_２）工程（ｃ_２）で得たオピオイド活
性画分（画分Ｖ−２）を上記工程（ａ_２）で使用したカ
ラムに供して１０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４−Ｎａ_２ＨＰＯ_４
緩衝液（ｐＨ７）（Ｃ液）と１０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４−
Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液を含有する５０％アセトニトリル
溶液（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の濃度を０％から１０
０％まで直線的に増加する濃度勾配にて溶出し，アセト
ニトリル濃度が約２４％付近の高吸収ピーク画分（画分
Ｖ−３）を分取し，このオピオイド活性を確認する；

【００３９】（ｅ_２）工程（ｄ_２）で得たオピオイド
活性画分（画分Ｖ−３）から溶媒を乾燥等により除去し
て回収する；そして（ｆ_２）工程（ｅ_２）で得た乾燥物のアミノ酸配列を例
えばアプライドバイオシステムス社製のプロテインシー
ケンサー（４７７−Ａ型）等を使用して調べて，画分Ｖ
−３は配列番号６で表されるペプチドであることを確認
する。

【００４０】また，配列番号１〜配列番号６で表される
本発明のペプチドを化学合成により製造する場合は，例
えば次の方法を採用することができる。本発明のペプチドの化学合成法米国バイオサーチ社のＳＡＭＴＷＯ型自動ペプチド合
成装置を使用して同装置の標準プロトコールにしたがっ
て合成を行う。すなわち，Ｂｏｃ（ブトキシカルボニ
ル）−Ｐｒｏ−樹脂を４５％トリフルオロ酢酸を含むデ
ブロック液で処理した後に，Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ_２−
Ｂｚｌ）をジイソプロピルカルボジイミドの存在下でカ
ップリングさせる。以下，上記と同様にデブロッキング
した後に，Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ_２−Ｂｚｌ）およびＢ
ｏｃ−Ｇｌｙを順次カップリングさせてＢｏｃ−Ｇｌｙ
−Ｔｙｒ（Ｃｌ_２−Ｂｚｌ）−Ｔｙｒ（Ｃｌ_２−Ｂｚｌ
−Ｐｒｏ−樹脂を得る。このペプチド樹脂を１０％アニ
ソールを含むフッ化水素中に入れて０℃で１時間撹拌す
る。フッ化水素を留去した後，エーテルで残渣を洗浄
し，３０％酢酸でペプチドを抽出する。抽出して得た粗
ペプチドをＯＤＳカラムによる高速液体クロマトグラフ
ィーを使用して精製することにより，配列番号１で表さ
れるペプチドを得る。また，配列番号２〜配列番号６で
表されるペプチドも同様の操作により合成および精製す
ることにより得られる。

【００４１】そして，上記のようにして製造された配
列番号１〜配列番号６で表されるペプチドおよびその
塩，並びにその化学構造は未だ解明されていないが小麦
蛋白を酸性プロテアーゼで加水分解した後，中性プロテ
アーゼまたはアルカリ性プロテアーゼで更に加水分解し
て得られるオピオイドペプチドおよびその塩を有効成分
として含有する剤は，鎮痛，麻酔，情動，呼吸，脈動，
体温，消化管機能，摂食，免疫，インシュリンやソマト
スタチン等のホルモンの分泌調節，心筋の収縮調節等に
関与している可能性があり，例えば，鎮痛麻酔剤，催眠
剤，消化管ホルモン促進剤，電解質吸収促進剤，腸管ぜ
ん動抑制による下痢改善剤等として，人間や種々の動物
に投与することができる。その際に，上記オピオイドペ
プチドおよびその塩は，１種類のみを使用してもまたは
２種以上のペプチドを含む混合物の形態で使用してもよ
い。本発明のオピオイド活性を有する剤の好適な投与量
は，投与される人間や動物の年令，体重，性別，症状，
動物の種類等の種々の条件によって異なる。

【００４２】そして，本発明のオピオイド活性を有する
剤は経口および非経口のいずれによっても投与可能であ
り，更に単独で投与しても，また製薬工業において通常
使用されている固体担体や液状担体と一緒に投与しても
よく，或は他の薬剤と混合または組合わせて使用するこ
とができる。また投与形態は，錠剤，丸剤，顆粒剤，カ
プセル，散剤，水溶液，注射剤等の任意の形態が可能で
ある。更に，本発明のオピオイド活性を有する剤は食品
や飼料中に添加して，またはそれらと一緒に投与するこ
ともでき，その場合小麦グルテンから得られたオピオイ
ドペプチドが安全性が高く望ましい。以下に，本発明を
例を挙げて具体的に説明するが本発明はそれらによって
限定されない。

【００４３】

【実施例】実施例１［小麦グルテンの加水分解による配列番号１，配列番号
２，配列番号４および配列番号５で表される本発明のペ
プチドの調製］（１）小麦グルテン５ｇを０．０２Ｎ塩酸１００ｍｌに
分散溶解させた後，３５００Ｇで２０分間遠心分離して
不溶物を除き，１Ｎ塩酸を加えてｐＨを２．０に調整し
た。この小麦グルテン液にペプシン（米国シグマ社製）
５０００ｕｎｉｔｓを加えて３７℃で１５時間インキュ
ベートした。反応終了後１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液
を加えてｐＨを７．０に調整した後，サーモライシン
（ペプチド研究所製）５０００ｕｎｉｔｓを加えて３７
℃において４時間インキュベートした。反応終了後，９
０℃で２０分間加熱して酵素を失活させ，３５００Ｇで
２０分間遠心分離して不溶物を除き，得られた上澄液を
凍結乾燥してぺプシンとサーモライシンによる小麦グル
テンの加水分解物約３．５ｇを得た。

【００４４】（２）上記（１）で得た小麦グルテンの
加水分解物８０ｍｇをナカライテスク社製オクタデシル
シラン（ＯＤＳ）カラムであるＣｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ
_１８−ＡＲ（内径２０ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）を使用
した逆相クロマトグラフィーに供した。次いで０．０５
％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）および０．０５％ト
リフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）
を使用して，Ｂ液の濃度を０％から４０％まで４０分か
けて直線的に増加する濃度勾配にて１０ｍｌ／分の流速
で溶出させた。その時の波長２３０ｎｍにおけるフロー
チャートを図１に示す。図１に示したフローチャートに
おける各画分を分取してそのオピオイド活性を測定した
ところ，アセトニトリルの濃度が約２２．５〜２３．５
％の範囲で溶出してくる画分（画分Ｉ），約２４〜２５
％の範囲で溶出してくる画分（画分ＩＩ），約２８〜２
９％の範囲で溶出してくる画分（画分ＩＩＩ），および
約３４〜３５％の範囲で溶出してくる画分（画分ＩＶ）
にオピオイド活性が認められた。

【００４５】（３）そこで，上記で（１）で得た小麦
グルテンの加水分解物２０００ｍｇを使用して上記
（２）と同じ工程を繰り返して，画分Ｉ，画分ＩＩ，画
分ＩＩＩおよび画分ＩＶのオピオイド活性画分を得て，
これらの画分を次にナカライテスク社製のフェニルカラ
ムＣｏｓｍｏｓｉｌ５Ｐｈ（内径４．６ｍｍ，長さ２
５０ｍｍ）を用いた逆相クロマトグラフィーに供した。
上記したＡ液とＢ液を使用してＢ液の濃度を０％から４
０％まで４０分かけて直線的に増加する濃度勾配にて１
ｍｌ／分の流速で溶出させた。溶出してくる各画分のオ
ピオイド活性を測定したところ，画分Ｉについてはアセ
トニトリルの濃度が約２４〜２５％の範囲で溶出してく
る画分（画分Ｉ−１），画分ＩＩについては約３３〜３
４％の範囲で溶出してくる画分（画分ＩＩ−１），画分
ＩＩＩについては約３０〜３１％の範囲で溶出してくる
画分（画分ＩＩＩ−１），そして画分ＩＶについては約
３６〜３７％の範囲で溶出してくる画分（画分ＩＶ−
１）にオピオイド活性が認められた。

【００４６】（４）次に，上記（３）で得た画分Ｉ−
１，画分ＩＩ−１，画分ＩＩＩ−１および画分ＩＶ−１
のオピオイド活性画分をナカライテスク社製のシアノプ
ロピルカラムＣｏｓｍｏｓｉｌ５ＣＮ−Ｒ（内径４．
６ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）を用いた逆相クロマトグラフ
ィーに供して，上記（３）におけるのと同条件で溶出さ
せた。溶出してくる各画分を分取してそのオピオイド活
性を測定したところ，画分Ｉ−１についてはアセトニト
リルの濃度が約１８〜１９％付近の高吸収ピーク画分
（画分Ｉ−２），画分ＩＩ−１については約２７％付近
の高吸収ピーク画分（画分ＩＩ−２），画分ＩＩＩ−１
については約２６〜２７％の範囲のピーク画分（画分Ｉ
ＩＩ−２），そして画分ＩＶについては約３２〜３３％
の範囲のピーク画分（画分ＩＶ−２）にオピオイド活性
が認められた。

【００４７】（５）次に，上記（４）で得たオピオイ
ド活性画分のうち，画分Ｉ−２，画分ＩＩＩ−２と画分
ＩＶ−２については，更にナカライテスク社製のオクタ
デシルシラン（ＯＤＳ）カラムであるＣｏｓｍｏｓｉｌ
５Ｃ_１８−ＡＲ（内径４．６ｍｍ，長さ１５０ｍｍ）
を使用して，逆相クロマトグラフィーに供した。次い
で，１０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４−Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液
（ｐＨ７）（Ｃ液）と１０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４−Ｎａ_２
ＨＰＯ_４緩衝液を含有する５０％アセトニトリル溶液
（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の濃度を０％から１００％
まで直線的に増加する濃度勾配にて溶出させた。溶出し
てくる各画分を分取して，そのオピオイド活性を測定し
たところ，画分Ｉ−２については，アセトニトリル濃度
が約１８％の高吸収ピーク画分（画分Ｉ−３），画分Ｉ
ＩＩ−２については，約２１％付近の高吸収ピーク画分
（画分ＩＩＩ−３），そして画分ＩＶ−２についてはア
セトニトリル濃度が約２８％付近の高吸収ピーク画分
（画分ＩＶ−３）にオピオイド活性が認められた。

【００４８】（６）次に，上記（５）で得たオピオイ
ド活性画分のうち画分ＩＶ−３については，再び上記
（５）で用いたカラムを使用した逆相クロマトグラフィ
ーに供し，次いで，上記（４）におけるのと同条件で溶
出させた。溶出してくる各画分を分取してそのオピオイ
ド活性を測定したところ，アセトニトリル濃度が約３１
％付近の高吸収ピーク画分（画分ＩＶ−４）にオピオイ
ド活性が認められた。

【００４９】（７）更に，上記（６）で得たオピオイ
ド活性画分のうち画分ＩＶ−４については，更に野村化
学社製のフェネチルカラムであるＤｅｖｅｌｏｓｉｌ
ＰｈＡ−Ｔ−５（内径４．６ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）に
供して，上記（５）におけるのと同条件で溶出させた。
溶出してくる各画分のオピオイド活性を測定したとこ
ろ，アセトニトリル濃度が約２９％付近の高吸収ピーク
画分（画分ＩＶ−５）にオピオイド活性が認められた。

【００５０】（８）上記（４）で得た画分ＩＩ−２，
上記（５）で得た画分Ｉ−３および画分ＩＩＩ−３，並
びに上記（７）で得た画分ＩＶ−５を回収し，濃縮乾燥
した。なお，上記図１において，左側縦軸は溶離してき
た液のＡｂｓ．２３０を，右側縦軸は溶離液中のアセ
トニトリル濃度（％）を示す。

【００５１】上記で得た乾燥物をアプライドバイオシス
テム社製のプロテインシーケンサー４７７−Ａ型を使用
してそのアミノ酸配列を調べたところ，画分Ｉ−３の乾
燥物については，Ｎ末端から順次Ｌ−Ｇｌｙ，Ｌ−Ｔｙ
ｒ，Ｌ−Ｔｙｒ，Ｌ−ＰｒｏおよびＬ−Ｔｈｒが遊離し
てきた。このことから，その構成アミノ酸のすべてがＬ
−アミノ酸である配列番号２で表されるペプチドである
ことが確認された。また，画分ＩＩ−２の乾燥物につい
てはＮ−末端から順次Ｌ−Ｇｌｙ，Ｌ−Ｔｙｒ，Ｌ−Ｔ
ｙｒおよびＬ−Ｐｒｏが遊離してきた。このことから，
その構成アミノ酸すべてがＬ−アミノ酸である配列番号
１で表されるペプチドであることが確認された。

【００５２】また，画分ＩＩＩ−３の乾燥物について
は，Ｎ末端から順次Ｌ−Ｔｙｒ，Ｌ−Ｇｌｙ，Ｌ−Ｇ１
ｙおよびＬ−Ｔｒｐが遊離してきた。このことからその
構成アミノ酸のすべてがＬ−アミノ酸である配列番号５
で表されるペプチドであることが確認された。そして，
画分ＩＶ−５から得た乾燥物については，Ｎ末端から順
次Ｌ−Ｔｙｒ，Ｌ−Ｇｌｙ，Ｌ−Ｇｌｙ，Ｌ−Ｔｒｐお
よびＬ−Ｌｅｕが遊離してきた。このことからその構成
アミノ酸のすべてがＬ−アミノ酸である配列番号４で表
されるペプチドであることが確認された。

【００５３】配列番号１，配列番号２，配列番号４およ
び配列番号５で表される各ペプチドの原料グルテンから
の収率（％）を，その分子量とＡｂｓ．_２８０における
分子吸光係数から求めたところ，順に約４×１０
^−２（％），４×１０^−３（％），１×１０^−５（％）
および３×１０^−４（％）であることが確認された。

【００５４】また，シリカゲルプレートによる薄層クロ
マトグラフィーでＲｆ値を求めたところ，ブタノール：
酢酸：ピリジン：水＝１５：３：１０：１２の展開溶媒
を使用した場合のＲｆ値は，配列番号１，配列番号２，
配列番号４および配列番号５で表される各ペプチドで，
順に，０．５８，０．５４，０．７７および０．６１で
あった。

【００５５】実施例２「小麦グルテンの加水分解による配列番号１，配列番号
２，配列番号は４および配列番号５で表されるペプチド
を含有するペプチド混合物の調製］酸性プロテアーゼとしてペプシンの代わりにアスペルギ
ルスニガー起源のアスパルティクプロティナーゼ（商品
名「プロテアーゼＹＰ−ＳＳ」；ヤクルト本社製）をペ
プシンの場合と同じ量（ｕｎｉｔｓ）で使用し，小麦グ
ルテン溶液をｐＨ３．０に調整して，３７℃で１５時間
インキュベートした他は実施例１と全く同様にして小麦
グルテンの加水分解を行ったところ，実施例１の（２）
と同様の逆相クロマトグラフィーにて，図１に示された
画分Ｉ，画分ＩＩ，画分ＩＩＩおよび画分ＩＶに実施例
１と同程度のオピオイド活性が認められた。したがっ
て，この実施例においても，配列番号１，配列番号２，
配列番号４および配列番号５で表されるペプチドを混合
含有するオピオイド活性を有するペプチド混合物が得ら
れた。

【００５６】実施例３「小麦グルテンの加水分解による配列番号１，配列番号
２，配列番号は４および配列番号５で表されるペプチド
を含有するペプチド混合物の調製］中性プロテアーゼとしてサーモライシンの代わりにアス
ペルギルオリゼー起源の中性プロテアーゼ（商品名「プ
ロチンＦＮ」；大和化成製）をサーモライシンの場合と
同じ量（ｕｎｉｔｓ）で使用した他は実施例１と全く同
様にして小麦グルテンの加水分解を行ったところ，実施
例１の（２）と同様の逆相クロマトグラフィーにて，図
１に示された画分Ｉ，画分ＩＩ，画分ＩＩＩおよび画分
ＩＶに実施例１と同程度のオピオイド活性が認められ
た。したがって，この実施例においても，配列番号１，
配列番号２，配列番号４および配列番号５で表されるペ
プチドを混合含有するオピオイド活性を有するペプチド
混合物が得られた。

【００５７】実施例４「小麦グルテンの加水分解による配列番号１，配列番号
２，配列番号は４および配列番号５で表されるペプチド
を含有するペプチド混合物の調製］中性プロテアーゼの代わりにバチルス起源のセリンプロ
テアーゼ（商品名「ビオプラーゼＳＰ−４」；長瀬産業
製）をサーモライシンの場合と同じ量（ｕｎｉｔｓ）で
使用した他は実施例１と同様にして小麦グルテンの加水
分解を行ったところ，実施例１の（２）と同様の逆相ク
ロマトグラフィーにて，図１に示された画分Ｉ，画分Ｉ
Ｉ，画分ＩＩＩおよび画分ＩＶに実施例１と同程度のオ
ピオイド活性が認められた。したがって，この実施例に
おいても，配列番号１，配列番号２，配列番号４および
配列番号５で表されるペプチドを混合含有するオピオイ
ド活性を有するペプチド混合物が得られた。

【００５８】実施例５［小麦グルテンの加水分解による配列番号６で表される
本発明のペプチドの調製］（１）小麦グレテン５ｇを０．０２Ｎ塩酸１００ｍｌに
分散溶解させた後，３５００Ｇで２０分間遠心分離して
不溶物を除き，１Ｎ塩酸を加えてｐＨを２．０に調整し
た。この小麦グルテン液にペプシン（米国シグマ社製）
５０００ｕｎｉｔｓを加えて３７℃で１５時間インキュ
ベートした。反応終了後１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液
を加えてｐＨを７．０に調整した後，トリプシン（米国
シグマ社製）およびキモトリプシン（米国シグマ社製）
を各５０００ｕｎｉｔｓづつ加えて３７℃において４時
間インキュベートした。反応終了後，９０℃で２０分間
加熱して酵素を失活させ，３５００Ｇで２０分間遠心分
離して不溶物を除き，得られた上澄液を凍結乾燥してペ
プシンとトリプシンおよびキモトリプシンによる小麦グ
ルテンの加水分解物約３．０ｇを得た。

【００５９】（２）上記（１）で得た小麦グルテンの
加水分解物をナカライテスク社製オクタデシルシラン
（ＯＤＳ）カラムであるＣｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ_１８−
ＡＲ（内径２０ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）を使用した逆相
クロマトグラフィーに供した。次いで０．０５％トリフ
ルオロ酢酸水溶液（Ａ液）および０．０５％トリフルオ
ロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）を使用し
て，Ｂ液の濃度を０％から４０％まで４０分かけて直線
的に増加する濃度勾配にて１０ｍｌ／分の流速で溶出さ
せた。その時の波長２３０ｎｍにおけるフローチャート
を図２に示す。図２に示したフローチャートにおける，
各画分を分取してそのオピオイド活性を測定したとこ
ろ，アセトニトリルの濃度が約３１〜３２％の範囲で溶
出してくる画分（画分Ｖ）にオピオイド活性が認められ
た。

【００６０】（３）そこで，上記（１）で得た小麦グ
ルテンの加水分解物２０００ｍｇを使用して，工程
（２）と同じ処理を繰り返して，画分Ｖのオピオイド活
性画分を得て，この画分を次にナカライテスク社製のフ
ェニルカラムＣｏｓｍｏｓｉｌ５Ｐｈ（内径４．６
ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）を用いた逆相クロマトグラフィ
ーに供した。上記したＡ液とＢ液を使用してＢ液の濃度
を０％から４０％まで４０分かけて直線的に増加する濃
度勾配にて１ｍｌ／分の流速で溶出させた。溶出してく
る画分のオピオイド活性を測定したところ，アセトニト
リルの濃度が約３３％付近で溶出してくる画分（画分Ｖ
−１）にオピオイド活性が認められた。

【００６１】（４）次に，上記（３）で得た画分Ｖ−
１のオピオイド活性画分をナカライテスク社製のシアノ
プロピルカラムＣｏｓｍｏｓｉｌ５ＣＮ−Ｒ（内径
４．６ｍｍ，長さ２５０ｍｍ）を用いた逆相クロマトグ
ラフィーに供して，上記（３）におけるのと同条件で溶
出させた。溶出してくる各画分を分取してそのオピオイ
ド活性を測定したところ，アセトニトリルの濃度が約２
７〜２８％の範囲のピーク画分（画分Ｖ−２）にオピオ
イド活性が認められた。

【００６２】（５）次に，上記（４）で得た画分Ｖ−
２のオピオイド活性画分を，ナカライテスク社製のオク
タデシルシラン（ＯＤＳ）カラムであるＣｏｓｍｏｓｉ
ｌ５Ｃ_１８−ＡＲ（内径４．６ｍｍ，長さ１５０ｍ
ｍ）を使用して逆相クロマトグラフィーに供した。次い
で，１０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４−Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液
（ｐＨ７）（Ｃ液）と１０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４−Ｎａ_２
ＨＰＯ_４緩衝液を含有する５０％アセトニトリル溶液
（ｐＨ７）（Ｄ液）で，Ｄ液の濃度を０％から１００％
まで直線的に増加する濃度勾配にて溶出させた。溶出し
てくる各々の画分を分取して，そのオピオイド活性を測
定したところ，アセトニトリル濃度が約２４％付近の高
吸収ピーク画分（画分Ｖ−３）にオピオイド活性が認め
られた。

【００６３】（６）上記（５）で得られた画分Ｖ−３
を回収し，濃縮乾燥した。上記で得た乾燥物を実施例１
で使用したのと同じプロテインシーケンサー４７７−Ａ
型を使用してそのアミノ酸配列を調べたところ，Ｎ末端
から順次Ｌ−Ｔｙｒ，Ｌ−Ｐｒｏ，Ｌ−Ｉｌｅ，Ｌ−Ｓ
ｅｒおよびＬ−Ｌｅｕが遊離してきた。このことからそ
の構成アミノ酸のすべてがＬ−アミノ酸である配列番号
６で表されるペプチドであることが確認された。配列番
号６で表されるペプチドの原料グルテンからの収率
（％）は，その分子量とＡｂｓ．_２８０における分子吸
光係数より，約４×１０^−４（％）であることが確認さ
れた。また，実施例１と同様にシリカゲルプレートによ
る薄層クロマトグラフィーでＲｆ値を求めたところ０．
７３であった。

【００６４】実施例６［合成による本発明のペプチドの製造］配列番号１で表されるペプチドの合成は以下の方法で行
った。市販のＢｏｃ（ブトキシカルボニル）−Ｐｒｏ−
樹脂（置換率０．４ｍｅｑ／ｇ）０．７５ｇと４５％ト
リフルオロ酢酸および２．５％アニソールを含む塩化メ
チレン２０ｍｌをバイオサーチ社のペプチド合成装置Ｓ
ＡＭＴＷＯの反応槽の中で室温で２５分間反応させて
Ｂｏｃ基を除去した。次にＢｏｃ基の除去されたＰｒｏ
−樹脂を塩化メチレンで洗浄し，次いで１０％のジイソ
プロピルエチルアミンを含む塩化メチレンにより中和し
た後，更に塩化メチレンで洗浄した。この樹脂に０．４
ＭＢｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ_２−Ｂｚｌ）のジメチルホル
ムアミド溶液５ｍｌ，０．４Ｍジイソプロピルカルボジ
イミドの塩化メチレン溶液５ｍｌを混合して反応槽に入
れて室温で２時間撹拌下に反応させた。

【００６５】上記で得られた樹脂を，順にジメチルホル
ムアミド，塩化メチレン，ジイソプロピルエチルアミン
を１０％含有する塩化メチレン，塩化メチレンおよび塩
化メチレン／ジメチルホルムアミド混合液で洗浄して，
Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ_２−Ｂｚｌ）−Ｐｒｏ−樹脂を得
た。引き続き上記と同様にしてＢｏｃ基の除去，Ｂｏｃ
アミノ酸のカップリングを繰り返してＢｏｃ−Ｔｙｒ
（Ｃｌ_２−Ｂｚｌ）−Ｔｙｒ（Ｃｌ_２−Ｂｚｌ）−Ｐｒ
ｏ−樹脂からなる生成物を得た。更に同様にしてＢｏｃ
基の除去，Ｂｏｃアミノ酸のカップリングを繰り返し
て，Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（Ｃｌ_２−Ｂｚｌ）−Ｔｙ
ｒ（Ｃｌ_２−Ｂｚｌ）−Ｐｒｏ−樹脂からなる生成物を
得た。

【００６６】この樹脂を１０％のアニソールを含有する
フッ化水素２０ｍｌに入れて０℃で２時間撹拌してペプ
チドを樹脂から遊離させた。その後，フッ化水素を減圧
留去し，残渣を３０％酢酸で抽出し，それを凍結乾燥し
て粗ペプチド１５０ｍｇを得た。これをナカライテスク
株式会社製のオクタデシルシラン（ＯＤＳ）カラムであ
るＣｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ_１８−ＡＲを用いた逆相クロ
マトグラフィーにより精製して最終生成物４０ｍｇを得
た。そのアミノ酸組成（モル比）は，Ｇｌｙ：Ｔｙｒ：
Ｔｙｒ：Ｐｒｏ＝１：１：１：１であった。更に実施例
１で使用したのと同じプロテインシーケンサーにより分
析したところ，配列番号１で表されるアミノ酸配列を有
するペプチドであることが判明した。また該生成物の薄
層クロマトグラフィーのＲｆ値は，実施例１の生成物と
同様に０．５８であった。

【００６７】また，配列番号２で表されるペプチドの場
合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様にし
て市販のＢｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−樹脂（置換率０．
３ｍｅｑ／ｇ）１ｇから最終生成物３０ｍｇを得た。そ
のアミノ酸組成（モル比）は，Ｇｌｙ：Ｔｙｒ：Ｔｙ
ｒ：Ｐｒｏ：Ｔｈｒ＝１：１：１：１：１であり，そし
て実施例１で使用したプロテインシーケンサーにより分
析したところ，配列番号２で表されるアミノ酸配列を有
するペプチドであることが判明した。またこの生成物の
薄層クロマトグラフィーのＲｆ値は実施例１の生成物と
同様に０．５４であった。

【００６８】更に，配列番号３で表されるペプチドの場
合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様にし
て市販のＢｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−樹脂（置換率０．
３９ｍｅｑ／ｇ）０．７７ｇから最終生成物３０ｍｇを
得た。そのアミノ酸組成（モル比）は，Ｇｌｙ：Ｔｙ
ｒ：Ｔｙｒ：Ｐｒｏ：Ｔｈｒ：Ｓｅｒ＝１：１：１：
１：１：１であり，そして実施例１で使用したプロテイ
ンシーケンサーにより分析したところ，配列番号３で表
されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが判明
した。またこの生成物の薄層クロマトグラフィーのＲｆ
値は０．５３であった。

【００６９】そして，配列番号４で表されるペプチド
の場合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様
にして，市販のＢｏｃ−Ｌｅｕ−樹脂（置換率０．５ｍ
ｅｑ／ｇ）０．６ｇから最終生成物４０ｍｇを得た。そ
のアミノ酸組成（モル比）は，Ｔｙｒ：Ｇｌｙ：Ｇｌ
ｙ：Ｔｒｙ：Ｌｅｕ＝１：１：１：１：１であった。更
に，実施例１で使用したプロテインシーケンサーにより
分析したところ，配列番号４で表されるアミノ酸配列を
有するペプチドであることが判明した。また，該生成物
の薄層クロマトグラフィーのＲｆ値は，実施例１の生成
物と同様に０．７７であった。

【００７０】更に，配列番号５で表されるペプチドの
場合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様に
して，市販のＢｏｃ−Ｔｒｐ−樹脂（置換率０．３ｍｅ
ｑ／ｇ）１ｇから最終生成物３０ｍｇを得た。そのアミ
ノ酸組成（モル比）は，Ｔｙｒ：Ｇｌｙ：Ｇｌｙ：Ｔｒ
ｐ＝１：１：１：１であり，そして実施例１で使用した
プロテインシーケンサーにより分析したところ，配列番
号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであるこ
とが判明した。また，該生成物の薄層クロマトグラフィ
ーのＲｆ値は，実施例１の生成物と同様に０．６１であ
った。

【００７１】そして，配列番号６で表されるペプチド
の場合も，配列番号１で表されるペプチドの場合と同様
にして，市販のＢｏｃ−Ｌｅｕ−樹脂（置換率０．５ｍ
ｅｑ／ｇ）０．６ｇから最終生成物４０ｍｇを得た。そ
のアミノ酸組成（モル比）は，Ｔｙｒ：Ｐｒｏ：Ｉｌ
ｅ：Ｓｅｒ：Ｌｅｕ＝１：１：１：１：１であった。そ
して実施例１で使用したプロテインシーケンサーにより
分析したところ，配列番号６で表されるアミノ酸配列を
有するペプチドであることが判明した。また，該生成物
の薄層クロマトグラフィーのＲｆ値は，実施例５の生成
物と同様に０．７３であった。

【００７２】上記の実施例１〜６における各画分のオピ
オイド活性および配列番号１〜配列番号６で表されるペ
プチド，ならびに既知のオピオイドペプチドのオピオイ
ド活性は，いずれも次のようにして測定した。

【００７３】《オピオイド活性の測定法》体重３０〜３５ｇのＩＣＲ系の雄マウスより摘出した２
本の輸精管をアイソトニックトランスデューサー（日本
光電工業株式会社製：ＴＢ６１２−Ｔ）に接続して
０．４ｇの張力をかける。３６℃に保温した２ｍｌ容量
のマグヌス管内に，Ｋｒｅｂｓ等張液（ＮａＣｌ１１
８ｍＭ，ＫＣｌ４．７５ｍＭ，ＣａＣｌ_２２．５４ｍ
Ｍ，ＮａＨＣＯ_３２５ｍＭ，ＫＨ_２ＰＯ_４１．１９ｍ
Ｍ，グルコース１１ｍＭ）を満たしたものの中に輸精管
を浸して，ボンベから通気（０_２９５％：ＣＯ_２５％）
を行った。このようにして約２時間安定化させた後，３
０Ｖで１ｍｓｅｃの電気刺激を与え，マウス輸精管を電
気収縮させた。電気収縮が安定した後，アミノペプチダ
ーゼ阻害剤等を含むインヒビター５０μｌを加え，小麦
グルテンの酵素分解物の高速液体クロマトグラフィーに
より分画された各画分を添加し，マウス輸精管の電気収
縮の変化をレコーダーで記録した。オピオイド活性は画
分添加後電気収縮の抑制と１０^−４Ｍナロキソン２０μ
ｌ添加による抑制の解除によって判定した。そしてマウ
ス輸精管の電気収縮を５０％抑制する濃度（ＩＣ_５０）
を測定した。

【００７４】その結果，上記実施例で得られた配列番号
１〜配列番号６で表される本発明のペプチドのＩＣ_５０
は表１に示すとおりであった。参考のため，既知のペプ
チドのオピオイド活性を上記と同様にして測定したとき
のＩＣ_５０を表１に併記する。

【００７５】

【表１】

【００７６】表１の結果から，本発明のオピオイド活性
剤は低濃度でＩＣ_５０を達成できることがわかる。

【００７７】

【発明の効果】本発明の方法によるときは，小麦グルテ
ン等の小麦蛋白を使用して，目的とするオピオイドペプ
チド，特に，配列番号１，２，４，５および６で表され
るペプチドを確実に得ることができる。また，合成によ
って配列番号３で表されるペプチドを得ることができ
る。

【００７８】本発明のペプチドおよびその塩はオピオイ
ド活性を有しているので，該ペプチドおよびその塩を有
効成分とする剤は極めて少量の投与で，鎮痛，麻酔，情
動，呼吸，脈動，体温，消化管機能，摂食，免疫，イン
シュリンやソマトスタチン等のホルモンの分泌調節，電
解質の吸収促進，心筋の収縮調節機能を示す可能性があ
るため，鎮痛麻酔剤，催眠剤，消化管ホルモン分泌促進
剤，電解質の吸収促進剤，胃腸輸送筋収縮による下痢改
善剤としての利用が期待できる。その場合に，本発明の
ペプチドおよびその塩は，水溶性の白色粉末であるた
め，そのままでまたは水等に溶解させて経口および非経
口のいずれの方法によっても極めて簡単に投与すること
ができる。

【００７９】更に，本発明のペプチドおよびその塩は４
〜６個のアミノ酸が配列しただけの極めて簡単な構造を
有する低分子量化合物であるため化学合成によっても簡
単に製造することができる。また，本発明のペプチド
は，小麦グルテンの酵素による加水分解物として得られ
るために安全性が高い。

【００８０】

【配列表】

【００８１】配列番号：１配列の長さ：４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＧｌｙＴｙｒＴｙｒＰｒｏ１

【００８２】配列番号：２配列の長さ：５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＧｌｙＴｙｒＴｙｒＰｒｏＴｈｒ１５

【００８３】配列番号：３配列の長さ：６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＧｌｙＴｙｒＴｙｒＰｒｏＴｈｒＳｅｒ１５

【００８４】配列番号：４配列の長さ：５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＴｙｒＧｌｙＧｌｙＴｒｐＬｅｕ１５

【００８５】配列番号：５配列の長さ：４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＴｙｒＧｌｙＧｌｙＴｒｐ１

【００８６】配列番号：６配列の長さ：５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＴｙｒＰｒｏＩｌｅＳｅｒＬｅｕ１５

【００８７】配列番号：７配列の長さ：７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＴｙｒＰｒｏＰｈｅＰｒｏＧｌｙＰｒｏＩｌｅ１５

【００８８】配列番号：８配列の長さ：５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＴｙｒＰｒｏＰｈｅＰｒｏＧｌｙ１５

【００８９】配列番号：９配列の長さ：７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＡｒｇＴｙｒＬｕｅＧｌｙＴｙｒＬｕｅＧｌｕ１５

【００９０】配列番号：１０配列の長さ：７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列ＴｙｒＰｒｏＧｌｎＰｒｏＧｌｎＰｒｏＰｈｅ１５

【図面の簡単な説明】

【図１】小麦グルテンをペプシンで加水分解した後，サ
ーモライシンで加水分解して得られたペプチド混合物を
高速液体クロマトグラフィーに通し，その吸着成分を直
線濃度勾配を有する特定の溶離液により溶離した時の該
成分の吸光度を測定したフローチャートである。

【図２】小麦グルテンをペプシンで加水分解した後，ト
リプシンとキモトリプシンで加水分解して得られたペプ
チド混合物を高速液体クロマトグラフィーに通し，その
吸着成分を直線濃度勾配を有する特定の溶離液により溶
離した時の該成分の吸光度を測定したフローチャートで
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭53−21139（ＪＰ，Ａ) Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．６（1984）ｐ．1139−1147 Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 21，Ｎｏ．11（1978）ｐ．1110−1116 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 5/103 - 7/06 C12P 21/06 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】小麦蛋白を酸性プロテアーゼを使用して
加水分解した後，バチルス起源の中性プロテアーゼおよ
びアスペルギルス起源の中性プロテアーゼから選ばれる
１種または複数種の中性プロテアーゼ或いはアルカリ性
プロテアーゼを使用して更に加水分解し，得られる加水
分解物から，オピオイド活性を有する配列番号１，配列
番号２，配列番号４または配列番号５で表されるペプチ
ドを回収することを特徴とする配列番号１，配列番号
２，配列番号４または配列番号５で表されるオピオイド
ペプチドの製造方法。
【請求項２】小麦蛋白を酸性プロテアーゼを使用して
加水分解した後，トリプシンおよびキモトリプシンを用
いて更に加水分解し，得られる加水分解物からオピオイ
ド活性を有する配列番号６で表されるペプチドを回収す
ることを特徴とする配列番号６で表されるオピオイドペ
プチドの製造方法。
【請求項３】配列番号１，配列番号２，配列番号３ま
たは配列番号６で表されるペプチド或いはその塩。
【請求項４】化学合成によって，配列番号１，配列番
号２，配列番号３または配列番号６で表されるペプチド
或いはその塩を製造する方法。