JP2710653B2 - 新規ポリペプチド及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 「技術分野」 本発明は、新規ポリペプチド及びその製造法に関し、
更に詳しくは、リポ多糖（エンドトキシン）に強い親和
性を示す新規ポリペプチド及びその製造法に関するもの
である。

「背景技術」 エンドトキシンは、内毒素とも呼ばれ、グラム陰性細
菌の菌体に存在する毒性物質の総称で、成分はリポ多糖
（以下「LPS」という。）である。

従来、エンドトキシンの除去法としては、熱分解法、
限外ろ過法、ポリミキシンＢによるアフィニティークロ
マト法等が知られている。

しかしながら、熱分解法は、250℃以上の乾熱処理に
よりLPSを熱分解し、ガラス容器等からLPSを分解・除去
する方法であり、熱に不安定な物質からのLPSの分離に
は利用できない。限外ろ過法は、低分子量物質からのLP
Sの分離に有効であるが、原理的に高分子量物質からの
エンドトキシンの分離には適用できない。ポリミキシン
Ｂによるアフィニティークロマト法は、ポリミキシンＢ
の有するLPSに対する親和力を利用する点から実用化が
期待されるが、ポリミキシンＢの有する毒性の点から用
途が制限され、現在実用化されていない。

従って、高分子量生理活性物質中からLPSを効果的か
つ安全に分離する方法として、実用的に有効な方法は未
だ見出されていない。

そこで、本発明者らは、LPSに親和性を示す新規物質
を見出すべく鋭意研究を重ねた。本発明において、この
物質をLPS結合ポリペプチド（時にはLBPと略する）とい
う。その結果、カブトガニ血球から新規ポリペプチドを
抽出・単離するとともに該ポリペプチドの固相ペプチド
合成法のような合成法による合成に成功し、更に、該ポ
リペプチドが、LPSに強い親和性を示し、抗菌活性及び
幼若化反応抑制作用などの生物活性を有することを見出
し、本発明を完成するに至った。

「発明の開示」 本発明は、 次式（Ｉ）： （式中、Lysはリジンを、Trpはトリフトファンを、Cys
はシステインを、Pheはフェニルアラニンを、Argはアル
ギニンを、Valはバリンを、Tyrはチロシンを、Glyはグ
リシンを、Ileはイソロイシンを表し;Xは水酸基又はア
ミノ基を表す。） で示されるポリペプチド及びその類縁体並びに該ポリペ
プチドの製造法に関するものである。

本発明の化合物は、アミノ酸17個からなるポリペプリ
ドであり、抽出・単離された状態ではＣ端末アミノ酸で
あるアルギニンのカルボキシル基はアミド化されている
が、加水分解により酸となっても、LPSとの親和性には
何ら影響は生じない。

本発明のポリペプチドは、以下のようにして、Tachyp
leus tridentatus又はTachypleus gigasのカブトガニ
血球から抽出・単離することができる。

即ち、Tachypleus tridentatusの血球を低張抽出後
の残渣を酸性条件下、例えば、塩酸、硝酸、硫酸等の鉱
酸の希酸中；又は有機酸、例えば酢酸等の低級脂肪酸中
で抽出して、得られた抽出液を、例えばゲルろ過、クロ
マトグラフィー等の精製手段により精製することによ
り、該ポリペプチドを単離することができる。

本発明のポリペプチドは、ペプチド合成法、例えば固
相ペプチド合成法、液相ペプチド合成法などのような合
成法によっても製造することができる。

即ち、例えば、固相合成法では、Ｎ−保護アルギニン
のカルボキシル基を、場合によりカルボキシル基と結合
しうる官能基とカルボキシル基とを有するスペーサーを
介して、アミノ基を有する不溶性樹脂に結合させた後、 次式： （式中の記号は前記と同義である。） で示されるペプチド配列の16位から１位までに対応する
保護アミノ酸を固相ペプチド合成法に従って順次、不溶
性樹脂に結合したアルギニンに結合させ、保護ポリペプ
チドを得、次いで、該不溶性樹脂及びアミノ酸の保護基
を脱離させて、 次式（II）： （式中の記号は前記と同義である。） で示されるポリペプチドを得、その３位と16位、及び７
位と12位のシステインをそれぞれのメルカプト基を介し
て結合させ、ジスルフィド結合を形成させることにより
本発明のポリペプチドを製造することができる。

前述のアミノ基を有する不溶性樹脂としては、そのア
ミノ基を介してＮ−保護アルギニンのカルボキシル基又
は場合によりこれに結合しているスペーサーのカルボキ
シル基と結合可能であり、かつ、その後脱離可能なもの
であれば如何なるものでもよい。

かかる不溶性樹脂としては、例えば、アミノメチル樹
脂（アミノメチル化スチレン−ジビニルベンゼン共重合
体）、ベンズヒドリルアミン樹脂、メチルベンズヒドリ
ルアミン樹脂、４−（アミノメチル）フェノキシメチル
樹脂等が挙げられる。ベンズヒドリルアミン樹脂、メチ
ルベンズヒドリルアミン樹脂、４−（アミノメチル）フ
ェノキシメチル樹脂を用いれば開裂によって直接アミド
を与えるが、収率の点からはアミノメチル樹脂が好まし
い。

前述の場合により存在するカルボキシル基と結合しう
る官能基とカルボキシル基とを有するスペーサーとして
は、例えばアルギニンのカルボキシル基をｐ−カルボキ
シルメチルベンジルエステルに変換しうるものが挙げら
れるが特に制限はない。

かかるスペーサーと保護アルギニンと係合した４−
（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−トシル−Ｌ−アルギニ
ルオキシメチル）フェニル酢酸はJ.P.Tamら（Synthesis
（1979）p.955−957）の方法により調製することができ
る。

保護アミノ酸とは、官能基を公知の方法により保護基
で保護したアミノ酸であり、各種の保護アミノ酸が市販
されている。本発明のポリペプチドを合成する場合に
は、以下に示す保護基のいずれかを選択するのが好まし
い。まず、アミノ酸のα−アミノ基の保護基はBoc（ｔ
−ブチルオキシカルボニル）又はFmoc（９−フルオレニ
ルメチルオキシカルボニル）である。Argのグアニジノ
基の保護基は、Tos（トシル）、NO₂（ニトロ）又はMtr
（４−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニ
ル）である。Cysのメルカプト基の保護基としてはBzl
（ベンジル）、Ｍ・Bzl（４−メトキシベンジル）、４
−MeBzl（４−メチルベンジル）、Acm（アセトアミドメ
チル）、Trt（トリチル）、Npys（３−ニトロピリジン
スルフェニル）、ｔ−Bu（ｔ−ブチル）又はｔ−Bus
（ｔ−ブチルメルカプト）が挙げられるが、４−MeBz
l、Acm及びHpysが好ましい。Tyrの水酸基の保護基は、B
zl、Cl₂・Bzl（2,6−ジクロロベンジル）、ｔ−Buであ
るか、あるいは保護しなくてもよい。Lysのε−アミノ
基の保護基は、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）、Cl・
Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、Boc又はN
pysである。各保護基は、ペプチドの合成条件に応じ適
切なものを選択する必要がある。

保護アミノ酸の結合は、通常の縮合法、例えば、DCC
（ジシクロヘキシルカルボジイミド）法、活性エステル
法、混合あるいは対称酸無水物法、カルボニルジイミダ
ゾール法、DCC−HOBt（１−ヒドロキシシベンゾトリア
ゾール）法、ジフェニルホスホリルアジド法等に従った
行なうことができるが、DCC法、DCC−HOBt法及び対称酸
無水物法が好ましい。これらの縮合反応は、通常、ジク
ロロメタン、ジメチルホルムアミド等の有機溶媒又はそ
れらの混合溶媒中で行なわれる。α−アミノ基の保護基
の脱離試薬としては、トリフルオロ酢酸／ジクロロメタ
ン、HC1/ジオキサン、ピペリジン／ジメチルホルムアミ
ド等が用いられ、該保護基の種類により適宜選択する。
また、合成の各段階における縮合反応の進行の程度はE.
カイザーらの方法［Anal.Bicchem.,34,595（1970）］
（ニンヒドリン反応法）によって検査される。

以上のようにして、所望のアミノ酸配列を有する保護
ペプチド樹脂を得ることができる。

不溶性樹脂としてアミノメチル樹脂を用いた場合に
は、例えば適当な溶媒中においてアンモニアで処理する
ことにより該樹脂を脱離させることができる。次いで、
フッ化水素で処理することにより、前記式（II）で示さ
れる、全ての保護基が脱離したポリペプチドが得られ
る。不溶性樹脂としてベンズヒドリルアミン樹脂、メチ
ルベンズヒドリルアミン樹脂又は４−（アミノメチル）
フェノキシメチル樹脂を用いた場合には、フッ化水素で
処理することにより、該樹脂及び保護基を同時に脱離さ
せることができる。

次いで、好ましくは、２−メルカプトエタノール等で
還元することによりシステインのメルカプト基が還元型
となっていることを確実ならしめた後、酸化処理するこ
とにより目的とする前記式（Ｉ）で示される環状ポリペ
プチドをアミドとして得ることができる。

この際の酸化処理は、公知の方法を用いることがで
き、通常、大気中の酸素やフェリシアン酸塩（例えば、
フェリシアン化カリウム）のような酸化剤を用いる。

かくして得られたポリペプチドは、常套的手段、例え
ば、抽出、再結晶、各種クロマトグラフィー（ゲルろ
過、イオン交換、分配、吸着、逆相）、電気泳動、向流
分配等により単離精製することができるが、逆相高速液
体クロマトグラフィーによる方法が最も効果的である。

「図面の簡単な説明」 第１図は、本発明のポリペプチドのSDSポリアクリル
アミドゲル電気泳動の結果を示す図である。第２図及び
第３図は、LPSによるＣ因子の活性化に対する本発明の
ポリペプチドの阻害効果についての試験結果を示す図で
ある。第４図は、本発明のポリペプチドの紫外部吸収ス
ペクトルである。第５図は、マウスのリンパ球のLPS刺
激による幼若化反応に及ぼす本発明のポリペプチドの影
響を示す図である。第６図は、LPS50μg/mlを加えたと
きのリンパ球幼若化反応を示す写真である。第７図、第
８図及び第９図は、それぞれ、本発明のポリペプチド0.
2、２及び20μg/ml添加後、LPS50μg/mlを加えたときの
結果を示す写真である。第10図は、ヒト末梢血リンパ球
のLPS刺激による幼若化反応に及ぼす本発明のポリペプ
チドの影響を示す図である。

「発明を実施するための最良の形態」 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、
これらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。

実施例１ A.本発明のポリペプチドの抽出・精製 Tachypleus tridentatusの血球約50gに20mMトリス塩
酸/50mM塩化ナトリウム/pH8.0緩衝液150mlを加え、高速
ホモゲナイザー（ヒスコトロン ；日本精密工業（株）
製）で３分間ホモゲナイズした後、遠心（8000rpm,30分
間,40℃）した。このようにして分離した沈殿物につい
て、前記操作を２回繰り返し、血球内の可溶性成分を充
分に抽出して残渣を得た。

残渣に20mM塩酸150mlを加え、高速ホモゲナイザーで
３分間ホモゲナイズし、遠心後、酸性抽出液の上清を得
た。この操作を計３回繰り返し、全量約400mlの抽出液
を得た。この上清画分の凍結乾燥により濃縮乾固した。

濃縮乾固した酸性抽出物は20mM塩酸で再溶解した後、
セファデックスＧ−50（3.0×90.0cm）カラム（20mM塩
酸で予め平衡化）に添加してゲルろ過を行った。LPS
（E.coli 0111 B4株由来のものを使用）によるＣ因子
（カブトガニ血球凝固セリンプロテアーゼ前駆体；本発
明者らが名付けたLPS感受性因子,Nakamura,et al.,Eur.
J.Biochem.,154,511（1986））の活性化を阻害する溶出
画分を集め、プールした画分のpHを水酸化ナトリウム水
溶液で6.0に合わせた。

サンプルを予め20mM酢酸緩衝液（pH6.0）で平衡化し
たCM−セファロースCL−6Bカラムにかけ、溶出を０〜0.
3M塩化ナトリウムを含む20mM酢酸緩衝液（pH6.0）のグ
ラジエントで行った。Ｃ因子活性化阻害画分を集め、LP
S結合物質の最終精製標品（本発明の新規ポリペプチ
ド）とした。収量は、血球約50gから約30mgであった。

B.純度検定 （１）SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法 LPS結合ポリペプチドを還元剤（β−メルカプトエタ
ノール）の不存在下又は存在下に、8M尿素を含む12％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クーマシーブリ
リアントブルー（Cccmassie Brilliant Blue）Ｒ−250
で染色したところ、共に分子量約2000の単一バンドを示
した。結果を第１図に示す。第１図において、左側のバ
ンドは、還元剤の不存在下におけるポリペプチドを、中
央のバンドは、還元剤の存在下におけるポリペプチド
を、右側のバンドは、ミオグロビン標準蛋白質マーカー
［SDS・PAGE Marker III,Fluka AG（スイス）］による
ミオグロビン（16.9kDa）、ミオグロピンＩ＋II（14.4k
Da）、ミオグロピンＩ（8.2kDa）、ミオグロビンII（6.
2kDa）及びミオグロビンIII（2.5kDa）の位置を示す。

（２）逆相高速液体クロマトグラフィー 本発明のポリペプチドを逆相高速液体クロマトグラフ
ィー（カラムハCosmosil 5C₁₈P、ペプチドの溶出は0.1
％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル０〜98％のグラジ
エント系を使用）で分析したところ、単一ピークを示し
た。

C.アミノ酸組成値 サンプルを110℃で24、48、72時間5.7M塩酸で加水分
解した後、日立835自動アミノ酸分析計で分析した。半
シスチンについては、サンプルを過ギ酸酸化後、110℃
で24時間5.7M塩酸で加水分解し、またトリプトファンに
ついては、サンプルを3Mメルカプトエタンスルホン酸で
110℃で24時間加水分解した後、それぞれアミノ酸分析
計で分析した。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法
で得た分子量から、このペプチドは17個のアミノ酸から
構成される単純塩基性ポリペプチドであることが判明し
た。アミノ酸分析の結果を表１に示す。

D.アミノ酸配列の決定とＣ末端アルギニンアミドの同定 アミノ酸配列は、インタクトな標品約23μｇを用い、
アミノ末端よりベックマン（Beckman）890Dシークエン
サーを用いて、15残基（半シスチンを除く）まで同定で
きた。また、還元アルキル化したサンプル（本発明のポ
リペプチドをM.A.Hermodson,et al.,Biochemistry,12,3
146（1973）の方法によりＳ−ピリジルエチル化したも
の）約36μｇを用い、16残基（半シスチンを含めて）ま
で同定できた。残る17番目のアミノ酸残基（Ｃ端末残
基）はアミノ酸分析値よりアルギニンであると推定でき
た。しかし、Ｃ末端アルギニンは、インタクトな標品、
ピリジリエチル化した標品を用い、カルボキシペプチダ
ーゼ（以下［CPase」という）Ｙ及びＢで消化しても全
く検出できなかった、そこで、一旦、サンプルを30mM塩
酸で110℃で10時間緩和な条件で加水分解した後、再度C
Pase Bで処理した。その結果、本発明のポリペプチド１
モル当りアルギニン約0.5モルの遊離が認められ、Ｃ末
端のカルボキシル基は、アミド化されている可能性が強
いものと判断した。このアミド化合物の理論分子量（計
算値MW＝2264）と質量分析による実測値とが完全に一致
したことにより、Ｃ末端アルギニンのカルボキシル基は
アミド化されていることが確認された。

E.ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合の同定 本発明のポリペプチド内に４個の半シスチンが同定さ
れたが、これは全てジスルフィド結合していることが、
還元剤（ジチオスライトール）の存在下又は不存在下に
おけるＳ−ピリジルエチル化の比較実験より明らかにな
った。そこで、ジスルフィド結合の位置を同定するた
め、インタクトな標品をジスルフィド結合の交換反応が
起こらない条件下（酸性条件下、pH6.5）でトリプシン
消化を行い、消化物を前述の逆相高速液体クロマトグラ
フィー（カラムはCosmosil 5C₁₈P、ペプチドの溶出は0.
1％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル系を使用）にて
分離した。得られたペプチドのアミノ酸組成を調べたと
ころ、アミノ末端から３番目と16番目、７番目と12番目
がジスルフィド結合していることが判明した。

F.本発明のポリペプチドのLPS結合活性 本発明のポリペプチドは、0.1μg/mlのLPS（E.coil 0
111 B4株由来のものを使用）によるＣ因子の活性化
（「因子」と表す）を0.05μＭ（0.12μg/ml）で50
％、１μＭ（2.3μg/ml）で完全に阻害した。また、本
発明のポリペプチドは、１％アガロースゲルを用いた二
重拡散テストにおいて、LPSと高分子複合体を形成し、
沈降線を形成することが観察された。

LPSによるＣ因子の活性化に対する本発明のポリペプ
チドの阻害効果についての試験結果を第２図及び第３図
に示す、第２図及び第３図は、それぞれ塩化ナトリウム
不存在下又は存在下（1M）における結果を示す。対称と
して、本発明者らにより始めて明らかになったLPSと電
気的に結合する性質を示す高分子塩基性物質、ポリリジ
ンを用いた。第２図及び第３図において、（○）印及び
（●）印は、それぞれ本発明のポリペプチド及びポリリ
ジンの結果を表す。

これらの結果より、本発明の新規ポリペプチドは、LP
Sと単なる電気的な結合ではなく、塩濃度に影響を受け
ない強い親和性を有することが判る。

G.吸光度の測定 本発明のポリペプチド99.2μg/ml水溶液の紫外部吸収
スペクトルを第４図に示す。276nmに吸収ピークをも
つ。280nmにおける吸光度は0.3842であるので、１％水
溶液の280nmにおける吸光度は、38.7と算出される。

実施例２ A.アミノメチル樹脂へのアルギニンの導入 （１）４（ブロモメチル）フェニル酢酸フェナシルエス
テルの合成 室温下、アセトニトリル75ml中にα−ブロモアセトフ
ェノン3.98g（20mmol）及びフッ化カリウム3.49g（60mm
ol）を懸濁させ、撹拌下、４−（ブロモメチル）フェニ
ル酢酸4.58g（20mmol）を６等分し30分間隔で添加し、
２時間撹拌を継続した。反応終了後、不溶物をろ別し、
ろ液から溶媒を留去し、残渣を酢酸エチルに再溶解し、
飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、蒸留水、クエン
酸、蒸留水で各１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し
た。酢酸エチルを留去し、石油エーテルから結晶化し、
5.5gの目的物（融点84〜85℃）を得た。これを再結晶し
て融点85〜86℃の結晶5.2g（収率75％）を得た。

（２）４−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−トシル−Ｌ
−アルギニルオキシメチル）フェニル酢酸の合成 ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−トシル−Ｌ−アルギニ
ン4.71g（11mmol）、４−（ブロモメチル）フェニル酢
酸フェナシルエステル3.47g（10mmol）、フッ化カリウ
ム1.28g（22mmol）、水0.8ml（44mmol）、アセトニトリ
ル50ml及びジメチルホルムアミド10mlの混合物を室温下
24時間激しく撹拌した。生成する不溶物を自然ろ過し、
ろ液をエバポレートにより15〜20mlまで濃縮した。酢酸
エチル80mlを添加した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶
液で２回、蒸留水で１回、飽和クエン酸水溶液で２回、
蒸留水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した、溶媒
を留去し、残渣を石油エーテルで処理して、半固形状の
４−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−トシル−Ｌ−アル
ギニルオキシメチル）フェニル酢酸フェナシルエステル
を得た。

これを酢酸105mlに溶解し、水19ml及び亜鉛13.1gを加
え、室温下5.5時間激しく撹拌した。亜鉛をハイフロス
ーバーセル及び酢酸エチルを用いてろ別し、ろ液に酢酸
エチル400ml及び水300mlを加え、酢酸エチル層を分離
し、10回水洗し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去
し、残渣を瀬油エーテル中で摩細し、４−（ｔ−ブトキ
シカルボニル−Ｇ−トシル−Ｌ−アルギニルオキシメチ
ル）フェニル酢酸4.77gを得た。本物質は薄層クロマト
グラフィーにより１スポットのほぼ純品として得られ
た。

（３）４−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−トシル−Ｌ
−アルギニルオキシメチル）フェニルアセトアミドメチ
ル樹脂の合成 ４−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−トシル−Ｌ−ア
ルギニルオキシメチル）フェニル酢酸577mg（1.0mmo
l）、アミノメチル樹脂（株式会社ペプチド研究所販
売、１％架橋）2.00g及びDCC206mg（1.0mmol）をジクロ
ロメタン中で常法によりカップリングさせ、樹脂1g当り
0.284mmolのカップリングが確認された。

B.16位システインの導入 ４−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−トシル−Ｌ−ア
ルギニルオキシメチル）フェニルアセトアミドメチル樹
脂1.0g（0.284mmol Arg（Tos）/g樹脂）をジクロロメタ
ン25mlで４回、各々、１分洗浄し、ろ過した。得られた
樹脂に30％トリフルオロ酢酸溶液（溶媒：ジクロロメタ
ン）25mlを添加し、混合物を30％撹拌し、Boc基を脱離
させた。得られた樹脂を下記の溶媒各25mlで順次処理
し、各々の処理後にろ過した。

ジクロロメタン （１回、１分） ジオキサン （１回、１分） ジクロロメタン （１回、１分） ジオキサン （１回、１分） ジクロロメタン （２回、各２分） 10％トリエチルアミン（ジクロロメタン溶液） （１回、２分;1回、５分） ジクロロメタン （４回、各１分） 次いで、前記樹脂をジクロロメタン25ml、及び総アル
ギニン量に対して3.5当量の保護アミノ酸、即ち、Boc−
Cys（４−MeBzl）310mg（0.994mmol）とともに１分撹拌
した、得られた混合物にDCC205mg（0.994mmol）のジク
ロロメタン溶液25mlを加え、２時間撹拌した。得られた
樹脂を下記の溶媒各25mlで順次処理し、各々の処理後に
ろ過した。

ジクロロメタン （１回、１分） イソプロパノール （１回、１分） ジクロロメタン （１回、１分） イソプロパノール （１回、１分） ジクロロメタン （３回、各１分） C.15〜１位のアミノ酸の導入 Ｂと同様にして、先に得られた樹脂に、前記式（II）
で示されるポリペプチドの15位から１位までの各構成ア
ミノ酸に対応する保護アミノ酸を順次カップリングし
た。表２に各反応段階で用いた保護アミノ酸を示す。保
護アミノ酸の使用量は全て総アルギニン量に対して3.5
当量である。

なお、Boc−Arg（Toc）のカップリングはDCC−HOBt法
によりDCCに対しHOBtを２倍モル使用で行った。

１位アミノ酸の導入後、樹脂ペプチドをジクロロメタ
ンを用いてグラスフィルターに回収し、減圧乾燥して、
乾燥樹脂ペプチド1.781gを得た。

D.樹脂の脱離 Ｃで得られた乾燥樹脂ペプチドをメタノール及びメチ
ルホルムアミド中においてアンモニア（無水）で処理す
ることにより樹脂を脱離させて、 次式： Ｈ−Lys（Cl・Ｚ）−Trp−Cys（４−MeBzl）−Phe−A
rg（Tos）−Val−Cys（４−MeBzl）−Tyr（Bzl）−Arg
（Tos）−Gly−Ile−Cys（４−MeBzl）−Tyr（Bzl）−A
rg（Tos）−Arg（Tos）−Cys（４−MeBzl）−Arg（To
s）−NH₂ で示される保護ポリペプチド0.765g（0.196mmol）を得
た。

分子量:3904 E.保護基の脱離 Ｄで得られた保護ポリペプチドをアニソール中におい
てエタンジオールの存在下フッ化水素で処理して保護基
を除き、次いで陰イオン交換樹脂（Cl^-型）で処理し、
凍結乾燥して、 次式： Ｈ−Lys−Trp−Cys−Phe−Arg−Val−Cys−Tyr−Arg
−Gly−Ile−Cys−Tyr−Arg−Arg−Cys−Arg−NH₂・7HC
lで示されるポリペプチド塩酸塩470mg（0.186mmol）を
得た。

分子量:2523 F.ポリペプチドの環化 Ｅで得られたポリペプチド塩酸塩30mgを、200倍モル
過剰の２−メルカプトエタノールを含む0.1M Tris−HCl
（pH8.5）中において一夜室温で放置した。次いで、１
％酢酸で平衡化したセファデックスＧ−10カラムで処理
してポリペプチド含有画分を得た。水で10倍に希釈し
（0.1mg/ml）、0.5MNaOHでpHを8.5に調整し、室温で30
時間放置した後、凍結乾燥した。次いで、１％酢酸で平
衡化したセファデックスＧ−10カラムで処理して酸化型
ポリペプチド8.5mgを得た。

このようにして得られたポリペプチドを逆相高速液体
クロマトグラフィー（カラムはTSK−ゲル ODS−120T
（0.46×25cm）、ペプチドの溶出は0.01Mギ酸−トリエ
チルアミン（pH4.5）（Ａ）−A20％含有アセトニトリル
（Ｂ）を使用）で分析したところ、実施例１で得られた
天然のポリペプチドのピークと一致し、更に両者を混合
したものは該ピークが２倍になり、両者は同一物と認め
られた。

試験例１ 本発明のポリペプチドの生物活性 A.材料と方法 （１）LPS Ｓ型はSalmonella minnesotalll4 W、E.coli 0111:B
4、E.coli 0113、Re型はSalmonella minnesota R595、
E.coli J5の精製LPSを用いた。

（２）LPS感作赤血球 主にヒトＯ型赤血球2.5％浮遊液1mlにLPS（1mg/ml）
0.5mlを加え、3.7℃で１時間振り混ぜ、生理食塩液で洗
浄した。

（３）溶血活性 0.5％LPS感作赤血球50μ、本発明の0.5％ポリペプ
チドの２倍４系列希釈液50μ及びTris−HCl緩衝化生
理食塩液（pH7.2）100μを37℃で１時間保温後、生理
食塩2.3mlを加え、遠心分離（2500rpm、10分）し、上清
のヘモグロビン量を412nmの吸収で定量し、またマイク
ロプレート・リーダー（Corona MPT−100:商品名）を用
い、0.5％LPS感作赤血球50μと0.5％ポリペプチドの
２倍系列希釈溶液50μを37℃で１時間保温後、そのマ
イクロプレート上の溶血パターンを測定した。

（４）抗菌活性 Penassay培地又はJarvis合成培地160μに本発明の
0.5％ポリペプチドの２倍系列希釈液20μ、菌液（10⁶
−10⁷/ml）20μを加え、37℃で18時間後の濁液をマイ
クロプレート・リーダーを用いて550nmで測定し、一部
生菌数や阻止円も計測した。

（５）ゲル内沈降反応 Tris−HCl緩衝化生理食塩液（pH7.2）、pH8.6ベロナ
ール緩衝液、pH4.6酢酸塩緩衝液に溶解した１％アガロ
ース溶液（0.1％NaN₃加）中でUPSと本発明のポリペプチ
ド又は抗LPS因子（Tachypleus tridentatus血球抽出液
（ライセート）から得られるアミノ酸102残基、分子量1
1,600の塩基性蛋白質；以下「ALF」という）の間に生じ
た沈降線をアミドブラック染色した。本発明のポリペプ
チドの希釈には50mM Tris MCl−0.15M NaCl（pH7.2）を
用いた。

B.結果 （１）溶血活性 Salmonella minnesota 1114 W、R595、E. coli 0113
のどのLPSで感作した赤血球に対しても本発明のポリペ
プチドは２〜３μg/mlで溶血を起し、高濃度では室温で
も速やかに溶血し、また遊離LPSで溶血が阻害される点
はALFと同じであるが、3.13μg/ml以上では非感作赤血
球の溶血も認められた。概して本発明のポリペプチドの
溶血活性はALFより弱かった。

（２）抗菌活性 本発明のポリペプチドはSalmonella typhimurium LT
2（Ｓ）、1102（Re）、Salmonella minnesota 1114 W
（Ｓ）、R595（Re）のいずれに対しても抗菌活性を示
し、最小抗菌量はLT2に対し3.13μg/ml、1102に対し1.5
6μg/mlであった。またStaphylococcus aureusのような
グラム陽性菌にも抗菌活性を示した。含菌寒天上では濃
度に応じた阻止円を生じた。一般に、本発明のポリペプ
チドはALFより抗菌活性が強かった。

（３）ゲル内沈降反応 本発明のポリペプチドはSalmonella minnesota 1114
W、R595、E.coli 0111:B4、0113、J5のいずれのLPSに対
してもゲル内沈降反応でシャープな沈降線を生じ、異種
のLPSに対する沈降線は互いに融合した。

前述したことから、本発明のポリペプチドは、UPSに
強い親和性を示し、エンドトキシンの除去手段として有
用であり、また細菌感染症治療剤としても有用である。

試験例２ 本発明のポリペプチドのLPSによるリンパ球
幼若化反応に対する抑制作用 A.材料と方法 C57BL雄性マウス（５週齢）の脾細胞をFicoll−Hypaq
ue比重遠心法で採取し、RPMI−1640培養液（無血清又は
BSA,FCS添加）に浮遊させた。

得られた培養液を３×10⁶cell/mlに調整後、100μ
ずつ96穴マイクロタイタープレートに分注した。分注し
た培養液に、本発明のポリペプチド（LBP）0.4,4,40及
び400μg/mlを10μ添加後、培養液80μとLPS400μg
/mlを10μ加え、５％CO₂インキュベーター内で72時間
培養した。³H−チミジン（³H−TdR）は培養終了18時間
前に１μci/10μ添加し、セルハーベスターを用いて
細胞を剥離して集めた後、取り込まれた³H−TdRの量を
液体シンチレーションカウンターで測定し、細胞増殖の
指標とした。

また、その細胞増殖を倒立顕微鏡を用いて観察し、写
真撮影した。

B.結果 LPS存在下におけるLBPのマウス脾リンパ球幼若化反応
（細胞増殖反応）抑制作用について第５図に示す。図か
ら明らかなようにLBP2μg/ml及び20μg/mlでリンパ球幼
若化反応を90％以上抑制した。また、倒立顕微鏡を用い
た観察においては、LPS50μg/mlを加えて３日間培養す
ると明らかに細胞が大型化及びコロニー化（幼若化反
応）しているのが認められた（第６図）。LBPを添加し
た後にLPSを加えた場合、LBP0.2μg/mlではほとんど変
化がみられなかったが（第７図）、LBP2μg/ml及びLBP2
0μg/mlで細胞の大型化及びコロニー化がほとんどみら
れず、LPSによる幼若化反応に対して抑制作用が認めら
れた（第８図及び第９図）。

試験例３ 本発明のポリペプチドのLPSによるリンパ球
幼若化反応に対する抑制作用 A.材料と方法 健常人（男性、30才）の末梢血単核細胞（PBMC）をFi
coll−Hypaque比重遠心法で採取し、RPMI−1640培養液
（無血清又はBSA,FCS添加）に浮遊させた。得られた培
養液で２×10⁶cell/mlに調整後、100μずつ96穴マイ
クロタイタープレートに分注した。LBP200μg/mlを10μ
添加後、培養液80μとLPS400μg/mlを10μ加え、
50％CO₂インキュベーター内で72時間培養した。^３−チ
ミジン（³H−TdR）は培養終了18時間前に１μci/10μ
添加し、セルハーベスターを用いて細胞を剥離して集め
た後、取り込まれた³H−TdRの量を液体シンテレーショ
ンカウンターで測定し、細胞増殖の指標とした。

B.結果 LPS存在下におけるPBMCのリンパ球幼若化反応（細胞
増殖反応）に対するLBPの抑制作用について第10図に示
す。図から明らかのようにLBP10μg/mlでLPS50μg/mlの
リンパ球幼若化反応をほぼ100％抑制した。

以上の結果から、LBPはヒト及びマウスのLPS刺激によ
るリンパ球幼若化反応をLPS量の1/25〜1/5量でほぼ完全
に阻害することが明らかとなった。

なお、LBPとLPSとの結合活性をＣ因子活性阻害を指標
として測定するとLPS量の約20倍量となる。このことか
ら、LBPのリンパ球幼若化反応の阻害作用はLPSとの結合
性とリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞）及び単球の細胞膜上に
存在するLPSレセプターへの拮抗作用ないしはLBPの陽性
荷重による細胞膜変化がその作用を発現させたものと考
えられる。

LPSレスプターは上記細胞の他にマクロファージ、好
中球、赤血球、血小板、血管内皮細胞、肝細胞など多く
の細胞に存在し、LPSの刺激により様々な免疫反応（Ｂ
細胞幼若化、アジュバント作用、多クローン性Ｂ細胞活
性化、インターロイキン産生、インターフェロン産生、
TNF産生、その他）、炎症反応（プロスタグランジン産
生、活性酸素産生、補体活性化、その他）などが誘発さ
れることが推定される。

LBPはLPS量の1/25〜1/5量でLPSに起因する上記免疫反
応及び炎症反応を直接的あるいは間接的にほぼ完全に阻
害することが予想され、下記の疾患に対する有効性が十
分期待される物質である。

感染症（上記道感染，尿路感染，その他） 皮膚疾患（床擦れ，火傷，その他） 大腸炎（潰瘍性大腸炎，クローン病，その他） 肝疾患（肝硬変，肝不全，その他） 外科手術時における術後合併症 「産業上の利用可能性」 本発明のポリペプチドは、LPSに強い親和性を示し、
エンドトキシンの除去手段として有用であり、また細菌
感染症治療剤としても有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＣＳ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＲ ＡＤＡ ＡＣＳ ＡＤＴ ＡＣＬ ＡＤＺ ＡＤＡ Ｃ０７Ｋ 1/06 ＡＤＴ 1/14 ＡＤＺ

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次式： （式中、Lysはリジンを、Trpはトリプトファンを、Cys
   はシステインを、Pheはフェニルアラニンを、Argはアル
   ギニンを、Valはバリンを、Tyrはチロシンを、Glyはグ
   リシンを、Ileはイソロイシンを表し;Xは水酸基または
   アミノ基を表す。） で示されるポリペプチド。
2. 【請求項２】次式： Ｈ−Lys−Trp−Cys−Phe−Arg−Val−Cys−Tyr−Arg−G
   ly−Ile−Cys−Tyr−Arg−Arg−Cys−Arg−Ｘ （式中、Lysはリジンを、Trpはトリプトファンを、Cys
   はシステインを、Pheはフェニルアラニンを、Argはアル
   ギニンを、Valはバリンを、Tyrはチロシンを、Glyはグ
   リシンを、Ileはイソロイシンを表し;Xは水酸基または
   アミノ基を表す。） で示されるポリペプチド。
3. 【請求項３】Ｎ−保護アルギニンのカルボキシル基を、
   場合によりカルボキシル基と結合し得る官能基とカルボ
   キシル基とを有するスペーサーを介して、アミノ基を有
   する不溶性樹脂に結合させた後、 次式： （式中の記号は前記と同義である。） で示されるペプチド配列の16位から１位までに対応する
   保護アミノ酸を固相ペプチド合成法に従って順次、不溶
   性樹脂に結合したアルギニンに結合させ、保護ポリペプ
   チドを得、次いで、該不溶性樹脂およびアミノ酸の保護
   基を脱離させて、次式（II）： （式中の記号は前記と同義である。） で示されるポリペプチドを得、その３位と16位、および
   ７位と12位のシステインをそれぞれのメルカプト基を介
   して結合させ、ジスルフィド結合を形成させることを特
   徴とする 次式： （式中、Ｘは水酸基またはアミノ基を表し、他の記号は
   前記と同義である） で示されるポリペプチドの製造法。
4. 【請求項４】カブトガニ血球を低張抽出し、低張抽出後
   の残渣を酸性条件下で再抽出し、当該再抽出液中の物質
   を精製することを特徴とする、リポ多糖親和性ポリペプ
   チドの製造法。
5. 【請求項５】カブトガニ血球を低張抽出し、低張抽出後
   の残渣を酸性条件下で再抽出し、当該再抽出液中の物質
   を精製することを特徴とする、グラム陽性菌およびグラ
   ム陰性菌に抗菌活性を有するリポ多糖親和性ポリペプチ
   ドの製造法。
6. 【請求項６】カブトガニ血球を低張抽出し、低張抽出後
   の残渣を酸性条件下で再抽出し、当該再抽出液中の物質
   を精製することを特徴とする、分子量約2000のリポ多糖
   親和性ポリペプチドの製造法。
7. 【請求項７】カブトガニが、Tachypleus tridentatusお
   よびTachypleus gigasの少なくとも１つである、請求項
   ４〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造法。