NO175372B

NO175372B - Analogifremgangsmåte for framstilling av et terapeutisk aktivt polypeptid

Info

Publication number: NO175372B
Application number: NO891572A
Authority: NO
Inventors: Takanori Nakamura; Sadaaki Iwanaga; Motonori Ohno; Kyosuke Miyazaki
Original assignee: Seikagaku Kogyo Co Ltd
Priority date: 1987-08-21
Filing date: 1989-04-18
Publication date: 1994-06-27
Also published as: EP0343248B1; DE3880481D1; NO175372C; ATE88480T1; DK193589A; NO940078L; EP0343248A1; DK193589D0; CN1031193C; US5416194A; WO1989001492A1; CN1031379A; JP2710653B2; FI92708C; AU642089B2; CA1337781C; NO940078D0; DE3880481T2; NO891572L; AU620345B2

Description

Oppfinnelsen angår en analogiframgangsmåte for framstilling av et terapeutisk aktivt polypeptid som angitt i den innledende del av patentkravet.

Bakgrunn.

Endotoksin er også kalt et intracellulært toksin, hvilken betegnelse i videste forstand viser til toksiske forbindelser som eksisterer i cellene i gram-negative bakterier. Bestanddelene i endotoksin er lipopolysakkarider (nedenfor kalt "LPS").

I kjent teknikk er pyrolyse, ultrafiltrering og affinitetskromatografi med polymixin B kjente framgangsmåter for fjerning av endotoksin.

Imidlertid er pyrolyse en framgangsmåte som termisk dekomponerer LPS ved en tørr varmebehandling ved 250°C eller høyere for å fjerne LPS fra glasskår, etc. ved dekomponering. Denne pyrolysemetoden kan ikke brukes for å separere LPS fra en substans som er ustabil overfor varme. Ultrafiltreirngsmetoden er effektiv for separering av LPS fra stoffer med lav molvekt, men er i prinsippet ikke anvendbar for separering av endotoksin fra stoffer med høy molvekt. Affinitetskromatografi-metoden med polymixin B kan forventes å kunne anvendes i praksis ved å utnytte affiniteten til polymixin B overfor LPS, men bruken er begrenset på grunn av toksisiteten av polymixin B, og således har denne metoden fram til i dag ikke fått noen praktisk anvendelse.

Formål.

Formålet med oppfinnelsen er følgelig å anvise en analogiframgangsmåte for framstilling av et terapeutisk aktivt polypeptid med affinitet overfor lipopolysakkarider.

Oppfinnelsen.

Dette formål oppnås med en analogiframgangsmåte ifølge den karakteriserende del av patentkravet.

Følgelig har oppfinnerne forsket intensivt for å finne nye substanser som oppviser affinitet overfor LPS. I den foreliggende oppfinnelsen kalles denne forbindelsen LPS-bindende polypeptid (ofte forkortet til LBP). Følgelig har de lykkes i å syntetiserte dette polypeptidet ved syntetiseringsframgangsmåten slik som faststoff peptidsyntese, og fant videre at nevnte polypeptid framviser sterk affinitet overfor LPS og har biologiske effekter slik som antibakteriell aktivitet og inhiberende virkning på blastgenesis, etc, for således å ha kommet fram til den foreliggende oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelsen angår en analogiframgangsmåte for framstilling av et polypeptid angitt ved formelen:

hvor Lys angir lysin, Trp tryptophan, Cys cystein, Phe fenylalanin, Arg arginin, Val valin, Tyr tyrosin, Gly glycin, Ile isoleucin og X en hydroksylgruppe eller en aminogruppe.

Forbindelsen framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen er et polypeptid bestående av 17 aminosyrer, hvori karboksylgruppen i arginin, som er aminosyren i C-enden, amideres under ekstraksjons- eller isolasjonsbetingelsene. Selv når dette polypeptidet konverteres til en syre ved hydrolyse, forblir affiniteten overfor LPS høy.

Polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan framstilles ved de syntetiske framgangsmåtene slik som peptid-syntese, f.eks. faststoff-peptid-syntese, flytende fase peptid-syntese, etc.

Nærmere bestemt, f.eks., i faststoff-syntesen, etter at karboksylgruppen i N-beskyttet arginin er bundet til en uløselig harpiks med aminogrupper, noen ganger over en avstands-forbindelse med både karboksylgrupper og en funksjonell gruppe med evne til å binde seg til en karboksylgruppe, bindes de beskyttede aminosyrene tilsvarende 16- til 1-posisjonene i peptidsekvensen representert ved formelen: (hvor symbolene er de samme som definert ovenfor) til argininet som er bundet til den uløselige harpiksen, i rekkefølge ifølge faststoff-peptid-syntesen for å oppnå et beskyttet polypeptid, hvor nevnte uløselige harpiks og de beskyttende gruppene til disse aminosyrene elimineres for å oppnå et polypeptid angitt ved formelen (II):

hvor symbolene er de samme som definert ovenfor og cysteinene i 3- og 16-posisjonene og 7- og 12- posisjonene er bundet til hverandre over de respektive merkapto-gruppene for å danne disulfidbindinger, hvormed polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan framstilles.

Enhver harpiks som kan bindes til karboksylgruppen i N-beskyttet arginin (eller i noen tilfeller karboksylgruppen i avstandforbindelsen bundet dertil) og som deretter kan elimineres, kan brukes som den uløselige harpiksen med aminogrupper.

Eksempler på slike uløselige harpikser er aminometylharpiks {aminometyl-poly(styren-CO-divinylbenzen)}, benzhydrylaminharpiks,

metylbenzhydrylaminharpiks, 4-(aminometyl)fenoksymetylharpiks. Ved bruk av benzhydrylaminharpiks, metylbenzhydrylaminharpiks og 4-(aminometyl)fenoksymetylharpiks, kan et amid oppnås direkte ved splitting, men aminometylharpiks foretrekkes med hensyn til utbyttet.

Avstandsforbindelsen som har både en karboksylgruppe, som eksisterer i tilfellet ovenfor, og en funksjonell gruppe med evne til å danne en binding til en karboksylgruppe bør være en som er i stand til å konvertere karboksylgruppen i arginin til p-karboksy-metylbenzyl-ester, og valget av avstandsforbindelse er ikke særlig begrenset.

4-(t-butoksykarbonyl-G-tosy 1-L-arginyloksymetyl) fenyl-edikksyre omfattende en slik avstandsforbindelse bundet til det beskyttede argininet kan framstilles ifølge framgangsmåten til J.P. Tam et al ("Synthesis" (1979), side 955-957).

En beskyttet aminosyre er en aminosyre med en funksjonell gruppe beskyttet med en beskyttende gruppe ved en kjent fremgangsmåte, og forskjellige beskyttede aminosyrer er kommersielt tilgjengelige. Ved syntetisering av polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen, bør fortrinnsvis en av de beskyttende gruppene vist nedenfor velges. Først er den beskyttende gruppen for alfa-aminogruppen i en aminosyre Boe (t-butyloksykarbonyl) eller Fmoc (9- fluorenylmetyloksykarbonyl). Den beskyttende gruppen for guanidino gruppen i Arg kan inkludere Tos (tosyl), N02(nitro), eller Mtr (4-metoksy-2,3,6- trimetylbenzensulfonyl). Den beskyttende gruppen for en merkaptogruppe i Cys kan inkludere Bzl (benzyl), M-Bzl(4-metoksybenzyl), 4-MeBzl (4-metylbenzyl), Acm (acetamidmetyl), Trt (trityl), Npys (3-nitropyridinsulfenyl), t-Bu (t-butyl), eller t-BuS (t-butylmerkapto). Blant disse foretrekkes 4-MeBzl, Acm og Npys. Den beskyttende gruppen for hydroksylgruppen i Tyr kan være Bzl, Cl2Bzl(2,6-diklorbenzyl), t-Bu, eller denne hydroksylgruppen kan være ubeskyttet. Den beskyttende gruppen for en aminogruppe i Lys kan inkludere Z (benzyloksykarbonyl), C1Z (2-klorbenzyloksykarbonyl), Boe, eller Nyps. Det er nødvendig å velge en passende gruppe for hver beskyttende gruppe avhengig av syntesebetingelsene for peptidet.

Den beskyttende gruppen kan være bundet ifølge en konvensjonell kondensasjonsmetode, slik som DCC (disykloheksylkarbodiimid)-metoden, aktiv ester-framgangsmåten, blandet eller symmetrisk syreanhydird-metoden, karbonyldiimidasol-metoden, DCC-HOBt (1- hydroksybenzotriasol)-metoden, difenylfosforylazid-metoden, etc, men DCC-metoden, DCC-HOBt-metoden og den symmetriske syreavhydird-metoden foretrekkes. Disse kondensasjonsreaksjonene utføres vanligvis i et organisk løsningsmiddel slik som diklorometan, dimetylformamid, etc. eller en løsningsmiddel-blanding derav. Trifluoredikksyre/diklorometan, HCl/dioxan, piperidin/dimetylformamid, etc. brukes som det eliminerende reagenset for den beskyttende gruppen for en alfa-aminogruppe. Passende valg avhenger av hvilken beskyttende gruppe som brukes. Graden av kondensasjonsreaksjon i de respektive trinn i syntesen granskes ved framgangsmåten til E. Kaiser et al. (Anal.Biochem. 34, 595 (1970) (ninhydrin-reakj sonsmetoden).

En beskyttet peptidharpiks med en ønsket aminosyresekvens kan oppnås som beskrevet ovenfor.

Når en aminometylharpiks brukes som den uløselige harpiksen, f.eks. ved å behandle harpiksen med amoniakk i et passende løsningsmiddel, kan harpiksen elimineres. Ved deretter å behandle harpiksen med hydrogenfluorid, kan polypeptidet med alle de beskyttende gruppene fjernet, angitt ved formelen (II) ovenfor oppnås. Når benzhydrylaminharpiks, metylbenzhydrylaminharpiks eller 4-(aminometyl)fenoksymetylharpiks benyttes som den uløselige harpiks, kan harpiksen og den beskyttende gruppen elimineres samtidig ved behandling med hydrogenfluorid.

Deretter, ved reduksjon, fortrinnsvis med 2-merkapto-etanol for å forsikre at merkaptogruppen i cystein er i redusert form, utføres oksidasjonsbehandling for å gi det ønskede sykliske polypeptidet med formelen (I) som amidet.

Oksidasjonsbehandlingen i dette tilfellet kan utføres ifølge kjente framgangsmåter, og vanligvis brukes et oksidasjonsmiddel, slik som oksygen i luften, eller jernholdig cyanat (f.eks. kalium-ferrocyanat).

Polypeptidet således oppnådd kan renses ved konvensjonelle midler slik som ekstraksjon, rekrystallisering, forskjellige typer kromatografi (gelfiltrering, ionebytting, ionedeling, adsorbsjon, motfase), elektroforese, motstrøms ionedeling, etc., men framgangsmåten med motfase-kromatografi med høy ytelse er den mest effektive.

Kortfattet beskrivelse av tegningene

Fig. 1 er et diagram som viser resultatene fra en SDS-polyakrylamidgel-elektroforese av polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Fig. 2 og fig. 3 er diagram som viser testresultatene angående den inhiberende effekt av polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen mot aktivering av C-faktor av LPS. Fig. 4 er et spektrum for absorbsjon av UV-stråler for polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Fig. 5 viser effekten av polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen mot blastogenese av lymfocytt fra mus som følge av LPS-stimulering. Fig. 6 er et mikrofotografi som viser blastogenese av lymfocytt når 50 /xg/ml LPS tilsettes. Fig. 7, fig. 8 og fig. 9 er mikrofotografier til hvilke, etter 0,2, 2 og 20 /xg/ml polypeptid framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen hver er tilsatt henholdsvis 50 Mg/ml LPS. Fig. 10 er et diagram som viser effekten av polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen mot blastogenese av menneskelig perifer lymfocytt som følge av LPS-stimulering.

Den foreliggende oppfinnelsen er beskrevet i nærmere detalj med henvisning til eksemplene.

Eksempel.

A. Introduksjon av arginin i aminoetylharpiks

(1) Syntese av fenacylester av 4-(brommetyl)phenyl-edikksyre.

I 75 ml acetonitril ble det suspendert 3,98 g (20 mmol) a-bromacetofenon og 3,49 g (60 mmol) kaliumfluorid ved romtemperatur. 4,58 g (20 mmol) 4-(brommetyl)-phenyl-edikksyre ble delt i 6 like deler, så ble de enkelte deler tilsatt suspensjonen under omrøring med 30 min. mellomrom, og omrøringen ble fortsatt i ytterligere 2 timer. Etter at reaksjonen hadde gått til endes, ble uløselige produkter filtrert fra og løsningmidler ble destillert av fra filtratet. Residuet ble gjennoppløst i etylacetat og vasket med vandig mettet natriumhydrogen-karbonatoppløsning 2 ganger og deretter vasket med destillert vann, sitronsyre og destillert vann hver en gang, etterfulgt av tørking med natriumsulfat. Etylacetat ble destillert av og krystallisering ble utført i petroleter for å gi 5,5 gram av det ønskede produkt (smeltepunkt: 84 til 85°C). Produktet ble rekrystallisert for å gi 5,2 gram krystaller med et smeltepunkt fra 85 til 86°C (utbytte: 75%).

(2) Syntese av 4-(t-butoksykarbonyl-G-tosyl-L-arginyloksy-metyl)fenyl-edikksyre

En blanding av 4,71 gram (11 mmol) av t-butoksykarbonyl-G-tosyl-L-arginin, 3,47 gram (10 mmol) fenacylester av 4-brommetylfenyl-edikksyre, 1,28 gram (22 mmol) kaliumfluorid, 0,8 ml (44 mmol) vann, 50 ml acetonitril og 10 ml dimetylformamid ble kraftig omrørt ved romtemperatur i 24 timer. Det resulterende uløselige produktet ble filtrert naturlig og filtratet ble konsentrert til 15 til 20 ml ved fordamping. Etter tilsetning av 80 ml etylacetat dertil, ble konsentratet vasket med vandig mettet natriumhydrogenkarbonatoppløsning 2 ganger, destillert vann 1 gang, vandig mettet sitronsyre oppløsning 2 ganger og destillert vann 1 gang, etterfulgt av tørking med natriumsulfat. Løsningsmidlet ble destillert av og residuet ble behandlet med petroleter for å gi fenacylester av 4-(t-butoksykarbonyl-G-tosyl-L-arginyloksymetyl)fenyl-edikksyre i halvfast tilstand. Den ble oppløst i 105 ml edikksyre, og så ble det tilsatt 19 ml vann og 13,1 gram sink dertil, etterfulgt av kraftig omrøring ved romtemperatur i 5,5 timer. Sink ble filtrert fra ved bruk av en Hyflo Super Cel og etylacetat, og filtratet ble tilsatt 400 ml etylacetat og 300 ml vann. En etylacetat-fase ble fraskilt og vasket med vann 10 ganger. Etter tørking med natriumsulfat ble løsningsmidlet destillert av og residuet ble gnidd ut i petroleter for å gi 4,77 gram 4-(t-butoksykarbonyl-G-tosyl-L-arginyloksymetyl)fenyl-edikksyre. Denne substansen ble oppnådd som nesten rent produkt på en flekk ved bruk av tynnsjiktskromatografi. (3) Syntese av 4-(t-butoksykarbonyl-G-tosyl-L-arginyloksymetyl)fenyl-acetamid-metylharpiks.

577 mg (1,0 mmol) 4-(t-butoksykarbonyl-G-tosyl-L-arginyloksymetyl)fenyl-edikksyre, 2,00 gram aminometylharpiks (tilgjengelig fra Peptide Laboratory K.K.; 1% kryssbundet) og 206 mg (1,0 mmol) DCC ble underkastet en koblingsreaksjon i diklorometan ved en konvensjonell framgangsmåte. Det ble oppnådd kobling av 0,284 mmol pr. 1 gram av harpiksen.

B. Introduksjon av cystein i posisjon 16.

En mengde av 1,0 g (0,284 mmol Arg (Tos)/g harpiks) av 4-(t-butoksykarbonyl-G-tosyl-L-alginyloksy-metyl) fenylacetamidometyl-harpiks ble vasket med 25 ml diklorometan 4 ganger, hver gang i 1 min., og filtrert. Til den resulterende harpiksen ble det tilsatt 25 ml 30% trifiuor-edikksyre oppløsning (løsningsmiddel: diklorometan) og blandingen ble omrørt i 30 min., etterfulgt av eliminering av en Boc-gruppe. Den resulterende harpiksen ble suksessivt behandlet med 25 ml av hver av de følgende løsningmidler, fulgt av filtrering etter hver behandling.

Deretter ble harpiksen ovenfor omrørt med 25 ml diklormetan og 3,5 ekvivalente mengder av beskyttet aminosyre i forhold til total mengde arginin, nemlig 310 mg (0,994 mmol) av Boc-Cys(4-MeBzl) i 1 min. Til den resulterende blandingen ble det tilsatt 25 ml diklormetanoppløsning inneholdende 205 mg (0,994 mmol DCC og blandingen ble omrørt i 2 timer. Den resulterende harpiksen ble suksessivt behandlet med 25 ml av hvert av følgende løsningsmidler etterfulgt av filtrering etter hver behandling.

C. Introduksjon av aminosyre i posisjonene 15 og 1.

Til harpiksen fremstilt på samme måte som i punkt B, ble de beskyttede aminosyrer tilsvarende de respektive aminosyrebestanddelene i posisjonenen 15 og 1 i polypeptidet koblet i 2 påfølgende trinn. De beskyttede aminosyrene som ble brukt i de respektive reaksjonstrinn er vist i tabell 2. Det ble brukt 3,5 ekvivalente mengder av alle de beskyttede aminosyrer i forhold til den totale mengde arginin. Koblingsreaksjonen for Boc-Arg (Tos) ble utført ifølge DCC-HOBt-metoden ved å bruke HOBt i dobbel mengde i forhold til DCC.

Etter introduksjonen av aminosyren i posisjon 1, ble det harpikslignende peptidet gjenvunnet og samlet opp i et glassfilter ved bruk av diklormetan og deretter tørket under redusert trykk for å gi 1,781 g av tørt harpiksholdig peptid.

D. Eliminering av harpiks

Det tørre harpiksholdige peptidet fremstilt under C ble behandlet med amoniakk (uten vann) i metanol og dimetylformamid for å eliminere harpiksen. Utbyttet av det således fremstilte beskyttede polypeptid angitt ved formelen: H-Lys(Cl-Z)-Trp-Cys(4-MeBzl)-Phe-Arg(Tos)-Val-Cys(4-MeBzl)-Tyr(Bzl)-Arg(Tos)-Gly-Ile-Cys(4-MeBzl)-Tyr(Bzl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)

- NH2

var 0,765 g (0,196 mmol). Molvekten var 3904.

E. Eliminering av den beskyttende gruppe

Det beskyttede polypeptid fremstilt i punkt D ble behandlet med hydrogenfluorid i anisol i nærvær av etandithiol for å fjerne den beskyttende gruppe, og deretter behandlet med anionbytte-harpiks (Cl type) og lyofilisert for å gi 470 mg (0,186 mmol) polypeptid-hydroklorid angitt ved følgende formel:

Molvekten var 2,523.

F. Syklisering av polypeptid.

En mengde på 30 mg av polypeptid-hydrokloridet framstilt under punkt E ble hensatt i 0,1 M Tris-HCL (pH 8,5) inneholdende 200 ganger mol-overskudd av 2-merkaptoetanol ved romtemperatur i en natt. Deretter ble den behandlet i en Sephadex G-10 kolonne preparert med 1% edikksyre for å gi den polypeptid-inneholdende fraksjonen. Fraksjonen ble fortynnet 10 ganger (0,1 mg/ml) med vann, pH-justert til 8,5 med 0,5M NaOH og hensatt ved romtemperatur i 30 timer, etterfulgt av lyofilisering. Deretter ble den behandlet i en Sephadex G-10 kolonne preparert med 1% edikksyre for å gi 8,5 mg surgjort polypeptid.

Det således fremstilte polypeptid ble analysert med motfase-væskekromatografi med høy yteevne (kolonnen var TSK-gel ODS-120T (0,46 x 25 cm), utvasking av peptidet ble utført ved bruk av (A) 0,01 M maursyre-tiretylamin (pH 4,5) - (B)

acetonitril inneholdende 20% av (A)).

Eksperimentelt eksempel 1

(biologisk aktivitet av polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen)

A. Utgangsmateriale og framgangsmåte

(1) LPS

Rensede LPS'er hvis S-type var salmonella minesota 1114 W, E. koli 0,111:B4, E.koli 0113 og Re-type var Salmonella minnesota R595, E. koli J5, ble brukt.

(2) LPS-erytrocyt sensitivisert med LPS

Til 1 ml suspensjon inneholdende hovedsakelig 2,5% human erytrocyt type O ble det tilsatt 0,5 ml LPS (lmg/ml) og blandingen ble ristet ved 3,7°C i 1 time for å blandes, etterfulgt av vasking med en saltoppløsning.

(3) Hemolyse-aktivitet

En blanding av 50 fil av 0,5 % LPS sensitivisert erytrocyt, 50 fil av en oppløsning av 0,5% polypeptid framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen fortynnet 2 ganger og 100 fil av Tris-HCl bufret saltoppløsning (pH 7,2) ble bibeholdt ved 37°C i 1 time og deretter ble det tilsatt 2,3 ml av fysiologisk saltoppløsning, etterfulgt av sentrifugering ved 2500 opm i 10 min. Mengden hemoglobin i supernatanten ble bestemt ved bruk av absorbsjon ved 412 fim. Hemolysemønsteret på en mikroplate ble også bestemt ved bruk av en mikroplate-avleser (Corona MPT-100: handelsnavn) etter at en blanding av 50 fil 0,5% LPS sensitivisert erytrocyt og 50 fd av en 0,5% polypeptidoppløsning fortynnet 2 ganger var holdt ved 37 °C i 1 time.

(4) Antibakteriell aktivitet.

20 fd av en 0,5% oppløsning av polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen fortynnet 2 ganger og 20 fd av en bakterieoppløsning (IO<6> til 10<7>/ml) ble dyrket på 160 fil kultiveringsmedium fra Penassay eller et syntetisk medium fra Jarvis. Etter 18 timer ved 37°C, ble dets grumsethet målt ved bruk av en mikroplate-avleser ved 550 nm og også antall delvis levende bakterier og inhiberingssirkel ble målt.

(5) Gel-utfellingsreaksjon

I en oppløsning av 1 % agarose (0,1 % NaN3 var tilsatt) oppløst i Tris-HCl bufret saltoppløsning med pH 7,2, Beronall-buffer med pH 8,6 og acetatbuffer med pH 4,6, ble det formet en sedimenteringslinje mellom LPS og polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen eller anti-LPS faktor (basisk protein med molvekt på 11600, bestående av aminosyre 102 -rest oppnådd fra ekstrakt (lysat) av Tachypleus tridentatus hemocyt; nedenfor angitt som "ALF"). Linjen var farget med amid-svart. Fortynningsmidlet brukt for polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen var 50 mM Tris-HCl - 0,15 M NaCl (Ph 7,2).

B. Resultater

(1) Hemolyse aktivitet

Polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen framviste hemolyse ved

2 til 3 fig/ ml for erytrocyt sensitivisert av enhver LPS fra salmonella minnesota 1114 W, R595 og E. koli 0113 og, ved høy konsentrasjon, framviste med letthet hemolyse selv ved romtemperatur. Selv om hemolyse var inhibert ved en fri LPS som på

lignende måte inhiberer ALF, ble hemolyse av ikke-sensitivisert erytrocyt observert i en mengde av 3,13 [ igl'ml eller mer. Generelt var hemolyseaktiviteten til polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen svakere enn den til ALF.

(2) Antibakteriell aktivitet

Polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende opprinnelsen framviste antibakteriell aktivitet for enhver av Salmonella typhimurium LT 2(S), 1102(Re), Salmonella minnesota 1114 W(S) og R 595(Re). En minimal antibakteriell dose var 3,13 /tg/ml for LT2 og 1,56 /ig/ml for 1102. Videre framviste den antibakteriell aktivitet selv overfor gram-positive bakterier slik som Staphylococcus aureus. På en agar inneholdende bakterier var inhiberingssirkelen dannet avhengig av konsentrasjonen. Den antibakterielle aktiviteten til polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende

oppfinnelsen var generelt sterkere enn den til ALF.

(3) Gel-utfellingsreaksjon

Polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen framviste skarpe sedimentasjonslinjer i gel-utfellingsreaksjonen for enhver LPS fra Samonella minnesota 1114 W, R595, E. koli 0111:B4, 0113 og J5. Sedimentasjonslinjer for heterogene LPS fløt sammen med hverandre.

Fra det ovenforstående fremgår det at polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen framviser sterk affinitet overfor LPS og er egnet som et middel for å fjerne endotoksin og som et terapeutisk middel for behandling av infeksjoner fra mikroorganismer.

Eksperiment 2 (Inhiberende effekt av polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende

oppfinnelsen mot blastogenese av lymfocyt av LPS)

A. Materiale og framgangsmåte

Celler fra milten (SC) fra C57BL hannmus (5 uker gamle) ble samlet opp ved bruk av Ficoll-Hypaque gravitasjons-sentrifugering og suspendert i RPMI-1640 kultiverings- medium (uten serum eller tilsatt BSA, FCS). Det resulterende kultiveringsmediet ble justert til 3 x IO6 celler/ml og 100 ^1 ble fordelt i hver av de 96 hullene i en "microtiter" plate. 10 ^1 hver av 0,4, 4, 40 og 400 /xg/ml polypeptid framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen (LBP), deretter 80 fil av kultiveringsmediet, og til slutt 10 /il av 400 ug/ml LPS ble tilsatt til det fordelte kultiveringsmediet, etterfulgt av inkubasjon i en inkubator med 5%C02i 72 timer. <3>H-tymidin (<3>H-TdR) ble tilsatt dertil i en mengde på 1 uci/10 /il 18 timer før utløpet av inkubasjonstiden. Mengden av <3>H-TdR samlet opp etter avtrekking av celler ved bruk av en cellehøster ble målt ved bruk av en flytende skintillasjonsteller for å avdekke faktoren for cellemultiplikasjon.

Cellemultiplikasjon ble observert ved bruk av et mikroskop for å ta et omvendt avbildende mikrofotografi.

B. Resultater

Fig. 5 viser inhiberingsvirkningen av LBP mot blastogenese av musemilt SC (cellemultiplikasjonsreaksjon) i nærvær av LPS. Som det klart fremgår fra tegningen, inhiberer 2 ug/ ml og 20 /ig/ml av LBP 90% eller mer av blastogenese av lymfocyt. Videre, ved å observere gjennom et mikroskop som gir et invertert bilde, ble forstørring og kolonisering (blastogenese) åpenbart avdekket etter tilsats av 50 /ig/ml LPS og påfølgende inkubasjon i tre dager (fig. 6). Selv om få forandringer ble avslørt i tilfelle hvor LPS ble tilsatt etter tilsetning av 0,2 /ig/ml LBP (Fig. 7), ble forstørrelse og kolonisering knapt avdekket i tilfellet med bruk av 2 ug/ ml LBP og 20 /ig/ml LBP for å framvise inhiberingsvirkning mot blastogenese av LPS (fig. 8 og fig. 9).

Eksperiment 3. (Inhiberende virkning av polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen mot blastogenese av lymfocyt fra

LPS)

A. Materialer og framgangsmåte

Enkjernete periferal blodceller (PBNC) fra friske mennesker (mann, 30 år gammel) ble samlet opp ved hjelp av Ficoll-Hypaque gravitasjonssentrifugering og suspendert i RPMI-1640 kultiveringsmedium (uten serum eller tilsetning av BSA, FCS). Det resulterende kultiveringsmediet ble justert til 2xl0<6> celler/ml og 100 /il ble fordelt i hver av de 96 hullene i en "microtiter" plate. 10 /il av 200 /tg/ml LBP, deretter 80 /il av kultiveringsmediet, og til slutt 10 /il av 400 /ig/ml LPS ble tilsatt til det fordelte kultiveringsmediet, etterfulgt av inkubasjon i en inkubator i 5% C02 i 72 timer. <3>H-tymidin ^H-TdR) ble tilsatt dertil i en mengde på 1 uci/10 /il 18 timer før fullføring av inkuberingen. Mengden av <3>H-TdR oppsamlet etter avtrekking av celler ved bruk av en cellehøster ble målt ved bruk av en flytende skintillasjonsteller for å avdekke faktoren for cellemultiplikasjon.

B. Resultater

Fig. 10 viser inhiberingsvirkningen av LBP mot blastogenese av PBMC (celle multiplikasjonsreaksjon) i nærvær av LPS. Som det klart fremgår fra tegningen, inhiberer 10 /tg/ml med LBP omtrent 100% blastogenese av lymfocyten fra 50 /ig/ml

LPS.

Fra de ovenfor angitte resultater fremgår det at LBP kan omtrent fullstendig inhibere blastogenese av lymfosytt fra menneske og mus på grunn av LPS-stimulering i en mengde på 1/25 til 1/5 på basis av mengden av LPS.

Bindingsaktiviteten mellom LBP og LPS ble målt ved bruk av C-faktor aktivitetsinhiberingen som en indeks for å vise omtrent 20 ganger mengden av LPS mengde. Følgelig anses inhiberingsvirkningen av LBP mot blastogenese av lymfosyt å være avdekket ved bindingsevnen med LPS, og antagonisme med en LPS reseptor eksisterende på cellemembranen av lymfocyten (T celle, B celle) og monocyt eller cellemembranens modifikasjon på grunn av positiv ladning av LBP.

En LPS-reseptor eksisterer i forskjellige celler, andre en cellene nevnt ovenfor, makrofag, nøytrofile, erytrocyt, trombocyt, blodkar, endotelialceller, hepatocyt, etc, og det antas at stimulering med LPS forårsaker forskjellige immunreaksjoner slik som B-celle-blastogenese, hjelpe-effekt, polyklonal B-celle-aktivering, interlaukin-produksjon, interferon-produksjon, TNF produksjon, etc; inflammasjon, slik som prostaglandin-produksjon, produksjon av aktivt oksygen, komplement-aktivering, etc.

Det er forventet at LBP direkte eller indirekte nesten fullstendig kan inhibere de ovennevnte immunreaksjoner og inflammasjon forårsaket av LPS i et mengdeforhold fra 1/25 til 1/5 i forhold til LPS mengden. Følgelig kan polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen forventes å være effektive mot følgende sykdommer: infeksjoner slik som luftveis-infeksjon, enhets-infeksjon, etc, hudsykdommer slik som liggesår, forbrenning eller skolding, etc, kolitt slik som verkende kolitt, klonisk sykdom, etc, hepatopati slik som cirrhose, leversvikt, etc, og postoperative komplikasjoner i kirurgi.

Mulighet for industriell anvendelse

Polypeptidet framstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen framviser sterk affinitet overfor lipopolysakkarid, og er egnet for å fjerne endotoxin og som et terapeutisk middel mot bakterieinfeksjoner.

Claims

1. Analogiframgangsmåte for framstilling av et terapeutisk aktivt polypeptid angitt ved formelen:

hvor Lys angir lysin, Trp tryptofan, Cys cystein, Phe fenylalanin, Arg arginin, Val valin, Tyr tyrosin, Gly glysin, Ile isoleusin og X en hydroksylgruppe eller en aminogruppe,

karakterisert ved at

en karboksylgruppe i N-beskyttet arginin bindes med en uløselig harpiks inneholdende aminogrupper, noen ganger over en avstandsforbindelse med både en karboksylgruppe og en funksjonell gruppe med evne til å danne binding med en karboksylgruppe;

de beskyttede aminosyrene tilsvarende 16-posisjonen til 1-posisjonen i peptidsekvens angitt ved følgende formel:

(hvor symbolene er de samme som definert ovenfor) bindes til argininet som ble bundet til den uløselige harpiksen, i rekkefølge i samsvar med en peptid-syntese-metode i fast fase for å framskaffe det beskyttede polypeptid;

den uløselige harpiksen og de beskyttende gruppene i disse aminosyrene elimineres for å framskaffe et polypeptid angitt med formelen (II):

hvor symbolene er de samme som definert ovenfor; og cystein i 3- og 16-posisjonene og 7- og 12-posisjonene bindes til hverandre over de respektive merkaptogrupper for dannelse av disulfidbindinger.