CN117603302A - 一种peg偶联树枝状分支抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种PEG偶联树枝状分支抗菌肽制备方法和应用，属于生物技术领域，抗菌肽PEG1000‑K3包括两个Lys、三组α‑螺旋结构的七肽基团以及PEG大分子，所述的七肽基团的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明通过PEG偶联显著提高了多肽的血清稳定性，同时抑制了抗菌肽的毒性。并进一步公开了抗菌肽PEG1000‑K3在制备治疗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用，抗菌肽PEG1000‑K3的血清稳定性更高。综上所述，本发明的PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000‑K3有潜力成为治疗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌感染的广谱抗菌药物，并有很高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3制备方法和应用。
背景技术
抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)已被证实作为传统抗生素的理想替代物有着来源广泛、安全且无残留、作用迅速、不易受到细菌耐药机制影响等优点。但天然抗菌肽在畜牧业的生产应用中，仍然存在着一定的局限性，这其中包括：易被血清和胃肠道蛋白酶降解、对宿主细胞的非特异性毒性、在生理pH和盐浓度下活性的降低。近年来，为了克服天然抗菌肽的一些限制，抗菌肽与其他生物分子偶联被广泛认为是一种有效的策略。因此，需要一种抗菌肽与其他生物分子偶联的多肽来提高生物相容性和稳定性。
发明内容
鉴于以上背景技术的不足之处，本发明的目的是提供一种PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3，解决现有的天然抗菌肽存在的生物相容性差，稳定性差的问题，抑制了抗菌肽的毒性。
本发明所采用的技术方案如下：一种PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3，包括两个Lys、三组α-螺旋结构的七肽基团以及分子量1000的聚乙二醇，所述的七肽基团的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，第一组七肽基团的第7位的Arg的C端与第一个Lys的ε-N端相连，第二组七肽基团的第7位的Arg的C端与第二个Lys的ε-N端相连，第三组七肽基团的第1位的Leu的N端与第二个Lys的C端相连，第一个Lys的C端与第二个Lys的α-N端以酰胺键相连，在第一个Lys的α-N端与一个Cys相连，并将聚乙二醇偶联在所述的Cys上；所述的抗菌肽PEG1000-K3的C端采用氨基酰胺化。
进一步的，如上所述的一种PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3，其分子式如式(I)所示，
本发明的另一目的是提供一种PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3的制备方法，步骤如下：
步骤一、以α-螺旋七肽重复序列“abcdefg”为模板，选择Leu放置在a、d位置上形成稳定α-螺旋结构的Leu拉链；在b和f位置添加Trp，以Trp-Trp相互作用来进一步提高α-螺旋结构稳定性，从而提高抗菌活性，其余位置添加Arg以增加正电荷数，得到七肽基团序列如SEQ ID No.1所示，将上述第一组抗菌单元LWRLRWR的第7位的Arg的C端与第一个Lys的ε-N端相连，第二组七肽基团的第7位的Arg的C端与第二个Lys的ε-N端相连，第三组七肽基团的第1位的Leu的N端与第二个Lys的C端相连，第一个Lys的C端与第二个Lys的α-N端以酰胺键相连；为方便PEG偶联，在第一个Lys的α-N端添加一个Cys，并用聚乙二醇偶联在所述的Cys上，最终获得聚乙二醇偶联树枝状分支的多肽序列，其C端采用氨基酰胺化；
步骤二、将设计得到的多肽采用固相化学合成法进行合成，进一步经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定，然后将多肽与聚乙二醇进行偶联制备，得到聚乙二醇偶联树枝状分支的多肽，最后再经过抑菌活性检测、溶血活性检测以及血清稳定性检测，最终命名为抗菌肽PEG1000-K3。
本发明的另一目的是提供如上所述的一种PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用。
进一步的，所述的革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和表皮葡萄球菌。
进一步的，所述的革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、绿脓杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。
本发明具有如下优势：本发明通过PEG偶联显著提高了多肽的血清稳定性，同时抑制了抗菌肽的毒性。对得到的PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3进行抗菌和溶血活性以及血清稳定性检测，发现抗菌肽PEG1000-K3对大肠杆菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌等几种测定的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有良好抑菌活性，并且具有优异的生物相容性以及血清稳定性。通过测定未经PEG偶联的树枝状分支抗菌肽K3、PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3引起人血红细胞(hRBC)5％溶血时抗菌肽的最低浓度(MHC)发现抗菌肽PEG1000-K3的MHC值(>256μg/mL)远高于抗菌肽K3的HC50值(32μg/mL)，这表明抗菌肽PEG1000-K3的生物安全性较高。进一步计算抗菌肽K3、抗菌肽PEG1000-K3治疗指数(TI)评价二者的细胞选择性，PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3的TI值(21.11)远高于树枝状分支抗菌肽K3的TI值(4.00)，经PEG修饰后TI值提高了4倍。综上所述，PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3有潜力成为治疗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌感染的广谱抗菌药物，并有很高的应用价值。
附图说明
图1为树枝状分支抗菌肽K3的反相高效液相色谱图；
图2为经Cys修饰后的树枝状分支抗菌肽K3(即未偶联前的裸肽)反相高效液相色谱图；
图3为树枝状分支抗菌肽K3的质谱图；
图4为经Cys修饰后的树枝状分支抗菌肽K3(即未偶联前的裸肽)的质谱图；
图5为PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI ToF)图；
图6为树枝状分支抗菌肽K3、PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3溶血活性图；
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述。
实施例1
抗菌肽的设计
1、以α-螺旋七肽重复序列“abcdefg”为模板，选择Leu放置在a、d位置上形成稳定α-螺旋结构的Leu拉链；在b、f位置添加成对Trp，以Trp-Trp相互作用来进一步提高α-螺旋结构稳定性，从而提高抗菌活性，其余位置添加Arg以增加正电荷数。将上第一组抗菌单元LWRLRWR的第7位的Arg的C端与第一个Lys的ε-N端相连，第二组七肽基团的第7位的Arg的C端与第二个Lys的ε-N端相连，第三组七肽基团的第1位的Leu的N端与第二个Lys的C端相连，第一个Lys的C端与第二个Lys的α-N端以酰胺键相连，并在所述多肽C端进行酰胺化形成具有3个分支的树枝状分支抗菌肽命名为K3。
2、在上述树枝状分支抗菌肽K3的基础上，在其第一个Lys支架的α-N端添加一个Cys其目的是方便PEG的偶联。进一步地，用PEG1000偶联在Cys上，最终获得PEG偶联树枝状分支抗菌肽命名为PEG1000-K3。抗菌肽的序列如表1所示。
表1树枝状分支抗菌肽K3、PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3序列
实施例2
抗菌肽的合成与鉴定
1、固相化学合成法合成树枝状分支抗菌肽K3以及经Cys修饰后的树枝状分支抗菌肽K3(即未偶联前的裸肽)
首先将Fmoc-Arg(pbf)-OH接入到Rink树脂，然后哌啶脱保护反应30min后，去除哌啶，并用二甲基甲酰胺(DMF)清洗，茚三酮检测脱保护颜色。再将后续直链氨基酸依次连接，直至接到N端的Cys，去除N端的Fmoc后，接Boc，得到如下物质：
Boc-C(trt)K(dde)K(dde)LW(boc)R(pbf)LR(pbf)W(boc)R(pbf)-Rink Resin
将上述树脂用2％的水合肼DMF溶液来处理15min，除去水合肼，DMF清洗5次，此时Lys侧链dde保护基去除，氨基裸露，然后以前面的缩合方式按R、W、R、L、R、W、L的顺序依次将这几个氨基酸连接到Lys侧链氨基上，得到目标物肽的树脂。
以95％的TFA将目标肽从树脂上裂解下来，同时切掉序列所有的侧链保护基。得到目标肽的粗品。液相提纯，冻干后得到纯品目标肽。
2、PEG偶联树枝状分支抗菌肽
取目标肽和mPEG1000-Mal，分别用pH＝7.5的PBS溶解，混合后常温反应4h。然后用MD4000透析袋将反应液进行透析，透析后拿到PEG1000-CK(LWRLRWR)K(LWRLRWR)LWRLRWR-NH2的纯品溶液，冻干即可。
树枝状分支抗菌肽K3、经Cys修饰后的树枝状分支抗菌肽K3(即未偶联前的裸肽)的反相高效液相色谱图见附图1、2。
树枝状分支抗菌肽K3、经Cys修饰后的树枝状分支抗菌肽K3(即未偶联前的裸肽)的质谱图见附图3、4。
PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3的质谱图以基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI ToF)图形式表示，见附图5。
实施例3
抗菌肽的抑菌活性
通过测定抗菌肽最小抑菌浓度(MIC)来了解抗菌肽抑菌活性。将所设计并成功合成得到的抗菌肽配制成5120μg/mL贮备液用于生物活性测定。取冻存于-20℃的菌液，将其划线接种于MHA固体培养基，于37℃摇速为220rpm摇床过夜培养。随后将过夜菌种挑单菌落接种于新鲜、无菌的MHB中培养至生长对数期。使用分光光度计将菌液的OD600nm值调至0.38-0.40备用。取无菌的96-孔培养板，以经0.22μM水系滤膜过滤后的0.2％BSA(含0.01％乙酸)作为稀释液，采用微量肉汤稀释法测定抗菌肽的MIC。将抗菌肽贮备液加入到96-孔培养板的稀释液中，进行2倍的梯度倍比稀释，然后向每孔中加入50μL稀释1000倍后的菌液。其中以含有细菌的MHB作为阳性对照，以无菌的MHB培养基作为阴性对照。将96孔培养板用封口膜封上以防细菌污染，并置于37℃培养箱中孵育16-18h。阴性对照孔保持清透状态，表明试验过程无污染。肉眼观察下，与阴性对照相比浑浊度未增加的最低肽浓度被定义为多肽的MIC。进行3次独立重复试验，每个重复两个平行。抗菌肽的最小抑菌浓度见表2。
表2树枝状分支抗菌肽K3、PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3抑菌活性(μg/mL)
从表中可以看出，树枝状分支抗菌肽K3、PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3对测定的8种菌株都表现出优良的抗菌活性，虽然PEG1000-K3抗菌活性不及未修饰PEG的K3，但其MIC值处于16-32μg/mL之间，这表明PEG1000-K3仍然具有一定抗菌活性。
实施例4
抗菌肽的溶血活性
为评估抗菌肽的安全性，研究了在1-256μg/mL浓度范围内的肽对人血红细胞(hRBC)的溶血行为。
采集健康人的新鲜血液1mL并在4℃，1000×g离心5min后弃去上清，收集红细胞。随后将收集的红细胞在相同离心条件下用PBS缓冲液洗涤3次，最后用10mL PBS重悬备用。取无菌的96-孔培养板，以PBS缓冲液作为稀释液，将抗菌肽贮存液加入到96-孔培养板的稀释液中，进行2倍的梯度倍比稀释，再向每孔中加入50μL红细胞悬液，于37℃培养箱内恒温孵育1h。孵育结束后将96-孔培养板于4℃、1000×g离心10min；吸取50μL离心后上清液，转移至新的96-孔培养板中，使用酶标仪测定570nm下吸光度。以50μL红细胞加50μL0.1％Triton X-100作为阳性对照，50μL红细胞加50μL PBS缓冲液作为阴性对照。检测结果见说明书附图6。以树枝状分支抗菌肽K3、PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3引起人血红细胞5％溶血时抗菌肽的最低浓度(MHC)评价二者的生物相容性，进一步通过计算K3、PEG1000-K3治疗指数(TI)评价二者的细胞选择性，见表3。
表3树枝状分支抗菌肽K3、PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3的生物相容性
a抗菌肽对测定细菌最小抑菌浓度的几何平均值(GM)；
b MHC是引起人血红细胞(hRBC)5％溶血时抗菌肽的最低浓度，当在256μg/mL时未观察到可检测到的溶血活性时，则使用512μg/mL来计算治疗指数；
c治疗指数(TI)为MHC与GM的比值。
由说明书附图6可以看出，树枝状分支抗菌肽K3在MIC范围内(4-32μg/mL)即可引起溶血，在测定最高浓度下引起近40％溶血，而PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3即使在最高浓度下仍不会引起溶血。通过测定树枝状分支抗菌肽K3、PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3引起人血红细胞(hRBC)5％溶血时抗菌肽的最低浓度(MHC)发现PEG1000-K3的MHC值(>256μg/mL)远高于K3的HC50值(32μg/mL)，这表明PEG1000-K3的生物安全性较高。进一步计算K3、PEG1000-K3治疗指数(TI)评价二者的细胞选择性，更高的TI值表示抗菌肽具有更高的细胞选择性。其中PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3的TI值(21.11)远高于树枝状分支抗菌肽K3的TI值(4.00)，经PEG修饰后TI值提高了4倍。这表明多肽经PEG修饰后虽抑菌活性表现出一定程度的下降，但其溶血活性也得到了显著的改善，提高了细胞选择性，PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3具有更好的细胞选择性。
实施例5
抗菌肽的血清稳定性
使用E.coli 25922作为典型的革兰氏阴性菌，S.aureus 29213作为典型的革兰氏阳性菌测定抗菌肽对血清的敏感性。多肽与等体积不同浓度血清(25％、50％、100％)混合，于37℃孵育3h后进行最小抑菌浓度实验。检测结果见表4。
表4树枝状分支抗菌肽K3、PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3的血清稳定性
通过测定树枝状分支抗菌肽K3、PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3对E.coli25922、S.aureus 29213的血清敏感性，发现K3在所有浓度的血清环境均无法保持原有抗菌活性，经PEG修饰后的PEG1000-K3在25％血清环境中能够维持对两种菌原有的抗菌活性，在50％血清环境中能够维持对E.coli 25922原有的抗菌活性而对S.aureus 29213的MIC值则由原有32μg/mL升高至64μg/mL，这表明PEG1000-K3的血清稳定性更高，多肽的PEG修饰策略能够显著提升多肽的血清稳定性。
Claims (6)
1.一种PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3，其特征在于：包括两个Lys、三组α-螺旋结构的七肽基团以及分子量1000的聚乙二醇，所述的七肽基团的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，第一组七肽基团的第7位的Arg的C端与第一个Lys的ε-N端相连，第二组七肽基团的第7位的Arg的C端与第二个Lys的ε-N端相连，第三组七肽基团的第1位的Leu的N端与第二个Lys的C端相连，第一个Lys的C端与第二个Lys的α-N端以酰胺键相连，在第一个Lys的α-N端与一个Cys相连，并将聚乙二醇偶联在所述的Cys上；所述的抗菌肽PEG1000-K3的C端采用氨基酰胺化。
2.根据权利要求1所述的一种PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3，其分子式如式(I)所示，
3.根据权利要求1所述的一种PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3的制备方法，其特征在于，方法步骤如下：
步骤一、以α-螺旋七肽重复序列“abcdefg”为模板，选择Leu放置在a、d位置上形成稳定α-螺旋结构的Leu拉链；在b和f位置添加Trp，以Trp-Trp相互作用来进一步提高α-螺旋结构稳定性，从而提高抗菌活性，其余位置添加Arg以增加正电荷数，得到七肽基团序列如SEQID No.1所示，将上述第一组抗菌单元LWRLRWR的第7位的Arg的C端与第一个Lys的ε-N端相连，第二组七肽基团的第7位的Arg的C端与第二个Lys的ε-N端相连，第三组七肽基团的第1位的Leu的N端与第二个Lys的C端相连，第一个Lys的C端与第二个Lys的α-N端以酰胺键相连；为方便PEG偶联，在第一个Lys的α-N端添加一个Cys，并用聚乙二醇偶联在所述的Cys上，最终获得聚乙二醇偶联树枝状分支的多肽序列，其C端采用氨基酰胺化；
步骤二、将设计得到的多肽采用固相化学合成法进行合成，进一步经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定，然后将多肽与聚乙二醇进行偶联制备，得到聚乙二醇偶联树枝状分支的多肽，最后再经过抑菌活性检测、溶血活性检测以及血清稳定性检测，最终命名为抗菌肽PEG1000-K3。
4.根据权利要求1所述的一种PEG偶联树枝状分支抗菌肽PEG1000-K3在制备治疗革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和表皮葡萄球菌。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、绿脓杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。
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