CN109232719B - 一种pH响应的抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种pH响应的抗菌肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种pH响应的抗菌肽及其制备方法和应用，属于抗菌肽技术领域。本发明首先提供一种氨基酸序列简单的抗菌肽，这种氨基酸序列只包括亲水的赖氨酸和疏水的亮氨酸，但是却拥有天然抗菌肽发挥抗菌作用的关键因素：带有正电荷、有疏水域、两亲性、α螺旋二级构象等；通过在该抗菌肽的端部简单修饰，可以维持抗菌肽的生物活性，同时提高其生物相容性。本发明提供的pH响应的抗菌肽，在设计的抗菌多肽链上修饰具有酸响应性的分子，可以使多肽在细菌感染部位的微酸环境中起到杀菌作用，又能降低抗菌肽对生理环境中哺乳动物细胞的毒性作用。

Description

一种pH响应的抗菌肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及抗菌肽技术领域。更具体地，涉及一种pH响应的抗菌肽及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，越来越多的致病菌对抗生素产生了耐药性，急需发展新型的抗菌剂。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是生物体内存在的一种具有抗菌活性的肽类物质，氨基酸数目通常10-50个，常带正电荷，并具有广谱抗菌活性。AMPs是大多数生物对入侵病原体的先天性非特异性防御系统的重要组成部分，其具有独特的抗菌作用机制，迅速杀菌且不易引发细菌的耐药性，可单独或与抗生素联合使用杀伤病原体。传统的抗生素通常是针对单一的酶来控制代谢途径(例如脱氧核糖核酸、蛋白质及细胞壁的合成)，容易引起细菌的耐药性。与传统抗生素相比，大部分的抗菌肽显示出了多种生物活性，主要通过影响病原体的细胞质膜来发挥作用。因此，细菌必须要改变它们膜的组成和结构来对抗菌肽产生抗药性，但这对菌体本身也会造成严重的伤害，所以抗菌肽不容易引起细菌的耐药性。
抗菌肽的抗菌机理尚不明确，但普遍认同的一种机制是大多数抗菌肽所带的正电荷可以与细菌细胞膜表面的负电荷通过静电相互作用相结合，抗菌肽的疏水区域可以与细胞膜磷脂双分子层的疏水区通过疏水相互作用结合，再结合肽链的α螺旋结构来破坏细菌的细胞膜从而达到杀菌目的。尽管天然抗菌肽(蜂毒肽、蛙皮素等)抗菌效果非常好，但其对血液和哺乳动物细胞的毒性高、蛋白酶稳定性低、制作成本高等缺点也都限制了天然抗菌肽的应用。
为了实现抗菌肽的临床应用，首先必须要降低其细胞毒性，研究者们通过多种方案来降低抗菌肽毒性，同时希望保持其抗菌特性。例如将聚乙二醇(PEG)接枝到抗菌肽CaLL的N端，可以提高抗菌肽与肺部组织的相容性，但同时抑菌效果降低了50％(Morris,C.J.Antimicrob.Agents Chemother.2012,56,3298-3308.)；将阳离子多肽KSLW接枝到PEG修饰的磷脂胶束上在维持抗菌活性的同时也能提高细胞相容性(Lee,W.Theranostics2017,7,3759-3767.)，设计合成人工抗菌肽及其衍生物来降低细胞毒性，维持抗菌活性(G.N.Tew Acc.Chem.Res.2010,43,30.)。
当微生物感染伤口时，由于微生物代谢活动和宿主免疫应答机制，会使细菌感染部位呈局部弱酸性。在应对微生物感染的发炎过程中，大量的中性粒细胞和巨噬细胞渗入感染部位引起局部酸中毒，感染部位pH值可以降到5.5。例如可以造成多种临床感染的金黄色葡萄球菌，其生存环境的pH范围为4.2-9.3。因此，构建一种酸响应的抗菌体系是很必要的。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供两种结构类似且具有简易氨基酸序列的抗菌肽。
本发明的第二个目的在于提供一种pH响应的抗菌肽，既可以保持抗菌肽在细菌感染部位的杀菌性能，又可降低其对哺乳动物细胞的毒性作用。
本发明的第三个目的在于提供一种在抗菌肽上修饰pH响应小分子得到pH响应的抗菌肽的制备方法。
本发明的第四个目的在于提供一种pH响应的抗菌肽在制备抑制细菌生长药物中的应用。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
根据本发明的第一个目的，本发明提供一种抗菌肽，所述抗菌肽从N端到C端的氨基酸序列为(LKLLKKLLKKLKKLLKKL)4即72肽中连续的4-72个氨基酸序列，或者为(KKLL)n+K；其中，n＝1～4。
优选地，所述抗菌肽的端基修饰有-SH、-N3、-炔基、-双键或-马来酰亚胺。
优选地，所述抗菌肽的C端添加有半胱氨酸。
根据本发明的第一个目的，本发明还提供另一种结构类似的抗菌肽，所述抗菌肽从N端到C端的氨基酸序列为(LKKLLKKLKKLLKKLLKL)4即72肽中连续的4-72个氨基酸序列，或者为K+(LLKK)n；其中，n＝1～4。
优选地，所述抗菌肽的端基修饰有-SH、-N3、-炔基、-双键或-马来酰亚胺。
优选地，所述抗菌肽的C端添加有半胱氨酸。
根据本发明的第二个目的，本发明提供一种pH响应的抗菌肽，在如上所述的两种抗菌肽上分别修饰有pH响应小分子；其中，所述pH响应小分子包括2,3-二甲基马来酸酐、柠康酐、2-丙酸-3-甲基马来酸酐和顺式乌头酸酐中的任意一种。
根据本发明的第三个目的，本发明提供一种pH响应的抗菌肽的制备方法，至少包括以下步骤：
将抗菌肽溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸和NaOH的混合溶液中；
称取过量的pH响应小分子溶于乙醇中；
将以上得到的两种溶液混合并搅拌；
超滤离心，然后将样品冻干得到粉末状pH响应的抗菌肽产物。
优选地，所述搅拌是在氩气或氮气的保护下进行，搅拌时间为0.5-24小时。
根据本发明的第四个目的，本发明还提供一种如上所述的pH响应的抗菌肽在制备抑制细菌生长药物中的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明首先提供一种氨基酸序列简单的抗菌肽，这种氨基酸序列只包括两种氨基酸，即亲水的赖氨酸和疏水的亮氨酸，但是却拥有天然抗菌肽发挥抗菌作用的关键因素：带有正电荷、有疏水域、两亲性、α螺旋二级构象等；此外，通过在该抗菌肽的端部简单修饰，可以维持抗菌肽的生物活性，同时提高其生物相容性。
本发明还提供一种pH响应的抗菌肽，在设计的抗菌多肽链上修饰具有酸响应性的分子，使多肽链的正电荷封闭；修饰的分子具有微酸响应性，可以使多肽在细菌感染部位的微酸环境中起到杀菌作用，又能降低抗菌肽对生理环境中哺乳动物细胞的毒性作用，具有很高的选择性。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出本发明实施例15中抗菌肽LKLLKKLLKKLKKLLKKL-NH2的圆二色谱图。
图2示出本发明实施例15中抗菌肽(KKLL)3K-NH2的圆二色谱图。
图3示出本发明实施例15中抗菌肽LKLLKKLLKKLKKC-NH2的圆二色谱图。
图4示出实施例18抗菌肽pH响应前的zeta电位值。
图5示出实施例18抗菌肽pH响应后的zeta电位值。
图6示出实施例19抗菌肽pH响应前后的二级构象。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
现有技术中，虽然天然抗菌肽(蜂毒肽、蛙皮素等)抗菌效果很好，但同时其细胞毒性也非常高，蛋白酶稳定性低，制作成本高，这些缺点都限制了天然抗菌肽的应用。为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种pH响应的抗菌肽及其制备方法和应用。
本发明的第一个目的在于提供两种结构类似且具有简易氨基酸序列的抗菌肽。
本发明的第二个目的在于提供一种pH响应的抗菌肽，既可以保持抗菌肽在细菌感染部位的杀菌性能，又可降低其对哺乳动物细胞的毒性作用。
本发明的第三个目的在于提供一种在抗菌肽上修饰pH响应小分子得到pH响应的抗菌肽的制备方法。
本发明的第四个目的在于提供一种抗菌肽在制备抑制细菌生长药物中的应用。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
根据本发明的第一个目的，本发明首先提供一种抗菌肽，所述抗菌肽从N端到C端的氨基酸序列为基础序列SEQ ID NO.1的4次重复序列中的连续的4-72个氨基酸序列，即为(LKLLKKLLKKLKKLLKKL)4的72肽中连续的4-72个氨基酸序列，或者为基础序列SEQ ID NO.2的n次重复序列末端加K，即为(KKLL)n+K；其中，n＝1～4。本领域技术人员可以理解的是，所述氨基酸序列可以是(LKLLKKLLKKLKKLLKKL)4中任意连续的4-72个氨基酸序列，或者为(KKLL)n+K，且n可以为1、2、3或4。
本发明提供的这些氨基酸序列，虽然只包括两种氨基酸，即亲水的赖氨酸(K)和疏水的亮氨酸(L)，但是却拥有天然抗菌肽发挥抗菌作用的关键因素：带有正电荷、有疏水域、两亲性、α螺旋二级构象等。所以此简易序列的抗菌肽可以代表多数天然抗菌肽作为一种模板肽使用。
据上所述，本发明中抗菌肽的氨基酸序列可以根据需要进行选择。例如，所述抗菌肽的氨基酸序列可以为：KLLK(4肽)，KKLL(4肽)，LKLLKKLLK(9肽)，KLLKKLLKK(9肽)，LKLLKKLLKKLKK(13肽)，KKLLKKLKKLLKK(13肽)，LKLLKKLLKKLKKLLKKL(18肽)，KKLKKLLKKLLKLLKKLL(18肽)，LKLLKKLLKKLKKLLKKLLKLLKK(24肽)，KKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKK(24肽)，LKLLKKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKKLK(30肽)，KKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKKLKKLLK(30肽)，LKLLKKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKKLKKLLKKL(36肽)，(LKLLKKLLKKLKKLLKKL)3(54肽)，(LKLLKKLLKKLKKLLKKL)4(72肽),KKLLK,KKLLKKLLKKLLK。
优选地，所述抗菌肽的端基修饰有-SH、-N3、-炔基、-双键或-马来酰亚胺。通过简单的端基修饰，可便于将该抗菌肽接枝到其他分子上发挥作用。例如，将抗菌肽接枝到壳聚糖上，可以提高抗菌肽的生物相容性，增长血液循环时间，也可以提高抗菌肽的抗真菌作用。
优选地，所述抗菌肽的C端添加有半胱氨酸，来使抗菌肽的端基上修饰有-SH，如本发明实施例6和实施例7中提供的抗菌肽，实验发现添加半胱氨酸不仅利于抗菌肽的接枝，还可以显著增加抗菌肽的抗菌性和功能性。例如在多肽(KKLL)3K的C端添加一个半胱氨酸使其对大肠杆菌的最小抑菌浓度从32ug/ml降低到4ug/ml；对绿脓杆菌的最小抑菌浓度从8ug/ml降低到4ug/ml。
根据本发明的第一个目的，本发明还提供另一种结构类似的抗菌肽，所述抗菌肽从N端到C端的氨基酸序列为基础序列SEQ ID NO.3的4次重复序列中连续的4-72个氨基酸序列，即为(LKKLLKKLKKLLKKLLKL)4的72肽中连续的4-72个氨基酸序列，或者为基础序列SEQ ID NO.4的n次重复序列前端加K，即为K+(LLKK)n；其中，n＝1～4。该技术方案是将上一技术方案中的抗菌肽氨基酸序列倒置得到的序列。通过我们的研究发现，序列倒置之后得到的抗菌肽可以具备相似的结构和功能，也带有正电荷、有疏水域、两亲性、α螺旋二级构象等，可以作为抗菌肽使用。
据上所述，本发明中抗菌肽的氨基酸序列也可以根据需要进行选择。
优选地，所述抗菌肽的端基修饰有-SH、-N3、-炔基、-双键或-马来酰亚胺。通过简单的端基修饰，可便于将该抗菌肽接枝到其他分子上发挥作用。例如，将抗菌肽接枝到壳聚糖上，可以提高抗菌肽的生物相容性，增长血液循环时间，也可以提高抗菌肽的抗真菌作用。
优选地，所述抗菌肽的C端添加有半胱氨酸，来使抗菌肽的端基上修饰有-SH，实验发现添加半胱氨酸不仅利于抗菌肽的接枝，还可以显著增加抗菌肽的抗菌性和功能性。例如在多肽K(LLKK)3的C端添加一个半胱氨酸使其对大肠杆菌的最小抑菌浓度从32ug/ml降低到4ug/ml；对绿脓杆菌的最小抑菌浓度从8ug/ml降低到4ug/ml。
根据本发明的第二个目的，本发明提供一种pH响应的抗菌肽，在如上所述的两种抗菌肽上分别修饰有pH响应小分子；其中，所述pH响应小分子包括2,3-二甲基马来酸酐、柠康酐、2-丙酸-3-甲基马来酸酐和顺式乌头酸酐中的任意一种。
我们将pH响应小分子修饰到设计的抗菌肽上，因为此序列中的赖氨酸富含伯胺基团，所以pH响应小分子与伯胺可以形成酰胺键和一个带负电的羧基基团。KL肽-pH响应小分子在生理环境(pH＝7.4)下整条肽链带负电荷，并且二级构象由纯肽的α螺旋转变为无规构象，此时对哺乳动物细胞膜没有破坏作用，生物相容性好；KL肽-pH响应小分子在细菌感染的微酸环境下(pH＝5.5)，酰胺键发生水解，暴露了抗菌肽原有的带正电荷的氨基基团，二级结构恢复为α螺旋，此时抗菌肽就可以破坏细菌细胞膜，起到杀菌作用。此种设计可以保持在细菌感染部位的杀菌作用，又能降低抗菌肽对哺乳动物细胞的毒性作用，使其具有很高的选择性。
根据本发明的第三个目的，本发明提供一种在抗菌肽上修饰pH响应小分子的方法，至少包括以下步骤：
(1)将抗菌肽溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸和NaOH的混合溶液中；
(2)称取过量的pH响应小分子溶于乙醇中；
(3)将以上得到的两种溶液混合并搅拌；
(4)超滤离心，然后将样品冻干得到粉末状pH响应的抗菌肽产物。
优选地，步骤(3)中所述搅拌是在氩气或氮气的保护下进行，搅拌时间为0.5-24小时。
优选地，步骤(1)中抗菌肽的质量浓度为0.1mg/ml-20mg/ml；所述HEPES浓度为10-200mM；所述NaOH浓度为10-500mM；在溶解过程中可以进行搅拌，搅拌时间为0.5～4小时；
优选地，步骤(2)中，所用的多肽链氨基与pH响应分子的物质的量比为1:1～1:100；优选地，步骤(4)中，所述超滤离心的离心力为1000～10000g，离心时间为5～60min，所用的超滤离心管截留分子量为1000～5000道尔顿。
根据本发明的第四个目的，本发明还提供一种如上所述的pH响应的抗菌肽在制备抑制细菌生长药物中的应用。
下面结合具体的实施例对本发明进行更详细的说明。
实施例1
抗菌肽的氨基酸序列为LKLLKKLLKKLKKLLKKL(18肽)，抗菌肽结构式为LKLLKKLLKKLKKLLKKL-NH2。
注：在抗菌肽的结构式中C端含有-NH2，本领域技术人员可以理解的是，抗菌肽的羧基酰胺化属于抗菌肽的常规处理方法。
上述抗菌肽的制备方法：
一.树脂溶胀
将一定量树脂放入反应管中，加DCM(二氯甲烷)，振荡30min溶胀树脂。
二.脱保护
将树脂用DMF(二甲基甲酰胺)洗三遍，用脱保护液DBLK(哌啶与DMF的混合液)去保护15分钟，再用DMF洗六遍。
三.接第一个氨基酸
滤掉溶剂后加入3倍摩尔过量的Fmoc-Leu-OH氨基酸，3倍摩尔过量的缩合剂TBTU/DIEA/DMF(TBTU：O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸；DIEA：N,N-二异丙基乙胺)，反应半小时后进行检测，溶液亮黄，树脂淡黄即检测合格。
四.脱保护
将样品用DMF(二甲基甲酰胺)洗三遍，用脱保护液DBLK(哌啶与DMF的混合液)去保护15分钟，再用DMF洗六遍
五.缩合
重复第三步骤偶联下一个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH，反应半小时后进行检测，检测合格(溶液亮黄，树脂淡黄)后重复第四步骤脱保护，从右到左依次连接序列中的氨基酸。
六.最后一个氨基酸连接后，DBLK溶液去保护15分钟。
七.用DMF、DCM、甲醇各洗3遍，收缩，用切割液切割后将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚层析出来，再用乙醚洗六次，然后常温挥干，即得粗品肽序。处理氧化后用HPLC纯化多肽。
需要说明的是，抗菌肽的制备方法属于本领域常规实验方法，以上实验步骤只是能够实现抗菌肽制备的一种常用步骤。本领域技术人员也可以对该方法中的某些参数进行替换，能够得到本发明保护的抗菌肽即可，本发明对此不作进一步限制。
实施例2
抗菌肽氨基酸序列为KKLL(4肽)，抗菌肽结构式为KKLL-NH2。
上述抗菌肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的氨基酸序列来进行。
实施例3
抗菌肽氨基酸序列为LKLLKKLLK(9肽)以及倒序KLLKKLLKL，抗菌肽结构式为LKLLKKLLK-NH2和KLLKKLLKL-NH2
上述抗菌肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的氨基酸序列来进行。
实施例4
抗菌肽氨基酸序列为KKLKKLLKKLLKLLKKLL(18肽)以及倒序LLKKLLKLLKKLLKKLKK，抗菌肽结构式为KKLKKLLKKLLKLLKKLL-NH2和LLKKLLKLLKKLLKKLKK-NH2
上述抗菌肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的氨基酸序列来进行。
实施例5
抗菌肽氨基酸序列为LKLLKKLLKKLKKLLKKLLKLLKK(24肽)以及倒序KKLLKLLKKLLKKLKKLLKKLLKL，抗菌肽结构式为LKLLKKLLKKLKKLLKKLLKLLKK-NH2和KKLLKLLKKLLKKLKKLLKKLLKL-NH2。
上述抗菌肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的氨基酸序列来进行。
实施例6
抗菌肽氨基酸序列为LKLLKKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKKLK(30肽)以及倒序KLKKLLKKLLKLLKKLLKKLKKLLKKLLKL，抗菌肽结构式为LKLLKKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKKLK-NH2和KLKKLLKKLLKLLKKLLKKLKKLLKKLLKL-NH2
上述抗菌肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的氨基酸序列来进行。
实施例7
抗菌肽氨基酸序列为LKLLKKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKKLKKLLKKL(36肽)，以及倒序LKKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKKLKKLLKKLLKL，抗菌肽结构式为LKLLKKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKKLKKLLKKL-NH2和LKKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKKLKKLLKKLLKL-NH2。
上述抗菌肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的氨基酸序列来进行。
实施例8
抗菌肽氨基酸序列为(KKLKKLLKKLLKLLKKLL)3(54肽)以及倒序(LLKKLLKLLKKLLKKLKK)3，抗菌肽结构式为(KKLKKLLKKLLKLLKKLL)3-NH2和(LLKKLLKLLKKLLKKLKK)3-NH2
上述抗菌肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的氨基酸序列来进行。
实施例9
抗菌肽氨基酸序列为(KKLKKLLKKLLKLLKKLL)4(72肽)以及倒序(LLKKLLKLLKKLLKKLKK)4，抗菌肽结构式为(KKLKKLLKKLLKLLKKLL)4-NH2和(LLKKLLKLLKKLLKKLKK)4-NH2
上述抗菌肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的氨基酸序列来进行。
实施例10
抗菌肽氨基酸序列为LKLLKKLLKKLKK(13肽)，以及倒序KKLKKLLKKLLKL抗菌肽结构式为LKLLKKLLKKLKK-NH2和KKLKKLLKKLLKL-NH2
上述抗菌肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的氨基酸序列来进行。
实施例11
抗菌肽氨基酸序列为KKLLK，以及倒序KLLKK抗菌肽结构式为KKLLK-NH2和KLLKK-NH2。
上述抗菌肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的序列来进行。
实施例12
抗菌肽氨基酸序列为(KKLL)3K，以及倒序KLLKKLLKKLLKK，抗菌肽结构式为(KKLL)3K-NH2和KLLKKLLKKLLKK-NH2。
上述抗菌肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按本实施例的序列来进行。
实施例13
抗菌肽氨基酸序列为LKLLKKLLKKLKK(13肽)，在抗菌肽C端添加半胱氨酸来使抗菌肽端基修饰上-SH，增加抗菌肽的功能性和抗菌性，抗菌肽结构式为LKLLKKLLKKLKKC-NH2。
上述抗菌肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的序列来进行。
实施例14
抗菌肽氨基酸序列为(KKLL)3K，在抗菌肽C端添加半胱氨酸来使抗菌肽端基修饰上-SH，增加抗菌肽的功能性和抗菌性，抗菌肽结构式为(KKLL)3KC-NH2。
上述抗菌肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的序列来进行。
实施例15
对本发明制备得到的抗菌肽进行二级结构测定：
以LKLLKKLLKKLKKLLKKL-NH2、(KKLL)3K-NH2、LKLLKKLLKKLKKC-NH2为例，采用圆二色谱法，检测抗菌肽在十二烷基磺酸钠(SDS)中的二级结构。将上述三种抗菌肽分别稀释到25mM的SDS溶液中，使抗菌肽终浓度固定在0.1mM，测量选取光程为1mm的石英样品池，扫描范围为190nm-250nm。在室温下进行所有实验，测量结果如图1、-图3所示。从图中看出，α螺旋在208nm和222nm存在两个负峰。
实施例16
在抗菌肽上修饰酸响应小分子DMMA(即2,3-二甲基马来酸酐)，以LKLLKKLLKKLKK-NH2为例。
将一定量抗菌肽溶于100mM HEPES和125mM NaOH的混合溶液中；称取过量的2,3-二甲基马来酸酐(DMMA)溶于乙醇中，加入上述溶液中混匀，在氩气保护下室温搅拌0.5小时-3小时；将得到的产物放入超滤离心管中浓缩纯化，最后将样品冻干得到粉末状产物。
实施例17
在抗菌肽上修饰酸响应小分子柠康酐，以LKLLKKLLKKLKK-NH2为例。
将一定量抗菌肽溶于100mM HEPES和125mM NaOH的混合溶液中；称取过量的柠康酐溶于乙醇中，加入上述溶液中混匀，在氩气保护下室温搅拌0.5小时-3小时；将得到的产物放入超滤离心管中浓缩纯化，最后将样品冻干得到粉末状产物。
实施例18
LKLLKKLLKKLKK-NH2接枝DMMA
将样品溶于一系列pH值(pH＝4.46,5.45,6.0,7.24,8.0)的柠檬酸磷酸钠缓冲溶液中，测溶液的Zeta电位；将溶在不同pH值缓冲液的样品放在37℃的恒温振荡摇床中处理24小时后再次测得Zeta电位。根据等电点的变化来表征样品带电荷情况的变化。测试结果如图4和图5所示：由图4和图5所示，pH缓冲液处理后，pH＝7.4缓冲液处理后的样品zeta电位基本无变化，而pH＝5.45缓冲液处理后的zeta电位由负电位翻转到正电位，处理前后等电点的pH值也升高。证明在微酸环境中，接枝在多肽上的2,3-二甲基马来酸酐可以脱落，暴露出带正电荷的氨基，可以实现电位的翻转。
实施例19
LKLLKKLLKKLKK-NH2接枝DMMA
将pH＝7.4处理过的KL肽-DMMA样品以及pH＝5.5处理过的KL肽-DMMA样品溶于25mM的SDS溶液中，配成100ug/ml的溶液，进行圆二色谱的测试，根据峰形来判断二级结构的变化。测试结果如图6所示：如图6所示，pH＝7.4时，圆二色谱峰形为无规构象，pH＝5.5时，圆二色谱峰形为α螺旋构象，证明在生理环境下2,3-二甲基马来酸酐将氨基保护后屏蔽了正电荷，改变了多肽的二级结构，在微酸环境下，2,3-二甲基马来酸酐脱落暴露出氨基使二级构象恢复为α螺旋构象。
实施例20
LKLLKKLLKKLKK-NH2接枝DMMA
将样品用微量肉汤稀释法测试其抗菌效果，具体方法为：先配浓度为4mg/ml的样品，在96孔板中的每个孔板预先加上100ul肉汤，然后第一列孔加100ul样品原液，将第一列溶液混匀，然后取出100ul加入到第二列孔，再混匀，再从第二列取出100ul加入到第三列，以此类推，到第十列混匀后把多余的100ul吸出弃掉，样品逐级稀释完后在每个孔里加入浓度为105CFU/ml的菌液，菌液预先用肉汤稀释，第11列只加肉汤200ul作阴性对照，第12列加100ul肉汤和100ul菌液而不加样品做阳性对照。将加完菌液的96孔板放入37℃恒温培养箱培养12-16个小时后，在每个孔板中加入20ul浓度为0.625mg/ml的刃天青指示剂，加入后放回培养箱，培养2-4小时后有明显颜色变化时就可以得到最小抑菌浓度(minimuminhibitory concentration，MIC)。通过测量不同pH值的最小抑菌浓度的差别来表征样品的响应性。测量结果如下表1所示：表格中数据说明，在pH＝7.4的环境中，ε-抗菌肽的抑菌效果得到了抑制，MIC值为原料的62倍以上(大肠杆菌)和31倍(金黄色葡萄球菌)，而在pH＝5.0的环境中，抗菌肽的抑菌效果得到了一定程度的恢复，MIC值为原料的31倍(大肠杆菌)和7倍(金黄色葡萄球菌)。说明此种设计可以控制抗菌肽在微酸环境中发挥很好的抑菌作用，而在生理环境下对细胞的破坏作用大大降低。
表1样品最小抑菌浓度测试结果
Figure GDA0001964863510000101
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
序列表
<110> 中国科学院理化技术研究所
<120> 一种pH响应的抗菌肽及其制备方法和应用
<130> JLC18I0663E
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Lys Lys Leu Leu Lys
1 5 10 15
Lys Leu
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Lys Lys Leu Leu
1
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu
1 5 10 15
Lys Leu
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Leu Leu Lys Lys
1

Claims (3)

1.一种pH响应的抗菌肽在制备抑制细菌生长药物中的应用，其特征在于，
所述抗菌肽从N端到C端的氨基酸序列为LKLLKKLLKKLKK，在所述抗菌肽上修饰有pH响应小分子；
其中，所述pH响应小分子包括2,3-二甲基马来酸酐、柠康酐、2-丙酸-3-甲基马来酸酐和顺式乌头酸酐中的任意一种；
所述细菌为大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽由至少包括以下步骤的方法制得：
将所述抗菌肽溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸和NaOH的混合溶液中；
称取过量的pH响应小分子溶于乙醇中；
将以上得到的两种溶液混合并搅拌；
超滤离心，然后将样品冻干得到粉末状pH响应的抗菌肽产物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述搅拌是在氩气或氮气的保护下进行，搅拌时间为0.5-24小时。
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The effect of thiol functional group incorporation into cationic helical peptides on antimicrobial activities and spectra;Nikken Wiradharma等;《Biomaterials》;20111222;第32卷(第34期);摘要，第9101页左栏第3段，表2 *
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