CN105463002A - 多肽类核酸载体、其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸载体,具体涉及包含细胞透膜肽和具有α-螺旋双亲性结构的抗菌肽的多肽类核酸载体。本发明还涉及含有所述核酸载体和核酸分子的复合体。本发明还涉及所述核酸载体和核酸载体/核酸分子复合体的制备方法以及用途。本发明的核酸载体具有很高的转染效率,并且具有制备方法简单,细胞毒性低等特点,为基因治疗提供了有效的治疗手段。
Description
技术领域
本发明涉及核酸载体,具体涉及多肽类核酸载体。本发明还涉及含有所述核酸载体和核酸分子的复合体,以及所述核酸载体和核酸载体/核酸分子复合体的制备方法及用途。
背景技术
美国食品药品管理局(FDA)定义基因治疗是通过转录或翻译、转运和/或整合到宿主基因组中外源基因进行治疗疾病的一种治疗方法。基因治疗是治疗癌症、单基因疾病、心血管疾病和神经性疾病等的潜在的最有效的治疗方法。自1990年,基因治疗第一次进入临床试验开始,全球已经有超过1800例基因治疗临床试验开展。我国更是在2004年,成为第一个在市场上引进基因药物(Gendicine)的国家。由于用于基因治疗的核酸药物分子具有分子量大、富含大量负电荷以及极易降解等特点,目前基因治疗面临的最大难题是缺乏理想的转运载体,因此寻找高效、安全的基因转运载体成为研究的重点。
目前开展的临床试验大多采用腺病毒和逆转录病毒作为基因药物的载体,但病毒载体的缺点在于转运能力低、使用成本高昂和潜在的安全性等。在1994年,因为在临床试验中使用病毒基因载体造成病人死亡,致使基因治疗研究一度陷入停滞。因此,近些年非病毒类载体研究发展迅速,包括脂质体、阳离子聚合物和多肽等。非病毒载体转运基因药物多数通过自身的阳离子与基因药物的阴离子之间的离子相互作用负载DNA或RNA,形成较小尺度的纳米颗粒,转运DNA或RNA进入宿主细胞,进而整合到宿主基因中进行表达。多肽以其较好的生物相容性、功能多样性和易于合成等特点成为基因治疗载体的较好选择。
细胞透膜肽(Cell-PenetratingPeptides,CPPs)是一类能够高效介导核酸、蛋白等生物大分子透过细胞膜进入细胞的一类短肽,一般肽序列长度不超过30个氨基酸,大部分透膜肽富含赖氨酸和精氨酸等碱性氨基酸。其中,TAT(49-57)(HIVtatprotein)是细胞透膜蛋白肽片段中可完全行使细胞透膜功能且无细胞毒性的最小片段,TAT(49-57)肽序列为Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(RKKRRQRRR)。该段透膜肽可以通过在生理条件下碱性氨基酸的正电荷与核酸的负电荷结合,负载核酸进而通过内吞作用介导核酸进入细胞,并且TAT肽片段有一定的细胞核靶向能力。然而,通过内吞作用进入细胞的TAT/DNA或RNA复合体首先进入内涵体(endosome,一种内部呈酸性环境的脂膜结构),最终运送至溶酶体降解。富含精氨酸的透膜肽肽序列Rn(n=6-10)也具有和TAT相似的特性。由于TAT和Rn缺乏逃逸内涵体的能力,因此很难单独作为递送DNA的载体达到理想的转染效率。
实现内涵体逃逸的方法主要有两种,一种是利用酸性环境(pH<6.0)下具有离子缓冲作用的材料,通过质子泵作用破坏内涵体,使DNA或RNA复合体逃逸;另一种是利用带有α-螺旋双亲性结构的多肽与脂膜作用,形成空洞,释放出来DNA或RNA复合体。具有α-螺旋双亲性结构的抗菌肽(AMPs)是一类可以有效促进内涵体逃逸的功能多肽。该类多肽在水性环境中呈无规则状态,但在疏水性环境中会形成α-螺旋的双亲性结构,进而起到破坏内涵体脂质囊泡的作用。
发明内容
本发明针对基因转运过程中需要解决的关键问题,设计合成了一类具有较高转染效率并且能够较好实现内涵体逃逸的多肽类核酸载体,由此完成了本发明。
本发明第一方面涉及核酸载体,所述载体含有细胞透膜肽和具有α-螺旋双亲性结构的抗菌肽(AMPs)。
在本发明的实施方案中,所述抗菌肽位于细胞透膜肽的N端方向。
在本发明中,所述具有α-螺旋双亲性结构的抗菌肽是指该类抗菌肽在水溶液中呈现无规则卷曲的构象,而在疏水性环境中呈现α-螺旋结构,亲水性的碱性氨基酸和疏水性氨基酸分别排列与螺旋的两侧,呈现特有的双亲性二级结构。
根据本发明第一方面任一项的核酸载体,其在所述抗菌肽的N端方向还连接有疏水性分子。
在本发明中,所述抗菌肽的N端方向连接有疏水性分子是指所述疏水性分子与抗菌肽直接连接或通过其它氨基酸或小肽片段连接于抗菌肽的N端。
在本发明的一个实施方案中,通过在抗菌肽N端连接疏水性分子,诱导AMP形成α-螺旋双亲性结构,这一结构有利于带正电荷的亲水性氨基酸与负电荷的核酸药物充分接触,进而形成稳定致密的纳米复合物,有利于细胞的摄取,使得抗菌肽可以通过疏水相互作用提高聚集体的局部浓度,进而提高局部电荷密度,提高DNA或RNA的负载能力、提高核酸载体/DNA或RNA复合体的稳定性,同时,通过其疏水性烷基链与细胞膜的融合作用,进而有效提高透膜效率和破坏内涵体的能力。
根据本发明第一方面任一项的核酸载体,在所述细胞透膜肽和抗菌肽之间、和/或抗菌肽和疏水性分子之间还连接有1个氨基酸或者2-10个氨基酸组成的小肽;优选地,所述1个氨基酸为半胱氨酸,或者所述小肽中含有半胱氨酸。
在本发明的实施方案中,在所述细胞透膜肽和抗菌肽之间、和/或抗菌肽和疏水性分子之间还连接有1个氨基酸或者2-10个氨基酸组成的小肽,该氨基酸或小肽可以起到连接肽的作用,以保证细胞透膜肽、抗菌肽和疏水性分子能够正确行使各自的功能,和/或起到提供半胱氨酸以有利于形成二硫键的作用;优选地,该氨基酸为半胱氨酸,或者所述小肽中含有半胱氨酸,两个半胱氨酸可以在分子间形成二硫键。载体示意图见图1。
在本发明的一个实施方案中,在细胞透膜肽和抗菌肽之间、以及抗菌肽和疏水性分子之间,各连接有一个甘氨酸。
在本发明的另一个实施方案中,在细胞透膜肽和抗菌肽之间、以及细胞透膜肽和疏水性分子之间,各连接有一个半胱氨酸。
根据本发明第一方面任一项的核酸载体,其在分子间形成二硫键。
在本发明的实施方案中,所述二硫键可以在上述起连接作用的氨基酸或小肽之间形成,如果在细胞透膜肽或抗菌肽中含有半胱氨酸,则也可在这样的两个半胱氨酸之间形成。
在本发明的实施方案中,通过在核酸载体中加入半胱氨酸,可以在分子间形成二硫键以稳定核酸载体/DNA或RNA复合体,并降低该复合体的尺寸,形成直径在100-200nm的纳米结构。
根据本发明第一方面任一项的核酸载体,其中所述细胞透膜肽选自TAT、Rn(n=6-10)(表示6-10个精氨酸组成的肽)、penetratin(RQIKIWFQNRRMKWKK,SEQIDNO:8)、MAP(KLALKLALKALKAALKLA,SEQIDNO:9)、pVEC(LLIILRRRIRKQAHAHSK,SEQIDNO:10)、MPG(Ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-NH2,SEQIDNO:11)、MPGΔNLS(Ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-NH2,SEQIDNO:12)、Stearyl-R8(st-RRRRRRRR-NH2,SEQIDNO:13)、EB1(LIKLWSHLIHIWFQNRRLKWKKK-NH2,SEQIDNO:14)、Tat-DRBD(GRKKRRQRRRPQ-DRBD,SEQIDNO:15)。
在本发明的具体实施方案中,所述TAT的序列为Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(RKKRRQRRR,SEQIDNO:5)或Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(GRKKRRQRRR,SEQIDNO:6)。
根据本发明第一方面任一项的核酸载体,其中所述α-螺旋双亲性结构的抗菌肽选自(LLKK)3(LLKKLLKKLLKK,SEQIDNO:7)、magainin(GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS,SEQIDNO:16)、Pexiganan(GIGKFLKKAKKFGKAFVKILKK,SEQIDNO:17)、mellitin(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ,SEQIDNO:18)、天蚕素(Cecropins)、蛙皮素(Magainins)。
根据本发明第一方面任一项的核酸载体,其中所述疏水性分子选自长链脂肪酸(如硬脂酸、棕榈酸、油酸、亚油酸等)、胆固醇、磷脂。
在本发明的一个实施方案中,所述核酸载体的序列为Gly-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(SEQIDNO:1)。
在本发明的一个实施方案中,所述核酸载体的序列为Cys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Cys-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(SEQIDNO:2)。
在本发明的一个实施方案中,所述核酸载体的序列为C18-Gly-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(SEQIDNO:3)。
在本发明的一个实施方案中,所述核酸载体的序列为C18-Cys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Cys-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(SEQIDNO:4)。
在本发明中,所述C18是指硬脂酸。
本发明第二方面涉及核酸载体/核酸复合体,其含有本发明第一方面任一项的核酸载体和核酸(DNA或RNA)分子。
根据本发明第二方面任一项的核酸载体/核酸复合体,所述核酸载体与核酸分子的电荷比为1-10,例如为2-8。
在本发明中,所述的核酸载体带有正电荷,核酸分子带有负电荷,核酸载体与核酸分子之间通过正负电荷间的吸引作用形成复合体。
本发明第三方面涉及重组细胞,其含有本发明第一方面任一项的核酸载体或者第二方面任一项的核酸载体/核酸复合体。
在本发明中,所述细胞可以为原核细胞或真核细胞,所述原核细胞例如为大肠杆菌细胞,所述真核细胞例如为酵母细胞或哺乳动物细胞,所述哺乳动物细胞例如为来源于人、小鼠、大鼠、猴等的细胞。
在本发明中,将所述核酸载体或核酸载体/核酸复合体导入细胞得到重组细胞的方法为本领域所公知,例如,可通过电穿孔或显微注射将核酸引入细胞中;或者,可使用脂转染试剂如FuGENE6、X-tremeGENE和LipofectAmine将其引入细胞中。
本发明还涉及本发明第二方面任一项的核酸载体/核酸复合体的制备方法,其包括将一定浓度的本发明第一方面任一项的核酸载体和核酸(DNA或RNA)分子孵育的步骤。
在本发明的实施方案中,所述核酸载体与核酸分子的电荷比为1-10,例如为2-8。
在本发明的实施方案中,所述孵育的条件为,36-38℃(例如37℃)条件下孵育20min以上(例如30min)。
本发明还涉及本发明第一方面任一项的核酸载体用于负载或转运核酸(DNA或RNA)分子的用途。
在本发明中,所述负载或转运核酸(DNA或RNA)分子是指将核酸分子转入或导入细胞。
本发明还涉及本发明第一方面任一项的核酸载体或者第二方面任一项的核酸载体/核酸复合体用于制备基因治疗药物的用途。
在本发明中,所述基因治疗是指将外源核酸分子(如正常基因、功能核酸分子等)导入有需要的受试者的体内或细胞中以达到治疗疾病的方法。
在本发明中,所述细胞透膜肽是指一类以非受体依赖方式,非经典内吞方式直接穿过细胞膜进入细胞的多肽,它们的长度一般不超过30个氨基酸且富含碱性氨基酸,氨基酸序列通常带正电荷,例如TAT、MPG(Ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-NH2)、MPGΔNLS(Ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-NH2)、Stearyl-R8(st-RRRRRRRR-NH2)、EB1(LIKLWSHLIHIWFQNRRLKWKKK-NH2)、Tat-DRBD(GRKKRRQRRRPQ-DRBD)。
在本发明中,所述抗菌肽(Antibacterialpeptide)又叫抗微生物肽(Antimicrobialpeptide)、抗生素肽(Antibioticspeptide),是由多种生物细胞特定基因编码经外界条件诱导产生的一类具有广谱抗细菌、真菌、病毒、原虫、抑杀肿瘤细胞等活性作用的多肽或人工合成的非天然序列多肽。抗菌肽广泛存在于从细菌到哺乳动物的生物中,例如细菌、哺乳动物、两栖动物、软体动物、鱼类、植物等。抗菌肽一般具有以下理化特性:(1)一般由10~50个氨基酸组成,分子量小,热稳定性好,免疫原性低;(2)富含疏水和碱性氨基酸残基,所以大多数抗菌肽都带正电荷且具有两亲性;(3)抗菌肽在较大的离子强度和较低或较高的pH值下仍可保持较强的活性;(4)部分抗菌肽还有抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的能力。在本发明中,所述抗菌肽是指具有α-螺旋双亲性结构的阳离子抗菌肽,例如包括天蚕素(Cecropins),蛙皮素(Magainins)等。
在本发明中,所述核酸是指DNA或RNA分子。所述核酸分子可以为载体、报告基因、效应基因(例如抗癌基因)或者具有其它功能的DNA或RNA分子。在本发明中,对核酸的长度没有特别要求,例如可以在几个碱基~几千个碱基的范围内。本领域技术人员可以根据核酸长度的大小调节核酸载体的用量,即当核酸的长度较小时,需要较少摩尔数的核酸载体,当核酸的长度较大时,需要较多摩尔数的核酸载体。
在本发明中,核酸载体和核酸分子的电荷比是通过计算核酸载体和核酸分子各自所带的电荷数计算出来的。其中,核酸载体所带的电荷数是指多肽携带的正电荷数,是指多肽序列中带正电荷的lys和arg的数量,定义为N,即一个lys或一个arg带一个正电荷;核酸分子所带的电荷数是指核酸碱基的磷酸基团数,定义为P,即一个磷酸基团带一个负电荷。
本发明设计合成了一系列含有细胞透膜肽和具有α-螺旋双亲性结构的抗菌肽的多肽类核酸载体,有效解决了基因转运过程中的负载、转运、细胞内内涵体逃逸等问题,实现了与商用Lipofectamine2000相近甚至更高的转染效率,同时具有较低的毒副作用。
附图说明
图1多肽基因载体结构示意图
图2多肽的圆二色谱图。A为多肽在50%三氟乙醇/PBS中的圆二色谱;B为多肽在PBS中的圆二色谱。
图3载体/DNA复合物琼脂糖凝胶电泳图
其中0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0分别为多肽与DNA的电荷比,
A为G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物,B为C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物,C为C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物,D为C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物。
图4载体/DNA复合物流体粒径和zeta电位图,其中横坐标为多肽与DNA的电荷比,纵坐标分别为颗粒粒径(A)和zeta电位(B)。
图5多肽/DNA电荷比为4的复合物投射电镜图。
A为G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物,
B为C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物,
C为C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物,
D为C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物。
其中图D红框表示单个C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物的放大图像。标尺为100nm。
图6载体/DNA复合物体外转染效率图,其中横坐标为多肽与DNA的电荷比,纵坐标为荧光素酶蛋白质量比(RLU/mg蛋白),
A为载体/DNA复合物在293T细胞的转染效率,B为载体/DNA复合物在NIH-3T3细胞的转染效率,C为加入氯化喹啉时载体/DNA复合物在293T细胞转染效率,D为加入氯化喹啉时载体/DNA复合物在NIH-3T3细胞转染效率。
图7载体/DNA复合物的细胞毒性评价,其中横坐标为多肽与DNA的电荷比,纵坐标为细胞存活率,
A、B为不同电荷比的细胞毒性,C、D为固定电荷比(N/P=4)、不同DNA用量条件下的细胞毒性,
A、C为293T细胞,B、D为NIH-3T3细胞。
具体实施方式
缩写词含义
Arg表示精氨酸
Cys表示半胱氨酸
Gln表示谷氨酰胺
Gly表示甘氨酸
Leu表示亮氨酸
Lys表示赖氨酸
Fmoc表示芴甲氧羰基
DMF表示二甲基甲酰胺
HBTU表示2-(1H-1-羟基苯并三唑)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐
HOBT表示1-羟基苯并三唑
DIEA表示N,N-二异丙基乙胺
TFA表示三氟乙酸
RP-HPLC表示反相高效液相色谱
TAE-buffer表示三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液
其它未标示的缩写具有本领域公知的含义。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例所用固相合成载体Rink-酰胺树脂为天津南开合成责任有限公司产品HOBT、HBTU、DIEA以及Fmoc-保护的氨基酸由上海吉尔生化公司提供。
实施例1
1、G(LLKK)3G-TAT的合成
根据G(LLKK)3G-TAT的氨基酸序列,Ac-Gly-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2,以Rink-酰胺树脂为固相载体,以HBTU-HOBt为缩合剂,采取标准Fmoc策略,利用微波多肽合成仪(CEM,USA)合成目标肽序列。以20ml三氟乙酸:苯甲硫醚:间甲酚:乙二硫醇:水(8.25:0.5:0.5:0.25:0.5,体积比)作裂解液,0℃反应30分钟,室温120反应分钟,将肽脱除保护基并从树脂上裂解下来。溶液经RP-HPLC纯化,RP-HPLC条件,A相:0.05%TFA/水;B相:0.05%TFA/70%ACN/水;色谱柱:C8;MALDI-Tof-MS:2999.84。
2、G(LLKK)3G-TAT的圆二色谱表征
为了验证多肽是否能够形成α-螺旋,分别测试了多肽在50%三氟乙醇/PBS溶液和PBS溶液中的圆二色光谱。测试仪器:BiologicMOS-450圆二色谱仪。如图2所示,在50%三氟乙醇/PBS溶液(A)中G(LLKK)3G-TAT在208nm和220nm有两个明显的负峰,显示其在疏水环境中能够形成很好的α-螺旋构象,螺旋度为70.33%,而在PBS溶液(B)中呈无规则卷曲构象。
3、G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物的制备与表征
取PGL-3质粒DNA(购自Promega公司)1μg,稀释到25μl,G(LLKK)3G-TAT配成1mg/ml的溶液,按照peptide/DNA电荷比(N/P)2-8吸取不同体积的肽溶液,稀释到25μl,将肽和DNA溶液混合,涡旋10s,在37℃孵育30min,形成不同电荷比的G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物。
为了评价G(LLKK)3G-TAT载体负载DNA的能力,本发明研究了G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳。配制质量/体积比为1%的琼脂糖/TAE缓冲溶液,在微波炉中加热溶解,倒入电泳槽模具中冷却30min,放入电泳槽中,加入10×TAE缓冲液。取按照上述方法制备的G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物,其中DNA为0.1μg,体积10μl上样,电压100v,60min。在EB染色液中染色15min,然后在凝胶成像仪下拍照,观察电泳中DNA迁移条带。结果如图3-A中所示,G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物电荷比在2.5时可以完全负载DNA。
G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物的粒径和zeta电位分析。复合物制备如上所述,粒径和zeta电位检测采用ZetasizerNanoZS90,Malvern激光粒度仪,检测温度25℃,每个样品重复三次,检测结果如图4所示。G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物的粒径随着电荷比增大,先由426.6nm降至200.2nm,然后稍微升至233.9nm。zeta电位随着正负电荷比增加由9.1mv升至19.4mv。
4、G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物的投射电镜表征
复合物制备如上所述,测试的样品为多肽/DNA电荷比为4的复合物。将制备好的G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物溶液5μl滴加在铜网上,30min后用滤纸吸干,在HitachiH-7650显微镜下拍照。如图5A所示,G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物为约110nm的纳米颗粒,这一尺度比DLS(动态光散射)所测的结果较小,是因为测试透射电镜时的复合物为晾干后的样品,比其在水溶液中测试的流体粒径尺度偏小。
5、G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物的转染效率
本发明的peptide/DNA复合物的细胞转染效率在两种细胞系293T和NIH-3T3细胞(购自协和细胞库,即中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)中评价。
将293T和NIH-3T3细胞分别接种于24孔板中,每孔接种5×104(500μlDMEM细胞悬液)个细胞,24小时后细胞汇合度达到80%,吸出培养基。将按实施例1-3中所得的G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物(每孔PGL-3质粒DNA1μg,电荷比(N/P)2-8)用DMEM培养基稀释到500μl,分别加入到细胞培养板,在37℃,5%CO2的细胞培养箱中孵育4小时。4小时后吸出培养基,加入500μl含10%FBS的DMEM培养基再培养44小时,然后检测细胞内荧光素酶表达。测试采用Promega公司的荧光素酶检测试剂盒,利用M5(MolecularDevices,WI,USA)酶标仪采集荧光信号值采集时间为500ms。统计结果绘图,数据如图6A、B中所示,实验数据每组重复三次,以商用脂质体Lipofectamine2000作为阳性对照。两种细胞的荧光素酶表达量在电荷比为4:1时达到最大,荧光素酶蛋白质量比(RLU/mgProtein)分别为5.32×105(293T细胞)和4.65×104(NIH-3T3细胞)。
本发明还评价了peptide/DNA复合物在有氯化喹啉(一种缓冲内涵体和溶酶体酸性环境的药物)作用下,复合物的细胞转染效率。细胞转染的给药方式如前所述,不同的是在转染过程中,在培养基中加入100μM的氯化喹啉。细胞的荧光素酶表达水平如图6C、D中所示,荧光素酶的表达水平显著上升,最高的荧光素酶蛋白/质量比(RLU/mgProtein)分别达到9.14×106(293T细胞)和5.62×105(NIH-3T3细胞)。
6、G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物的细胞毒性评价
本发明的细胞毒性评价实验同样在上述两种细胞系293T和NIH-3T3细胞中评价,实验采用Promega公司的CellTiterAQueousOneSolutionreagent试剂盒分别评价了G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物在固定DNA用量(1μg/μl),不同电荷比(N/P=2-8)的细胞毒性和固定电荷比(N/P=4),在不同DNA用量(1-6μg)条件下的细胞毒性。
将293T和NIH-3T3细胞分别接种于96孔板中,每孔1×104个细胞,在37℃,5%CO2条件下培养24小时后,细胞汇合度达到70%-80%。吸出培养基,加入按实施例1-3中所得G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物100μl,孵育4个小时。4小时后吸出培养基,换成新鲜的含10%FBS的DMEM,再培养20小时,然后按照MTS方法检测细胞存活率。细胞存活率如图7所示,在不同的条件下,细胞的存活率都达到了90%以上,可见本发明的G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物具有较低的细胞毒性。
实施例2
1、C(LLKK)3C-TAT的合成
根据C(LLKK)3C-TAT的氨基酸序列,Ac-Cys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Cys-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2,以Rink-酰胺树脂为固相载体,以HBTU-HOBt为缩合剂,采取标准Fmoc策略,利用微波多肽合成仪(CEM,USA)合成目标肽序列。以20ml三氟乙酸:苯甲硫醚:间甲酚:乙二硫醇:水(8.25:0.5:0.5:0.25:0.5,体积比)作裂解液,0℃反应30分钟,室温120反应分钟,将肽脱除保护基并从树脂上裂解下来。溶液经RP-HPLC纯化,RP-HPLC条件,A相:0.05%TFA/水;B相:0.05%TFA/70%ACN/水;色谱柱:C8;MALDI-Tof-MS:3093.26。
2、C(LLKK)3C-TAT的圆二色谱表征
为了验证多肽是否能够形成α-螺旋,分别测试了多肽在50%三氟乙醇/PBS溶液和PBS溶液中的圆二色光谱。测试仪器:BiologicMOS-450圆二色谱仪。如图2所示,在50%三氟乙醇/PBS溶液(A)中C(LLKK)3C-TAT在208nm和220nm有两个明显的负峰,显示其在疏水环境中能够形成很好的α-螺旋构象,螺旋度为86.48%,此螺旋度比G(LLKK)3G-TAT高16.15%,可见在多肽中引入半胱氨酸有利于α-螺旋构象的形成;而在PBS溶液(B)中呈无规则卷曲构象。
3、C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物的制备与表征
取PGL-3质粒DNA,1μg,稀释到25μl,C(LLKK)3C-TAT配成1mg/ml的溶液,按照peptide/DNA电荷比(N/P)2-8吸取不同体积的肽溶液,稀释到25μl,将肽和DNA溶液混合,涡旋10s,在37℃孵育30min,形成不同电荷比的C(LLKK)3C-TAT复合物。
为了评价C(LLKK)3C-TAT载体负载DNA的能力,本发明研究了C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳。配制质量/体积比1%的琼脂糖/TAE溶液,在微波炉中加热溶解,倒入电泳槽模具中冷却30min,放入电泳槽中,加入10×TAE缓冲液。按照上述方法制备C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物,其中DNA为0.1μg,体积10μl上样,电压100V,60min。在EB染色液中染色15min,然后在凝胶成像仪下拍照,观察电泳中DNA迁移条带。结果如图3-B中所示,C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物电荷比在2.0时可以完全负载DNA,说明序列中两个半胱氨酸有助于帮助形成更稳定的C(LLKK)3C-TAT/DNA复合体。
C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物的粒径和zeta电位分析。复合物制备如上所述,粒径和zeta电位检测采用ZetasizerNanoZS90,Malvern激光粒度仪,检测温度25℃,每个样品重复三次,检测结果如图4所示。C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物的粒径随着电荷比增大,先由200.6nm降至91.0nm,然后稍微升至123.1nm,从结果可以看出半胱氨酸的加入使形成的复合物粒径有明显降低。同时,zeta电位也明显升高,zeta电位随着正负电荷比增加由10.5mv升至31.2mv。
4、C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物的投射电镜表征
复合物制备如上所述,测试的样品为多肽/DNA电荷比为4的复合物。将制备好的C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物溶液5μl滴加在铜网上,30min后用滤纸吸干,在HitachiH-7650显微镜下拍照。如图5B所示,C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物为约50nm的纳米颗粒,明显小于G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物的纳米颗粒尺度,可见在多肽中引入半胱氨酸促使多肽间形成二硫键有利于形成较小的多肽/DNA纳米颗粒。同样,这一尺度比DLS所测的结果较小,是因为测试透射电镜时的复合物为晾干后的样品,比其在水溶液中测试的流体粒径尺度偏小。
5、C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物的转染效率
本发明的peptide/DNA复合物的细胞转染效率在两种细胞系293T和NIH-3T3细胞中评价。
将293T和NIH-3T3细胞分别接种于24孔板中,每孔接种5×104(500μlDMEM细胞悬液)个细胞,24小时后细胞汇合度达到80%,吸出培养基。将按实施例2-3中所得的C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物(每孔PGL-3质粒DNA1μg,电荷比(N/P)2-8)用DMEM培养基稀释到500μl,分别加入到细胞培养板,在37℃,5%CO2的细胞培养箱中孵育4小时。4小时后吸出培养基,加入500μl含10%FBS的DMEM培养基再培养44小时,然后检测细胞内荧光素酶表达。测试采用Promega公司的荧光素酶检测试剂盒,利用M5(MolecularDevices,WI,USA)酶标仪采集荧光信号值采集时间为500ms。统计结果绘图,数据如图6A、B中所示,实验数据每组重复三次,以商用脂质体Lipofectamine2000作为阳性对照。两种细胞的荧光素酶表达量在电荷比为4:1时达到最大,荧光素酶蛋白质量比(RLU/mgProtein)分别为1.50×107(293T细胞)和5.59×105(NIH-3T3细胞)。荧光素酶的表达效率比实施例1中有了明显提高。
本发明还评价了peptide/DNA复合物在有氯化喹啉作用下,复合物的细胞转染效率。细胞转染的给药方式如前所述,不同的是在转染过程中,在培养基中加入100μM的氯化喹啉。细胞的荧光素酶表达水平如图6C、D中所示,荧光素酶的表达水平显著上升,最高的荧光素酶蛋白/质量比(RLU/mgProtein)分别达到4.46×107(293T细胞)和9.63×105(NIH-3T3细胞)。
6、C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物的细胞毒性评价
本发明的细胞毒性评价实验同样在上述两种细胞系293T和NIH-3T3细胞中评价,实验采用Promega公司的CellTiterAQueousOneSolutionreagent试剂盒分别评价了C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物在固定DNA用量(1μg/μl),不同电荷比(N/P=2-8)的细胞毒性和固定电荷比(N/P=4),在不同DNA用量(1-6μg)条件下的细胞毒性。
将293T和NIH-3T3细胞分别接种于96孔板中,每孔1×104个细胞,在37℃,5%CO2条件下培养24小时后,细胞汇合度达到70%-80%。吸出培养基,加入按实施例2-3中所得C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物100μl,孵育4个小时。4小时后吸出培养基,换成新鲜的含10%FBS的DMEM,再培养20小时,然后按照MTS方法检测细胞存活率。细胞存活率如图7所示,在不同的条件下,细胞的存活率都达到了90%以上,可见本发明的C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物具有较低的细胞毒性。
实施例3
1、C18-G(LLKK)3G-TAT的合成
根据C18-G(LLKK)3G-TAT的氨基酸序列,C18-Gly-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Gly-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2(其中C18为硬脂酸),以Rink-酰胺树脂为固相载体,以HBTU-HOBt为缩合剂,采取标准Fmoc策略,利用微波多肽合成仪(CEM,USA)合成目标肽序列。以20ml三氟乙酸:苯甲硫醚:间甲酚:乙二硫醇:水(8.25:0.5:0.5:0.25:0.5,体积比)作裂解液,0℃反应30分钟,室温120反应分钟,将肽脱除保护基并从树脂上裂解下来。溶液经RP-HPLC纯化,RP-HPLC条件,A相:0.05%TFA/水;B相:0.05%TFA/70%ACN/水;色谱柱:C8;MALDI-Tof-MS:3225.84。
2、C18-G(LLKK)3G-TAT的圆二色谱表征
为了验证多肽是否能够形成α-螺旋,分别测试了多肽在50%三氟乙醇/PBS溶液和PBS溶液中的圆二色光谱。测试仪器:BiologicMOS-450圆二色谱仪。如图2所示,在50%三氟乙醇/PBS溶液(A)中C18-G(LLKK)3G-TAT在208nm和220nm有两个明显的负峰,显示其在疏水环境中能够形成很好的α-螺旋构象,螺旋度为70.93%;而在PBS溶液(B)中表现形成α-螺旋的趋势,螺旋度大幅提高为42.60%。可见在α-螺旋抗菌肽中引入疏水性基团,在分子内提供疏水环境能够有效的诱导α-螺旋抗菌肽在水溶液中形成双亲性α-螺旋构象。在该构象中,赖氨酸和亮氨酸分别排布在螺旋分子的两侧,更有利于阳离子的赖氨酸和核酸分子的磷酸基团结合,形成更加稳定致密的复合物;同时分布在另一侧的疏水性亮氨酸可以与疏水性的细胞膜融合,促进细胞对C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物的摄取。
3、C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物的制备与表征
取PGL-3质粒DNA1μg,稀释到25μl,C18-G(LLKK)3G-TAT配成1mg/ml的溶液,按照peptide/DNA电荷比(N/P)2-8吸取不同体积的肽溶液,稀释到25μl,将肽和DNA溶液混合,涡旋10s,在37℃孵育30min,形成不同电荷比的C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物。
为了评价C18-G(LLKK)3G-TAT载体负载DNA的能力,本发明研究了C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳。配制质量/体积比1%的琼脂糖/TAE溶液,在微波炉中加热溶解,倒入电泳槽模具中冷却30min,放入电泳槽中,加入10×TAE缓冲液。按照上述方法制备C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物,其中DNA为0.1μg,体积10μl上样,电压100v,60min。在EB染色液中染色15min,然后在凝胶成像仪下拍照,观察电泳中DNA迁移条带。结果如图3-C中所示,C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物电荷比在2.0时可以完全负载DNA。
C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物的粒径和zeta电位分析。复合物制备如上所述,粒径和zeta电位检测采用ZetasizerNanoZS90,Malvern激光粒度仪,检测温度25℃,每个样品重复三次,检测结果如图4所示。C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物的粒径随着电荷比增大,先由188.2nm降至93.9nm,然后稍微升至117.5nm。zeta电位随着正负电荷比增加由18.7mv升至36.6mv。
4、C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物的投射电镜表征
复合物制备如上所述,测试的样品为多肽/DNA电荷比为4的复合物。将制备好的C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物溶液5μl滴加在铜网上,30min后用滤纸吸干,在HitachiH-7650显微镜下拍照。如图5C所示,C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物为约40nm的纳米颗粒,比C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物纳米颗粒更小,可见在多肽中引入疏水性基团,促进双亲性α-螺旋构象形成有利于和DNA形成更加致密的纳米颗粒。同样,这一尺度比DLS所测的结果较小,是因为测试透射电镜时的复合物为晾干后的样品,比其在水溶液中测试的流体粒径尺度偏小。
5、C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物的转染效率
本发明的peptide/DNA复合物的细胞转染效率在两种细胞系293T和NIH-3T3细胞中评价。
将293T和NIH-3T3细胞分别接种于24孔板中,每孔接种5×104(500μlDMEM细胞悬液)个细胞,24小时后细胞汇合度达到80%,吸出培养基。将按实施例3-3中所得的C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物(每孔PGL-3质粒DNA1μg,电荷比(N/P)2-8)用DMEM培养基稀释到500μl,分别加入到细胞培养板,在37℃,5%CO2的细胞培养箱中孵育4小时。4小时后吸出培养基,加入500μl含10%FBS的DMEM培养基再培养44小时,然后检测细胞内荧光素酶表达。测试采用Promega公司的荧光素酶检测试剂盒,利用M5(MolecularDevices,WI,USA)酶标仪采集荧光信号值采集时间为500ms。统计结果绘图,数据如图6A、B中所示,实验数据每组重复三次,以商用脂质体Lipofectamine2000作为阳性对照。两种细胞的荧光素酶表达量在电荷比为4:1时达到最大,荧光素酶蛋白质量比(RLU/mgProtein)分别为7.22×107(293T细胞)和1.03×106(NIH-3T3细胞)。
本发明还评价了peptide/DNA复合物在有氯化喹啉作用下,复合物的细胞转染效率。细胞转染的给药方式如前所述,不同的是在转染过程中,在培养基中加入100μM的氯化喹啉。细胞的荧光素酶表达水平如图6C、D中所示,荧光素酶的表达水平显著上升,最高的荧光素酶蛋白/质量比(RLU/mgProtein)分别达到8.62×107(293T细胞)和1.62×106(NIH-3T3细胞)。
6、C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物的细胞毒性评价
本发明的细胞毒性评价实验同样在上述两种细胞系293T和NIH-3T3细胞中评价,实验采用Promega公司的CellTiterAQueousOneSolutionreagent试剂盒分别评价了C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物在固定DNA用量(1μg/μl),不同电荷比(N/P=2-8)的细胞毒性和固定电荷比(N/P=4),在不同DNA用量(1-6μg)条件下的细胞毒性。
将293T和NIH-3T3细胞分别接种于96孔板中,每孔1×104个细胞,在37℃,5%CO2条件下培养24小时后,细胞汇合度达到70%-80%。吸出培养基,加入按实施例3-3中所得C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物100μl,孵育4个小时。4小时后吸出培养基,换成新鲜的含10%FBS的DMEM,再培养20小时,然后按照MTS方法检测细胞存活率。细胞存活率如图7所示,在不同的条件下,细胞的存活率都达到了90%以上,可见本发明的C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物具有较低的细胞毒性。
实施例4
1、C18-C(LLKK)3C-TAT的合成
根据C18-C(LLKK)3C-TAT的氨基酸序列,C18-Cys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Cys-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2,以Rink-酰胺树脂为固相载体,以HBTU-HOBt为缩合剂,采取标准Fmoc策略,利用微波多肽合成仪(CEM,USA)合成目标肽序列。以20ml三氟乙酸:苯甲硫醚:间甲酚:乙二硫醇:水(8.25:0.5:0.5:0.25:0.5,体积比)作裂解液,0℃反应30分钟,室温120反应分钟,将肽脱除保护基并从树脂上裂解下来。溶液经RP-HPLC纯化,RP-HPLC条件,A相:0.05%TFA/水;B相:0.05%TFA/70%ACN/水;色谱柱:C8;MALDI-Tof-MS:3317.34。
2、C18-C(LLKK)3C-TAT的圆二色谱表征
为了验证多肽是否能够形成α-螺旋,分别测试了多肽在50%三氟乙醇/PBS溶液和PBS溶液中的圆二色光谱。测试仪器:BiologicMOS-450圆二色谱仪。如图2所示,在50%三氟乙醇/PBS溶液(A)中C18-C(LLKK)3C-TAT在208nm和220nm有两个明显的负峰,显示其在疏水环境中能够形成很好的α-螺旋构象,螺旋度为76.23%,略高于C18-G(LLKK)3G-TAT;而在PBS溶液(B)中表现形成明显的α-螺旋构象,螺旋度为69.42%。可见在α-螺旋抗菌肽中同时引入疏水性基团和半胱氨酸,在分子内提供疏水环境并且通过二硫键交联能够有效的诱导α-螺旋抗菌肽在水溶液中形成双亲性α-螺旋构象。在该构象中,赖氨酸和亮氨酸分别排布在螺旋分子的两侧,更有利于阳离子的赖氨酸和核酸分子的磷酸基团结合,形成更加稳定致密的复合物;同时分布在另一侧的疏水性亮氨酸可以与疏水性的细胞膜融合,促进细胞对C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物的摄取。
3、C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物的制备与表征
取PGL-3质粒DNA1μg,稀释到25μl,C18-C(LLKK)3C-TAT配成1mg/ml的溶液,按照peptide/DNA电荷比(N/P)2-8吸取不同体积的肽溶液,稀释到25μl,将肽和DNA溶液混合,涡旋10s,在37℃孵育30min,形成不同电荷比的C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物。
为了评价C18-C(LLKK)3C-TAT载体负载DNA的能力,本发明研究了C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳。配制质量/体积比1%的琼脂糖/TAE溶液,在微波炉中加热溶解,倒入电泳槽模具中冷却30min,放入电泳槽中,加入10×TAE缓冲液。按照上述方法制备C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物,其中DNA为0.1μg,体积10μl上样,电压100v,60min。在EB染色液中染色15min,然后在凝胶成像仪下拍照,观察电泳中DNA迁移条带。结果如图3-D中所示,C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物电荷比在2.0时可以完全负载DNA。
C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物的粒径和zeta电位分析。复合物制备如上所述,粒径和zeta电位检测采用ZetasizerNanoZS90,Malvern激光粒度仪,检测温度25℃,每个样品重复三次,检测结果如图4所示。C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物的粒径随着电荷比增大,先由185.4nm降至97.7nm,然后稍微升至116.9nm。zeta电位随着正负电荷比增加由19.4mv升至37.3mv。
4、C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物的投射电镜表征
复合物制备如上所述,测试的样品为多肽/DNA电荷比为4的复合物。将制备好的C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物溶液5μl滴加在铜网上,30min后用滤纸吸干,在HitachiH-7650显微镜下拍照。如图5D所示,C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物为约35nm的纳米颗粒,比C18-G(LLKK)3G-TAT/DNA复合物纳米颗粒更小,可见在多肽中同时引入疏水性基团和半胱氨酸,更有利于促进双亲性α-螺旋构象形成,并且和DNA形成更加致密的纳米颗粒。这一尺度比DLS所测的结果较小,是因为测试透射电镜时的复合物为晾干后的样品,比其在水溶液中测试的流体粒径尺度偏小。
5、C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物的转染效率
本发明的peptide/DNA复合物的细胞转染效率在两种细胞系293T和NIH-3T3细胞中评价。
将293T和NIH-3T3细胞分别接种于24孔板中,每孔接种5×104(500μlDMEM细胞悬液)个细胞,24小时后细胞汇合度达到80%,吸出培养基。将按实施例4-3中所得的C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物(每孔PGL-3质粒DNA1μg,电荷比(N/P)2-8)用DMEM培养基稀释到500μl,分别加入到细胞培养板,在37℃,5%CO2的细胞培养箱中孵育4小时。4小时后吸出培养基,加入500μl含10%FBS的DMEM培养基再培养44小时,然后检测细胞内荧光素酶表达。测试采用Promega公司的荧光素酶检测试剂盒,利用M5(MolecularDevices,WI,USA)酶标仪采集荧光信号值采集时间为500ms。统计结果绘图,数据如图6A、B中所示,实验数据每组重复三次,以商用脂质体Lipofectamine2000作为阳性对照。两种细胞的荧光素酶表达量在电荷比为4:1时达到最大,荧光素酶蛋白质量比(RLU/mgProtein)分别为1.11×108(293T细胞)和1.59×106(NIH-3T3细胞)。
本发明还评价了peptide/DNA复合物在有氯化喹啉作用下,复合物的细胞转染效率。细胞转染的给药方式如前所述,不同的是在转染过程中,在培养基中加入100μM的氯化喹啉。细胞的荧光素酶表达水平如图6C、D中所示,荧光素酶的表达水平显著上升,最高的荧光素酶蛋白/质量比(RLU/mgProtein)分别达到1.02×108(293T细胞)和1.64×106(NIH-3T3细胞)。
从结果可以看出,实施例4中的C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物具有最高的荧光素酶表达水平;同时,氯化喹啉对实施例4中C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物的转染效率提升很小,可见该载体/DNA复合逃逸内涵体的效率非常高,说明本发明多功能肽作为基因治疗载体的优越性。
6、C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物的细胞毒性评价
本发明的细胞毒性评价实验同样在上述两种细胞系293T和NIH-3T3细胞中评价,实验采用Promega公司的CellTiterAQueousOneSolutionreagent试剂盒分别评价了C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物在固定DNA用量(1μg/μl),不同电荷比(N/P=2-8)的细胞毒性和固定电荷比(N/P=4),在不同DNA用量(1-6μg)条件下的细胞毒性。
将293T和NIH-3T3细胞分别接种于96孔板中,每孔1×104个细胞,在37℃,5%CO2条件下培养24小时后,细胞汇合度达到70%-80%。吸出培养基,加入按实施例4-3中所得C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物100μl,孵育4个小时。4小时后吸出培养基,换成新鲜的含10%FBS的DMEM,再培养20小时,然后按照MTS方法检测细胞存活率。细胞存活率如图7所示,在不同的条件下,细胞的存活率都达到了90%以上,可见本发明的C18-C(LLKK)3C-TAT/DNA复合物具有较低的细胞毒性。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导,可以对那些细节进行各种修改和替换,这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (16)
1.核酸载体,所述载体含有细胞透膜肽和具有α-螺旋双亲性结构的抗菌肽。
2.权利要求1的核酸载体,其在所述抗菌肽的N端方向还连接有疏水性分子。
3.权利要求1或2的核酸载体,在所述细胞透膜肽和抗菌肽之间、和/或抗菌肽和疏水性分子之间还连接有1个氨基酸或者2-10个氨基酸组成的小肽;优选地,所述1个氨基酸为半胱氨酸,或者所述小肽中含有半胱氨酸。
4.权利要求1-3任一项的核酸载体,其在分子间形成二硫键。
5.权利要求1-4任一项的核酸载体,其中所述细胞透膜肽选自TAT、Rn(n=6-10)、penetratin、MAP、pVEC、MPG、MPGΔNLS、Stearyl-R8、EB1、Tat-DRBD。
6.权利要求1-4任一项的核酸载体,其中所述具有α-螺旋双亲性结构的抗菌肽选自(LLKK)3、magainin、Pexiganan、mellitin、天蚕素、蛙皮素。
7.权利要求2-4任一项的核酸载体,其中所述疏水性分子选自长链脂肪酸(如硬脂酸、棕榈酸、油酸、亚油酸)、胆固醇、磷脂。
8.权利要求1-7任一项的核酸载体,其含有选自SEQIDNO:1~SEQIDNO:4所示的序列。
9.核酸载体/核酸复合体,其含有权利要求1-8任一项的核酸载体和核酸(DNA或RNA)分子。
10.权利要求9的核酸载体/核酸复合体,所述核酸载体与核酸分子的电荷比为1-10,例如为2-8。
11.重组细胞,其含有权利要求1-8任一项的核酸载体或者权利要求9或10的核酸载体/核酸复合体。
12.权利要求8或9的核酸载体/核酸复合体的制备方法,其包括将一定浓度的权利要求1-7任一项的核酸载体和核酸(DNA或RNA)分子孵育的步骤。
13.权利要求12的制备方法,所述核酸载体与核酸分子的电荷比为1-10,例如为2-8。
14.权利要求12或13的制备方法,所述孵育的条件为,36-38℃(例如37℃)条件下孵育20min以上(例如30min)。
15.权利要求1-8任一项的核酸载体用于负载或转运核酸分子的用途。
16.权利要求1-8任一项的核酸载体或者权利要求8或9的核酸载体/核酸复合体用于制备基因治疗药物的用途。
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