CN109876155A - 一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统 - Google Patents
一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109876155A CN109876155A CN201910111752.8A CN201910111752A CN109876155A CN 109876155 A CN109876155 A CN 109876155A CN 201910111752 A CN201910111752 A CN 201910111752A CN 109876155 A CN109876155 A CN 109876155A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- star
- delivery system
- poss
- core
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
本发明公开了一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统，本发明是以阳离子聚合物POSS‑(CG‑NLS‑G‑TAT)16通过静电作用负载上ZNF580基因形成二元基因复合物，然后通过静电相互作用在二元基因复合物表面包裹上修饰了靶向多肽的酸敏感外壳PLCA‑CAGW，从而制备了兼具电荷翻转和靶向功能的基因递送系统。该基因递送系统能促进特定细胞的摄取，能在弱酸性环境下做出智能响应，加速内涵体逃逸和细胞核摄入，从而提高基因转染效率，实现增强内皮细胞体外血管生成的目的。以解决传统基因递送系统所存在的细胞毒性‑转染效率恶性循环的问题。
Description
技术领域
本发明属于基因载体材料技术领域，具体涉及一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统及制备方法和应用。
技术背景
通过基因治疗的手段修复受损基因，可实现对肿瘤和心血管疾病等基因相关疾病的治疗。基因治疗是指利用特定的基因输送系统将具有生物学功能的核酸或含有目的基因的质粒DNA导入到细胞内，使核酸或质粒DNA在细胞内维持相应功能。然而，限制基因药物临床试验效果的因素一直是缺乏安全有效的递送系统。因此，需要寻求合适的载体，将基因治疗药物有效地递送到靶细胞，实现高效的基因治疗。
阳离子聚合物载体由于具有无基因尺寸限制、可大量生产且产品质量重复性好、价格低、使用简单方便、易于修饰等优点，受到了研究者的广泛关注。笼状倍半硅氧烷具有八个有机基团，易于能被功能化基团修饰，其结构新奇、性能独特，在基因治疗方面呈现出很大的潜力。但阳离子聚合物的正电荷和高分子量使其具有较高的毒性。研究者通常利用具有“隐形”功能的大分子如聚乙二醇对载体表面进行修饰，从而屏蔽载体在血液循环中的非特异性作用，延长循环时间。然而，这也影响了载体与靶细胞之间的相互作用，降低了基因递送效率。
近年来，研究者提出了智能基因或药物递送系统的设计理念。利用体内环境的差异性，发明了响应性递送系统，使其在体内生理环境下呈现弱负电、中性或弱正电，但在到达微酸性肿瘤组织或者细胞时发生电荷翻转，并在进入细胞后能对溶酶体/内涵体的弱酸环境作出响应。这类智能基因或药物递送系统具有良好的生物相容性，并能实现在靶组织或细胞中累积，且具有较好的内涵体逃逸能力，从而实现基因或药物的递送。
目前，细胞穿透肽(TAT)和核定位信号肽(NLS)对基因载体进行修饰，能促进载体进入细胞以及基因穿过核孔到达细胞核中，取得了一定的成功，但其在体内的非特异性结合降低了其效果。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统。
本发明的第二个目的是提供一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统的应用。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统的制备方法，包括如下步骤：(1)星型阳离子聚合物POSS-(CG-NLS-G-TAT)16的制备：
1)取POSS-(NH3 +Cl-)8溶于pH为8-9的磷酸盐缓冲溶液中得到溶液一；取二烯丙基氨基甲酰氯溶于无水氯仿中，得到溶液二；将溶液一冷却至0-4℃，在搅拌条件下，将溶液二滴加到溶液一中，滴加1M NaOH水溶液，保持反应液的pH在8-9，再在室温下搅拌12-15h，分离得到有机相，依次用盐酸水溶液、饱和NaCl水溶液和去离子水洗涤有机相，再用无水Na2SO4干燥，过滤，真空干燥得到粗产品，纯化，得到POSS-(DA)8；所述POSS-(NH3 +Cl-)8和二烯丙基氨基甲酰氯的质量比为1:(5-7)；
2)按质量比为2:(0.5-1):(46-65)的比例，取POSS-(DA)8、光引发剂安息香二甲醚和TAT-G-NLS-GC溶于体积浓度为50-75％的四氢呋喃水溶液中，紫外光光照10-15min，置于截留分子量3500-5000Da的透析袋中，在蒸馏水中透析24-48h，冷冻干燥，得到多肽功能化的星型阳离子聚合物POSS-(CG-NLS-G-TAT)16；
POSS为笼状倍半硅氧烷的缩写；
POSS-(NH3 +Cl-)8为八氨丙基笼状倍半硅氧烷盐酸盐的缩写；
POSS-(DA)8为二烯丙基官能化的笼状倍半硅氧烷缩写；
TAT-G-NLS-GC的氨基酸序列：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Gly-Cys；
(2)电荷翻转和靶向功能外层的制备：
取数均分子量为4200Da的ε-PLL溶于去离子水中得到ε-PLL水溶液，取双官能的偶联剂溶于甲醇中得到溶液三；在搅拌条件下，将溶液三滴加到ε-PLL水溶液中，所述ε-PLL和双官能偶联剂的质量比为20:(6-12)，在黑暗条件下搅拌4-6h，加入双官能偶联剂质量(2-3)倍的靶向多肽CAGW，继续搅拌6-10h；用1M NaOH水溶液调节pH＝8-9，降温至0-4℃，加入顺式乌头酸酐，所述ε-PLL与顺式乌头酸酐的质量比为2:(5-7.5)，搅拌12-15h，置于截留分子量为1000-2000Da的透析袋中，用pH为8-9的蒸馏水透析24-48h，冷冻干燥，得到PLCA-CAGW粉末；即电荷翻转和靶向功能外层；
ε-PLL是ε-聚赖氨酸的缩写；
双官能的偶联剂为3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯；
靶向多肽CAGW的氨基酸序列为：Cys-Ala-Gly-Trp；
CA是顺式乌头酸酐的缩写；
PLCA-CAGW为顺式乌头酸酐和靶向多肽共同修饰聚赖氨酸的聚合物的缩写；
(3)兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统的制备：
取POSS-(CG-NLS-G-TAT)16溶于pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，与目的基因混匀，室温下静置20-30min，得到二元基因复合物溶液；取PLCA-CAGW溶于pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，得到PLCA-CAGW溶液，将PLCA-CAGW溶液加入到二元基因复合物溶液中，混匀，室温下静置20-30min，POSS-(CG-NLS-G-TAT)16、目的基因与PLCA-CAGW的质量比为5：1：(0.5-5)，得到兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统。
上述方法制备的兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统。
上述兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统在制备治疗心血管疾病基因药物的应用。
本发明的优点：
(1)本发明的选用的笼状倍半硅氧烷具有良好的稳定性以及易修饰性，修饰多肽序列后星型阳离子聚合物较直链肽聚合物稳定以及更强的基因负载能力。
(2)本发明制备的兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统，具备优良的生物相容性，延长体内循环时间；同时，递送系统修饰的靶向多肽提高了其主动靶向性，促进递送系统进入细胞；此外，酸敏感外层在内涵体中水解，加速递送系统的内涵体逃逸；最后，外层脱离后暴露出细胞穿透肽和核信号定位肽，有利于基因进入细胞核中，克服层层障碍，提高最终的基因递送效率。
(3)本发明制备的星型核壳式基因递送系统兼具电荷翻转和靶向功能，可以使二者协同发挥作用，解决传统基因递送过程中所面临的低效细胞摄取、内涵体逃逸以及细胞核摄入的问题，以提高转染效果。相比于仅具有电荷翻转功能星型核壳式基因递送系统，该基因递送系统具有增强的内皮细胞靶向摄取；相比于仅具有靶向功能的星型核壳式基因递送系统，该基因递送系统则呈现出更高效的内涵体逃逸以及细胞核摄入；相比于二元基因复合物，该基因递送系统则可以协同发挥内皮细胞靶向和电荷翻转的功能，明显降低了细胞毒性，同时展现出内皮细胞靶向并且促进了内涵体逃逸和细胞核摄入过程，从而显著提高了ZNF580蛋白的表达以及体外血管形成。
附图说明
图1为星型核壳式基因递送系统负载基因的能力及稳定性的结果。
图2为星型核壳式基因递送系统的粒径和电位的结果。
图3为顺式乌头酰胺pH响应水解反应的测定结果。
图4为星型核壳式基因递送系统电荷翻转的性质的结果。
图5为细胞毒性实验的结果。
图6为蛋白印迹实验的结果。
图7为细胞摄取实验的结果。
图8为体外血管形成实验的结果。
具体实施方式
以下通过实施例的具体实施方式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。此外，在阅读本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做改动或修改，该等价形式同样落于本申请的权利要求所限定的范围。
TAT-G-NLS-GC多肽的氨基酸序列为Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Gly-Cys，与靶向多肽CAGW：Cys-Ala-Gly-Trp均购于GL Biochem公司。
八氨丙基笼状倍半硅氧烷盐酸盐购于Hybrid Plastics公司。
本发明所用的目的基因是以ZNF580基因为例，但不限定这个基因。
ZNF580基因来源：ZNF580是由中国人民武装警察部队后勤学院生理与病理实验室张文成课题组首先克隆并于Genbank注册的C2H2型转录因子新基因，注册号为AF184939。该基因的核苷酸序列:
atgctgctgc tgcctccgcg cccaccgcat ccgcgttctt cttctccaga agcaatggac 60
ccgccgcctc cgaaagcccc accgttcccg aaagctgaag gcccgtcctc tactccgtct 120
agcgccgctg gcccgcgtcc gccacgcctg ggtcgtcacc tgctgatcga tgccaacggt 180
gtaccgtaca cctacactgt tcagctggaa gaggaaccac gtggcccgcc gcaacgtgaa 240
gcacctccgg gtgaaccggg ccctcgtaaa ggttattcct gcccggaatg tgcacgtgtg 300
ttcgcatctc cgctgcgtct gcagagccac cgcgttagcc actccgacct gaagccgttc 360
acctgcggcg cgtgcggtaa agctttcaaa cgtagctccc acctgtctcg tcaccgtgcg 420
acccaccgcg ctcgtgcggg tccgccgcat acgtgcccgc tgtgtccacg tcgctttcag 480
gatgctgcgg agctggcgca gcacgtccgc ctgcattaa 519(SEQ ID NO.1)
各实施例中：
POSS为笼状倍半硅氧烷的缩写；
POSS-(NH3 +Cl-)8为八氨丙基笼状倍半硅氧烷盐酸盐的缩写；
POSS-(DA)8为二烯丙基官能化的笼状倍半硅氧烷缩写；
TAT-G-NLS-GC的氨基酸序列：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Gly-Cys；(SEQ ID NO.2)
ε-PLL是ε-聚赖氨酸的缩写；
双官能的偶联剂为3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯；
靶向多肽CAGW的氨基酸序列为：Cys-Ala-Gly-Trp；
CA是顺式乌头酸酐的缩写；
SA是琥珀酸酐的缩写；
实施例1
一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统的制备方法，包括如下步骤：
(1)星型阳离子聚合物POSS-(CG-NLS-G-TAT)16的制备：
1)称取1.5g POSS-(NH3 +Cl-)8溶于10mLpH为8.5的磷酸盐缓冲溶液中得到溶液一；取8.16g二烯丙基氨基甲酰氯溶于40mL无水氯仿中，得到溶液二；将溶液一冷却至0℃，在搅拌条件下，将溶液二滴加到溶液一中，滴加1M NaOH溶液，保持反应液的pH在8.5，再在室温下搅拌12h，分离得到有机相，依次用1M盐酸水溶液、饱和NaCl水溶液和去离子水洗涤有机相，用无水Na2SO4干燥，过滤，真空干燥48h得到粗产品，用反相柱层析法进一步纯化，得到POSS-(DA)8；
2)取2mgPOSS-(DA)8、1mg光引发剂安息香二甲醚和55mgTAT-G-NLS-GC溶于体积浓度为66％的四氢呋喃水溶液中，紫外光光照10min，置于截留分子量3500Da的透析袋中，在蒸馏水中透析48h，冷冻干燥，得到多肽功能化的星型阳离子聚合物POSS-(CG-NLS-G-TAT)16；
(2)电荷翻转和靶向功能外层的制备：
取20mg数均分子量为4200Da的ε-PLL溶于15mL去离子水得到ε-PLL水溶液，取10mg双官能的偶联剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯溶于2mL甲醇中，得到溶液三；在搅拌条件下，将溶液三滴加到ε-PLL水溶液中，在黑暗条件下搅拌4h，加入双官能偶联剂质量2.5倍的靶向多肽CAGW，继续搅拌8h；用1M NaOH水溶液调节pH＝8.5，降温至0℃，加入50mg顺式乌头酸酐，搅拌13h，置于截留分子量为1000Da的透析袋中，用pH为8的蒸馏水透析36h，冷冻干燥，得到PLCA-CAGW粉末；即电荷翻转和靶向功能外层；
(3)兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统的制备：
取2mgPOSS-(CG-NLS-G-TAT)16溶于10mLpH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，与6份目的基因溶液混匀，使POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与目的基因的质量比分别为0.5:1，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，室温下静置25min，得到6份二元基因复合物溶液；
取PLCA-CAGW溶于pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，得到PLCA-CAGW溶液，将PLCA-CAGW溶液加入到二元基因复合物溶液中，混匀，室温下静置25min，POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLCA-CAGW的质量比为5：1.25，得到6份兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统。
目的基因为ZNF580基因。
实施例2
一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统的制备方法，包括如下步骤：
(1)、(2)同实施例1步骤(1)、(2)；
(3)兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统的制备：
取2mgPOSS-(CG-NLS-G-TAT)16溶于10mLpH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，与基因溶液混匀，使POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与目的基因的质量比为5:1，室温下静置25min，得到二元基因复合物溶液；
取4份PLCA-CAGW溶于pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，得到PLCA-CAGW溶液，将PLCA-CAGW溶液加入到二元基因复合物溶液中，混匀，室温下静置25min，POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLCA-CAGW的质量比分别为(5:0.5),(5:1.25),(5:2.5),(5:5)，得到4份兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统。
目的基因为ZNF580基因。
对照例1：
一种电荷翻转的星型核壳式基因递送系统的制备方法，包括如下步骤：
同实施例1步骤(1)；
(2)电荷翻转外层的制备：
取20mg数均分子量为4200Da的ε-PLL溶于15mL去离子水得到ε-PLL水溶液，取10mg双官能的偶联剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯溶于2mL甲醇中，得到溶液三；在搅拌条件下，将溶液三滴加到ε-PLL水溶液中，在黑暗条件下搅拌4h，用1M NaOH水溶液调节pH＝8.5，降温至0℃，加入50mg顺式乌头酸酐，搅拌13h，置于截留分子量为1000Da的透析袋中，用pH为8的蒸馏水透析36h，冷冻干燥，得到PLCA粉末；即电荷翻转外层；
(3)电荷翻转的星型核壳式基因递送系统的制备：
取2mgPOSS-(CG-NLS-G-TAT)16溶于10mLpH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，与基因溶液混匀，使POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与目的基因的质量比为，5:1，室温下静置25min，得到二元基因复合物溶液；
取PLCA溶于pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，得到PLCA溶液，将PLCA溶液加入到二元基因复合物溶液中，混匀，室温下静置25min，POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLCA的质量比为5：1.25，得到电荷翻转的星型核壳式基因递送系统。
对照例2：
一种靶向功能的星型核壳式基因递送系统的制备方法，包括如下步骤：
(1)同实施例1步骤(1)；
(2)靶向功能外层的制备：
取20mg数均分子量为4200Da的ε-PLL溶于15mL去离子水得到ε-PLL水溶液，取10mg双官能的偶联剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯溶于2mL甲醇中，得到溶液三；在搅拌条件下，将溶液三滴加到ε-PLL水溶液中，在黑暗条件下搅拌4h，加入双官能偶联剂质量2.5倍的靶向多肽CAGW，继续搅拌8h；用1M NaOH水溶液调节pH＝8.5，降温至0℃，加入32mg的琥珀酸酐，搅拌13h，置于截留分子量为1000Da的透析袋中，用蒸馏水透析36h，冷冻干燥，得到PLSA-CAGW粉末；即靶向功能外层；
(3)靶向功能的星型核壳式基因递送系统的制备：
取2mgPOSS-(CG-NLS-G-TAT)16溶于10mLpH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，与6份目的基因溶液混匀，使POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与目的基因的质量比为5:1，室温下静置25min，得到二元基因复合物溶液；
取PLSA-CAGW溶于pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，得到PLSA-CAGW溶液，将PLSA-CAGW溶液加入到二元基因复合物溶液中，混匀，室温下静置25min，POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLSA-CAGW的质量比为5：1.25，得到靶向功能的星型核壳式基因递送系统。
实验例1：星型核壳式基因递送系统负载基因的能力及稳定性
分别配制实施例1中以POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与目的基因质量比为0.5:1，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1的二元基因复合物和实施例2中以POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLCA-CAGW质量比5:0.5，5:1.25，5:2.5，5:5的兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统，与6×loading buffer混匀后，样品在1×TAE缓冲溶液，0.8％琼脂糖凝胶，电压100伏的条件下进行电泳30分钟后，在紫外灯照射下观察质粒pZNF580在凝胶电泳中的分布位置并拍照记录。结果见图1，A、B分别为二元基因复合物和基因递送系统的结果，且A、B两图中条带1、2分别表示marker和裸ZNF580，后面列表示不同质量比。
A图中的条带3、4、5、6、7、8各代表实施例1中以POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与目的基因质量比为0.5:1，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1的二元基因复合物。
B图中的条带3、4、5、6各代表实施例2中以POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLCA-CAGW质量比5:0.5，5:1.25，5:2.5，5:5的兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统
实验结果表明，对于二元基因复合物，POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与目的基因的质量比为2:1时，基因完全负载上；基于转染效果的考虑，选择上述质量比为5:1的二元基因复合物，且在该质量比下，功能外层的加入不会影响二元基因复合物的稳定性。
实验例2：星型核壳式基因递送系统的粒径和电位
分别配制实施例2中以POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与目的基因的质量比为5:1的二元基因复合物和POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLCA-CAGW质量比5:0.5，5:1.25，5:2.5，5:5的兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统，对照例1中的电荷翻转的星型核壳式基因递送系统以及对照例2中靶向功能的星型核壳式基因递送系统。使用Zetasizer Nano ZS测量各溶液的粒径和电位，结果见图2。实验结果表明实施例2的样品具有合适的粒径，在120-160nm之间，且电位随外层含量的增加而降低。对照例1和对照例2的样品均具有合适的粒径和电位，且电位均在+10mV以内，带微正电。
实验例3：顺式乌头酰胺pH响应水解反应的测定
制备对照例1中步骤(2)所述的PLCA粉末，溶解在D2O中，然后用DCl将溶液的pH分别调至7.4和5.5，依次于室温放置0.5h，2h，4h，24h后，测量溶液中的H核磁谱图，结果见图3。实验结果表明PLCA中的顺式乌头酰胺键在pH为5.5的条件下会发生水解，重新生成氨基，且24h后就水解完全。
实验例4：星型核壳式基因递送系统电荷翻转的性质
分别制备实施例2中POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLCA-CAGW质量比5:1.25的兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统和对照例2中所述靶向功能的星型核壳式基因递送系统，分别调节溶液的pH为7.4和5.5，使用Zeta potential仪测量样品溶液在1h、2h、4h、7h、10h、13h和24h下的电位，结果见图4。结果表明兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统在弱酸性条件下不稳定，逐渐水解并重新生成对应的氨基，电荷逐渐升高；而靶向功能的星型核壳式基因递送系统的电位不具有pH响应性。
实验例5：星型核壳式基因递送系统体外评价
(1)细胞毒性实验将人脐静脉内皮细胞以1×104/孔接种到96孔板，37℃孵育24h，换为无血清DMEM培养基。12h后，加入不同浓度的基因载体和基因复合物水溶液，混合均匀，4小时后弃去培养基，更换为完全培养基(含10％FBS)，继续培养24小时。然后向每个孔中加入5毫克/毫升的MTT溶液20微升，4h后弃去培养液，并加入150μLDMSO，置摇床上震荡10min。用酶标仪测量波长490nm处的光密度值(OD)，按公式：计算相对细胞活性。实验结果见图5，A为POSS-(CG-NLS-G-TAT)16；B为实施例2中的二元基因复合物；C为实施例2中以POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLCA-CAGW质量比5:1.25的POSS-(CG-NLS-G-TAT)16/PLCA-CAGW复合物；D为实施例2以POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLCA-CAGW质量比5:1.25的兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统；E为对照例2中以POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLSA-CAGW质量比5:1.25的POSS-(CG-NLS-G-TAT)16/PLSA-CAGW复合物；F为对照例2以POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLSA-CAGW质量比5:1.25的靶向功能的星型核壳式基因递送系统；结果表明细胞存活率在90％以上，星型核壳式基因递送系具有良好的生物相容性。
(2)蛋白印迹实验
分别配制实施例2中以POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLCA-CAGW质量比5:1.25的兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统，对照例1中的电荷翻转的星型核壳式基因递送系统以及对照例2中靶向功能的星型核壳式基因递送系统。将人脐静脉内皮细胞以3×105/孔接种到6孔板，37℃孵育24h，换为无血清DMEM培养基。12h后，加入已制好的样品，继续培养4h，换新鲜完全培养基，继续培养24h。弃掉培养液，用磷酸盐缓冲液清洗三遍，加100μL细胞裂解液(含1％的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)，冰上裂解30min，收集到EP管中。4℃13000rpm离心5分钟，取上清，按浓度配齐，沸水煮5min变性。按蛋白印迹法的操作说明，检测蛋白的表达水平，并用Image J软件对结果进行分析，实验结果见图6。A空白对照组；B为对照例1中的电荷翻转的星型核壳式基因递送系统；C为实施例2中以POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLCA-CAGW质量比5:1.25的兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统；D为对照例2中靶向功能的星型核壳式基因递送系统。结果表明，
实施例2制得的兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统递送效果最佳。
(3)细胞摄取实验
用Cy5标记的寡核苷酸代替ZNF580基因，分别配制实施例2中以POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLCA-CAGW质量比5:1.25的兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统，对照例1中的电荷翻转的星型核壳式基因递送系统以及对照例2中靶向功能的星型核壳式基因递送系统。将人脐静脉内皮细胞以3×105/孔接种到6孔板，37℃孵育24h，换为无血清DMEM培养基。12h后，加入已配制的样品，继续培养4h，弃培养液，胰酶消化，收集到EP管中。用磷酸盐缓冲液冲洗三遍，轻轻吹打重悬，使其混合均匀后用流式细胞仪进行测定分析，计算平均荧光强度，结果见图7。A空白对照组；B为对照例1中的电荷翻转的星型核壳式基因递送系统；C为实施例2中以POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLCA-CAGW质量比5:1.25的兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统；D为对照例2中靶向功能的星型核壳式基因递送系统。实验结果表明CACW靶向配体能促进载体进入内皮细胞。
(4)体外血管形成实验
根据Corning Matrigel Matrix说明书，首先将Matrigel胶置于4℃过夜充分融化。然后取50μL稀释后的Matrigel(10mg/mL)缓慢滴加到预冷的96-孔板孔内，37℃孵育1h，使Matrigel胶充分地凝胶化。再将实施例2中以POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLCA-CAGW质量比5:1.25配制的兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统，对照例1中配制的电荷翻转的星型核壳式基因递送系统以及对照例2中配制的靶向功能的星型核壳式基因递送系统转染后的人脐静脉内皮细胞以4×104/孔均匀地接种在Matrigel胶表面，继续孵育6h，光学显微镜下观察血管形成并拍照记录。每个样品进行3次平行实验，并通过ImageProPlus6.0软件对血管环个数进行统计。结果见图8。A空白对照组；B为对照例1中的电荷翻转的星型核壳式基因递送系统；C为实施例2中以POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLCA-CAGW质量比5:1.25的兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统；D为对照例2中靶向功能的星型核壳式基因递送系统。实验结果表明，兼具靶向和电荷翻转的星型基因递送系统具有良好的促血管形成能力。
实施例3
一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统的制备方法，包括如下步骤：
(1)星型阳离子聚合物POSS-(CG-NLS-G-TAT)16的制备：
1)称取1.5g POSS-(NH3 +Cl-)8溶于10mLpH为8的磷酸盐缓冲溶液中得到溶液一；取7.5g二烯丙基氨基甲酰氯溶于40mL无水氯仿中，得到溶液二；将溶液一冷却至0℃，在搅拌条件下，将溶液二滴加到溶液一中，滴加1M NaOH溶液，保持反应液的pH在8，再在室温下搅拌13h，分离得到有机相，依次用1M盐酸水溶液、饱和NaCl水溶液和去离子水洗涤有机相，用无水Na2SO4干燥，过滤，真空干燥48h得到粗产品，用反相柱层析法进一步纯化，得到POSS-(DA)8；
2)取2mgPOSS-(DA)8、0.5mg光引发剂安息香二甲醚和46mgTAT-G-NLS-GC溶于体积浓度为50％的四氢呋喃水溶液中，紫外光光照10min，置于截留分子量4000Da的透析袋中，在蒸馏水中透析24h，冷冻干燥，得到多肽功能化的星型阳离子聚合物POSS-(CG-NLS-G-TAT)16；
(2)兼具电荷翻转和靶向功能外层的制备：
取20mg数均分子量为4200Da的ε-PLL溶于15mL去离子水得到ε-PLL水溶液，取6mg双官能的偶联剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯溶于2mL甲醇中，得到溶液三；在搅拌条件下，将溶液三滴加到ε-PLL水溶液中，在黑暗条件下搅拌4h，加入双官能偶联剂质量2倍的靶向多肽CAGW，继续搅拌6h；用1M NaOH水溶液调节pH＝8，降温至0℃，加入50mg顺式乌头酸酐，搅拌12h，置于截留分子量为1000Da的透析袋中，用pH为8的蒸馏水透析24h，冷冻干燥，得到PLCA-CAGW粉末；即兼具电荷翻转和靶向功能外层；
(3)兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统的制备：
取2mgPOSS-(CG-NLS-G-TAT)16溶于10mLpH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，与目的基因溶液混匀，使POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与目的基因的质量比为5:1，室温下静置20min，得到二元基因复合物溶液；
取PLCA-CAGW溶于pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，得到PLCA-CAGW溶液，将PLCA-CAGW溶液加入到二元基因复合物溶液中，混匀，室温下静置20min，POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLCA-CAGW的质量比为5：0.5，得到兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统。目的基因为ZNF580基因。
实验证明，本实施例制备的兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统的性质和效果与实施例1制备的产品相似。
实施例4
一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统的制备方法，包括如下步骤：
(1)星型阳离子聚合物POSS-(CG-NLS-G-TAT)16的制备：
1)称取1.5g POSS-(NH3 +Cl-)8溶于10mLpH为9的磷酸盐缓冲溶液中得到溶液一；取10.5g二烯丙基氨基甲酰氯溶于40mL无水氯仿中，得到溶液二；将溶液一冷却至4℃，在搅拌条件下，将溶液二滴加到溶液一中，滴加1M NaOH溶液，保持反应液的pH在9，再在室温下搅拌15h，分离得到有机相，依次用1M盐酸水溶液、饱和NaCl水溶液和去离子水洗涤有机相，用无水Na2SO4干燥，过滤，真空干燥48h得到粗产品，用反相柱层析法进一步纯化，得到POSS-(DA)8；
2)取2mgPOSS-(DA)8、0.8mg光引发剂安息香二甲醚和65mgTAT-G-NLS-GC溶于体积浓度为75％的四氢呋喃水溶液中，紫外光光照15min，置于截留分子量5000Da的透析袋中，在蒸馏水中透析36h，冷冻干燥，得到多肽功能化的星型阳离子聚合物POSS-(CG-NLS-G-TAT)16；
(2)兼具电荷翻转和靶向功能外层的制备：
取20mg数均分子量为4200Da的ε-PLL溶于15mL去离子水得到ε-PLL水溶液，取12mg双官能的偶联剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯溶于4mL甲醇中，得到溶液三；在搅拌条件下，将溶液三滴加到ε-PLL水溶液中，在黑暗条件下搅拌6h，加入双官能偶联剂质量3倍的靶向多肽CAGW，继续搅拌10h；用1M NaOH水溶液调节pH＝9，降温至4℃，加入75mg顺式乌头酸酐，搅拌15h，置于截留分子量为2000Da的透析袋中，用pH为9的蒸馏水透析48h，冷冻干燥，得到PLCA-CAGW粉末；即兼具电荷翻转和靶向功能外层；
(3)兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统的制备：
取2mgPOSS-(CG-NLS-G-TAT)16溶于10mLpH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，与目的基因溶液混匀，使POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与目的基因的质量比分别为5:1，室温下静置30min，得到二元基因复合物溶液；
取PLCA-CAGW溶于pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，得到PLCA-CAGW溶液，将PLCA-CAGW溶液加入到二元基因复合物溶液中，混匀，室温下静置30min，POSS-(CG-NLS-G-TAT)16与PLCA-CAGW的质量比为5：5，得到兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统。目的基因为ZNF580基因。
实验证明，本实施例制备的兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统的性质和效果与实施例1制备的产品相似。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgctgctgc tgcctccgcg cccaccgcat ccgcgttctt cttctccaga agcaatggac 60
ccgccgcctc cgaaagcccc accgttcccg aaagctgaag gcccgtcctc tactccgtct 120
agcgccgctg gcccgcgtcc gccacgcctg ggtcgtcacc tgctgatcga tgccaacggt 180
gtaccgtaca cctacactgt tcagctggaa gaggaaccac gtggcccgcc gcaacgtgaa 240
gcacctccgg gtgaaccggg ccctcgtaaa ggttattcct gcccggaatg tgcacgtgtg 300
ttcgcatctc cgctgcgtct gcagagccac cgcgttagcc actccgacct gaagccgttc 360
acctgcggcg cgtgcggtaa agctttcaaa cgtagctccc acctgtctcg tcaccgtgcg 420
acccaccgcg ctcgtgcggg tccgccgcat acgtgcccgc tgtgtccacg tcgctttcag 480
gatgctgcgg agctggcgca gcacgtccgc ctgcattaa 519
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Pro Lys Lys Lys
1 5 10 15
Arg Lys Val Gly Cys
20
Claims (3)
1.一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)星型阳离子聚合物POSS-(CG-NLS-G-TAT)16的制备：
1)取POSS-(NH3 +Cl-)8溶于pH为8-9的磷酸盐缓冲溶液中得到溶液一；取二烯丙基氨基甲酰氯溶于无水氯仿中，得到溶液二；将溶液一冷却至0-4℃，在搅拌条件下，将溶液二滴加到溶液一中，保持反应液的pH在8-9，再在室温下搅拌12-15h，分离得到有机相，洗涤有机相，干燥，过滤，真空干燥得到粗产品，纯化，得到POSS-(DA)8；所述POSS-(NH3 +Cl-)8和二烯丙基氨基甲酰氯的质量比为1:(5-7)；
2)按质量比为2:(0.5-1):(46-65)的比例，取POSS-(DA)8、光引发剂安息香二甲醚和TAT-G-NLS-GC溶于体积浓度为50-75％的四氢呋喃水溶液中，紫外光光照10-15min，置于截留分子量3500-5000Da的透析袋中，在蒸馏水中透析24-48h，冷冻干燥，得到多肽功能化的星型阳离子聚合物POSS-(CG-NLS-G-TAT)16；
POSS为笼状倍半硅氧烷的缩写；
POSS-(NH3 +Cl-)8为八氨丙基笼状倍半硅氧烷盐酸盐的缩写；
POSS-(DA)8为二烯丙基官能化的笼状倍半硅氧烷缩写；
TAT-G-NLS-GC的氨基酸序列：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Gly-Cys；
(2)电荷翻转和靶向功能外层的制备：
取数均分子量为4200Da的ε-PLL溶于去离子水中得到ε-PLL水溶液，取双官能的偶联剂溶于甲醇中得到溶液三；在搅拌条件下，将溶液三滴加到ε-PLL水溶液中，所述ε-PLL和双官能偶联剂的质量比为20:(6-12)，在黑暗条件下搅拌4-6h，加入双官能偶联剂质量(2-3)倍的靶向多肽CAGW，继续搅拌6-10h；调节pH＝8-9，降温至0-4℃，加入顺式乌头酸酐，所述ε-PLL与顺式乌头酸酐的质量比为2:(5-7.5)，搅拌12-15h，置于截留分子量为1000-2000Da的透析袋中，用pH为8-9的蒸馏水透析24-48h，冷冻干燥，得到PLCA-CAGW粉末；即电荷翻转和靶向功能外层；
ε-PLL是ε-聚赖氨酸的缩写；
双官能的偶联剂为3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯；
靶向多肽CAGW的氨基酸序列为：Cys-Ala-Gly-Trp；
CA是顺式乌头酸酐的缩写；
(3)兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统的制备：
取POSS-(CG-NLS-G-TAT)16溶于pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，与目的基因混匀，室温下静置20-30min，得到二元基因复合物溶液；取PLCA-CAGW溶于pH为7.4的10mM磷酸盐缓冲液中，得到PLCA-CAGW溶液，将PLCA-CAGW溶液加入到二元基因复合物溶液中，混匀，室温下静置20-30min，POSS-(CG-NLS-G-TAT)16、目的基因与PLCA-CAGW的质量比为5：1：(0.5-5)，得到兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统。
2.权利要求1的方法制备的兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统。
3.根据权利要求2的兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统在制备治疗心血管疾病基因药物的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910111752.8A CN109876155A (zh) | 2019-02-12 | 2019-02-12 | 一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910111752.8A CN109876155A (zh) | 2019-02-12 | 2019-02-12 | 一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109876155A true CN109876155A (zh) | 2019-06-14 |
Family
ID=66928044
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910111752.8A Pending CN109876155A (zh) | 2019-02-12 | 2019-02-12 | 一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109876155A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110438162A (zh) * | 2019-08-22 | 2019-11-12 | 广州晶欣生物科技有限公司 | 一种改良型非脂质体转染试剂盒及其应用方法 |
| CN110755629A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-02-07 | 天津大学 | 一种逐级响应型双基因递送系统及制备方法 |
| CN111944851A (zh) * | 2019-05-16 | 2020-11-17 | 天津大学 | 一种纳米尺度siRNA递送系统 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108531513A (zh) * | 2018-03-20 | 2018-09-14 | 天津大学 | 基于poss的星型多重靶向功能性基因载体及应用 |
| CN109265680A (zh) * | 2018-09-21 | 2019-01-25 | 中国科学院理化技术研究所 | 一种pH响应的ε-聚赖氨酸及其制备方法和应用 |
-
2019
- 2019-02-12 CN CN201910111752.8A patent/CN109876155A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108531513A (zh) * | 2018-03-20 | 2018-09-14 | 天津大学 | 基于poss的星型多重靶向功能性基因载体及应用 |
| CN109265680A (zh) * | 2018-09-21 | 2019-01-25 | 中国科学院理化技术研究所 | 一种pH响应的ε-聚赖氨酸及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BIN GAO 等: "A progressively targeted gene delivery system with a pH triggered surface charge-switching ability to drive angiogenesis in vivo", 《BIOMATER. SCI.,》 * |
| QIAOPING ZHANG等: "Multifunctional gene delivery systems with targeting ligand CAGW and charge reversal function for enhanced angiogenesis", 《J. MATER. CHEM. B》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111944851A (zh) * | 2019-05-16 | 2020-11-17 | 天津大学 | 一种纳米尺度siRNA递送系统 |
| CN110438162A (zh) * | 2019-08-22 | 2019-11-12 | 广州晶欣生物科技有限公司 | 一种改良型非脂质体转染试剂盒及其应用方法 |
| CN110438162B (zh) * | 2019-08-22 | 2021-06-25 | 广州晶欣生物科技有限公司 | 一种改良型非脂质体转染试剂盒及其应用方法 |
| CN110755629A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-02-07 | 天津大学 | 一种逐级响应型双基因递送系统及制备方法 |
| CN110755629B (zh) * | 2019-11-18 | 2022-09-23 | 天津大学 | 一种逐级响应型双基因递送系统及制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wu et al. | Bone mesenchymal stem cells stimulation by magnetic nanoparticles and a static magnetic field: release of exosomal miR-1260a improves osteogenesis and angiogenesis | |
| Yeo et al. | Photocrosslinkable hydrogel for myocyte cell culture and injection | |
| Xia et al. | Mechanical stimulation of Schwann cells promote peripheral nerve regeneration via extracellular vesicle-mediated transfer of microRNA 23b-3p | |
| Jeon et al. | Biodegradable, photocrosslinked alginate hydrogels with independently tailorable physical properties and cell adhesivity | |
| Chen et al. | Preconditioning and engineering strategies for improving the efficacy of mesenchymal stem cell-derived exosomes in cell-free therapy | |
| CN109876155A (zh) | 一种兼具电荷翻转和靶向功能的星型核壳式基因递送系统 | |
| Yang et al. | Bioactive glass nanoparticles inhibit osteoclast differentiation and osteoporotic bone loss by activating lncRNA NRON expression in the extracellular vesicles derived from bone marrow mesenchymal stem cells | |
| Park et al. | Receptor-mediated gene delivery into human mesenchymal stem cells using hyaluronic acid-shielded polyethylenimine/pDNA nanogels | |
| Feng et al. | Delivery of therapeutic miRNAs using nanoscale zeolitic imidazolate framework for accelerating vascularized bone regeneration | |
| CN108175759A (zh) | 一种抗肿瘤靶向给药系统及其制备方法与应用 | |
| CN103705465A (zh) | 一种微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统及其制备方法 | |
| CN105463002A (zh) | 多肽类核酸载体、其制备方法及用途 | |
| CN112353950B (zh) | 一种siRNA纳米递送系统的制备方法及其在前列腺癌中的应用 | |
| CN107629118A (zh) | 基于组氨酸的靶向性穿膜肽载体及用途 | |
| Gao et al. | A progressively targeted gene delivery system with a pH triggered surface charge-switching ability to drive angiogenesis in vivo | |
| Jiang et al. | Brain microenvironment responsive and pro‐angiogenic extracellular vesicle‐hydrogel for promoting neurobehavioral recovery in type 2 diabetic mice after stroke | |
| Yao et al. | Reduction-responsive cross-linked stearyl peptide for effective delivery of plasmid DNA | |
| Zhang et al. | Smart graphene-based hydrogel promotes recruitment and neural-like differentiation of bone marrow derived mesenchymal stem cells in rat skin | |
| Zhang et al. | Injectable supramolecular hybrid hydrogel delivers IL-1β-stimulated exosomes to target neuroinflammation | |
| Tong et al. | Polyethylenimine600-β-cyclodextrin: a promising nanopolymer for nonviral gene delivery of primary mesenchymal stem cells | |
| CN107794280A (zh) | 靶向穿膜肽基因载体及其应用 | |
| CN105327358A (zh) | 一种联合输送核酸与多肽的纳米制剂及制备方法 | |
| CN106086079B (zh) | 多重靶向修饰的载基因复合物及制备方法及应用 | |
| WO2023226203A1 (zh) | 一种骨靶向细胞外囊泡及其制备方法和应用 | |
| CN102517332B (zh) | Egf修饰的pamam自组装转基因组合物及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190614 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |