CN110755629A

CN110755629A - 一种逐级响应型双基因递送系统及制备方法

Info

Publication number: CN110755629A
Application number: CN201911126385.5A
Authority: CN
Inventors: 冯亚凯; 王小宇; 高彬; 任相魁; 郭锦棠
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2019-11-18
Filing date: 2019-11-18
Publication date: 2020-02-07
Anticipated expiration: 2039-11-18
Also published as: CN110755629B

Abstract

本发明公开了一种逐级响应型双基因递送系统及制备方法，制备方法为：(1)PLL‑DSP基因载体的制备；(2)制备PLL‑g‑Cit‑g‑PDP；(3)制备PLL‑g‑Cit‑g‑CG‑TAT‑GG‑REDV；(4)制备PLL‑g‑Cit‑g‑MMPSP‑PEG；(5)制备获得一种逐级响应型双基因递送系统；本发明的逐级响应型双基因递送系统，具有优异的体内长循环性能、内皮细胞靶向功能、内涵体逃逸性能及可控的基因释放功能，并共递送pZNF580和peNOS至内皮细胞。该递送系统由于其表面的PEG外层屏蔽作用，具有优异的血液稳定性。可有效递送治疗型基因至内皮细胞，促进增殖、迁移、血管化并缓解炎症。

Description

一种逐级响应型双基因递送系统及制备方法

技术领域

本发明属于基因载体材料技术领域，具体涉及一种逐级响应型双基因递送系统及制备方法及用途。

背景技术

针对内皮细胞靶向基因递送的研究对动脉粥样硬化、下肢严重缺血等疾病的治疗具有重要意义。高特异性载体将目的基因递送至病灶处，并实现靶向转染内皮细胞，促进内皮细胞的增殖、迁移和血管化等，进而实现血管内皮化和新血管形成，获得良好的治疗效果。过去十几年里，基因载体的制备多缺乏特异性，在体内应用时往往会导致目的细胞摄取率过低和其它细胞非特异性摄取引发副作用等弊端，严重制约了基因载体的临床应用。

近年来，提高目的细胞靶向摄取的问题引起了广泛关注。通常，科研人员通过在载体表面连接内皮细胞特异性多肽如REDV和CAG来提高基因的靶向递送效果。然而，在体内循环中，载体表面的多肽材料易被血液中的酶迅速降解，从而降低了治疗效果。因此，亟需开发一种血液稳定性好、内皮细胞特异性强的高效基因载体。

将亲水性强的PEG链段连接到基因载体上，显著提高了载体的血液稳定性和生物相容性，这使得PEG广泛应用于基因载体的改性，但PEG的强屏蔽作用同时也大幅降低了载体的转染性能。

近期，智能型高分子材料的发展为载体设计提供了新思路。有研究者制备了环境特异性响应的药物/基因载体用于肿瘤治疗。在肿瘤的特定微环境中，载体表明的PEG外层响应性脱落，暴露出载体内层，从而高效进入肿瘤细胞实现药物/基因释放，取得了理想的治疗效果。

目前，尚未有同时具有酶、酸、还原环境敏感的逐级响应型的双基因递送系统的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种逐级响应型双基因递送系统。

本发明的第二个目的是提供一种逐级响应型双基因递送系统的制备方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种逐级响应型双基因递送系统的制备方法，包括如下步骤：

(1)PLL-DSP基因载体的制备；

由Lys-Cbz制备Lys-Cbz-NCA；

将Lys-Cbz-NCA溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入己胺作为引发剂，室温下，开环聚合反应，置于截留分子量6000-8000Da的透析袋中用蒸馏水透析48-72h，冷冻干燥，制得PZLL；将PZLL溶解于三氟乙酸中，并加入33wt％的HBr的HAc溶液，室温下，反应1-2h进行脱保护，用无水乙醚沉淀出粗产物，冷冻干燥，获得PLL；将PLL溶解于pH＝7.2-7.4的PBS溶液，向溶液中滴入DSP交联剂的二甲基亚砜溶液，室温下搅拌12-24h，置于截留分子量3500Da的透析袋中用蒸馏水进行透析48-72h，冷冻干燥，制得PLL-DSP粉末；

Lys-Cbz为N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的简写；

Lys-Cbz-NCA为N(ε)-苄氧-L-赖氨酸环内酸酐的简写；

PZLL为聚-N(ε)-苄氧羰基赖氨酸的简写；

PLL为聚-L-赖氨酸的简写；

DSP为3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)的简写；

PLL-DSP为DSP交联的聚-L-赖氨酸的简写；

(2)将SPDP溶解于甲醇中，滴加至ε-PLL的PBS溶液中，室温搅拌反应12-24h，冷却至0℃，加入氢氧化钠水溶液调整溶液pH值至8-9，再滴加柠槺酸酐，ε-PLL与SPDP、柠槺酸酐的质量比为1:(0.1-0.5):(1-3)，滴加过程中不断补充氢氧化钠水溶液，使得pH保持在8-9之间，待溶液pH值不再发生变化时，再继续搅拌12-24h，用pH在8-9之间的蒸馏水透析48-72h，冷冻干燥获得PLL-g-Cit-g-PDP；

所述PBS溶液为10mM,pH＝8.0-9.0；

SPDP为3-(2-吡啶二巯基)丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯的简写；

ε-PLL为ε-聚-L-赖氨酸的简写；

Cit为柠槺酸酐的简写；

PLL-g-Cit-g-PDP为柠槺酸酐和SPDP共修饰的酸敏感的ε-聚-L-赖氨酸的缩写；

(3)将REDV-GG-TAT-GC多肽的PBS溶液，滴加至步骤(2)制得的PLL-g-Cit-g-PDP的PBS溶液中，PLL-g-Cit-g-PDP与REDV-GG-TAT-GC的质量比为1:(0.5-1)，室温搅拌12-24h，置于截留分子量3500Da的透析袋中用pH在8-9之间的蒸馏水进行透析48-72h，冷冻干燥，获得PLL-g-Cit-g-CG-TAT-GG-REDV；

所述PBS溶液为10mM,pH＝pH＝8.0-9.0；

PLL-g-Cit-g-CG-TAT-GG-REDV为REDV和TAT共同修饰的酸敏感的ε-聚-L-赖氨酸的简写；

所述REDV-GG-TAT-GC多肽的氨基酸序列用SEQ ID NO.1所示；

(4)将GPLGLAGC的PBS溶液滴入步骤(2)获得的PLL-g-Cit-g-PDP的PBS溶液中，室温搅拌12-24h，得反应液，再将NHS-PEG-OMe加入反应液中，继续室温搅拌12-24h，置于截留分子量3500Da的透析袋中用pH在8-9蒸馏水进行透析48-72h，冷冻干燥，制得PLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG；

所述PBS溶液为10mM,pH＝8.0-9.0；

GPLGLAGC为基质金属蛋白酶(MMP)敏感的多肽序列，简写为MMPSP；

NHS-PEG-OMe为一端带有-N-羟基琥珀酰亚胺的聚乙二醇单甲醚的简写；

PLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG为基质金属蛋白酶敏感型PEG修饰的酸敏感的ε-聚-L-赖氨酸的简写；

(5)将步骤(1)制备的PLL-DSP溶解在PBS溶液，得到第一溶液；向第一溶液中加入pDNA溶液，PLL-DSP与pDNA的质量比为(3-5)：1，涡旋混匀并室温孵化，得到二元基因复合物溶液；将步骤(3)制备的PLL-g-Cit-g-CG-TAT-GG-REDV和步骤(4)制备的PLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG按质量比1：1均匀分散在PBS溶液，得到第二溶液；向二元基因复合物溶液中加入第二溶液，PLL-DSP的质量与PLL-g-Cit-g-CG-TAT-GG-REDV和PLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG的总质量的质量比为1：(1-2)，涡旋混匀并室温孵化，获得四元基因复合物溶液，即为一种逐级响应型双基因递送系统；

所述PBS溶液为10mM,pH＝pH＝7.2-7.4；

优选地，pDNA为pZNF580和peNOS的组合物，所述pZNF580的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述peNOS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3表示；pZNF580为含ZNF580基因的质粒的简写；peNOS为含eNOS基因的质粒的简写。

上述方法制备的一种逐级响应型双基因递送系统。

本发明的优点：本发明制备的逐级响应型双基因递送系统，具有优异的体内长循环性能、内皮细胞靶向功能、内涵体逃逸性能及可控的基因释放功能，并共递送pZNF580和peNOS至内皮细胞。该递送系统由于其表面的PEG外层屏蔽作用，具有优异的血液稳定性。在炎症环境中时，细胞外基质中大量分泌的基质金属蛋白酶触发并切断基质金属蛋白酶敏感序列，使得最外层的PEG链段脱落，载体上的内皮细胞靶向多肽和细胞穿膜肽暴露出来，从而协同促进了对内皮细胞的靶向摄取能力。当该系统陷于溶酶体的弱酸性环境中时，弱酸敏感的聚阴离子外层会被触发还原成聚阳离子，由于静电排斥作用而逐渐从二元复合物表面脱离，促进了基因簇合物的内涵体/溶酶体逃逸效率。随后，进入细胞质的DSP交联聚赖氨酸，被细胞质中丰富的谷胱甘肽GSH还原，解离成分子量较低的聚赖氨酸，释放出pZNF580和peNOS进入细胞核并表达，提高了载体的转染效率。

本发明制备的逐级响应型双基因递送系统可有效递送治疗型基因至内皮细胞，促进其增殖、迁移、血管化并缓解炎症，为下肢严重缺血等疾病的治疗提供了新思路。

附图说明

图1为本发明中PLL的核磁共振氢谱图。

图2为本发明中PLL-DSP的核磁共振氢谱图。

图3为本发明中(A)PLL-g-Cit-g-PDP、(B)PLL-g-Cit-g-CG-TAT-GG-REDV、(C)PLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG和(D)PLL-g-Cit-g-PEG(作为对照组)的核磁共振氢谱图。

图4为本发明中(A)PLL-g-Suc-g-PDP、(B)PLL-g-Suc-g-CG-TAT-GG-REDV、(C)PLL-g-Suc-g-MMPSP-PEG和(D)PLL-g-Suc-g-PEG的核磁共振氢谱图。

图5为不同载体递送Cy5-oligonucleotide(Cy5修饰的寡核苷酸)的共聚焦细胞定位实验结果图。

图6为逐级响应型双基因递送系统治疗小鼠下肢缺血的激光多普勒血流灌注结果图。

图7为小鼠缺血下肢肌肉的H&E病理染色、CD34和CD68免疫荧光染色图。

具体实施方式

pZNF580和peNOS由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列分别用SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3表示。

以下通过具体实施例对本发明进一步的详细说明。

在本发明实施例中，基质金属蛋白酶(MMP)敏感多肽(序列为：Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly-Cys)

GPLGLAGC为基质金属蛋白酶(MMP)敏感的多肽序列的简写。和Lys-Cbz购于吉尔生化(上海)有限公司。

ε-PLL购于上海源叶生物科技有限公司。

pZNF580,peNOS,Cy5--oligonucleotide购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

实施例1：氧化还原敏感的PLL-DSP基因载体的制备

称取5g的Lys-Cbz和5.82g的三光气加入100mL无水四氢呋喃中，50℃搅拌1.5h，溶液变澄清。反应结束待恢复至室温后，氮气保护旋干溶剂。然后用无水四氢呋喃/无水正己烷多次进行重结晶，抽滤、真空干燥，获得Lys-Cbz-NCA固体。

将新鲜制得的1g Lys-Cbz-NCA溶于10mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入5.4×10^- ³mL己胺作为引发剂，室温下开环聚合反应72h，反应结束后用截留分子量6000-8000Da的透析袋中透析60h，冷冻干燥，制得PZLL固体；

将500mg新鲜制得的PZLL固体溶解于8mL三氟乙酸中，搅拌溶解后加入3mLHBr/HAc(33wt.％)溶液，室温下，进行脱保护反应1h，用无水乙醚沉淀出粗产物，用截留分子量6000-8000Da的透析袋进行透析60h，冷冻干燥，获得PLL固体。经核磁共振氢谱检测，如图1所示，谱中化学位移4-5ppm的范围内的峰g为聚-L-赖氨酸主链上次甲基的H的特征峰，化学位移0.9ppm附近的峰a为己胺部分甲基的特征峰，根据峰g和峰a的积分面积比约为25:1，可计算出制得聚-L-赖氨酸的结构单元数为75，制得的PLL的数均分子量约为9690Da。

将20mg上述PLL粉末溶解于10mL的pH＝7.4(也可以选pH＝7.2-7.4之间任意数)PBS溶液中，并向溶液中逐滴加入2mL浓度为5mg/mL的DSP交联剂的DMSO溶液，(PLL与DSP的质量比为2：1)室温搅拌反应12h(也可以选12-24h之间任意值)，将反应液置于截留分子量3500Da的透析袋中用蒸馏水进行透析60h(也可以选48-72h之间任意值)，冷冻干燥，获得DSP交联的聚-L-赖氨酸固体(PLL-DSP粉末)。经核磁共振氢谱检测，如图2所示，化学位移4-5ppm范围内的峰d为聚赖氨酸主链次甲基上H的特征峰，峰b为交联剂部分邻近羰基的亚甲基上H的特征峰，峰d和峰b的积分面积比例约为2.1:1，由此可计算出大约有23.8％的氨基参与反应。

Lys-Cbz为N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的简写；

Lys-Cbz-NCA为N(ε)-苄氧-L-赖氨酸环内酸酐的简写；

PZLL为聚-N(ε)-苄氧羰基赖氨酸的简写；

PLL为聚-L-赖氨酸的简写；

DSP为3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)的简写；

PLL-DSP为DSP交联的聚-L-赖氨酸的简写。

实施例2，弱酸敏感型聚阴离子PLL-g-Cit-g-CG-TAT-GG-REDV，PLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG及PLL-g-Cit-g-PEG的制备

(1)弱酸敏感型PLL-g-Cit-g-PDP的制备：

取50mgε-PLL溶解于15mLPBS溶液中得到ε-PLL水溶液，取10mg的SPDP溶解2mL甲醇中并将其缓慢滴加到上述制备的ε-PLL水溶液中，室温搅拌12h(也可以选12-24h之间任意值)。反应结束后，将反应液冷却至0℃，向其中加入1M氢氧化钠水溶液调节反应液pH为8(也可以选8-9之间的任意值)，再向其中逐渐滴加100mg柠槺酸酐(Cit)，(ε-PLL与SPDP、柠槺酸酐的质量比为1:0.3:2(还可以是1:(0.1-0.5):(1-3)中任意比例)，此过程不断补充氢氧化钠水溶液保持反应液pH为8-9，待反应液的pH不发生变化，继续搅拌12h(也可以选12-24h之间任意值)，反应后将反应液置于1000Da的透析袋中用pH在8(也可以选8-9之间的任意值)的蒸馏水透析48h，冷冻干燥获得PLL-g-Cit-g-PDP固体。

所述PBS溶液为10mM,pH＝8.5(也可以选pH＝8.0-9.0之间任意数)；

SPDP为3-(2-吡啶二巯基)丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯的简写；

ε-PLL为ε-聚-L-赖氨酸的简写；

Cit为柠槺酸酐的简写；

PLL-g-Cit-g-PDP为柠槺酸酐和SPDP共修饰的酸敏感的ε-聚-L-赖氨酸的缩写。

(2)PLL-g-Cit-g-CG-TAT-GG-REDV的制备：

称取10mg步骤(1)中制得的PLL-g-Cit-g-PDP溶解于5mL PBS溶液中，将7mg的REDV-GG-TAT-GC粉末溶解于1mL PBS溶液中并将其逐滴滴加PLL-g-Cit-g-PDP溶液中，室温搅拌12h(也可以选12-24h任意数)，反应结束后将反应液置于3500Da的透析袋中用pH在8(也可以用pH在8-9之间任意数)的蒸馏水透析48h、冷冻干燥，获得PLL-g-Cit-g-CG-TAT-GG-REDV固体。

所述PBS溶液为10mM,pH＝8.5(也可以选pH＝8.0-9.0之间任意数)；

所述REDV-GG-TAT-GC多肽的氨基酸序列用SEQ ID NO.1所示；

PLL-g-Cit-g-PDP与REDV-GG-TAT-GC的质量比可以选1:(0.5-1)之间的任意数。

(3)PLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG的制备：

称取10mg上述制得的PLL-g-Cit-g-PDP溶解于5mLPBS中，将2.3mg的GPLGLAGC溶解于1mL PBS溶液中并逐滴滴加至PLL-g-Cit-g-PDP的PBS溶液中，室温搅拌反应12h(可以选12-24h中任意值)得反应液，再将7.4mg的NHS-PEG-OMe直接加入反应液中，继续搅拌反应12h(可以选12-24h中任意值)，置于截留分子量3500Da的透析袋中用pH＝8(pH还可以在8-9之间的任意值)蒸馏水透析48h、冷冻干燥，得到PLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG固体。

所述PBS溶液为10mM,pH＝8.5(也可以选pH＝8.0-9.0之间任意数)；

GPLGLAGC为基质金属蛋白酶(MMP)敏感的多肽序列，简写为MMPSP；

PLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG为MMP敏感的PEG修饰的酸敏感的ε-聚-L-赖氨酸的简写；

(4)PLL-g-Cit-g-PEG的制备：

先称取10mg上述制得的PLL-g-Cit-g-PDP溶解于5mLPBS溶液中，将0.41mg的L-半胱氨酸溶解于1mLPBS溶液中并逐滴滴加至PLL-g-Cit-g-PDP溶液中，搅拌反应12h，再将7.4mg的NHS-PEG-OMe直接加入获得的反应液中，继续搅拌反应12h，反应后将反应液置于3500Da的透析袋中用pH＝8的蒸馏水透析48h、冷冻干燥，得到PLL-g-Cit-g-PEG固体。

所述PBS溶液为10mM,pH＝8.5(也可以选pH＝8.0-9.0之间任意数)；

PLL-g-Cit-g-PEG为非MMP敏感的PEG修饰的、酸敏感的ε-聚-L-赖氨酸的简写；

针对实施例2制备的PLL-g-Cit-g-PDP，PLL-g-Cit-g-CG-TAT-GG-REDV，PLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG和PLL-g-Cit-g-PEG进行核磁共振检测，如附图3所示，PLL-g-Cit-g-PDP主结构中的特征峰被标注于图3-A，其中，吡啶环部分的特征峰h,i,j,k在7-9ppm之间。PLL-g-Cit-g-CG-TAT-GG-REDV，PLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG和PLL-g-Cit-g-PEG的主特征峰分别被标注于图3-B,C,D中，可以发现，B,C,D中的吡啶环特征峰均消失，说明其完全被取代。B中TAT的上酪氨酸残基的芳香H特征峰位于7ppm左右，可证明PLL-g-Cit-g-CG-TAT-GG-REDV合成成功。C中GALGLP上亮氨酸残基中甲基H的特征峰p位于0.8ppm左右，PEG的亚甲基特征峰q位于3.61-4ppm之间，可说明PLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG制备成功。D与C相比，只有PEG的亚甲基特征峰r，没有GALGLP的上亮氨酸残基中甲基H特征峰，说明PLL-g-Cit-g-PEG合成成功。

实施例3，非酸敏感型聚阴离子PLL-g-Suc-g-CG-TAT-GG-REDV，PLL-g-Suc-g-MMPSP-PEG及PLL-g-Suc-g-PEG的制备

(1)非酸敏感型聚阴离子PLL-g-Suc-g-PDP的制备：

取50mgε-PLL溶解于15mLPBS溶液中得到ε-PLL水溶液，取10mg的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶解2mL甲醇中并将其缓慢滴加到上述制备的ε-PLL水溶液中，室温搅拌12h。反应结束后，将反应液冷却至0℃，向其中加入1M氢氧化钠水溶液调节反应液pH为8，再向其中逐渐滴78mg琥珀酸酐(Suc)，此过程不断补充氢氧化钠溶液保持反应液pH为8-9，待反应液的pH不发生变化，继续搅拌12h，反应后将反应液置于1000Da的透析袋中用蒸馏水透析48h，冷冻干燥获得PLL-g-Suc-g-PDP固体。

所述PBS溶液为10mM,pH＝8.5；

PLL-g-Suc-g-PDP为柠槺酸酐和SPDP共修饰的非酸敏感的ε-聚-L-赖氨酸的缩写。

(2)PLL-g-Suc-g-CG-TAT-GG-REDV的制备：

称取10mg(1)中制得的PLL-g-Suc-g-PDP溶解于5mL PBS中，将7.3mg的REDV-GG-TAT-GC粉末溶解于PBS溶液1mLPBS中并将其逐滴滴加PLL-g-Suc-g-PDP溶液中，室温搅拌12h，反应结束后将反应液置于3500Da的透析袋中用蒸馏水透析48h，冷冻干燥，获得PLL-g-Suc-g-CG-TAT-GG-REDV固体。

所述PBS溶液为10mM,pH＝8.5；

PLL-g-Suc-g-CG-TAT-GG-REDV为REDV和TAT共同修饰的非酸敏感的ε-聚-L-赖氨酸的简写；

(3)PLL-g-Suc-g-MMPSP-PEG的制备：

先称取10mg上述制得的PLL-g-Suc-g-PDP溶解于5mLPBS中，将2.4mg的GPLGLAGC溶解于1mLPBS溶液中并逐滴滴加至PLL-g-Suc-g-PDP溶液中，搅拌反应12h，再将7.5mg的NHS-PEG-OMe直接加入获得的反应液中，继续搅拌反应12h，反应后将反应液置于3500Da的透析袋中用蒸馏水透析48h、冷冻干燥，得到PLL-g-Suc-g-MMPSP-PEG固体。

所述PBS溶液为10mM,pH＝8.5；

GPLGLAGC为基质金属蛋白酶(MMP)敏感的多肽序列，简写为MMPSP；

PLL-g-Suc-g-MMPSP-PEG为MMP敏感的PEG修饰的非酸敏感的ε-聚-L-赖氨酸的简写；

(4)PLL-g-Suc-g-PEG的制备：

先称取10mg上述制得的PLL-g-Suc-g-PDP溶解于5mL PBS中，将0.42mg的L-半胱氨酸溶解于1mLPBS溶液中并逐滴滴加至PLL-g-Suc-g-PDP溶液中，搅拌反应12h，再将7.6mg的NHS-PEG-OMe直接加入获得的反应液中，继续搅拌反应12h，反应后将反应液置于3500Da的透析袋中用蒸馏水透析48h、冷冻干燥，得到PLL-g-Suc-g-PEG固体。

所述PBS溶液为10mM,pH＝8.5；

PLL-g-Suc-g-PEG为非MMP敏感的PEG修饰的、非酸敏感的ε-聚-L-赖氨酸的简写；

针对实施例3制备的PLL-g-Suc-g-PDP，PLL-g-Suc-g-CG-TAT-GG-REDV，PLL-g-Suc-g-MMPSP-PEG和PLL-g-Suc-g-PEG进行核磁共振检测，如附图4所示，PLL-g-Suc-g-PDP主结构中的特征峰被标注于图4-A，其中，琥珀酸酐部分的特征峰a和b在2.5ppm附近。PLL-g-Suc-g-CG-TAT-GG-REDV，PLL-g-Suc-g-MMPSP-PEG和PLL-g-Suc-g-PEG的主特征峰分别被标注于图4-B,C,D中，可以发现，B,C,D中的吡啶环特征峰均消失，说明其完全被取代。B中TAT的上酪氨酸残基的芳香H特征峰位于7ppm左右，可证明PLL-g-Suc-g-CG-TAT-GG-REDV合成成功。C中GALGLP的上亮氨酸残基中甲基H的特征峰特征峰d位于0.8ppm附近，可说明PLL-g-Suc-g-MMPSP-PEG制备成功。D与C相比，只有PEG的亚甲基特征峰，没有GALGLP的特征峰，说明PLL-g-Suct-g-PEG合成成功。

实施例4，逐级响应型双基因共递送系统的制备

称取1mg实施例1制备的PLL-DSP粉末溶解于2mL的PBS中，得到第一溶液；将pZNF580和peNOS配置成pDNA溶液(pZNF580和peNOS质量比为1：1)，溶剂为PBS溶液，混合均匀，再向第一溶液中加入混匀的pDNA溶液，PLL-DSP与pDNA的质量比为3：1(质量比可以为(3-5)：1中任意值)，涡旋混匀并室温孵化30min，得到二元基因复合物溶液；

所述PBS溶液为10mM,pH＝7.4(也可以选pH＝7.2-7.4之间任意数)；

所述pZNF580的氨基酸序列用SEQ ID NO.2所示；

所述peNOS的氨基酸序列用SEQ ID NO.3所示；

将实施例步骤(2)中制备的PLL-g-Cit-g-CG-TAT-GG-REDV聚阴离子和实施例2步骤(3)中制备的PLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG聚阴离子按质量比1：1均匀分散在PBS溶液中，得到第二溶液，向二元基因复合物溶液中加入第二溶液，PLL-DSP的质量与PLL-g-Cit-g-CG-TAT-GG-REDV和PLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG的总质量的质量比为1：1.3(也可以是(1：1-2中任意值)，涡旋混匀并室温孵化30min，获得四元基因复合物溶液，即为一种逐级响应型双基因递送系统；

所述PBS溶液为10mM,pH＝7.4(也可以选pH＝7.2-7.4之间任意数)。

实施例5，非酸敏感、非MMP酶敏感双基因共递送系统的制备

将实施例3步骤(2)中制备的PLL-g-Suc-g-CG-TAT-GG-REDV聚阴离子和实施例3步骤(4)中制备的PLL-g-Suc-g-PEG聚阴离子按质量比1：1均匀分散在PBS溶液中，将其加入到实施例4中制备的二元基因复合物溶液中，PLL-DSP与聚阴离子的质量比为1：1.3，涡旋混匀并室温孵化30min，获得四元基因复合物溶液，为具有“非酸敏感”和“非MMP酶敏感”外层的双基因内皮靶向递送系统。

所述PBS溶液为10mM,pH＝7.4。

实施例6，酸敏感、非MMP敏感双基因共递送系统的制备

将实施例2步骤(2)中制备的PLL-g-Cit-g-CG-TAT-GG-REDV聚阴离子和实施例2步骤(4)中制备的PLL-g-Cit-g-PEG聚阴离子按质量比1：1均匀分散在PBS溶液中，将其加入到实施例4中制备的二元基因复合物溶液中，PLL-DSP与聚阴离子的质量比为1：1.3，涡旋混匀并室温孵化30min，获得四元基因复合物溶液，为具有“酸敏感”和“非MMP酶敏感”外层的双基因内皮靶向递送系统。

所述PBS溶液为10mM,pH＝7.4。

实施例7，非酸敏感、MMP敏感双基因共递送系统的制备

将实施例3步骤(2)中制备的PLL-g-Suc-g-CG-TAT-GG-REDV聚阴离子和实施例3步骤(3)中制备的PLL-g-Suc-g-MMPSP-PEG聚阴离子按质量比1：1均匀分散在PBS溶液中，将其加入到实施例4中制备的二元基因复合物溶液中，PLL-DSP与聚阴离子的质量比为1：1.3，涡旋混匀并室温孵化30min，获得四元基因复合物溶液，为具有“非酸敏感”和“MMP酶敏感”外层的双基因内皮靶向递送系统。

所述PBS溶液为10mM,pH＝7.4。

实施例8，不同载体递送Cy5-oligonucleotide(Cy-5修饰的寡核苷酸)的共聚焦细胞定位实验。将人脐静脉内皮细胞(澳赛尔斯生物技术(上海)有限公司)以3×10⁴/孔接种到共聚焦平皿中培养24h，然后用无血清培养基(含1μg/mL的LPS)培养12h以饥饿细胞并造炎症模型，再分别用实施例4，5，6，7中制备的四元基因复合物(PLL-DSP内层：pDNA：阴离子外层质量比＝3：1：1.3)样品溶液转染细胞4h(仅加入Cy5-oligonucleotide作为对照组)，更换为含有10％FBS的DMEM培养基继续培养24h。用PBS洗涤细胞3次，5min/次。然后加入含有0.5mM Lyso Tracker Green的无血清DMEM培养基放入孵箱继续培养1h，PBS洗涤细胞2次，再加入含2μg/mLHoechst 33342的无血清DMEM培养基继续培养10min，PBS洗涤细胞3次，最后在645nm，504nm和350nm处的激发下用共聚焦激光显微镜分别观察Cy5-oligonucleotide，Lyso Tracker Green染色的溶酶体和Hoechst 33342染色的细胞核。其中，Cy5-oligonucleotide与Lyso Tracker Green荧光重叠部分表示Cy5-oligonucleotide进入溶酶体，如图5中箭头1所示，Cy5-oligonucleotide与Hoechst 33342荧光重叠部分表示Cy5-oligonucleotide进入细胞核如图5中箭头2所示。图5中，A为无载体仅转染Cy5-oligonucleotide，B为双非敏感载体复合物转染，C为酸敏感，非MMP酶敏感载体复合物转染，D为非酸敏感，MMP酶敏感载体复合物转染，E为双敏感载体复合物转染，F为商用转染试剂Lipo3000复合物转染作为阳性对照。

实验结果表明：就摄取量(Cy5-oligonucleotide进入细胞总量)而言，D、E两组有MMP酶敏感外层的复合物对Cy5-oligonucleotide的摄取量明显高于B、C两组非MMP敏感外层的复合物，这一结果说明MMP敏感外层在高表达MMP的细胞外基质中被MMP切断，进而大幅提高了对内皮细胞的摄取。此外，C与B相比，E与D相比，进入细胞核的Cy5-oligonucleotide比例大幅提高，内涵体中Cy5-oligonucleotide比例有所下降，这说明弱酸敏感型载体外层在溶酶体中完成了解组装，极大促进了Cy5-oligonucleotide的逃逸，进而提高了Cy5-oligonucleotide的进核率。

实施例9，逐级响应型双基因递送系统治疗下肢严重缺血实验。

先将小鼠(C57BL/6)(中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心)左侧下肢进行股动脉结扎手术，术后每3天向小鼠患肢进行多点肌肉注射逐级响应型双基因复合物，仅注射生理盐水的组作为对照组。术后当天、一周、两周时分别通过激光多普勒血流灌注仪测试小鼠下肢的血流情况。2周后，处死小鼠并取患肢肌肉进行包埋、切片，并进行HE染色、CD34和CD68的免疫荧光染色，对小鼠患肢的血管形成和炎症情况进行评估。

多普勒血流灌注结果如图6，注射了基因载体复合物的治疗组患肢血流恢复较好，14天时患肢与健康肢灌注量之比接近80％，而注射生理盐水的对照组则显示出非常低的血流灌注(灌注量10％左右)，甚至出现轻微坏死，说明该专利所述逐级响应型双基因递送系统能有效促进缺血肢体的血流恢复。H&E、CD34、CD68染色结果如图7，H&E染色显示，治疗组有更多的呈管腔状分布的血管内皮细胞，且缝匠肌细胞形态相对正常，对照组的细胞形态呈圆形、形态大小不一组织，且有大量疑似炎性细胞浸润，通过CD34标记血管内皮细胞验证了治疗组血管生成情况更好，通过CD68标记巨噬细胞说明了治疗组的炎症水平更低。综上，实验证明通过逐级响应型基因载体递送pZNF580/peNOS双基因能有效促进缺血组织血管化并缓解炎症，有利于下肢严重缺血疾病的治疗。

根据本发明内容进行工艺参数的调整，均可实现pDNA递送系统的制备，且表现出与本发明基本一致的性能。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种逐级响应型双基因递送系统及制备方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Glu Asn Val Gly Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg

1 5 10 15

Arg Gly Cys

<210> 2

<211> 519

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgctgctgc tgccgccgcg gccaccccac cctcggtcct cctctccgga ggccatggac 60

ccaccgcccc ccaaggctcc ccctttcccc aaggcggaag gcccctcctc cactccttcc 120

tcggcggcgg ggccccgacc cccgcggctg ggccgccacc tcctcatcga cgccaatggg 180

gtcccctaca catacacggt gcagctggag gaggagcccc ggggcccgcc ccagcgcgag 240

gcgcccccag gagagcccgg ccctcgcaag ggctacagct gcccggagtg cgcccgtgtc 300

tttgccagcc ctctgcggct gcagagccac cgcgtgtcgc actcggacct caagcccttc 360

acgtgcggcg cctgcggcaa ggccttcaag cgctccagcc acctgtcgcg gcatcgcgcc 420

acgcaccgcg cccgcgccgg gccgccgcac acctgcccgc tctgcccacg ccgcttccag 480

gacgccgcgg agctggcgca gcacgtgcgc ctccactaa 519

<210> 3

<211> 3612

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggcaact tgaagagcgt ggcccaggag cctgggccac cctgcggcct ggggctgggg 60

ctgggccttg ggctgtgcgg caagcagggc ccagccaccc cggcccctga gcccagccgg 120

gccccagcat ccctactccc accagcgcca gaacacagcc ccccgagctc cccgctaacc 180

cagcccccag aggggcccaa gttccctcgt gtgaagaact gggaggtggg gagcatcacc 240

tatgacaccc tcagcgccca ggcgcagcag gatgggccct gcaccccaag acgctgcctg 300

ggctccctgg tatttccacg gaaactacag ggccggccct cccccggccc cccggcccct 360

gagcagctgc tgagtcaggc ccgggacttc atcaaccagt actacagctc cattaagagg 420

agcggctccc aggcccacga acagcggctt caagaggtgg aagccgaggt ggcagccaca 480

ggcacctacc agcttaggga gagcgagctg gtgttcgggg ctaagcaggc ctggcgcaac 540

gctccccgct gcgtgggccg gatccagtgg gggaagctgc aggtgttcga tgcccgggac 600

tgcaggtctg cacaggaaat gttcacctac atctgcaacc acatcaagta tgccaccaac 660

cggggcaacc ttcgctcggc catcacagtg ttcccgcagc gctgccctgg ccgaggagac 720

ttccgaatct ggaacagcca gctggtgcgc tacgcgggct accggcagca ggatggctct 780

gtgcgggggg acccagccaa cgtggagatc accgagctct gcattcagca cggctggacc 840

ccaggaaacg gtcgcttcga cgtgctgccc ctgctgctgc aggccccaga tgatccccca 900

gaactcttcc ttctgccccc cgagctggtc cttgaggtgc ccctggagca ccccacgctg 960

gagtggtttg cagccctggg cctgcgctgg tacgccctcc cggcagtgtc caacatgctg 1020

ctggaaattg ggggcctgga gttccccgca gcccccttca gtggctggta catgagcact 1080

gagatcggca cgaggaacct gtgtgaccct caccgctaca acatcctgga ggatgtggct 1140

gtctgcatgg acctggatac ccggaccacc tcgtccctgt ggaaagacaa ggcagcagtg 1200

gaaatcaacg tggccgtgct gcacagttac cagctagcca aagtcaccat cgtggaccac 1260

cacgccgcca cggcctcttt catgaagcac ctggagaatg agcagaaggc cagggggggc 1320

tgccctgcag actgggcctg gatcgtgccc cccatctcgg gcagcctcac tcctgttttc 1380

catcaggaga tggtcaacta tttcctgtcc ccggccttcc gctaccagcc agacccctgg 1440

aaggggagtg ccgccaaggg caccggcatc accaggaaga agacctttaa agaagtggcc 1500

aacgccgtga agatctccgc ctcgctcatg ggcacggtga tggcgaagcg agtgaaggcg 1560

acaatcctgt atggctccga gaccggccgg gcccagagct acgcacagca gctggggaga 1620

ctcttccgga aggcttttga tccccgggtc ctgtgtatgg atgagtatga cgtggtgtcc 1680

ctcgaacacg agacgctggt gctggtggta accagcacat ttgggaatgg ggatcccccg 1740

gagaatggag agagctttgc agctgccctg atggagatgt ccggccccta caacagctcc 1800

cctcggccgg aacagcacaa gagttataag atccgcttca acagcatctc ctgctcagac 1860

ccactggtgt cctcttggcg gcggaagagg aaggagtcca gtaacacaga cagtgcaggg 1920

gccctgggca ccctcaggtt ctgtgtgttc gggctcggct cccgggcata cccccacttc 1980

tgcgcctttg ctcgtgccgt ggacacacgg ctggaggaac tgggcgggga gcggctgctg 2040

cagctgggcc agggcgacga gctgtgcggc caggaggagg ccttccgagg ctgggcccag 2100

gctgccttcc aggccgcctg tgagaccttc tgtgtgggag aggatgccaa ggccgccgcc 2160

cgagacatct tcagccccaa acggagctgg aagcgccaga ggtaccggct gagcgcccag 2220

gccgagggcc tgcagttgct gccaggtctg atccacgtgc acaggcggaa gatgttccag 2280

gctacaatcc gctcagtgga aaacctgcaa agcagcaagt ccacgagggc caccatcctg 2340

gtgcgcctgg acaccggagg ccaggagggg ctgcagtacc agccggggga ccacataggt 2400

gtctgcccgc ccaaccggcc cggccttgtg gaggcgctgc tgagccgcgt ggaggacccg 2460

ccggcgccca ctgagcccgt ggcagtagag cagctggaga agggcagccc tggtggccct 2520

ccccccggct gggtgcggga cccccggctg cccccgtgca cgctgcgcca ggctctcacc 2580

ttcttcctgg acatcacctc cccacccagc cctcagctct tgcggctgct cagcaccttg 2640

gcagaagagc ccagggaaca gcaggagctg gaggccctca gccaggatcc ccgacgctac 2700

gaggagtgga agtggttccg ctgccccacg ctgctggagg tgctggagca gttcccgtcg 2760

gtggcgctgc ctgccccact gctcctcacc cagctgcctc tgctccagcc ccggtactac 2820

tcagtcagct cggcacccag cacccaccca ggagagatcc acctcactgt agctgtgctg 2880

gcatacagga ctcaggatgg gctgggcccc ctgcactatg gagtctgctc cacgtggcta 2940

agccagctca agcccggaga ccctgtgccc tgcttcatcc ggggggctcc ctccttccgg 3000

ctgccacccg atcccagctt gccctgcatc ctggtgggtc caggcactgg cattgccccc 3060

ttccggggat tctggcagga gcggctgcat gacattgaga gcaaagggct gcagcccact 3120

cccatgactt tggtgttcgg ctgccgatgc tcccaacttg accatctcta ccgcgacgag 3180

gtgcagaacg cccagcagcg cggggtgttt ggccgagtcc tcaccgcctt ctcccgggaa 3240

cctgacaacc ccaagaccta cgtgcaggac atcctgagga cggagctggc tgcggaggtg 3300

caccgcgtgc tgtgcctcga gcggggccac atgtttgtct gcggcgatgt taccatggca 3360

accaacgtcc tgcagaccgt gcagcgcatc ctggcgacgg agggcgacat ggagctggac 3420

gaggccggcg acgtcatcgg cgtgctgcgg gatcagcaac gctaccacga agacattttc 3480

gggctcacgc tgcgcaccca ggaggtgaca agccgcatac gcacccagag cttttccttg 3540

caggagcgtc agttgcgggg cgcagtgccc tgggcgttcg accctcccgg ctcagacacc 3600

aacagcccct ga 3612

Claims

1.一种逐级响应型双基因递送系统的制备方法，其特征是包括如下步骤：

(1)PLL-DSP基因载体的制备；

由Lys-Cbz制备Lys-Cbz-NCA；

将Lys-Cbz-NCA溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺中，加入己胺作为引发剂，室温下，开环聚合反应，置于截留分子量6000-8000Da的透析袋中用蒸馏水透析，冷冻干燥，制得PZLL；将PZLL溶解于三氟乙酸中，并加入33wt％的HBr的HAc溶液，室温下，进行脱保护反应，用无水乙醚沉淀出粗产物，透析，冷冻干燥，获得PLL；将PLL溶解于pH＝7.2-7.4的PBS溶液，向溶液中滴入DSP交联剂的二甲基亚砜溶液，室温下搅拌12-24h，置于截留分子量3500Da的透析袋中用蒸馏水进行透析，冷冻干燥，制得PLL-DSP粉末；

Lys-Cbz为N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的简写；

Lys-Cbz-NCA为N(ε)-苄氧-L-赖氨酸环内酸酐的简写；

PZLL为聚-N(ε)-苄氧羰基赖氨酸的简写；

PLL为聚-L-赖氨酸的简写；

DSP为3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)的简写；

PLL-DSP为DSP交联的聚-L-赖氨酸的简写；

(2)将SPDP溶解于甲醇中，滴加至ε-PLL的PBS溶液中，室温搅拌反应12-24h，冷却至0℃，加入氢氧化钠水溶液调整溶液pH值至8-9，再滴加柠槺酸酐，ε-PLL与SPDP、柠槺酸酐的质量比为1:(0.1-0.5):(1-3)，滴加过程中不断补充氢氧化钠水溶液，使得pH保持在8-9之间，待溶液pH值不再发生变化时，再继续搅拌12-24h，用pH在8-9之间的蒸馏水透析，冷冻干燥获得PLL-g-Cit-g-PDP；

所述PBS溶液为10mM,pH＝8.0-9.0；

SPDP为3-(2-吡啶二巯基)丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯的简写；

ε-PLL为ε-聚-L-赖氨酸的简写；

Cit为柠槺酸酐的简写；

(3)将REDV-GG-TAT-GC多肽的PBS溶液，滴加至步骤(2)制得的PLL-g-Cit-g-PDP的PBS溶液中，PLL-g-Cit-g-PDP与REDV-GG-TAT-GC的质量比为1:(0.5-1)，室温搅拌12-24h，置于截留分子量3500Da的透析袋中用pH在8-9之间的蒸馏水进行透析，冷冻干燥，获得PLL-g-Cit-g-CG-TAT-GG-REDV；

所述PBS溶液为10mM,pH＝pH＝8.0-9.0；

所述REDV-GG-TAT-GC多肽的氨基酸序列用SEQ ID NO.1所示；

(4)将GPLGLAGC的PBS溶液滴入步骤(2)获得的PLL-g-Cit-g-PDP的PBS溶液中，室温搅拌12-24h，得反应液，再将NHS-PEG-OMe加入反应液中，继续室温搅拌12-24h，置于截留分子量3500Da的透析袋中用pH在8-9蒸馏水进行透析，冷冻干燥，制得PLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG；

所述PBS溶液为10mM,pH＝8.0-9.0；

GPLGLAGC为基质金属蛋白酶(MMP)敏感的多肽序列，简写为MMPSP；

PLL-g-Cit-g-MMPSP-PEG为基质金属蛋白酶敏感的PEG修饰的酸敏感的ε-聚-L-赖氨酸的简写；

所述PBS溶液为10mM,pH＝pH＝7.2-7.4。

2.根据权利要求1所述的一种逐级响应型双基因递送系统的制备方法其特征是所述pDNA为pZNF580和peNOS的组合物，所述pZNF580的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述peNOS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3表示；pZNF580为含ZNF580基因的质粒的简写；

peNOS为含eNOS基因的质粒的简写。

3.权利要求1或2的方法制备的一种逐级响应型双基因递送系统。