CN111920700B - 一种干细胞外泌体的制备技术及在药品和化妆品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种干细胞外泌体的制备技术及在药品和化妆品中的应用。本发明筛选获得了能够特异性结合黑色素瘤的靶向肽，通过将靶向肽连接到内部转染有miR‑137的外泌体后，获得了能够特异性结合黑色素瘤的靶向治疗药物，这与之前的单纯递送miR‑137相比，能够更快的抑制增殖，以及提高抑制效率，具有极大的应用价值。

Description

一种干细胞外泌体的制备技术及在药品和化妆品中的应用
技术领域
本发明涉及生物领域，更具体的，涉及一种干细胞外泌体的制备技术及在药品和化妆品中的应用。
背景技术
外泌体是一种可由各类细胞分泌的纳米级（直径30-100 nm）囊泡。其表面和内部有多种蛋白、mRNA、miRNA 以及长链非编码RNA（LncRNA）等活性物质。外泌体具有高度稳定性，甚至可耐受低浓度Triton-100的处理，可广泛存在于人体体液中，包括唾液、血液、尿液及脑脊液等。现已证实外泌体不仅是细胞的代谢产物，而且具有在细胞间传递信息的生物学功能，尤其在肿瘤扩散和转移过程中具有重要作用。同时其也可作为癌症等疾病的早期体液诊断的生物学标志物。特别是作为皮肤治疗的研究也变得越来越重要。
血管再生是间充质干细胞分泌的外泌体促进皮肤损伤修复的主要机制之一。血管再生包括动脉、静脉以及毛细血管的再生，主要是通过促进平滑肌细胞和血管内皮细胞的增殖和迁移来修复已损伤血管的内皮细胞。Zhang 等在促进大鼠烫伤创面的愈合的实验中，发现来源于脐带间充质干细胞的外泌体含有丰富的Wnt 蛋白， 它能活化β-catenin 信号通路，促进创伤后血管的重建新生和胶原蛋白合成, 从而促进皮肤损伤修复。Zhang 等的研究表明，内皮祖细胞来源的外泌体可通过激活Erk1/2 信号通路上调成血管基因如VEGFA，Cox-2，FGF2 等的表达， 增强人微血管内皮细胞的增殖、迁移，促进新生血管形成，提高糖尿病大鼠难愈性皮肤伤口的愈合。Wang 等获取的外泌体来源于一种新近发现的间充质干细胞，即女性月经血的经血源性子宫内膜干细胞。通过microRNA芯片筛选后，发现microRNA-21 表达最高, microRNA-21 作用于靶基因PTEN, 并激活下游的PTEN/Akt 信号通路，发挥促血管新生和抗心肌细胞凋亡的作用。
皮肤损伤修复过程中的一个重要的细胞是成纤维细胞。在伤口愈合过程中，成纤维细胞有助毛囊的形成，从而降低皮肤愈合过程中瘢痕形成的几率。另一个重要细胞是肌成纤维细胞，它在皮肤损伤修复过程中起到组织收缩的作用。但是在病理情况下，肌成纤维细胞的持续存在会引发皮肤创面过度收缩从而导致増生性瘢痕形成。Fang 等研究表明，脐带间充质干细胞来源的外泌体在小鼠背部皮肤全层创面缺损模型中可通过减少肌成纤维细胞在皮肤损伤后的过度聚集，来抑制瘢痕形成。该课题组通过高通量转录组测序发现外泌体中富含microRNAs， 主要成员有miR-23a, miR-21等，通过阻断TGF-β/SMAD2 信号通路，减少胶原沉积，抑制肌成纤维细胞的形成，从而起到抑制瘢痕形成的作用。Hu 等在皮肤全层损伤模型中发现，脂肪间充质干细胞来源的外泌体能刺激成纤维细胞的增殖、迁移，促进胶原蛋白的合成，增加PCNA，cyclin-1，N-cadherin 的表达，从而抑制瘢痕形成、促进皮肤伤口的愈合。
在皮肤疾病中，黑色素瘤是一个重要病因。当前在黑色素瘤治疗方面缺乏有效手段，但近年来，对肿瘤微环境的研究提示其可能是肿瘤发生转移的关键机制，进而成为肿瘤生物学的研究热点之一。其中，肿瘤来源的外泌体在改造微环境中的重要作用正在被越来越多地揭示出来。2011 年，Wickline 实验室发现，黑色素瘤通过外泌体改造前哨淋巴结，从而促进癌细胞向该处转移。Peinado 等进一步指出黑色素瘤通过外泌体能招募骨髓衍生细胞，诱发预转移小生境的形成。还能增强肺血管内皮通透性和促进小鼠肺转移的发生。曹蕾等证实黑色素瘤来源的外泌体很快进入间充质基质细胞，并促进其增殖和迁移。这种作用可能有利于在肿瘤微环境中募集到更多的基质细胞，从而更好地支持肿瘤的生长和转移。同时，还发现在摄入黑色素瘤来源的外泌体后，间充质基质细胞的α-平滑肌肌动蛋白（SMA）表达显著上调，提示在黑色素瘤外泌体的影响下，其出现了向肌成纤维细胞转化的趋势。Ji 等发现间充质基质细胞分泌的外泌体也能被肿瘤细胞摄取，进而促进肿瘤发展。因此，肿瘤细胞与间充质基质细胞之间的外泌体传递是双向进行的。Luga 等也支持肿瘤细胞和肿瘤间质细胞之间外泌体的信息传递不是单向的，而是双向过程。如果将来针对外泌体传递信息的过程设计药物进行阻断，将有希望控制黑色素瘤的病理进程，并在此基础上发展新型的抗肿瘤疗法。
miR-137是一种重要的肿瘤抑制因子，已经有文献报道发现c-Met，YB1，MITF等均为miR-137的直接靶基因，并且miR-137能够通过抑制这些蛋白的表达而降低黑色素瘤细胞的体外增殖与迁移能力。但是由于体内环境复杂，并不能较好的准确给药，导致在体内治疗效果不佳。
尽管外泌体可通过抑制参与黑色素瘤进展的外泌体或运用外泌体递送抗肿瘤物质或利用外泌体自身的某些抗瘤作用治疗黑色素瘤。尽管目前已有许多关于外泌体和黑色素瘤的研究，但是还缺乏一种有效的能够靶向治疗黑色素瘤的方法。
发明内容
为实现上述个目的，本发明采取的技术方案是： 一种靶向抗恶性黑色素瘤的miR-137外泌体，所述的靶向抗恶性黑色素瘤的miR-137外泌体为外部结合靶向肽HSS-5，内部转染有miR-137的外泌体。
优选地，所述靶向抗恶性黑色素瘤的miR-137外泌体其制备方法包括以下步骤：
a)制备外泌体；
b)将miR-137转染所述外泌体；
c)将所述靶向肽结合到外泌体上，制备得到靶向抗恶性黑色素瘤的miR-137外泌体。
本发明进一步的，还提供了如上任一所述的靶向抗恶性黑色素瘤的外泌体 在制备治疗恶性黑色素瘤的药物中的应用。
进一步的，所述的黑色素瘤是B16BL6 细胞导致的。
更进一步的，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物能够用于治疗黑色素瘤，所述药物组合物含有一种靶向抗恶性黑色素瘤的miR-137外泌体以及药学上可接受的载体。所述的靶向抗恶性黑色素瘤的miR-137外泌体为外部结合靶向肽HSS-5，内部转染有miR-137的外泌体。所述靶向抗恶性黑色素瘤的miR-137外泌体其制备方法包括以下步骤：
a)制备外泌体；
b)将miR-137转染所述外泌体；
c)将所述靶向肽结合到外泌体上，制备得到靶向抗恶性黑色素瘤的miR-137外泌体。
还需要说明的是，以上“药学上可接受的载体”是指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系，具体地，其不仅可以是外泌体，还可以是病毒、脂质体、高分子聚合物等基因运送载体，还可以指代常规药用辅料，包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂和吸附剂等。
本发明还提供了能够特异性结合黑色素瘤细胞的靶向肽HSS-5，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
更进一步的，所述靶向肽的制备方法为通过噬菌体库通过差选多轮筛选后获得的特异性的靶向结合肽。
更进一步的，本发明制备了表皮干细胞的外泌体。
具体的，所述外泌体的制备方法为：
将表皮干细胞进行培养后，把胎牛血清（FBS）超速离心，倒掉血清自身携带的exosomes。干细胞的融合度达到约 90%，丢弃旧培养基的上清液，洗涤，并用已经除去自身外泌体的 10%FBS 培养液，继续培养。吸取大皿内干细胞的培养基上清液到无菌的离心管内，离心，弃去细胞与细胞碎片。提取离心后的上清液到新的无菌离心管内，依照上清液：提取试剂=2:1 的比例向管中添加 exosomes 快速抽提试剂，多次震荡混匀之后放于 4℃冰箱内过夜。在第二天离心 1 小时，试管壁能够发现白色外泌体条带。倒掉上清，PBS 液重新混选外泌体，放于-80℃冰箱中保管待用。
有益效果
本发明筛选获得了能够特异性结合黑色素瘤的靶向肽，通过将靶向肽连接到内部转染有miR-137的外泌体后，获得了能够特异性结合黑色素瘤的靶向治疗药物，这与之前的单纯递送miR-137相比，能够更快的抑制增殖，以及提高抑制效率，具有极大的应用空间。
附图说明
图1 为肺结节数量图。
图2 为肺重量结果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。
实施例1 特异性结合黑色素瘤细胞的多肽的筛选
1、黑色素瘤细胞的准备
B16BL6细胞培养于DMEM完全培养基(含10% FBS、青-链霉素100 μg/mL), 37 ℃、5% CO2 培养箱内培养。收集处于对数生长期的B16BL6 细胞备用。
2、特异性结合多肽的筛选
弃去10 cm皿中的培养基，PBS洗两遍；用50mmol/L的EDTA消化B16BL6细胞，DMEM洗涤1遍，含1％BSA DMEM调整细胞浓度为1.0×107／ml；取10 μl Ph.D.7噬菌体环七肽库加入到100μl细胞悬液中，冰上温和震摇4 h；按照处理B16BL6的方法处理人A-431表皮细胞，含1％ BSA的DMEM调整细胞浓度为5.0×106／ml；小心将B16BL6与肽库混合液转移到300 gl有机溶剂(DBP：环己烷=9：1（v／v)上层，不混合，10 000 g、4℃离心10 min；离心后将上层水相转移到含有200μl人A-431表皮细胞的离心管中，混匀，冰上温和震摇4 h；小心将细胞与肽库混合液转移到300μl有机溶剂(DBP：环己烷=9：1(v／v)上层，不混合，10 000 g、4℃离心10min；液氮速冻，迅速切下离心管底部，100μl PBS重悬沉淀，加入900μl对数期ER2738，作用5min后，加入9 ml LB，得到淘选分离液。取5O ul用来滴度测定，其余在37℃摇床震摇4．5 h，PEG／NaC1沉淀法沉淀扩增后的噬菌体，进行下一轮筛选。在筛选过程中，每轮投入的噬菌体文库的量保持在1.8×1012 ，以B16BL6为靶细胞、A-431表皮细胞为差减细胞。
将第4轮筛选产物铺板，经过4轮差减筛选噬菌体在B16BL6细胞的富集度提高了62倍。从总量为l012 板上随机挑取分割良好的蓝色菌斑50个，经过扩增后，取25 u1噬菌体克隆扩增液，98℃金属浴10 min；取1μl上清为PCR模板进行PCR反应，DNA电泳鉴定有插入片段的为21个；选取有插入片段的噬菌体克隆进行测序。测序成功14个，测序结果有11个为GPGCINV的七肽的氨基酸序列，因此，GPGCINV即为筛选得到的SEQ ID NO：1的结合肽也称靶向肽HSS-5。
3、多肽鉴定
将B16BL6与A-431表皮细胞按照1.0×104/孔接种于96孔板，培养24 h后，撤去血清1 h，PBS洗3遍，4％多聚甲醛固定15 min，PBS洗3遍，封闭液室温封闭1 h，加入2．5×10噬菌体，室温作用1 h，PBST(O．05％Tween)洗涤9次，加人兔抗M13抗体和HRP，作用1 h后，PBST(O．05％Tween)洗涤6次，TMB显色，2 mol／L H2SO4终止反应，测450 nm处吸光值。PBS、空M13噬菌体及Hela细胞作为对照，并设置副孔，取两者平均值。
表1 ELISA检测结果
细胞 靶标噬菌体组 空M13噬菌体组 PBS对照组
B16BL6 细胞 0.929 0.039 0.037
Hela细胞 0.072 0.035 0.038
A-431表皮细胞 0.065 0.037 0.039
结果如表1所示，靶标噬菌体与B16BL6结合性明显高于空噬菌体、PBS对照组，A-431表皮细胞和Hela细胞对照组也明显低于B16BL6组。这说明本发明制备得到的多肽具有较好的结合特性和特异性。
4、荧光测定
细胞荧光染色鉴定噬茵体克隆靶向性体外合成该七肽并标记FITC，合成短肽与荧光基团FITC复合物。将1×104个细胞铺在6孔板内，贴壁后，撤去培养基，无血清DMEM洗3遍。无血清培养基培养30min。5％BSA封闭细胞，37℃培养60 min，加入FITC-phage(100ng/L)室温作用60min。PBST洗涤3次。再孵育抗体后，用DAPI核染等常规细胞荧光后，倒置显微镜下观察。结果显示，所述多肽荧光主要集中在包膜上，说明多肽的细胞受体可能主要位于B16BL6的细胞膜上。
实施例2 表皮干细胞外泌体的制备
将表皮干细胞进行培养，获得了第3代的细胞，按照如下步骤进行外泌体的提取：
a. 初始把胎牛血清（FBS）超速离心，100,000g 离心超过 11 小时，倒掉血清自身携带的 exosomes。
b. 干细胞的融合度达到约 90%，丢弃旧培养基的上清液，预热 PBS 洗涤 2 次，并用已经除去自身外泌体的 10%FBS 培养液，继续在 37℃ CO2 培养箱中培养 48h。
c. 吸取大皿内干细胞的培养基上清液到无菌 15ml 的离心管内，2000g 离心半小时，弃去细胞与细胞碎片。
d. 提取离心后的上清液到新的无菌离心管内，依照上清液：提取试剂=2:1 的比例向管中添加 exosomes 快速抽提试剂，多次震荡混匀之后放于 4℃冰箱内过夜(超过12h)。
e. 在第二天放于 4℃ 10,000g 离心 1 小时，试管壁能够发现白色外泌体条带。倒掉上清，PBS 液重新混选外泌体，放于-80℃冰箱中保管待用。
采用BCA试剂盒检测外泌体的蛋白浓度为4.05mg/ml。所述外泌体采用粒径检测发现其直径分布为 50-140nm，峰值为 125nm左右。
实施例3 靶向治疗药物组合物的制备
I．靶向抗恶性黑色素瘤的miR-137外泌体的制备：
（1）按照miRNA-137的核苷酸序列5＇- UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG-3＇合成miRNA-137模拟物（上海吉玛生物制药技术有限公司）。
（2）模拟物转染外泌体
将实施例2提取的外泌体用100μl的PBS重悬，然后与20μg的miRNA-137模拟物共同放入电击杯(biorad，0.2cm)中。在200V电压下电击20ms后，将电击杯连同其中的液体放入37℃培养箱中恢复1小时。
（3）结合肽嵌合外泌体的制备
将实施例1筛选的结合肽HSS-5与步骤（2）制备的转染外泌体按质量比(1:10)溶于PBS中，通过冻融技术实现结合肽与外泌体的结合。冻融参数是：-60℃ 低温冰箱快速冷冻40min后，然后室温条件下缓慢融化，如此反复冻融3次， 即得。
II．对比例：
（1）按照miRNA-137的核苷酸序列5＇- UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG-3＇合成miRNA-137模拟物（上海吉玛生物制药技术有限公司）。
（2）模拟物转染外泌体
将实施例2提取的外泌体用100μl的PBS重悬，然后与20μg的miRNA-137模拟物共同放入电击杯(biorad，0.2cm)中。在200V电压下电击20ms后，将电击杯连同其中的液体放入37℃培养箱中恢复1小时。制备得到转染外泌体。
实施例4 细胞增殖抑制实验
将处于对数生长期的人B16BL6 细胞(3×104/ml，100μl)，接种到96孔培养板中，培养至大约90％的细胞融合时，弃去含血清培养液，PBS冲洗两遍。对照组加入不含药的无血清培养基100μl培养；实验1组为靶向抗恶性黑色素瘤的miR-137外泌体，实验2组为对照例的模拟物转染外泌体，二组分别加入外泌体10ug和无血清培养基100μl，培养24h和36h后予MTT检测细胞生长抑制率。
表2 细胞抑制率结果图
组别 24h细胞抑制率（%） 36h细胞抑制率（%）
对照 0.00 0.00
实验1组 87.57±3.21 94.57±5.26
实验2组 80.24±3.19 89.33±2.97
结果如表2所示，靶向抗恶性黑色素瘤的miR-137外泌体具有比不连接靶向肽的miR-137外泌体具有更好、更快的抑制效果。
实施例5细胞克隆形成实验
将对数生长期B16BL6细胞消化并制成单个细胞悬液，将细胞悬液以每孔200个细胞密度接种于6孔细胞培养板，细胞贴壁生长24h后吸 取上清液，加入3ml无胎牛血清培养液，分成对照组、实验1组和实验2组（分组如实施例4相同）。当培养板中出现肉眼可见克隆时停止培养，弃培养液，PBS小心清洗2次，加甲醛固定 15min后，Giemsa染色3min，流水缓慢冲去染色液，空气中干燥，倒置显微镜下计数≥50个细胞。把培养板放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数，计数＞50个细胞的克隆数。克隆形成率＝克隆数/接种细胞数×100％。
表3不同处理组的细胞克隆形成率
组别 细胞克隆形成率（%）
对照 100
实验1组 17.86±1.56
实验2组 29.53±2.03
结果如表3所示，所述结合肽与miR的组合使用能够使得外泌体具有协同抑制肿瘤细胞克隆形成作用，即协同降低肿瘤细胞的侵袭能力。
实施例6 本发明制备的外泌体体内抗肿瘤转移情况
建立小鼠黑色素瘤肺转移实验模型, 取对数生长期B16BL6 细胞, 用灭菌的PBS溶液将细胞制成细胞悬液, 并将细胞数调整至每毫升5×105个, 迅速进行接种。每只C57BL/6 小鼠尾静脉处注射0.2 mL新鲜制备、吹打均匀的B16BL6细胞悬液。小鼠接种肿瘤细胞后, 随机分为模型组、实验1组、实验2组, 每组5只。23 天后开始给药, 腹腔注射, 给药剂量为10mg外泌体·kg-1, 隔天给药, 其中给药形式为（blank组为正常小鼠PBS对照，模型组为PBS对照，实验1组给药实施例3的靶向抗恶性黑色素瘤的miR-137外泌体，实验2组给药实施例3的对照例的模拟物转染外泌体）14 天后脱颈椎处死小鼠, 解剖, 取小鼠肺组织, 记录肺结节数目, 并对剥离的肺组织进行称重。
结果显示, 造模后, H&E 染色发现模型组小鼠与正常组相比, 肺部发生了严重的转移, 体现在模型组小鼠肺部出现了较多的肿瘤结节数目和较大的肿瘤体积如图1-2所示。不论是实验1组还是实验2组均表现出一定的抑制肿瘤转移的效果, 而与实验2组相比,实验1组含有靶向多肽的转基因外泌体组能更好地抑制肿瘤的肺转移, 减少肿瘤结节数目, 降低异常的肺重量, 具有更优的抗肿瘤转移作用。
序列表
<110> 北京达熙生物科技有限公司
<120> 一种干细胞外泌体的制备技术及在药品和化妆品中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Pro Gly Cys Ile Asn Val
1 5

Claims (3)

1.靶向抗恶性黑色素瘤的miR-137外泌体在制备治疗恶性黑色素瘤的药物中的应用；其中所述的靶向抗恶性黑色素瘤的miR-137外泌体其制备方法包括以下步骤：
a)制备表皮干细胞外泌体；
b)将miR-137转染所述a）步骤制备的外泌体；
c)将靶向肽SEQ ID NO：1结合到外泌体上，制备得到靶向抗恶性黑色素瘤的miR-137外泌体；
其中所述的黑色素瘤是B16BL6 细胞导致的。
2.一种药物组合物，所述药物组合物能够用于治疗黑色素瘤，所述药物组合物含有一种靶向抗恶性黑色素瘤的miR-137外泌体以及药学上可接受的载体，所述的靶向抗恶性黑色素瘤的miR-137外泌体为外部结合靶向肽SEQ ID NO：1，内部转染有miR-137的外泌体，
所述靶向抗恶性黑色素瘤的miR-137外泌体其制备方法包括以下步骤：
a)制备表皮干细胞外泌体；
b)将miR-137转染所述外泌体；
c)将所述靶向肽结合到外泌体上，制备得到靶向抗恶性黑色素瘤的miR-137外泌体。
3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于药学上可接受的载体是指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系。
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