CN105477016A - 人间充质干细胞来源的外泌体在抗组织纤维化及瘢痕形成中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域,涉及间充质干细胞来源的外泌体在制备拮抗瘢痕或组织器官纤维化药物中的应用。本发明采用健康人脐带经过原代体外培养,扩增后收集上清液并利用低温超速离心、纯化等手段制备得到高纯度、高生物活性的外泌体;单独使用或按照比例加入到医药、保健品、化妆品中,开发成具有生物活性功能的产品,可以有效调控机体细胞信号转导,抑制成纤维细胞分化,继而拮抗器官组织纤维化以及瘢痕形成。经试验验证,外泌体对皮肤损伤后的增生性瘢痕,尤其关节部位的瘢痕挛缩以及肝脏纤维化,心脏纤维化等病理性纤维增生具有明显促修复的作用,而且其具有安全性高,毒性小,便于储存和运输的优势,具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于药物研发,细胞生物学、分子生物学领域。其涉及人脐带间充质干细胞来源的外泌体,可用于多种情况,包括拮抗组织器官纤维化、瘢痕过度形成以及皮肤关节的瘢痕粘连等。
背景技术
肌成纤维细胞(myofibroblast)是一种表达平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的由成纤维细胞高度分化而来的细胞,它参与了纤维化级联反应中纤维形成和细胞外基质重塑两个阶段(VanDeWaterL,VarneyS,TomasekJJ,MechanoregulationoftheMyofibroblastinWoundContraction,Scarring,andFibrosis:OpportunitiesforNewTherapeuticIntervention.2013May;2(4):122-141)。Tomasek(TomasekJJ,GabbianiG,HimB,eta1.Myofibmblasandmechalno-regulationofconnectivetissueremodelling.NatRevMolCellBiol.2002May;3(5):349-63.)等指出,肌成纤维细胞是创面肉芽收缩和纤维收缩性疾病主要的细胞,它的功能是产生力量和改变组织张力。这些细胞大量分泌胶原、纤维连接蛋白、生长因子和各种酶类。在伤口愈合和纤维化的细胞外基质中主要负责组织收缩。当组织由于氧化应激、低氧状态、炎症、凋亡等刺激而受到损伤时,虽然通过用细胞外基质将损伤组织置换而试图进行修复,但当损伤很严重时或者该刺激变为慢性化时等,组织无法充分地发挥其功能,肌成纤维细胞分化则不受调控进而引起不适当或过度的纤维结缔组织生成,即一种被统称为纤维化的过程。这样的疾病和病症包括纤维化肝病、肝硬化、心脏纤维化和肺纤维化(包括特发性肺纤维化)。而在皮肤损伤引起的过度瘢痕增生,在关节部位引起的瘢痕粘连挛缩都可以一并认为肌成纤维细胞的过度增生。更有文献表明它的存在与促进肿瘤生长也有直接关系(VanDeWaterL,VarneyS,TomasekJJ,MechanoregulationoftheMyofibroblastinWoundContraction,Scarring,andFibrosis:OpportunitiesforNewTherapeuticIntervention.2013May;2(4):122-141;JunkerJP1,KratzC,A,KratzG,echanicaltensionstimulatesthetransdifferentiationoffibroblastsintomyofibroblastsinhumanburnscars.Burns.2008Nov;34(7):942-6.)。
近年来,干细胞相关机制及应用的研究在创面修复领域有了新的突破。研究表明(HeldinCH,LandstrSmM,MoustakasA.MechanismofTGF—betasignalingtogrowtharrest,apoptosis,andepithetlial-mesenchymaltransition[J].CurrOpinCellBiol,2009,21:166—176),间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)能够促进组织器官创伤的愈合并且能够拮抗瘢痕过度形成。其机制包括(1)在创面的局部微环境下可以诱导分化为创面修复所必需的成纤维细胞、角质形成细胞和血管内皮细胞等。(2)具有抗炎、免疫调节和免疫抑制作用,可通过调控创伤局部的炎症反应调节创面愈合(ZhangQ,ShiS,LiuY,eta1.Mesenchymalstemcellsderivedfromhumangingivaarecapableofimmunomodulatoryfunctionsandameliorateinflammation—relatedtissuedestructioninexperimentalcolitis[J].JImmunol,2009,183(12):7787—7798)。(3)几乎可以自分泌或旁分泌创面修复需要的所有细胞因子或生长因子。促进创伤局部或循环中的细胞迁移、增殖和新血管形成。尤其可以调控TGF-β细胞因子的表达。在瘢痕增生以及许多内脏器官的纤维化过程中TGF-β/SMAD信号通路广泛存在并起到重要作用(HeldinCH,LandstrSmM,MoustakasA.MechanismofTGF—betasignalingtogrowtharrest,apoptosis,andepithetlial-mesenchymaltransition[J].CurrOpinCellBiol,2009,21:166—176),当肌成纤维细胞过度聚集时,SMAD2和SMAD3过度表达并且呈高磷酸化水平,干扰它们的表达可调控成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化继而减轻过度纤维化。然而,MSC本身并不易于储存并且活性随时间推移急剧下降,并且在移植入体内后存在安全性问题,长期使用甚至有致瘤隐患,极大的限制了临床应用,寻找能够替代MSC在组织损伤修复拮抗纤维化以及瘢痕过度增生的生物材料或干细胞制品显得十分迫切。
外泌体(exosome)作为是一种脂质双分子膜包裹的小囊泡,由细胞的多囊体与质膜融合后,以胞吐的方式释放到胞外环境中。其成分较复杂,表面含有大量与其来源和功能密切相关的蛋白质和脂质成分(SimpsonRJ,LiraJW,MoritzRL,et.Exosomes:proteomicinsightsanddiagnosticpotential[J].ExpertRevProteomics,2009,6(3):267—283)。当外泌体和靶细胞融合后,它会把诸如受体和配体等重要的生物分子运输到靶细胞并将其释放(RecordM,SubraC,Silvente—PoirotS,et01.Exosomesasintercellularsignalosomesandpharmacologicaleffectom[J].BiochemPharmaeol,2011,81(10):1171—1182)。其转运在调节多种细胞的增殖、分化、凋亡等过程中发挥作用。后续的研究又证实外泌体在高温、缺氧、各种pH环境、反复冻融等恶劣条件下仍能保持稳定,还能对抗RNase的作用。
外泌体作为非细胞的微囊泡,可将间充质干细胞来源的活性成分如蛋白,核酸等包裹并保持其完整性(UmezuT,OhyashikiK,KurodaM,eta1.LeukemiacelltoendothelialcellcommunicationviaexosomalmiRNAs[J].Oncogene,2013,32(22):2747—55.),稳定地从一个细胞转移到另一个细胞中,并在新的细胞中发挥功能。
发明内容
结合国内外研究现状以及体内体外实验基础,我们发现间充质干细胞来源的外泌体中的核酸以及蛋白阻断了TGF-β/Smads信号传导通路,抑制了TGF-β诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化,阻止肌成纤维细胞在组织损伤后过度聚集,减少胶原沉积,细胞外基质降解增强,从而起到抗纤维化的作用。与传统的细胞治疗相比,它的安全系数和稳定性更高,可以为瘢痕过度增生以及器官组织纤维化的提供新的靶向治疗方案。
本发明的目的在于(1)提供间充质干细胞来源的外泌体的制备方法;(2)提供包含间充质来源的外泌体的组合物的制备方法;(3)提供间充质干细胞来源的外泌体及其组合物对于拮抗瘢痕和/或组织器官纤维化的用途。
本发明中所提到的间质干细胞来源的外泌体及其组合物均为无菌产品,间充质干细胞主要为骨髓及脐带,资源获取便捷,其分泌的外泌体可以作为干细胞治疗的有效替代品,具有极佳的临床应用价值。
本发明的第一方面提供了间充质干细胞来源的外泌体。
本发明所述的外泌体,优选为脐带来源的间充质干细胞分泌的。
其制备方法步骤如下:
(1)间充质干细胞的体外培养、扩增:1)取新鲜脐带,经磷酸盐缓冲液反复冲洗后,浸泡于含有1%青链霉素的L-DMEM约5分钟,剪成直径约1.5mm大小的组织块;含10%胎牛血清L-DMEM营养液,5%CO2、37℃饱和湿度培养;待7—10日后可见间充质干细胞爬出组织,去除组织块后以0.25%胰蛋白酶消化进行传代培养。2)提取健康人的骨髓,暴露骨髓腔后,用5ml注射器吸取5.2ml细胞生长液,用针头插到骨头的一端冲洗,然后换另一端继续冲洗,将骨髓冲出的细胞生长液加入至60mm培养皿,冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。后用1ml注射器的针头,反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中,按6-8×l06/ml的浓度接种至培养皿。将培养皿放置在37℃、5%CO2培养箱中常规培养。待细胞融合之80%进行传代扩增。
(2)间充质干细胞来源的外泌体的制备:1)将不含外泌体血清的培养基加入2—6代的间充质干细胞中,48h—72h后收取培养上清液,如数量有限,可将上清液暂冻存于-80℃冰箱保存,待条件培养基收集到一定数量(约>150ml)一并制备外泌体;3)将条件培养基于4℃300×g,10min离心除去细胞碎片;4℃2000×g,10min离心去除死细胞等杂质;0.22μm无菌滤膜过滤上清液进一步去除杂质;4℃100000×g,120min44超速离心得到外泌体沉淀,去除上清液后加入约200ulPBS洗涤一遍;再次4℃100000×g,120min超速离心,弃去上清液,加入50ulPBS可得到浓度较纯的间充质干细胞来源的外泌体。分装后于-80℃冰箱保存。
(3)通过流式指标鉴定分离成功的脐带以及骨髓间充质干细胞;通过Nanosight和WesternBlot方法检测抽提成功的exosome,并用BCA蛋白质定量试剂盒进行对外泌体中蛋白质定量检测,浓度约为1500ng/ul—3000ng/ul。
本发明的第二方面在于提供间充质干细胞来源的外泌体的组合物,其特征在于,该组合物由上述外泌体和稀释液组成,稀释液为水凝胶、PBS或9%生理盐水。制备方法为将成功抽提的外泌体与稀释液体积比为1:50—1:200比例稀释,稀释液为水凝胶、PBS或9%生理盐水。可予以-80℃保存。
本发明的第三方面提供了间充质干细胞来源的外泌体及其组合物在制备拮抗瘢痕和/或组织器官纤维化药物中的用途。
上述拮抗瘢痕和组织器官纤维化药物的给药方式,较佳地,为外敷或注射。
本发明的有益效果:
本发明具有明显的优势:第一,产品易于制备及贮藏。通过梯度离心、过滤及超速离心后的外泌体纯度很高并且可以储存于-80℃冰箱至少6个月依然保持活性以及功能;第二,安全系数高,易于吸收。通过超速离心,摒弃了普通细胞提取产品可能含有的有毒的细胞因子,以及其本身不具有免疫原性,避免了干细胞本身潜在的致瘤隐患。外泌体通过细胞内吞作用摄入细胞,可以避免一些大分子生物因子(如蛋白质,RNA)被细胞的磷脂双分子膜所阻挡,不容易被细胞吸收的问题;第三,具有靶向性。外泌体可以靶向调控TGF/SMAD通路,从而抑制组织器官纤维化以及皮肤过度瘢痕的形成。并不会引起其他功能的缺失。第四,给药途径广泛。本发明可以通过水凝胶组合物形式外敷,皮下注射,生理盐水组合物静脉给药甚至对组织器官纤维病变区域直接注射,皆不影响外泌体活性及作用。
附图说明
图1为鉴定脐带间充质干细胞的流式鉴定图。
图2A为WesternBlot方法检测外泌体的蛋白标记CD81和CD63的表达情况。其中A1为干细胞,A2为干细胞来源外泌体,A3为抽提外泌体后的培养基,结果可见A2中富含CD63及CD81,说明抽提成功;B为Nanosight检测外泌体直径及纯度情况,可见外泌体直径主要集中在100nm,说明提取成功。
图3为RealTime检测α-SMA及I型胶原蛋白(CollagenI);RealTime检测间充质干细胞来源外泌体干预人成纤维细胞分化肌成纤维细胞后,肌成纤维细胞特异蛋白α-SMA以及胶原I形成的表达情况。其中1空白对照组;2外泌体组(实验组);3TGFβ组(阳性对照组);结果提示,外泌体干预组α-SMA以及胶原I的表达量较TGFβ阳性对照组明显下调,说明外泌体可以抑制肌成纤维细胞的形成。
图4为流式细胞仪检测细胞磷酸化SMAD2的活化程度;流式细胞仪检测间充质干细胞来源外泌体干预TGF-β诱导的成纤维细胞细胞向肌成纤维细胞分化的磷酸化SMAD2的情况。其中1TGFβ组;2外泌体组;3空白对照组;结果提示外泌体干预组磷酸化SMAD2活性明显降低,说明外泌体抑制了肌成纤维细胞形成所需的SMAD2活化过程。
图5为光镜下HE染色后肝细胞状态(200倍);建立以四录化碳(CCl4)模拟大鼠肝脏纤维化的动物模型,采用外泌体尾静脉注射干预后,切取病变纤维化组织进行HE化学染色(200倍);1为注射生理盐水对照组;2注射外泌体组;3CCl4阳性对照模型组。光学显微镜下显示,外泌体组肝细胞结缔组织相对于1与3减少,假小叶数量减少,肝细胞形态相较于阳性对照组规则,无脂肪变性。而阳性对照组肝脏可见小叶被纤维结构分割包围,假小叶形成,肝细胞可见脂肪变性。
图6为光镜下HE染色后心肌细胞纤维化状态(100倍);建立大鼠心肌纤维化模型,采用外泌体尾静脉注射干预后,切取心肌病变纤维化组织进行HE化学染色(100倍);6A为外泌体组;6B为空白对照组,结果显示外泌体组心肌纤维化细胞(箭头)明显少于空白对照组,意在说明外泌体可以减轻心肌细胞纤维病变。
图7为光镜下α-SMA特异性染色后皮肤肌成纤维细胞状态(200倍);建立SD大鼠背部全层皮肤缺损创面模型,采用外泌体与水凝胶的组合物皮下注射干预后,切取瘢痕皮肤组织对α-SMA进行免疫组织化学染色(200倍);7A为外泌体组;7B为空白对照组。结果显示外泌体组肌成纤维细胞(箭头)明显少于空白对照组,并且排列整齐规律,而空白对照组肌成纤维细胞排列紊乱。N代表正常区域皮肤组织,W代表创面皮肤组织。
具体实施实例
以下结合具体实施例对本发明更好的阐述,以便与对本发明更好的理解,但本发明的实施不仅限于此。
实施例1:间充质干细胞来源的外泌体的制备过程
(1)间充质干细胞的分离培养与扩增:
1)取新生儿的新鲜脐带,经磷酸盐缓冲液反复冲洗后,浸泡于含有1%青链霉素的L-DMEM约5分钟,剪成直径约1.5mm大小的组织块;含10%胎牛血清L-DMEM营养液,5%CO2、37℃饱和湿度培养;待7—10日后可见间充质干细胞爬出组织,去除组织块后以0.25%胰蛋白酶消化进行传代培养。鉴定结果如图1所示。可见脐带间充质干细胞高表达CD29,阳性率为99.7%;CD44,阳性率为94.4%,不表达CD14,阳性率为0.2%;不表达CD45,阳性率为3.1%。
2)取健康人骨髓,暴露出骨髓腔,用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液,用针头插到骨头的一端冲洗,然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm培养皿中,冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出.1ml注射器的针头,反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中。细胞生长液5ml具体配制为DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+青链霉素,低糖DMEM液(含glutamine,Gibco公司)浓度为90%。5ml细胞生长液中需4.5ml胎牛血清(HYCLONE公司)浓度为10%。需25ul青链霉素(HYCLONE公司)浓度为10万U/ml,需要5ulNaHCO3,浓度为7.5%,使细胞生长液的PH在7.0-7.2之间。按6-8×l06/ml的浓度接种至培养皿。将培养皿放置在37℃、5%CO2培养箱中常规培养。48h后半量更换细胞生长液。待细胞铺满培养皿约80%时可进行传代。
(2)无外泌体血清培养基的制备:将胎牛血清于4℃,120000×g离心12小时后弃去沉淀,加入L-DMEM营养液而获得。
(3)抽提外泌体所需的间充质干细胞上清液的制备:选择生长状态良好的2—6代干细胞,先用含10%胎牛血清的L-DMEM培养基培养,待细胞融合至70%-80%时,更换无外泌体血清培养基48h—72h。后收集培养上清并保存于-80℃冰箱待收集至一定数量后再一起抽提外泌体。
(4)间充质干细胞来源的外泌体的抽提纯化:将收集完成的上清液条件于4℃全部融化后,于4℃,300×g,10min离心除去细胞碎片;4℃,2000×g,10min离心去除死细胞等杂质;0.22μm无菌滤膜过滤进一步去除杂质;4℃,100000×g,120min超速离心得到外泌体沉淀,遂加入约200ulPBS洗涤一遍;再次4℃100000×g,120min超速离心,可得到较纯浓度间充质干细胞来源的外泌体。分装后于-80℃保存,并用BCA蛋白质定量试剂盒法进行蛋白质定量检测。
Nanosight:取50微升样品注射入专用管道,进行外泌体的定量以及纯度检测。Nanosight检测仪为英国马尔文NanoSightNS300。
western-blot检测Exosome的特异性蛋白CD81。
1)用试剂盒将Exosome提取蛋白,经BCA法检测蛋白含量后上样
2)电泳、转膜。
3)浸没于5%BSA封闭液中室温缓慢摇荡两小时。孵育一抗4℃过夜。
4)根据一抗来源选择合适的二抗,按相应比例稀释(1:1000~1:10000),室温轻摇两小时。
5)TBS洗涤后,使用ECL发光试剂显色。结果外泌体特异性标志物CD81清晰可见。如图2所示。
实施例1所使用的主要材料和来源分别如下:
MSC培养试剂低糖DMEM、胎牛血清(Gibco公司产品)、胰蛋白酶(Sigma公司产品)、二氧化碳培养箱,生物显微镜,超净工作台,台式离心机;超速离心机(美国贝克曼库尔特有限公司),兔抗人CD9抗体(Abcam公司),兔抗人CD81抗体(美国Abcam公司),BCA蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗(北京康为世纪公司)、0.22μm无菌滤膜(美国Millipore公司);抗人CD9抗体和兔抗人CD81抗体(Bioworld公司)。
实施例2:脐带间充质干细胞分泌的外泌体对成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的调控能力的细胞学研究
(1)成纤维细胞的分离、培养与扩增:取正常人皮肤组织,经磷酸盐缓冲液反复冲洗后,浸泡于含有1%青链霉素的H-DMEM约5分钟,剪成直径约1.5mm大小的组织块贴于培养皿中;含10%胎牛血清H-DMEM营养液,5%CO2、37℃饱和湿度培养;待7—10日后可见成纤维细胞及表皮细胞爬出组织,去除组织块后以0.25%胰蛋白酶根据成纤维细胞所需的消化时间约1分钟消化,去除表皮细胞后进行传代培养。
(2)建立成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的细胞模型:将成纤维细胞铺于6孔板,将TGFβ1细胞因子分别以5ng/ml,10ng/ml浓度加入成纤维细胞中,并设定时间点(6h、12h、24h、48h)检测肌成纤维细胞的标志性蛋白α-SMA的表达情况。RealTime显示48h时α-SMA表达最高,遂证明细胞模型建立成功
(3)脐带间充质干脑细胞来源的外泌体可抑制细胞模型肌成纤维细胞的分化:
1.RT-PCR检测肌成纤维细胞的特异性蛋白α-SMA以及细胞外基质胶原蛋白I(CollagenI)的表达水平
1)将成纤维细胞铺于六孔板,待细胞密度为70%时对其进行处理。分别设1空白对照组;2外泌体组;3TGFβ组;
2)48h后利用Trizol(Invitrogen,15596-026)提取上述处理组及对照组总RNA,逆转录为cDNA。设计引物,检测肌成纤维细胞的特异性蛋白α-SMA的表达水平。GAPDH作为检测用内参。以TGFβ作为阳性对照。
引物序列如下:
α-SMA的引物如下:
f:50-GGACTCTGGGGATGGTGA(SEQIDNO:1)
r:50-AATGAAGGAGGGCTGGAAGA(SEQIDNO:2)
CollagenI的因为如下:
f:TGAGAGAGGGGTTGTTGGAC(SEQIDNO:3)
r:TTGAGAAGAGTTACGAGTTG(SEQIDNO:4)
GAPDH的引物如下:
f:AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG(SEQIDNO:5)
r:GCTGTCACCTTCACCGTTCC(SEQIDNO:6)
结果如图3所示,可见加入脐带间充质干细胞分泌的外泌体经后,α-SMA以及CollagenI表达量下降最为明显。说明干细胞分泌的外泌体可以抑制肌成纤维细胞的形成。
2.流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白磷酸化SMAD2活化情况
1)细胞按每孔4×105个的密度接种于60mm细胞培养皿内,待细胞融合至80%—90%时,设置空白对照组,TGFβ组,外泌体组,处理细胞48h。
2)胰酶消化收集细胞,并用1mLPBS缓冲液清洗剩余细胞一次,全部加入5ml管中。
3)800rpm离心5分钟,去除上清,加3mLPBS缓冲液重悬细胞,再次离心弃上清,重复两次,最后重悬细胞于0.1mLPBS中,并转移到1.5mL离心管中。
4)按照1:100加入磷酸化SMAD2(P-SMAD2)一抗,置于垂直混合液上室温孵育1-2小时。
5)1500rpm,小型离心机离心5分钟,去除上清,加1mLPBS缓冲液重悬细胞,再次离心弃上清,重复3次,最后将洗好的细胞重悬于0.1mLPBS中。
6)将荧光二抗按照1:1000比例加入细胞悬液中,室温孵育1小时。
7)1500rpm离心5分钟,去除上清,加1mLPBS缓冲液重悬细胞,再次离心弃上清,重复3次,最后重悬细胞于0.2mLPBS中。
8)用锡箔纸包住避光,将细胞加入流式管中,在流式细胞仪上分析。
结果如图4所示,外泌体处理组磷酸化SMAD2含量最少,意味着TGFβ/SMAD通路活性受到抑制从而阻止了成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。
实施例2所使用的主要材料和来源分别如下:
一抗、二抗(美国abcam公司,按照试剂盒说明书进行操作),超净工作台,台式离心机,RT-PCR技术相关试剂(Takara),流式细胞仪
实施例3.间充质干细胞来源的外泌体减轻大鼠肝纤维化
(1)建立大鼠肝纤维化模型:将CCl4制成50%橄榄油剂,按lml/kg体重在处理组每只大鼠腹腔注射,第一周三次,第二周后每周二次,同时喂以10%的酒精饮料,共六周。
(2)间充质干细胞来源的外泌体干预治疗:
将肝纤维化大鼠随机分为2组,每组10只。
治疗方法:外泌体组:将外泌体于注射CCl4后第2周开始每三日治疗1次,尾静脉注射本发明,剂量为150ug/kg共3周。空白对照组:同外泌体组处理时间,每三日1次,尾静脉注射相同体积的生理盐水,共3周。
(3)治疗结果检测:
疗程结束后,取大鼠尾静脉血,使用全自动生化仪检测大鼠ALT(丙氨酸转氨酶)、AST(天门冬氨酸转氨酶)、ALP(血清碱性磷酸酶)含量。结果如表1:
表1大鼠ALT、AST、ALP含量
Group | N | ALT | AST | ALP |
外泌体组 | 10 | 42.23±10.54** | 116.34±20.11** | 270.67±60.21** |
生理盐水组 | 10 | 79.21±10.11** | 190.56±70.66** | 310.22±89.48** |
结果所示:外泌体组相比空白对照组ALT,AST,ALP明显降低。(**P<0.05)
将大鼠处死,解剖肝脏,将其固定于4%甲醛中,经常规脱水,石蜡包埋,切5μm厚切片,行HE染色。结果如图5:1为注射生理盐水组;2为注射外泌体组;3为未干预的四氯化碳肝纤维化模型组。可见外泌体组的肝细胞结缔组织相对于四氯化碳阳性对照组减少,假小叶数量减少,肝细胞形态相较于对照组规则,无脂肪变性。对照组肝脏可见小叶被纤维结构分割包围,假小叶形成,肝细胞可见脂肪变性。
实施例3所使用的材料:动物:清洁级SD大鼠30只,雄性,体重(200±20)g,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,许可证号:SCXK(沪)2007-0005;药物与主要试剂:按上述实施例1方法制备本发明生物制剂;CCl4南京化学试剂厂产品;ALT、AST、ALP测定试剂盒,购自南京建成生物工程研究所;
实施例4:间充质干细胞外泌体减轻大鼠心肌纤维化
(1)构建大鼠心肌纤维化模型
大鼠21只,雄性,体重180-220g,本发明采用异丙肾上腺素诱发大鼠心肌纤维化模型,背部皮下注射异丙肾上腺素5mg/(kg·d),连续7d,表现为左室指数升高,左心室羟脯氨酸含量增加,血清中I型胶原含量增高,表明心肌纤维化模型成立。
(2)间充质干细胞来源的外泌体干预治疗:
将大鼠随机分为两组:空白对照组、外泌体组。将外泌体组大鼠自第2天开始尾静脉注射外泌体,剂量为150ug/kg,每三日一次,持续2周。空白对照组给予相同体积的生理盐水。
(3)治疗结果检测:
末次给药后禁食不禁水12h,所有大鼠称体重后,10%水合氯醛(0.3mL/kg)麻醉,开胸取出心脏,去除大血管和心外膜脂肪组织,用生理盐水清洗,吸干后称左心室重量,计算左心室重量指数(左心室重量/体重)。左心室指与空白对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。
另外,心脏组织用冰生理盐水冲洗后,取部分左心室心肌,将其固定于4%甲醛中,经常规脱水,石蜡包埋,切5μm厚切片,行HE染色。结果如图6箭头所示,6A外泌体组心肌坏死细胞含量相对于6B空白对照组明显减少。
实施例4所使用的材料:动物:清洁级SD大鼠30只,雄性,体重(200±20)g,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,许可证号:SCXK(沪)2007-0005;药物与主要试剂:按上述实施例1方法制备本发明生物制剂。
实施例5:间充质干细胞来源的外泌体抑制皮肤瘢痕形成
(1)构建大鼠背部皮肤全层缺损创面模型
SD大鼠10只(体重约为200g,雌雄各半)以10%水合氯醛麻醉大鼠并放置于操作台上,脱毛处理后根据标准在大鼠背部创建直径为1.5cm大小的圈层皮肤缺损创面模型。并随机分为两组。一组为外泌体组,一组为空白对照组。
(2)间充质干细胞来源的外泌体干预治疗
于术后第2d、7d、14d、21d进行创面面积的测量,并在外泌体组创面皮下四个点进行皮下注射外泌体与水凝胶组合物,比例为1:50。浓度为150ug/kg。空白对照组给予皮下注射生理盐水与水凝胶组合物,比例体积同外泌体组。
(3)治疗结果检测:
大体创面观察表明间充质干细胞来源的外泌体明显促进创面愈合速度。第21天外泌体组创面已接近愈合,而空白对照及NC对照则仍有裂痕。将皮肤组织切下进行经常规脱水,石蜡包埋,切5μm厚切片,行特异性α-SMA组化染色。
结果如图7:显微镜下显示:其中箭头所指为肌成纤维细胞,N代表正常区域皮肤组织,W代表创面皮肤组织。可见外泌体组7A成纤维细胞排列整齐,毛囊结构较成熟,炎性细胞浸润少,肌成纤维细胞的特异性蛋白α-SMA表达量低,且呈排列规律。而空白对照组7B可见表达α-SMA的肌成纤维细胞聚集于未愈合的裂痕处,排列紊乱,毛囊结构未形成。
实施例5所使用的材料:动物:清洁级SD大鼠10只,雄性,体重(200±20)g,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,许可证号:SCXK(沪)2007-0005;药物与主要试剂:按上述实施例1方法制备本发明生物制剂。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (10)
1.间充质干细胞来源的外泌体在制备拮抗瘢痕或组织器官纤维化药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞来源的外泌体在制备拮抗瘢痕或组织器官纤维化药物中的应用,其特征在于,所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞来源的外泌体在制备拮抗瘢痕或组织器官纤维化药物中的应用,其特征在于,所述的药物以间充质干细胞来源的外泌体为唯一活性成份或活性成份中包含间充质干细胞来源的外泌体。
4.根据权利要求2所述的间充质干细胞来源的外泌体在制备拮抗瘢痕或组织器官纤维化药物中的应用,其特征在于,所述的间充质干细胞来源的外泌体是用以下方法制备得到的:
A、选用脐带来源的间充质干细胞体外传代培养、扩增;
B、间充质干细胞来源的外泌体的制备:
a)将不含外泌体血清的培养基加入2至6代中的任一代间充质干细胞中,48h—72h后收取培养上清液,作为条件培养基;
b)将条件培养基于4℃300×g,10min离心除去细胞碎片;4℃2000×g,10min离心去除死细胞等杂质;0.22μm无菌滤膜过滤上清液进一步去除杂质;4℃100000×g,120min44超速离心得到外泌体沉淀,去除上清液后加入约200ulPBS洗涤一遍;再次4℃100000×g,120min超速离心,弃去上清液,加入50ulPBS可得到浓度较纯的间充质干细胞来源的外泌体;分装后于-80℃冰箱保存。
5.根据权利要求4所述的间充质干细胞来源的外泌体在制备拮抗瘢痕或组织器官纤维化药物中的应用,其特征在于,所述的步骤A为:
a)取新鲜脐带,经磷酸盐缓冲液反复冲洗后,浸泡于含有1%青链霉素的L-DMEM约5分钟,剪成直径约1.5mm大小的组织块;含10%胎牛血清L-DMEM营养液,5%CO2、37℃饱和湿度培养;待7—10日后可见间充质干细胞爬出组织,去除组织块后以0.25%胰蛋白酶消化进行传代培养;
b)提取健康人的骨髓,暴露骨髓腔后,用5ml注射器吸取5.2ml细胞生长液,用针头插到骨头的一端冲洗,然后换另一端继续冲洗,将骨髓冲出的细胞生长液加入至60mm培养皿,冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出;后用1ml注射器的针头,反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中,按6-8×l06/ml的浓度接种至培养皿;将培养皿放置在37℃、5%CO2培养箱中常规培养;待细胞融合之80%进行传代扩增。
6.一种间充质干细胞来源的外泌体的组合物,其特征在于,该组合物由间充质干细胞来源的外泌体和稀释液组成,稀释液为水凝胶、PBS或9%生理盐水;且间充质干细胞来源的外泌体与稀释液体积比为1:50—1:200比例稀释。
7.根据权利要求6所述的间充质干细胞来源的外泌体的组合物,其特征在于,所述的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
8.根据权利要求7所述的间充质干细胞来源的外泌体的组合物,其特征在于,所述的间充质干细胞来源的外泌体是用以下方法制备得到的:
A、选用脐带来源的间充质干细胞体外传代培养、扩增;
B、间充质干细胞来源的外泌体的制备:
a)将不含外泌体血清的培养基加入2至6代中的任一代间充质干细胞中,48h—72h后收取培养上清液,作为条件培养基;
b)将条件培养基于4℃300×g,10min离心除去细胞碎片;4℃2000×g,10min离心去除死细胞等杂质;0.22μm无菌滤膜过滤上清液进一步去除杂质;4℃100000×g,120min44超速离心得到外泌体沉淀,去除上清液后加入约200ulPBS洗涤一遍;再次4℃100000×g,120min超速离心,弃去上清液,加入50ulPBS可得到浓度较纯的间充质干细胞来源的外泌体;分装后于-80℃冰箱保存。
9.如权利要求6、7或8所述的间充质干细胞来源的外泌体的组合物在制备拮抗瘢痕或组织器官纤维化药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的间充质干细胞来源的外泌体的组合物在制备拮抗瘢痕或组织器官纤维化药物中的应用,其特征在于,所述的药物的给药方式为外敷或注射。
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |