CN108743619A

CN108743619A - 一种利用温度响应型水凝胶包裹递送外泌体并增强其治疗效果的技术手段

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Publication number: CN108743619A
Application number: CN201810642490.3A
Authority: CN
Inventors: 李宗金; 张凯悦
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2018-06-21
Filing date: 2018-06-21
Publication date: 2018-11-06

Abstract

本发明是一种利用温度响应型水凝胶包裹递送外泌体并增强其在组织损伤中的治疗效果的技术手段。该方法是使用温度响应型水凝胶在4℃为液体时，将干细胞来源的外泌体包裹，在注射至损伤部位后在体内形成包裹了外泌体的水凝胶，并将外泌体缓慢释放至损伤组织；所述水凝胶可以增强外泌体在损伤部位的保留率和局部浓度，同时提高外泌体内功能分子的稳定性，并可以将外泌体缓释到损伤部位，进一步提高外泌体的治疗效果，并促进损伤组织结构和功能的恢复。

Description

一种利用温度响应型水凝胶包裹递送外泌体并增强其治疗效果的技术手段

技术领域

本发明涉及利用温度响应型水凝胶包裹递送外泌体并增强其在组织损伤中的治疗效果的技术手段，属于组织工程与新医药技术领域。

背景技术

外泌体是细胞旁分泌成分的主要形式，在细胞间通讯中起着十分重要的作用。外泌体通常被认为是由细胞内部多囊泡体向内出芽所产生的微囊泡，在多囊泡体与细胞膜融合时，将其内部的微囊泡释放至细胞膜外，形成外泌体。外泌体的直径约为30-100 nm，由于其特殊的形成方式，外泌体内部富含细胞内具有生物活性的信号分子，包括DNA、RNA、microRNA及蛋白质等。外泌体介导的细胞间通讯可以为临近细胞提供大量的生物活性材料及信号分子，这项功能不能被简单的可溶性旁分泌因子所取代，可以为细胞内蛋白质及遗传物质的水平转移提供有效的途径。外泌体在正常的生理过程中扮演着重要的角色，如炎症反应、凝血机制及内环境的稳态维持；同时外泌体在病理过程中也具有很大的影响，尤其是在自身免疫疾病和肿瘤中。因此，病理性的外泌体作为疾病诊断的生物标志和以外泌体作为疾病的新治疗方法成为了全新的研究领域。

水凝胶作为一种亲水聚合物的交联形式，已经展现出是一种在生物及医学领域具有巨大潜力的生物材料。这些亲水聚合物网络中通常对水有很高的亲和力，但由于其通过物理或化学作用形成了交联网络，故不会溶解在水中，同时水可以渗入聚合物的聚合物网络之间，随后引起膨胀形成一种水凝胶模式。根据水凝胶对外界环境的响应，可以将水凝胶分为光响应型水凝胶、pH响应型水凝胶和温度响应型水凝胶。其中，温度响应型水凝胶是目前研究最广泛的响应型水凝胶系统，温度在4℃时为液态，在处于37℃时，发生交联反应形成水凝胶，具有良好的可注射性。可注射的温敏型聚合物溶液在不加任何有机溶剂和交联剂的情况下，经很小的插管导入体内后可原位形成（半）固体凝胶，即在体温时发生溶胶－凝胶转变。作为植入体，可经过简单的混合而负载多种治疗药物和不需预设支架形状，是理想的药物载体、栓塞材料和组织工程支架材料。此外，水凝胶作为一种天然大分子化合物，具有一定的机械强度和可降解性等物理参数，同时也具有生物相容性和提供生物相关微环境的生物学特性，在医学领域具有广泛的应用。此外，因温度响应型水凝胶具有良好的可注射性，可以避免置放已成形细胞支架带来的损伤，故温度响应型水凝胶可作为组织工程的细胞支架用于移植细胞。天然水凝胶具有疏松多孔的网状结构，可以模拟天然的细胞外基质并为细胞粘附、迁移和增殖提供支持；另外，天然水凝胶可以被溶酶体降解，在生物体内具有良好的生物可降解性，可以完全被生物降解，以便在组织修复后完全被生物组分取代。因此，以温度响应型水凝胶为基础的多种类型的细胞支架材料已经在组织工程领域显示出重要的应用价值。

近年来，科学家们发现外泌体作为细胞外囊泡的重要组成部分，不是用于细胞内垃圾物质的排放，而是细胞间通讯的重要形式。外泌体通常被认为是由细胞内部多囊泡体向内出芽所产生的微囊泡，在多囊泡体与细胞膜融合时，将其内部的微囊泡释放至细胞膜外，形成外泌体。外泌体的直径约30-100 nm，由于其特殊的形成方式，外泌体内部富含细胞内具有生物活性的信号分子，包括DNA、RNA、microRNA及蛋白质等。被释放至细胞外的外泌体可以通过不同的途径进入靶细胞内，发挥其生物学功能。第一，与细胞分泌的可溶性旁分泌因子类似，外泌体可以通过与靶细胞膜表面受体结合，触发靶细胞内的信号转导通路，并进一步调节靶细胞内的生物学过程；第二，外泌体可以被靶细胞内在化，这一过程依赖于网格蛋白介导的内吞作用、脂筏介导的内吞作用及胞饮作用等；第三，外泌体可以通过与靶细胞膜融合，直接将外泌体内携带的活性物质递送到靶细胞内。外泌体介导的细胞间通讯可以为邻近细胞提供大量的生物活性材料及信号分子，这项功能不能被简单的可溶性旁分泌因子所取代，可以为细胞内蛋白质及遗传物质的水平转移提供有效的转移途径。

随着细胞生物学和医学前沿交叉领域的不断发展，外泌体的研究逐渐深入，越来越多的外泌体在疾病治疗中展现出令人振奋的治疗效果。如间充质干细胞来源的外泌体通常被认为具有与间充质干细胞相似的功能，包括促进组织损伤修复、抑制炎症反应及减轻组织纤维化程度等。但是，在实际应用过程中，由于外泌体直径较小，易于被免疫系统及网状内皮系统吞噬，在注射后外泌体在损伤部位的滞留率很低；同时，虽然在低温保存时，外泌体内的成分十分稳定，但是外泌体被注射至体内后其内部携带的生物活性分子的稳定性目前还不清楚。近年来，生物材料被广泛应用于干细胞治疗与组织工程领域，其中温度响应型水凝胶作为一种水溶性高分子，具有疏松多孔的网状结构，同时其可以对温度进行响应，具有可注射性，并且具有良好的生物相容性、生物可降解性和一定的分子识别能力。利用温度响应型水凝胶包裹并缓释外泌体，理论上可以提高外泌体在机体环境中的稳定性，并且可以提高外泌体在损伤部位的滞留率，并且可以为组织损伤修复提供良好的微环境。

发明内容

本发明是一种利用温度响应型水凝胶包裹递送外泌体并增强其在组织损伤中的治疗效果的技术手段。

该发明是使用温度响应型水凝胶在4℃为液体时，将干细胞来源的外泌体包裹，在注射至损伤部位后在体内形成包裹了外泌体的水凝胶，并将外泌体缓慢释放至损伤组织。

所述水凝胶为温度响应型，是一类以溶液状态给药后在用药部位立即发生相转变，由液体固化形成半固体凝胶的制剂。可以是壳聚糖水凝胶，但不限于壳聚糖水凝胶，还包括以胶原纤维、聚乙二醇等为原料的温度响应型水凝胶。

所述外泌体为干细胞来源的外泌体，所述干细胞包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、尿液来源干细胞、内皮祖细胞、或心脏干细胞等。

本发明可以有效增强外泌体在损伤部位的滞留率，同时提高外泌体内蛋白质及microRNA等有效成分的稳定性，并可以将外泌体缓释到损伤部位，进一步提高外泌体的治疗效果，促进损伤组织结构和功能的恢复。

所述组织损伤包括下肢缺血、肾脏损伤、心肌梗死及皮肤损伤等。

附图说明

图1A为温度响应型水凝胶在4℃和37℃的状态；图1BCD为外泌体特征的鉴定，该外泌体为间充质干细胞分泌的外泌体。

图2为水凝胶包裹的外泌体在下肢缺血小鼠损伤部位的滞留情况，与未被包裹的外泌体相比，温度响应型水凝胶可以有效提高外泌体在损伤部位的滞留率。

图3 AB为水凝胶包裹的外泌体内蛋白质在37℃的稳定性；图C为水凝胶包裹的外泌体内microRNA在37℃的稳定性，温度响应型水凝胶可以有效增强外泌体内功能分子在37℃的稳定性。

图4为水凝胶包裹的外泌体的缓释效率，R²=0.8672。

图5为水凝胶包裹缓释的外泌体可以更好的促进下肢缺血组织结构和功能的恢复。H&E染色及Masson染色显示水凝胶包裹的外泌体治疗组中缺血肌肉纤维化最轻，结构恢复最好。

具体实施方案

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可以从商业途径获得。

实施例1，本发明提供一种干细胞来源的外泌体提取及鉴定的方法。

细胞培养基、双抗、胰酶等试剂均购于Gibco公司；细胞培养耗材均购于Corning公司。

细胞培养所需血清为去除外泌体的胎牛血清，购于BI公司，处理步骤如下：将胎牛血清置于超速离心管中，120000 g在4℃离心2 h，在超净台中取上清，并用0.22μm的针式滤器过滤，保存于-80℃冰箱备用。

细胞传代培养、冻存及复苏等细胞生物学实验操作步骤详见《动物细胞培养（第六版）》。

收集含有外泌体的hP-MSCs条件培养基：当培养于75 cm2的细胞培养瓶中的hP-MSCs处于对数增长期，细胞汇合度达到80%时，吸尽培养基，用PBS洗两次，每瓶加入10 ml配置好的含有10%无外泌体的FBS的完全培养基，继续培养24 h后，将培养基收集至离心管中，该培养基为富含外泌体的条件培养基。

超速离心法分离提取外泌体：① 将上述步骤获得的条件培养基于4℃，300 g离心10 min，去除细胞碎片；② 将所得上清于4℃，12000 g离心20 min，去除凋亡小体等大的细胞碎片；③ 用0.22 μm的针式滤器过滤所得上清，去除直径大于200 nm的微囊泡；④ 把过滤后的上清置于超速离心管中，4℃ 100000 g离心 70 min，弃上清，加入适量PBS重悬管底沉淀，于-80℃保存。

使用透射电子显微镜鉴定外泌体形态，将上一步骤提取的外泌体滴于200目的样品网上，室温静止2 min，用滤纸吸干多余液体；在样品网上滴加20 mg/mL 醋酸铀溶液，室温静置1 min，对样品进行负染，用滤纸吸干多余液体，并将样品网晾干；将制备好的样品置于透射电镜下观察，并采集照片。如图1B所示，外泌体为杯状囊泡样结构，直径约为70-100nm左右。

通过Western blot检测外泌体标志蛋白CD9和CD63（图1C）。

1）蛋白样品制备：将超速离心后得到的外泌体沉淀中加入RIPA裂解液裂解外泌体，反复吹打后移入洁净1.5 mLEP管中，在冰上裂解30 min，每10 min涡旋振荡一次，于4℃，12000 rpm离心15 min，将上清移入新的EP管中；使用BCA法测定外泌体蛋白浓度，其余蛋白液中加入5×上样缓冲液，在沸水中煮10 min，保存于-80℃冰箱中备用。

2）聚丙烯酰胺凝胶电泳：将洁净晾干的玻璃板装于制胶架上，使底边吻合严密，用蒸馏水验漏。按照分离胶配方配制10%的分离胶溶液，充分混匀，用移液器加入4.5 ml分离胶溶液至玻璃板缝隙中，立即轻柔加入蒸馏水将分离胶液面压平，约20 min后分离胶凝固。按照配方配制5%的浓缩胶溶液，灌注1.5 ml浓缩胶溶液到分离胶的上方，立即插入梳子，待浓缩胶凝固后便可使用。将配好的胶板放置到电泳槽内，注意短玻板向内侧，在两块玻板中间加入电泳液，将梳子拔出，按照测定蛋白浓度统一上样量，将蛋白样品加入上样孔中，添加电泳液至电泳槽标记处，盖好电泳槽盖，注意连接正负极，90 V开始电泳，待溴酚蓝跑至分离胶时，将电压调至120 V，直至溴酚蓝接近玻板底部时停止电泳。

3）转膜：将转膜夹与海绵及滤纸浸泡于预冷的转膜缓冲液中，把聚丙烯酰胺凝胶置于黑色夹板一侧，剪取适宜大小的PVDF膜，置于甲醇中活化60 s，放置于胶上，除尽气泡，覆盖滤纸和海绵，按照转膜夹负极（黑色）-海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵-正极（白色）顺序夹好转膜夹，放置于转膜槽中，添加转膜液，冰浴恒压120V转膜2 h。

4）封闭：将转膜完成的PVDF膜取出，用TBST溶液洗尽凝胶残渣，置于5%的脱脂牛奶（封闭液）中，水平摇床100 rpm室温封闭1 h。

5）抗体杂交：① 一抗孵育：用封闭液按照说明书稀释一抗（Gapdh，1:5000稀释，CD9，1：1000稀释，CD63，1:1000稀释），吸取2 ml一抗置于抗体孵育盒中，对照蛋白Marker将目的条带剪下，浸泡于对应一抗中，4℃孵育过夜；② 二抗孵育：将条带用TBST溶液清洗3次，每次5 min，然后加入对应二抗，水平摇床100 rpm室温孵育2 h，孵育完成后用TBST洗3次，每次5 min。

6）发光检测：把发光液A/B按1:1比例进行混合配成工作液，在暗室中将发光液滴加在膜上，待目的条带发出绿色荧光时，用胶片进行曝光、显影及定影。

用动态光散射仪检测所提取外泌体粒径频度分布。

将上述分离提取的外泌体稀释至1 mg/ml，用0.22 μm针式滤菌器过滤，在动态光散射仪样品池中加入100 μL外泌体溶液进行检测，检测结果以粒径频度分布来表示。图1D显示外泌体平均直径约为80 nm。

实施例2，本发明提供温度响应型水凝胶的制备方法。

温度响应壳聚糖水凝胶制备方法：将脱乙酰壳聚糖（Mn = 50,000）粉末溶解于0.1M乙酸中，0.22 μm滤器过滤灭菌，并在冰浴中制备成2％壳聚糖的溶液。配置50％β-甘油磷酸盐溶液，并过滤除菌。在冰浴中，将β-甘油磷酸盐溶液以1：5的体积比加入壳聚糖溶液中，并不断搅拌，直至这两种溶液充分混合。该壳聚糖/甘油磷酸混合溶液在37℃孵育30分钟后，可以交联成水凝胶（如图1A所示）。

温度响应胶原纤维凝胶制备方法：取体重约250 g 的SD大鼠并取其鼠尾，置于75%乙醇中浸泡灭菌，无菌条件下折断尾骨并剔除皮毛，抽出尾腱置于生理盐水中浸泡，剪碎后每克尾腱加入0.1%乙酸溶液50mL，在4℃放置7天，期间每天定时振荡4~6次，4000rmp/min离心30分钟后，吸取上清，为鼠尾胶原溶液，于4℃保存备用，鼠尾胶原处于37℃环境中时凝固为凝胶样。

实施例3，本发明提供一种利用温度响应型水凝胶包裹递送外泌体的方法。

将2×水凝胶溶液与干细胞来源的外泌体等体积互溶，制备成1×的含有外泌体的水凝胶溶液，并一直使其处于4℃环境中，在使用时保持注射器于4℃预冷，在注射至损伤部位后，于体内37℃环境中交联形成含有外泌体的水凝胶。

实施例4，本发明提供一种利用生物发光成像对外泌体进行示踪及评价的技术。

生物发光报告系统表达Gaussia萤光素酶（Gluc）和乳粘素融合蛋白，可以用于标记外泌体。乳粘素是一种粘附相关蛋白，其在外泌体膜上特异性地高表达，利用基因工程技术，将Gluc基因片段插入到乳粘素基因片段中，即可表达Gluc与乳粘素的融合蛋白（Gluc-lac）。将携带Gluc-lac融合蛋白的慢病毒感染宿主细胞，将该融合基因插入宿主细胞基因组中，使宿主细胞稳定表达该融合蛋白，使其分泌的外泌体被Gluc标记，可在体内及体外成像示踪。

生物发光成像技术对外泌体示踪及评价：称取小鼠体重，按330 mg/kg（10 μL/g）4%水合氯醛的剂量，腹腔注射麻醉小鼠；同时开启并初始化Imaging System IVIS Lumina成像系统；静脉注射Gaussia荧光素酶（Gluc）底物腔肠素（CTZ），立即将小鼠置于成像系统内，采集图片，并使用图像分析软件Living Image测定每只小鼠的发光信号强度；在刚注射Gluc标记的外泌体后（0 h）及注射完外泌体后第6、12、24、48及72 h时，均根据上述步骤进行活体成像操作。

实施例5，本发明提供小鼠下肢缺血、肾脏损伤、心肌梗死及皮肤损伤等模型的构建方法。

小鼠下肢缺血模型的构建：称取小鼠体重，按330 mg / kg（10 μL/g）4%水合氯醛的剂量，腹腔注射麻醉小鼠；沿着右腿膝内侧至腹股沟中点做切口，并钝性分离皮下结缔组织；用眼科手术镊分离并暴露出股动脉及大隐动脉，旋髂外动静脉和股动静脉肌支，轻轻分离伴行的神经，用8/0号线结扎股动脉两端并移除中间段；缝合好皮肤切口，将动物置于加热垫上直至苏醒；将手术后动物随机分为4组：PBS组，壳聚糖（CS）组，外泌体（Exo）组，CS包裹的外泌体（CS-Exo）组。此外仅在小鼠右腿皮肤做切口并缝合，未做动脉结扎的小鼠为假手术（Sham）组。

小鼠急性肾损伤模型的构建：称取小鼠体重，按330 mg / kg（10 μL/g）4%水合氯醛的剂量，腹腔注射麻醉小鼠；于背部中部、脊柱左侧 0.2 厘米处纵行切开皮肤（ 0.8-1厘米），分离皮下结缔组织，离断背部肌肉进入腹腔，探查并暴露左肾，可见正常肾脏呈现鲜红色；用尖镊游离肾周脂肪及筋膜，向左侧轻轻牵拉肾脏暴露肾蒂，使用微型血管夹略靠近肾脏夹闭肾蒂，约 1 分钟可见肾脏出现淤血呈紫黑色；肾脏缺血期间，使用浸沾温生理盐水的纱布覆盖切口并保持纱布湿润，小鼠上方暖灯照射并保持加热垫温度（ 37°C）恒定；缺血 40 分钟后移除血管夹，肉眼可见肾脏颜色即刻变为红色；将手术后动物随机分为4组：PBS组，壳聚糖（CS）组，外泌体（Exo）组，CS包裹的外泌体（CS-Exo）组，在肾包膜下分别注射PBS、CS、Exo和CS-Exo后，使用 4-0 丝线逐层缝合肌层和皮肤关闭背部切口，将动物置于加热垫上直至苏醒。此外仅在小鼠左侧皮肤做切口并缝合，未做肾缺血再灌注的小鼠为假手术（Sham）组。

小鼠心肌梗死模型的构建：用 5%的异氟烷气体预麻小鼠并固定，剪开颈部气管，气管插管后接通麻醉呼吸机正压通气，调节异氟烷的含量约为 1%-1.5%，呼吸频率为 120次/分钟；进行胸廓切开术，并于第四肋间处暴露心脏左心室前壁；左冠状动脉起始端的下方距离左心耳约 1 毫米处，用 7-0 的缝合线结扎冠状动脉左前降支；将手术后动物随机分为4组：PBS组，壳聚糖（CS）组，外泌体（Exo）组，CS包裹的外泌体（CS-Exo）组，于结扎位点左下、右下各 1 毫米处分别注射PBS、CS、Exo和CS-Exo；关胸，缝合肌肉和皮肤，将动物置于加热垫上直至苏醒。此外仅将小鼠开胸、穿线不接扎不移植任何细胞或溶液，后关胸缝合肌肉的小鼠为假手术（Sham）组。

小鼠皮肤损伤模型的构建：称取小鼠体重，按330 mg / kg（10 μL/g）4%水合氯醛的剂量，腹腔注射麻醉小鼠；在小鼠背部剪除全层皮肤及肉膜，暴露肌肉层，造成直径为1cm的圆形皮肤缺损；用IV3000 无菌不透水伤口敷料覆盖创面，贴膜边缘用伤口粘合剂點附于裸鼠背部皮肤，自第 3 天起每隔 2 天更换创面敷料；将手术后动物随机分为4组：PBS组，壳聚糖（CS）组，外泌体（Exo）组，CS包裹的外泌体（CS-Exo）组，并于皮肤损伤位点分别注射PBS、CS、Exo和CS-Exo。

实施例6，本发明提供一种检测温度响应型水凝胶包裹的外泌体滞留率及稳定性的方法。

使用例2中的温度响应型水凝胶溶液将例1中的外泌体混合，注射于例5中下肢缺血模型小鼠损伤下肢，并通过例4中生物发光报告基因检测外泌体的滞留率。该报告基因产生的生物荧光与外泌体的蛋白量呈线性关系，可以用生物荧光信号强弱反应外泌体的蛋白量。通过对生物荧光的检测（图2），水凝胶包裹的外泌体在缺血下肢中保留率更高。此外，还通过例4中生物荧光检测外泌体内蛋白质成分在37℃的稳定性（图3AB），并通过检测miRNA-126的稳定性检测外泌体内RNA在37℃的稳定性（图3C）。结果表明，温度响应型水凝胶包裹的外泌体在损伤部位具有更好的滞留率及稳定性。

实施例7，本发明提供一种检测温度响应型水凝胶包裹的外泌体释放率的方法。

通过例4中生物荧光报告基因对外泌体的释放率进行检测。简言之，将100 μgGluc标记的外体重悬于200 μl水凝胶溶液中，在48孔板中在37℃下孵育30分钟，形成水凝胶。然后，在每个孔中加入200 μl PBS以浸没包裹了外泌体的水凝胶。在37℃培养箱中培养不同时间后，收集上清液PBS并移至另一个48孔板进行BLI分析。根据外泌体蛋白浓度与生物荧光信号之间的线性关系，我们可以计算PBS中外泌体的蛋白浓度，经计算可知在12小时内，100 μg被水凝胶包裹的外泌体每小时可持续释放0.25 μg外泌体到周围环境中（图4）。

实施例8，本发明提供检测温度响应水凝胶对干细胞来源外泌体治疗功能影响的方法。

实时荧光定量PCR 评价温度响应水凝胶包裹的外泌体对体外培养细胞血管新生能力的影响：使用水凝胶包裹的外泌体处理人脐静脉内皮细胞，使用TRIzol法提取细胞内总RNA，通过反转录获得cDNA后，通过Real-time PCR对血管新生相关基因进行RNA水平的检测。结果表明被温度响应水凝胶包裹并缓释的干细胞来源的外泌体，可以更好的抑制内皮细胞凋亡基因的表达，同时具有更强的促进血管新生相关基因表达的能力。

内皮细胞标志蛋白免疫荧光染色检测温度响应水凝胶包裹的外泌体对损伤组织血管新生的影响：将水凝胶包裹的外泌体注射至下肢缺血损伤组织中成胶，并缓释到损伤部位，在第24天时处死动物，对缺血组织进行取材，制作冰冻切片并进行免疫荧光染色检测，结果显示水凝胶包裹缓释的外泌体可以促进缺血组织中内皮细胞标志蛋白CD31的表达，进一步表明温度响应水凝胶包裹缓释的干细胞来源的外泌体具有更强的促进血管新生的能力。

苏木素&伊红染色评价损伤组织结构恢复情况：使用温度响应水凝胶包裹缓释的干细胞来源外泌体治疗下肢缺血模型小鼠，在第14天时，处死小鼠对损伤组织取材，制作石蜡切片，并对其进行苏木素&伊红染色，对损伤组织肌纤维坏死情况及炎症浸润进行评估，表明温度响应水凝胶包裹缓释的干细胞来源的外泌体可以减轻损伤组织坏死，抑制炎症反应，并促进损伤组织结构的恢复（图5）。

Masson染色评价损伤组织纤维化情况：使用温度响应水凝胶包裹缓释的干细胞来源外泌体治疗下肢缺血模型小鼠，在第45天时，处死小鼠对损伤组织取材，制作石蜡切片，并对其进行Masson染色，对损伤组织纤维化水平进行评估，表明温度响应水凝胶包裹缓释的干细胞来源的外泌体可以减轻损伤组织纤维化，并促进损伤组织结构和功能的恢复（图5）。

Claims

1.一种温度响应型水凝胶，可以是壳聚糖水凝胶，但不限于壳聚糖水凝胶，还包括以胶原纤维、聚乙二醇等为原料的温度响应型水凝胶。

2.根据权力要求1所述的水凝胶，其特征在于：所述水凝胶为温度响应型水凝胶，是一种仅随贮藏条件和用药部位的温度变化而发生相转变的原位凝胶。该水凝胶溶液在4℃时为液态，处于37℃时交联形成疏松多空的网络状结构。

3.该治疗手段的有效成分为干细胞来源的外泌体，一种从体外培养的离体细胞体外培养基中分离提取，携带了来源细胞内蛋白质、RNA及DNA等生物活性分子，并具有治疗功能的细胞旁分泌成分。

4.根据权力要求3所述的外泌体，其特征在于：该外泌体来源于干细胞，包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、尿液来源干细胞、内皮祖细胞、或心脏干细胞等。

5.一种包裹递送外泌体并增强其在组织损伤中的修复效果的技术手段，是将权力要求1所述的水凝胶溶液为载体，包裹权力要求3中所述的外泌体，并注射至损伤部位形成水凝胶状，并可将外泌体缓释至周围组织中。

6.根据权利要求5所述的技术手段，其特征在于：所述技术可以增强外泌体在损伤部位的滞留率及稳定性，并可实现外泌体的体内缓释，并进一步增强外泌体的治疗效果。

7.根据权利要求5所述的在组织损伤中的应用，其特征在于，组织损伤包括下肢缺血、肾脏损伤、心肌梗死及皮肤损伤等。