CN101242862B - 片状组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种片状组合物，该片状组合物含有保存性以及操作性优良并且使用时具有高度柔软性的羊膜。使用附加了海藻糖的羊膜。通过附加海藻糖可提高羊膜的柔软性，并且可防止伴随着冻干处理的基底膜以及致密层的损伤。

Description

片状组合物

技术领域

本发明涉及使用羊膜的片状组合物及其制作方法。本发明的片状组合物可以用作例如用于制作人工组织(角膜上皮片等)的培养基质、眼表面或皮肤等再建用的移植材料、或者抗粘连剂。

背景技术

羊膜具有活体适合性高、富有柔软性等作为移植材料而优选的特性，正在谋求在以角膜上皮的再建为代表的各种组织再建中的利用(例如参照专利文献1～4)。羊膜的利用方法大致可划分为两种。即，谋求羊膜直接应用于患处的组织再建的方法和羊膜作为细胞培养用基质而使用的方法。对于这些中的任一种利用方法而言，羊膜的柔软性都是重要的特性。因为具有高柔软性，羊膜可无间隙地被覆患处，并且也可以与患处良好的粘附并成活，发挥出良好的治疗效果。另一方面，作为细胞培养用基质使用羊膜时，由于具有高柔软性因此可以在羊膜上进行良好的细胞增殖以及正常的组织化(分化)。

专利文献1：特开平5-56987号公报

专利文献2：国际公开第03/043542 A1号文本

专利文献3：国际公开第03/092762 A1号文本

专利文献4：国际公开第2004/078225 A1号文本

发明内容

羊膜是哺乳动物中覆盖子宫和胎盘最表层的膜，由分娩时获取。因此，并非能够经常得到新鲜状态的羊膜，如果考虑到今后的临床应用，期待着提供可以长时间保存并且操作性也优异的羊膜。因此，将采取的羊膜制成干燥状态，使保存性以及操作性提高。通过实施干燥处理羊膜的保存性等虽然显著提高了，但是发生结构蛋白质的变性等，结果是当回到湿润状态时柔软性大大地降低。如果柔软性降低，还发生不能无间隙地被覆患处的情况，对患处的粘附性、成活性也降低。另一方面，经干燥处理的羊膜，在其上的细胞增殖率降低、多层化也受阻、不发生正常的组织化(分化)。认为这是由于伴随着柔软性的降低，羊膜表面的平坦性大幅降低而引起的。

本发明是鉴于以上课题而完成的，其主要目的在于提供含有保存性以及操作性优异，并且使用时具有高柔软性的羊膜的片状组合物。

为了实现上述目的，本发明人等试着通过对羊膜实施修饰，来提高柔软性。结果发现了用作为二糖之一的海藻糖处理后的羊膜，即使随后实施干燥处理，在回到湿润状态时柔软性也恢复、其柔软性是与未处理的羊膜(未加工羊膜)同等的水平。总之，明确了海藻糖处理对提高羊膜的柔软性是有效的。

并且，看到了通过经由海藻糖处理，羊膜的透明度也提高了这个惊人的现象。由上述事实表明，在对透明性的要求尽可能高的用途(例如角膜再建)中使用时，将羊膜进行海藻糖处理是极其有效的。

另一方面，通过海藻糖处理能够获得羊膜的拉伸强度也提高、比未加工羊膜还强韧的羊膜。由上述事实弄清了海藻糖处理对于羊膜操作性的提高、移植后的形态保持也是有效的。

此外，在验证海藻糖处理后的羊膜的活体适合性时，看到与未加工羊膜同样的高活体适合性。由此，确认了海藻糖处理对于活体适合性没有影响。

得到以上见解后，检查海藻糖对羊膜在作为细胞培养基质时的功能所带来的影响。具体而言，在海藻糖处理后的羊膜上培养角膜上皮细胞，检查细胞增殖率、多层化的程度。其结果是看到了良好的细胞增殖，并且发生了5～7层的多层化。这比未实施海藻糖处理的羊膜上的多层化(1～2层)的程度大幅提高。如此，表明羊膜在作为细胞培养基质使用时，海藻糖处理也是有效的。

接着，将在羊膜上形成有细胞层的片移植到动物眼表面，验证其再建效果。其结果是，显示出良好的粘附性和成活性，能够无缺损地再建眼表面，并维持高透明性。

本发明主要基于以上见解，提供以下的片状组合物。

一种片状组合物，具备附加了海藻糖的羊膜而成。

根据[1]所述的片状组合物，是冻结状态或者干燥状态。

根据[2]所述的片状组合物，是冻干状态。

根据[1]～[3]中任一项所述的片状组合物，所述羊膜是去除了上皮细胞层的羊膜。

根据[1]～[4]中任一项所述的片状组合物，检测出所述羊膜的作为基底膜成分的胶原IV、胶原VII、层粘连蛋白5与未处理的羊膜为同等强度。

根据[1]～[5]中任一项所述的片状组合物，所述羊膜是人羊膜。

根据[1]～[6]中任一项所述的片状组合物，在所述羊膜上形成含有活体来源的细胞的细胞层。

根据[7]所述的片状组合物，在所述细胞层中所述活体来源的细胞是多层化的。

根据[7]所述的片状组合物，所述活体来源的细胞是来源于角膜上皮、结膜上皮、皮肤表皮、毛囊上皮、口腔粘膜上皮、虹膜色素上皮、视网膜色素上皮、呼吸道粘膜上皮或者肠管粘膜上皮的细胞。

根据[7]所述的片状组合物，所述细胞层是由多层化为约5～7层的细胞构建的，并且具备与角膜上皮类似的性质。

根据[1]～[6]中任一项所述的片状组合物，作为抗粘连用材料、或者作为由于手术侵害导致的脏器或器官的表面组织损害的再建用材料而使用。

根据[1]～[11]中任一项所述的片状组合物，在所述羊膜的绒毛膜侧的表面附着粘附成分。

根据[12]所述的片状组合物，所述粘附成分为纤维蛋白原及凝血酶。

根据[12]所述的片状组合物，所述粘附成分为纤维蛋白原、凝血酶以及抑肽酶。

根据[1]～[14]中任一项所述的片状组合物，用活体吸收性材料被覆所述羊膜的绒毛膜侧的表面。

作为其他方面本发明提供以下的移植方法。

一种移植方法，使用[1]～[15]中任一项的片状组合物作为移植材料。

作为其他方面，本发明还提供以下的制作方法。

一种片状组合物的制作方法，包括以下步骤：

(a)制备羊膜的步骤；

(b)向所述羊膜附加海藻糖的步骤。

根据[17]所述的制作方法，还包括以下步骤：

(c)在步骤b之后进行冻结处理或干燥处理的步骤。

根据[18]所述的制作方法，还包括以下步骤：

(d)在步骤c之后进行灭菌处理的步骤。

根据[17]～[19]中任一项所述的制作方法，所述步骤a包括以下步骤：

(a1)从羊膜去除上皮的步骤。

根据[20]所述的制作方法，所述步骤a1包括以下步骤：

(1)准备由活体分离的羊膜的步骤；

(2)对所述羊膜实施冻融处理的步骤；

(3)对冻融处理后的羊膜实施胰蛋白酶处理的步骤；

(4)清洗胰蛋白酶处理后的羊膜的步骤。

根据[21]所述的制作方法，其特征在于，在所述冻融处理中，冻结温度为约-20℃～约-80℃，融解温度为约4℃～约50℃。

根据[21]或[22]所述的制作方法，其特征在于，所述冻融处理反复实施2次以上。

根据[20]～[23]中任一项所述的制作方法，其特征在于，使用胰蛋白酶浓度为约0.01％(w/v)～约0.05％(w/v)的胰蛋白酶溶液实施所述胰蛋白酶处理。

根据[24]所述的制作方法，其特征在于，所述胰蛋白酶溶液含有约0.1mM～约0.6mM的从EDTA、NTA、DTPA、HEDTA、GLDA以及它们的任意组合中选择的螯合剂。

根据[20]～[25]中任一项所述的制作方法，其特征在于，在胰蛋白酶溶液仅接触羊膜上皮侧的条件下，实施所述胰蛋白酶处理。

根据[20]～[26]中任一项所述的制作方法，在步骤b之后实施以下的步骤：

(A)在所述羊膜上形成含有活体来源的细胞的细胞层。

附图说明

图1是汇总了作为组织再建用材料的片状组合物的用途(主要应用部位、应用方法的例子，优选的羊膜形态、主要目的)的表。

图2是说明羊膜的固定法的图。(a)是以一对框夹持羊膜；(b)是以框和平板状部件夹持羊膜。

图3是显示海藻糖处理·冻干羊膜的物性评价试验(厚度)结果的图。

图4是显示海藻糖处理·冻干羊膜的物性评价试验(透明度)结果的图。

图5是显示海藻糖处理·冻干羊膜的物性评价试验(拉伸强度)结果的图。

图6是显示海藻糖处理·冻干羊膜的物性评价试验(柔软性)结果的图。

图7是显示海藻糖处理·冻干羊膜的活体适合性评价试验结果的图。将海藻糖处理·冻干羊膜移植到家兔的角膜实质层间，观察眼表面的状态。左边是刚移植完的眼表面状态，右边是移植后一个月的眼表面状态。

图8是显示海藻糖处理·冻干羊膜的活体适合性评价试验结果的图。将海藻糖处理·冻干羊膜移植到家兔的角膜实质层间，在移植后1个月时将包含移植部的角膜的一部分摘出进行HE染色。

图9是显示在海藻糖处理·冻干羊膜上培养角膜上皮细胞时的器具等状态的剖面模式图。培养嵌套12静置于培养皿11内，在培养皿11底面形成3T3细胞层15。此外，显示了如下状态：在培养嵌套12的底面上静置羊膜13，在其上培养角膜上皮细胞14。符号16为培养基。

图10是显示在海藻糖处理·冻干羊膜上形成细胞层的图(HE染色图像)。将使用了未进行海藻糖处理而进行冻干所得到的羊膜(未处理冻干羊膜)时所形成的细胞层状态作为比较对照。

图11是在海藻糖处理·冻干羊膜上形成细胞层的片(培养角膜上皮片)的HE染色图像和免疫染色图像。在免疫染色图像中，各抗体的信号为绿色。细胞核以红色表示。角膜型角蛋白3表达(+)、皮肤角化型角蛋白10(-)、结膜型角蛋白13(-)。

图12是显示使用海藻糖处理·冻干羊膜制作的培养角膜上皮片的再建效果的图。在培养角膜上皮片移植后第二天以及第十四天的眼表面的状态(上面)以及荧光素染色图像(下面)。

图13是移植后第二周的培养角膜上皮片的HE染色图像(左上边)和关于各种角蛋白的免疫染色图像(右上边、下边)。记号**表示海藻糖处理·冻干羊膜(TH-AM)。

图14是使用了对基底膜特异性成分的抗体以及对致密层特异性成分的抗体将海藻糖处理·冻干羊膜进行免疫染色后的结果。显示将海藻糖处理·冻干羊膜的免疫染色图像(C)与未加工羊膜(A)的免疫染色图像以及未经海藻糖处理但进行冻干的羊膜的免疫染色图像(B)进行比较。1：胶原I的染色图像；2：胶原III的染色图像；3：胶原IV的染色图像；4：胶原V的染色图像；5：胶原Ⅶ的染色图像；6：层粘连蛋白5的染色图像；7：纤连蛋白的染色图像。

图15是显示羊膜上皮的去除顺序的流程图。

图16是显示胰蛋白酶处理的方法的图。(a)是将框固定的羊膜的上皮侧朝下浸渍于胰蛋白酶溶液中。(b)是向框内加入胰蛋白酶溶液，从而使胰蛋白酶作用于羊膜的上皮侧。

图17是经胰蛋白酶处理的羊膜、未加工羊膜(有上皮)、用手处理的羊膜的HE染色图像。

图18是经胰蛋白酶处理的羊膜的免疫染色图像。

图19同样是经胰蛋白酶处理的羊膜的免疫染色图像。

图20是未加工羊膜(有上皮)的免疫染色图像。

图21是用手处理的羊膜的免疫染色图像。

图22是汇总HE染色实验以及免疫实验结果的表。

标号说明

1、2、3框

4  板状部件

5  胰蛋白酶溶液

10 羊膜

11 培养皿(culture dish)

12 培养嵌套(培养插入容器)

13 羊膜

14 角膜上皮细胞

15 3T3细胞层

16 培养基

具体实施方式

本发明的第1方面涉及片状组合物。在本发明的片状组合物中使用羊膜作为其主要构成成分。由于羊膜所具有的高透明性及强韧性，所以可以构成透明性及强度优异的片状组合物。此外，由于羊膜的高活体亲和性及低免疫原性，所以可以构成活体亲和性更加优异且免疫原性低的片状组合物。通过使用羊膜，可以进一步期待抗炎症作用、抑制瘢痕形成、阻碍血管新生的作用。在本发明的片状组合物含有细胞层的情况下，在良好地形成该细胞层方面，也优选使用羊膜。即，如后所述，具备细胞层的片状组合物是通过以羊膜为基质(支持体)并在其上播种、培养规定的细胞而形成，结果由于羊膜具有使细胞在其上良好地粘附及增殖的特性，所以使用羊膜则细胞可以良好地粘附及增殖而形成细胞层。

(羊膜的来源)

“羊膜”是哺乳动物中覆盖子宫和胎盘最表层的膜，在胶原丰富的软组织上形成基底膜、上皮层而构成。可以使用人、猴子、黑猩猩、猪、马、牛等的羊膜。其中，优选使用人羊膜。这是因为在包括免疫原性、病毒感染的安全性方面有利。

(海藻糖的附加)

本发明的片状组合物使用附加了海藻糖的羊膜。本发明人等的研究结果表明，通过附加海藻糖，可以提高羊膜的柔软性、特别是可大幅改善处于冻干状态时的柔软性。并且，如后述实施例所示，表明了附加海藻糖的羊膜作为细胞培养用基质发挥了良好的功能。基于这些见解，构成的本发明的片状组合物具有高度柔软性、另一方面在作为细胞培养用基质使用时可进行良好的细胞增殖和多层化。

这里，如果羊膜内部的基质蛋白变弱，则羊膜的强度降低，并且容易受到损害。并且，不能将水分牢固地保持在内部，会变脆弱而失去弹性。海藻糖作用于基质蛋白内结合松散的部位从而强化了蛋白质间的结合，由此使羊膜内部的保持水分的功能正常化，预想维持了羊膜本来的湿润、聚集、弹性。认为通过预先附加海藻糖，可有效防止伴随着冻干处理的羊膜内部的基质蛋白变柔软，特别是在水中的膨润变弱的情况。

海藻糖(物质名，通称)是以α-D-吡喃葡糖基(1，1)-α-D-吡喃葡萄糖苷来表示的化合物。

对羊膜附加海藻糖，可以通过例如用海藻糖溶液处理羊膜来进行。另外，后面详细描述了海藻糖的附加方法。

另外，本发明的一种实施方式实质上是仅由附加了海藻糖的羊膜构成的。

(羊膜的状态)

本发明的一种实施方式是使用去除了上皮细胞层的羊膜。去除了上皮细胞层的羊膜完全没有因上皮细胞所引起的免疫排斥等问题，安全性变得极高。并且，细胞在去除了上皮的羊膜上更加良好地粘附以及增殖，因此也可获得能够在更短时间构建高品质的细胞片这种制作方面的优点。

通过检查本发明的片状组合物中不含羊膜上皮层的细胞，能够确认是去除了上皮层的羊膜。

另一方面，也可以使用残存有上皮层的羊膜来构建本发明的片状组合物。通过预先使羊膜的上皮层残存，可在制作阶段进行γ射线处理等充分的灭菌处理，可实现安全性的提高。

(再构建后的羊膜的使用)

使用再构建后的羊膜也能构成本发明的片状组合物。具体而言，例如可以使用经匀浆器、超声波、酶处理而暂时分解，并再次构建成膜状的形状的羊膜。处理方法优选使用匀浆器。这是由于能期待基底膜的微小结构体较高度地保持。匀浆器处理的条件(转数)为例如3000rpm～50000rpm，优选为10000rpm～40000rpm，更优选为约30000rpm。

(厚度)

通过使用羊膜，本发明的片状组合物可构成非常薄的片状。本发明的片状组合物可调制成例如10μm～500μm的厚度。如此的非常薄的片状会增加通用性。也可以使用去除了绒毛膜侧的致密层的一部分(例如10μm～30μm左右)的羊膜来构建本发明的片状组合物，还可以通过涂敷活体吸收性原材料而制成例如100μm～500μm左右的厚度。

(粘附成分的使用)

本发明的一种实施方式是将纤维蛋白原以及凝血酶(以下，也将它们统称为“粘附成分”)附着于羊膜的表面。由此，在移植本发明的片状组合物时，首先，通过凝血酶特异性地水解纤维蛋白原而生成纤维蛋白，接着，纤维蛋白聚合而形成稳定的纤维蛋白块，从而发挥粘附作用。如果这样提高了粘附性，在将片状组合物应用于患处时，无需缝合也能获得足够的粘附力，由此可实现手术方式的简便化。另外，在本说明书中，将具有上皮且附着有粘附成分的羊膜还称作“粘附成分附着·有上皮羊膜”，将无上皮但附有粘附成分的羊膜还称作“粘附成分附着·无上皮羊膜”。

纤维蛋白原及凝血酶根据本发明的片状组合物的用途，附着在羊膜的单面或两面。单面附着时，无论羊膜上有无上皮，羊膜的绒毛膜侧表面(即，与上皮侧相反侧的表面)成为附着面。因此，使用如此构成的片状组合物时，使存在羊膜上皮的侧朝上，移植到应用部位。另外，以抗粘连为目的的片状组合物时，制成粘附成分附着于羊膜的单面。以活体粘附剂为目的移植到活体内时，优选在羊膜的两面附着粘附成分。

如后所述，该方式的片状组合物考虑到使用目的等，制备成适当的状态(例如干燥状态或湿润状态)，并经过在羊膜表面附着纤维蛋白原及凝血酶的工序来制备。因此，根据其制作过程中及/或其最终状态如何，可预想直到被使用为止的期间由一部分纤维蛋白原生成纤维蛋白。因此，本发明的片状组合物还包括附着有因这样的原因生成的纤维蛋白或纤维蛋白块的物质。

纤维蛋白原及凝血酶的来源没有特别限定。例如，可以把人、猴子、黑猩猩、牛、马、羊、猪等的血液作为材料来制备纤维蛋白原及凝血酶。比外，作为纤维蛋白原及凝血酶，可以使用利用培养细胞(例如CHO细胞或COS细胞)而得到的重组体(recombinant)。优选使用人来源(特别是人来源的重组体)的纤维蛋白原及凝血酶。这是因为在包括免疫原性的安全性方面有利。此外，如果考虑可以使用稳定品质的物质及感染的问题，则特别优选使用重组体。

特别优选使用来源于接受本发明的片状组合物移植的患者(recipient)的血液的纤维蛋白原及凝血酶。这是因为不用担心会发生起因于这些粘附成分的免疫排斥反应。

另外，纤维蛋白原及凝血酶的来源可以不必相同。如果列举一例，可以将人血液来源的纤维蛋白原和牛血液来源的凝血酶组合使用。

纤维蛋白原及凝血酶的附着量没有特别限定。例如，纤维蛋白原的附着量可以设定在每1cm²羊膜0.1mg～50mg的范围。同样地，凝血酶的附着量可以设定在每1cm²羊膜0.5μmg～10mg的范围。

设定纤维蛋白原及凝血酶的附着量时首要考虑粘附力。即，为了获得所希望的粘附力，必须设定这些成分的附着量。另一方面，纤维蛋白原或凝血酶的附着量过多时，虽然根据所使用的纤维蛋白原的来源来决定，但是容易发生免疫反应或血管新生这一点成为问题。

在此，例如在片状组合物被应用于眼表面的再建等的情况下，在移植后这些成分导致的血管新生成为问题时，为了尽可能抑制血管新生的发生，优选减少这些成分的附着量。通过将这些成分的附着量设定在可能范围内的低值，可抑制移植后的血管新生，期待高的治疗效果。本发明人等的研究结果表明：当将纤维蛋白原与羊膜组合使用的情况下，当纤维蛋白原的附着量为每1cm²羊膜约0.5mg以上时，可获得对眼表面的良好粘附力。即使凝血酶的附着量为每1cm²羊膜约1μg时，也可获得对眼表面的良好粘附力。基于这些见解，纤维蛋白原附着量优选的范围为每1cm²羊膜0.5～20mg，进一步优选的范围为每1cm²羊膜0.5mg～10mg，更进一步优选的范围为每1cm²羊膜0.5mg～6mg(具体地说，例如约0.5mg、约1mg、约2mg)。同样地，凝血酶附着量优选的范围为每1cm²羊膜1μg～1mg，进一步优选的范围为每1cm²羊膜5μg～200μg，更进一步优选的范围为每1cm²羊膜10μg～100μg(具体地说，例如约10μg、约20μg、约30μg)。

在本发明的一种实施方式中，除了纤维蛋白原及凝血酶以外，还有抑肽酶附着在羊膜表面。抑肽酶阻碍如下过程：通过凝血酶的作用而形成的纤维蛋白块被纤维蛋白溶酶溶解。因此，通过并用抑肽酶可抑制纤维蛋白块的分解，可维持甚至强化粘附力。

抑肽酶的来源没有特别限定。例如，可以使用牛、马、羊、猪、猴子、黑猩猩等的胰脏来源的抑肽酶。此外，还可以使用利用培养细胞(例如CHO细胞或COS细胞)而得到的重组体(recombinant)的抑肽酶。如果考虑可以使用稳定品质的物质及感染问题，则优选使用重组体。

使用抑肽酶时，其附着量没有特别限定。例如，可以将抑肽酶的附着量设定在每1cm²羊膜0.1KIU～200KIU的范围。根据上述的纤维蛋白原附着量的研究，使抑肽酶的附着量变化来研究对于粘附力的影响，结果表明，在与羊膜组合使用时即使将抑肽酶量设定在1KIU～2KIU的范围，也可以得到对眼表面的充分粘附力。基于该见解，抑肽酶附着量优选的范围为每1cm²羊膜1KIU～100KIU，进一步优选的范围为每1cm²羊膜1KIU～20KIU，更进一步优选的范围为每1cm²羊膜1KIU～10KIU(具体地说，例如约1KIU、约2KIU、约3KIU)。抑肽酶的量过多时，自然会引起制造成本的上升，起因于抑肽酶自身的免疫原性等的副作用的可能性增大。另一方面，抑肽酶的量过少时，可能不能充分发挥抑制纤维蛋白块分解的抑肽酶的作用。

另外，在各种用途中纤维蛋白块被用作粘附剂，在那样的用途中一般并用抑肽酶。本发明人等的研究结果表明，与羊膜进行组合时，即使不使用抑肽酶也可得到对于活体的充分粘附力。可以不使用抑肽酶，意味着不仅简化构成而在制作上及成本方面上有利，而且没有必要考虑起因于抑肽酶自身的免疫原性等的副作用。

(利用活体吸收性材料的强化)

以活体吸收性材料被覆羊膜的绒毛膜侧，由此能够提高本发明的片状组合物的强度。作为以该目的使用的活体吸收性材料，优选采用在较早期被羊膜分解·吸收的材料。例如可适当使用例如聚乳酸羟基乙酸(polyglactin)910、明胶、胶原、聚乳酸等作为此处的活体吸收性材料。用于强化的活体吸收性材料的形态没有特别限定。例如以成形为网眼状或者片状的活体吸收性材料被覆羊膜绒毛膜侧从而强化羊膜。羊膜的状态在进行强化的过程中可以是湿润状态、干燥状态任一种。但是，产品的最终形态优选羊膜为干燥状态。这是因为如果是干燥状态则操作性以及保存性优异。需要说明的是，本说明书中的实施了强化的羊膜也称作“杂化羊膜”。

(细胞层)

本发明的片状组合物的一种实施方式为在羊膜上具有细胞层。在该实施方式中，并用粘附成分时，在未形成细胞层的侧的羊膜表面附着有粘附成分(纤维蛋白原等)。

在该实施方式中，使用去除了上皮的羊膜。从而，在上皮存在的一侧形成细胞层。此处的细胞层由活体来源的细胞构成。构成细胞层的细胞的来源没有特别限定。例如，由角膜上皮、结膜上皮、皮肤表皮、毛囊上皮、口腔粘膜上皮、虹膜色素上皮、视网膜色素上皮、呼吸道粘膜上皮或者肠道粘膜上皮来源的细胞构成细胞层。可以由相互不同的二种以上的细胞构成细胞层。这样，通过含有来源不同的二种以上的细胞来构成，本说明书中也称之为“杂化”。经杂化的细胞层中的细胞的含有形态(杂化状态)没有特别限定，例如，各细胞可以分散，任意细胞(或者多种类的细胞)可以具有一定的聚集而存在。此外，各细胞的含有率在细胞层整体中可以不是均匀的。细胞层可以是单层，也可以是多层(多层化的状态)。

具有经杂化的细胞层时，构成细胞层的细胞种类，以构建用作角膜上皮的再建的本发明的片状组合物的情况为例，详述如下。

经杂化的细胞层含有二种以上的细胞。因此，为了方便说明，把细胞层所含有的细胞种类之一当作第1细胞，把与其种类不同的细胞种类当作第2细胞。首先，使用自体细胞作为第1细胞。本说明书中的“自体”是指应用本发明的片状组合物的对象，即接受移植的人(recipient)。另一方面，这样的“自体”以外的人称为“他人”。只要在与后述的第2细胞杂化时能够形成角膜上皮样的粘膜上皮层，则第1细胞的种类没有特别限定。作为第1细胞的例子，可列举来源于口腔粘膜上皮、结膜上皮、鼻腔粘膜上皮等粘膜上皮的细胞，或者来源于能够构建这样的粘膜上皮的未分化细胞(即粘膜上皮的干细胞)的细胞。在此“来源于或者来源的”是指为了特别指定起始材料而使用的。因此，例如，如果说来源于口腔粘膜上皮的(或者口腔粘膜上皮来源的)细胞，则是指以口腔粘膜上皮细胞为起始材料而获得的细胞。此外，本发明中的“能够构建粘膜上皮的未分化细胞”是指具有向构成该粘膜上皮的细胞分化的能力的细胞。例如，如果说能够构建口腔粘膜上皮的未分化细胞，则是指能够向口腔粘膜上皮细胞分化的细胞。作为未分化细胞的具体例，可举出口腔粘膜上皮或结膜上皮等、构成特定组织的细胞的前体或者干细胞、或者分化度低的上皮系干细胞等。

经杂化的细胞层可以含有不同的二种以上的第1细胞。例如，可以在含有来源于口腔粘膜上皮的细胞和来源于结膜上皮的细胞的状态下构建细胞层。

本发明中的“口腔粘膜上皮”包括口腔内缘粘膜上皮部、口唇部、口上颚部、颊部等。其是来源于口腔粘膜上皮的细胞，可以以表达口腔粘膜上皮特异性的角蛋白4、或角蛋白13为指标来确认。或者，还可以以表达角蛋白3为指标。已知这种角蛋白3是角膜特异性的角蛋白之一，但在口腔粘膜上皮中也确认其有表达。另外，从表达这种作为角膜特异性角蛋白的角蛋白3的角度讲，可优选使用口腔粘膜上皮细胞作为制作角膜上皮移植用的组合物的材料。

另一方面，通过研究口腔粘膜上皮细胞特异性的基因的表达，可以确认其为口腔粘膜上皮来源。

另外，来源于口腔粘膜上皮以外的组织的细胞，也同样地可以通过检查该组织中特异性的标记或者基因的表达来确认其来源。

作为第2细胞的具体例，可列举来源于角膜上皮、结膜上皮、或者羊膜上皮的细胞。其中，优选第2细胞为来源于角膜上皮或者结膜上皮的细胞。这是因为，对于由来源于眼表面组织的细胞而构建的细胞层来说，可具有与角膜上皮更接近的特性。特别优选第2细胞为来源于角膜上皮的细胞。这是因为，可成为与角膜上皮更近似特性的细胞层。

第2细胞可以是自体细胞或者他人细胞的任何一种。如果是由自体细胞构建而得的细胞层，则会形成没有或很少免疫排斥问题的细胞层。如果是由他人细胞构建而得的细胞层，由于作为原材料的细胞容易获得，所以形成在其制作方面有利的细胞层。本发明的细胞层可以含有不同的二种以上的第2细胞。例如，可以在含有来源于角膜上皮的细胞和来源于结膜上皮的细胞的状态下构建细胞层。

本发明的片状组合物中的细胞层含有来源于角膜上皮的细胞，可以以例如角膜上皮特异性的角蛋白3或者角蛋白12的表达为指标来确认。此外，还可以以表达角蛋白4为指标。

另外，来源于角膜上皮以外的组织的细胞也同样地可以通过检查该组织中特异性的标记或者基因的表达来确认其来源。

本发明的片状组合物由于使用羊膜作为支持体，所以可以构建成非常薄的状态。可以将本发明的片状组合物制备成如下厚度：在不含细胞层时制备成例如10μm～100μm的厚度，在含有细胞层时制备成例如20μm～200μm的厚度。这样，非常薄也是本发明的一大特征。由于具有该特征，可以在各种用途中应用。特别是，可以利用高透明性在眼表面的再建等中应用。

(片状组合物的状态)

本发明的片状组合物的状态没有特别限定，可以以湿润状态(例如被浸于溶液中的状态)、冻结状态或者干燥状态(包括半干燥状态)提供。如果是冻结状态或者干燥状态，则操作容易、保存性也优异。如果是干燥状态，即使在常温(例如约10℃～约35℃)等也能够保存。即，在使用前无需在冷冻或者冷藏环境下进行管理，其操作(保存、运输等)变得容易。但是，即使是干燥状态，也可以根据需要进行冷冻或者冷藏保存。

特别地，如制成冻干状态则在操作方面优异，而且应用时良好地粘附于患处(在患处表面浸润而发挥粘附力)，因此在应用后基本上不需要缝合(但是，为了更加牢固地粘附在患处，也可以进行缝合处理)。不需要缝合的话，就大大减轻了患者以及医生的负担。

优选使用具有上皮层的冻结状态、具有上皮层的干燥状态(冻干状态)、没有上皮层的湿润状态、没有上皮层的冻结状态或者没有上皮层的干燥状态(冻干状态)的羊膜来构建本发明的片状组合物。

另外，本说明书中，具有上皮层的冻结状态的羊膜也称作“冻结保存·有上皮羊膜”，具有上皮层的冻干状态的羊膜也称作“冻干·有上皮羊膜”，没有上皮层的冻结状态的羊膜称作“冻结保存·无上皮羊膜”，没有上皮层的冻干状态的羊膜也称作“冻干·无上皮羊膜”。

干燥状态的片状组合物容易操作，具体来讲，在常温(例如约10℃～约35℃)等也能保存。即，在使用前无需在冷冻或者冷藏环境下进行管理，其操作(保存、运输等)变得容易。

另一方面，由于处在干燥状态，在不影响其使用的情况下可以进行有效的灭菌处理。并且，由于是干燥状态经时劣化极小，经长时间仍可维持其高品质状态。

为了发挥本发明的片状组合物所期待的功能(例如作为用于形成细胞层的基质的功能、作为组织再建材料的功能等)，认为保持基底膜的结构是重要的。此处本发明优选的一种实施方式，其特征在于，使用残存有基底膜成分(胶原IV(α1、α2和α5)、胶原VII、层粘连蛋白5)的羊膜。是否残存有基底膜成分，可以通过实施以该成分为检测对象的免疫染色来鉴定。本发明的一种实施方式，是将这些成分中的至少一种、优选多种、更优选全部进行检测。并且，优选检测的这些成分的强度与以未处理的羊膜(即，从活体分离后未进行冻结等处理的羊膜)为对象检测时的强度没有显著不同(优选几乎是相等的强度)。

另一方面，优选使用还残存有致密层成分(胶原I、III、V、纤连蛋白)的羊膜。致密层成分的残存状态与上述基底膜成分的情况同样地可通过免疫染色进行鉴定。

通过对羊膜附加海藻糖，即使是实施冻干处理也可以高度地维持基底膜以及致密层的结构。

(提供形态)

例如，可以以收纳于玻璃或塑料等容器的状态、或者使用透明膜或者遮光片等进行包装后的状态来提供本发明的片状组合物。

优选以基本上不与氧接触的状态包装本发明的片状组合物来提供。在该形态下，没有因氧而引起的品质劣化，经长时间仍能维持高品质。作为“基本上不与氧接触的状态”，可列举以容器内处于真空状态或者将氮填充到容器内(氮置换)的状态、或者用膜、片材等密封包装的状态。另外，本发明的片状组合物通常是事先进行灭菌处理。

(用途)

本发明的片状组合物可以作为组织再建用移植材料、抗粘连剂等使用。本发明的片状组合物的应用领域可列举眼科领域、消化器外科领域、妇科领域、皮肤科领域。

将本发明的片状组合物的应用例(应用部位、应用方法等)分为本发明的片状组合物不具备细胞层的情况(A)和具备细胞层的情况(B)进行记载。

A.不具备细胞层的片状组合物的应用例

不具备细胞层的片状组合物可应用于巩膜、角膜的再建(对于翼状胬肉或者角膜上皮缺损等的治疗)、皮肤(表皮)溃疡、烫伤时的被覆等。并且，也可用作组织再建用材料。此处的“组织再建用材料”是指活体组织的再建(再生)所使用的材料。不具备细胞层的片状组合物，优选用在以再建因手术侵害引起的脏器或者器官的表面组织损害为目的的治疗中。本发明的片状组合物特别适合作为用于再建在通常的治愈过程中产生粘连的表面组织的材料。此处的术语“组织再建”典型地意味着将表面组织损伤处恢复成正常状态，由于防止了该脏器或者器官等的表面组织的再粘连，也作为包括使该脏器等恢复成正常状态(例如防止输卵管的粘连剥离后的再粘连，使其恢复正常状态)的情况的术语使用。

作为本发明的再建对象的组织的适合例有腹部、胸部或者骨盆内的脏器或者器官(胃、大肠、小肠、盲肠、十二指肠、心脏、肺、输卵管、直肠、肝脏、卵巢、子宫等)的表面组织；或者腹腔、胸腔、骨盆腔、口腔、鼻腔、耳或者咽喉的表面组织；或者眼组织。因此，本发明的片状组合物可应用于消化器外科、妇产科、胸外科、口腔外科、耳鼻喉外科以及眼外科领域。本发明的片状组合物特别适合于作为用于再建腹部、胸部或者骨盆内的脏器或者器官的表面组织，或者腹腔、胸腔或者表面组织的材料。但是，即使是上述这些领域之外，本发明也可广泛应用于伴有外科手术的领域。以下，对本发明的片状组合物的应用部位、应用方法等进行了详细的记载。

在作为组织再建用材料使用时，本发明的片状组合物的用途以应用方法和应用目的为基准，可大致可划为以下三类。

(1)被覆组织再建用材料(应用方法)·组织再建(应用目的)型

将组织再建用材料贴于脏器表面、腹膜表面等，目的在于再建受损的组织表面的用法(使用方法)。该用途的具体例为下述的1-1、1-4，1-5，1-6。

(2)被覆组织再建用材料(应用方法)·抗粘连(应用目的)型

将羊膜贴于脏器表面、腹膜表面等，目的在于抑制与周边组织形成粘连的用法(使用方法)。该用途的具体例为下述的2-1、3-1，3-2，3-3。

(3)留置组织再建用材料(应用方法)·抗粘连(应用目的)型

通过将羊膜留置于形成高度粘连的部位，抑制粘连形成的用法(使用方法)。该用途的具体例，为下述的1-2、1-3、2-2。以往的抗粘连剂大多采用该使用形态。例如作为抗粘连剂现在正使用的生物膜与下述的1-2是同样的使用形态。但是，在下述的1-3，2-2的使用形态下生物膜却不能使用。

以下显示了作为组织再建用材料的片状组合物的用途的具体例(参照图1)。

1.在消化器外科领域的应用

1-1受损脏器的再建、抗粘连用途的应用法

在进行各种外科手术时在操作过程中会对脏器产生微小损伤。损伤区域失去浆膜结构，如在术后早期不能再建该结构的话，就成为脏器间形成粘连的原因，也存在损伤基本功能的情况，这是不利的。有效利用羊膜的组织再建能力、抗粘连能力，可以解决上述问题。具体地讲，用组织再建用材料覆盖损伤脏器表面来实现组织再建以及抗粘连。对于这种目的，可优选使用以冻结保存·有上皮羊膜、冻结保存·无上皮羊膜、冻干·有上皮羊膜、粘附成分附着·无上皮羊膜等构建的组织再建用材料。为了简便操作，优选以干燥状态的羊膜(例如冻干·有上皮羊膜、冻干·无上皮羊膜)构建的组织再建用材料，在心脏等需要载体柔软性的领域中也可以选择以冻结保存状态的羊膜(例如冻结保存·有上皮羊膜、冻结保存·无上皮羊膜)构建的组织再建用材料。应用方法，是在外科手术结束的阶段，以羊膜基底膜面向腹腔侧的状态用组织再建用材料直接被覆脏器的损伤区域。之后，根据需要进行固定。固定可以使用医用缝合线(vicryl)等缝合线。在使用以干燥状态的羊膜构建的组织再建用材料时，可期待高粘接力，因此可以省略缝合等固定处理。在使用用粘附成分构建的组织再建用材料时，也同样可期待高粘接力。这样，优选无需另行进行缝合等固定处理，来实现组织再建用材料固定于应用部位。这是由于进行缝合等时，操作变得繁琐并且有可能会促进发生炎症而形成粘连。特别地，如果使用以冻结保存·有上皮羊膜构建的组织再建用材料，则可发挥对应用部位的高粘接力，并且不会发生由粘附成分引起的异物反应的问题，可以说特别优选。

通过以上操作，可期待在术后早期浆膜结构的再建，并且可实现损伤脏器的再建·抗粘连。

1-2.受损脏器-创面间的抗粘连用途的应用法

在进行各种外科手术后，有时会在腹腔内脏器和创面间形成粘连。如果腹腔内脏器与创面发生粘连，则脏器被物理性固定了成为脏器的运动性减弱，内腔梗阻、麻痹性肠梗阻的原因。有效利用羊膜的抗粘连能力，可以解决上述问题。对于这种目的，可使用以冻结保存·有上皮羊膜、冻结保存·无上皮羊膜、冻干·有上皮羊膜进行强化的杂化羊膜等构建的组织再建用材料。为了获得不褶皱的足够的强度，优选使用用干燥状态的羊膜构建的组织再建用材料，更优选使用以干燥状态的羊膜且进行强化的杂化羊膜构建的组织再建用材料。应用方法例如下面内容。在外科手术结束的阶段，将组织再建用材料插入创面下，直接留置。此时，以羊膜的基底膜侧成为腹腔侧、绒毛膜侧成为腹壁侧的方式应用组织再建用材料。应用后，可利用缝合等进行固定，优选不固定仅留置的方式。

通过以上操作，可以实现术后脏器和创面间的抗粘连。

1-3.骨盆底抗粘连的应用

在骨盆内，存在直肠、子宫等脏器表面的一部分没有被腹膜覆盖的腹腔外脏器。在对这种腹腔外脏器进行手术时，产生在骨盆内没有腹膜存在的区域，小肠落入骨盆底，形成骨盆壁和小肠的粘连。一旦形成粘连的话，大多难以剥离。因此预防措施是重要的。使用羊膜的浆膜再建能力可以预防骨盆底的粘连。对于这种目的，可优选使用以冻结保存·有上皮羊膜、冻结保存·无上皮羊膜、冻干·有上皮羊膜进行强化的杂化羊膜等构建的组织再建用材料。组织再建用材料所要求的性质与1-2.相同。应用方法例如下面内容。在外科手术结束的阶段，将组织再建用材料插入骨盆底，轻轻地压于腹膜而被覆腹膜。此时，以羊膜的基底膜侧成为腹腔侧、绒毛膜侧成为腹膜侧的方式应用组织再建用材料。应用后，可利用缝合等进行固定，优选不固定仅被覆的方式。

通过以上操作，可以实现术后骨盆底的抗粘连。

1-4.壁侧腹膜的再建用途的应用法

由于进行数次手术的情况或腹壁瘢痕疝等腹膜疾病引起壁侧腹膜的缺损。可使用羊膜作为缺损腹壁的填补用载体。对于这种目的，可优选使用以冻结保存·有上皮羊膜、冻结保存·无上皮羊膜、冻干·有上皮羊膜、粘附成分附着·无上皮羊膜等构建的组织再建用材料。腹膜的缺损大、重度的情况下，从强度角度出发优选使用以冻结保存·有上皮羊膜构建的组织再建用材料。应用在外科手术结束阶段进行。首先将组织再建用材料置于腹壁缺损区域进行覆盖。以羊膜的基底膜侧面向腹腔侧的状态用组织再建用材料被覆腹壁缺损区域。之后，还可以使用缝合线等将组织再建用材料固定。使用以附有粘附成分的羊膜构建的组织再建用材料时，通过粘附成分完成固定即可。通过以上操作可以期待腹壁的再建。

1-5.抑制腹膜播种性转移的应用

腹膜播种是指胃癌、大肠癌、卵巢癌发展、癌细胞从组织游离通过胸水、腹水转移至体腔而引起的病例。伴随着腹膜播种的癌症的预后极差，抑制转移的方法是所人们期望的，但目前还未知有效的方法。有效利用羊膜的性质，存在能够抑制转移的可能性。作为癌细胞以高频率发生转移的部位已知有大网膜、横膈膜、肠间膜等。将这些乳斑(milkyspots)预先以组织再建用材料被覆形成屏障，由此可实现转移的抑制。对于这种目的，可使用以冻结保存·有上皮羊膜、冻结保存·无上皮羊膜、冻干·有上皮羊膜、粘附成分附着·无上皮羊膜等构建的组织再建用材料，从操作简便出发，优选使用以冻干·有上皮羊膜构建的组织再建用材料。作为应用方法，例如以包覆组织的状态用组织再建用材料被覆应用部分。并且，还可以通过在一部分以补丁的形式进行缝合或者通过附着于羊膜的粘附成分将组织再建用材料固定在应用部位。组织再建用材料的应用时期可以是癌症进展发生转移后，也可以在未开始播种的阶段(预备性的使用)。

1-6.防止复发粘连的应用

在进行剖腹手术后，发生肠间或者肠和腹壁的粘连折曲，引发通路障碍、陷入功能衰竭的地步，而引起肠梗阻。即使实施粘连解除术，由于在粘连组织特别是出现高度炎症而瘢痕化的组织中发生浆膜缺损而经常在术后导致再粘连。使用羊膜可实现防止术后粘连复发以及修复、强化浆膜缺损部。对于这种目的，可使用以冻结保存·有上皮羊膜、冻结保存·无上皮羊膜、冻干·有上皮羊膜、粘附成分附着·无上皮羊膜等构建的组织再建用材料。从操作简便出发，优选使用以冻干·有上皮羊膜构建的组织再建用材料。作为应用方法例如，剖腹后在将粘连进行物理性剥离的阶段，用组织再建用材料以筒状包裹肠。此时，适合以羊膜的基底膜侧面向腹腔侧的状态使用组织再建用材料。之后，通常进行固定，可以用医用缝合线等缝合线将脏器与羊膜进行缝合，还可以缝合羊膜之间(羊膜成为管状)或者不缝合而进行留置。使用以附有粘附成分的羊膜构建的组织再建用材料时通过该粘附成分完成固定即可。优选无需另行进行缝合等固定处理，来实现将组织再建用材料固定于应用部位。进行缝合等操作时操作变得繁琐，并且有可能会促进引发炎症而形成粘连。特别是如果使用以干燥状态的羊膜构建的组织再建用材料，可以对应用部位发挥高粘接力，并且没有因粘附成分所引发的异物反应问题，可以说特别优选。

通过以上操作，可以预防粘连的复发，并可期待在术后早期浆膜结构的再建。

2.妇产科领域的应用

2-1.输卵管阻塞的应用

如果输卵管与腹膜等发生粘连，则输卵管闭塞卵子不能通过，导致不孕。使用羊膜可以防止输卵管的粘连。对于这种目的，组织再建用材料的应用方法例如下面内容。将已粘连的部分剥离，进行通常的输卵管伞端成形术。在术后闭合腹部前以组织再建用材料被覆输卵管区域。对于这种目的，可使用以冻结保存·有上皮羊膜、冻结保存·无上皮羊膜、冻干·有上皮羊膜、粘附成分附着·无上皮羊膜等构建的组织再建用材料，从操作简便出发，优选使用以冻干·有上皮羊膜构建的组织再建用材料。作为应用方法，例如以包覆组织的状态用组织再建用材料被覆应用部分。并且，还可以通过在一部分以补丁的形式进行缝合或者通过附着于羊膜的粘附成分将组织再建用材料固定在应用部位。

2-2.防止骨盆底粘连的应用

骨盆内的子宫是腹腔外脏器，脏器表面的约50％没有被腹膜覆盖。为此，如果进行子宫摘除手术则产生腹膜缺损部位，结果导致骨盆底和小肠的粘连形成。使用羊膜可防止骨盆底的粘连。对于这种目的所使用的组织再建用材料的形态、应用方法与1-3.相同。

3.眼科领域中的应用

3-1.青光眼手术的应用

青光眼是视神经受损、视野变窄而视力下降的疾病。青光眼的治疗是通过切除小梁形成新的房水排出系统来进行手术的，术后巩膜和结膜发生粘连，有时治疗效果并不理想。针对这种问题，认为羊膜的使用是有效的。具体来讲，进行一般的小梁切除后，将组织再建用材料插入结膜下。对于这种目的，可使用以冻结保存·有上皮羊膜、冻结保存·无上皮羊膜、冻干·有上皮羊膜、粘附成分附着·无上皮羊膜等构建的羊膜，从操作简便出发，优选使用以冻干·有上皮羊膜构建的组织再建用材料。应用后，还可以将组织再建用材料经缝合等固定在应用部位。

3-2.睑球粘连的应用

睑球粘连是指从眼睑结膜到眼球发生瘢痕化，眼睑与眼球发生粘连的疾病。发生睑球粘连时，眼表面大范围受损的情况居多，将粘连的组织剥离后多复发。认为利用羊膜可以抑制睑球粘连。作为具体的应用方法，例如将眼睑与眼球间的粘连剥离后，将瘢痕化的结膜组织剥离，使巩膜露出，以组织再建用材料被覆。对于这种目的，可使用以冻结保存·有上皮羊膜、冻结保存·无上皮羊膜、冻干·有上皮羊膜、粘附成分附着·无上皮羊膜等构建的组织再建用材料，从操作简便等理由出发，优选使用以粘附成分附着·无上皮羊膜构建的组织再建用材料。使用该组织再建用材料时，主要可利用粘附成分实现固定于应用部位。以组织再建用材料被覆的部位可以是睑侧也可以是巩膜。

3-3.复发翼状胬肉的应用

翼状胬肉是指结膜组织发生异常增生，增生组织粘连于角膜引起散光、视力下降的疾病。认为羊膜对于该疾病是有效的。作为具体的应用方法，例如将翼状胬肉组织剥离使巩膜露出后，以组织再建用材料被覆。对于这种目的，可使用以冻结保存·有上皮羊膜、冻结保存·无上皮羊膜、冻干·有上皮羊膜、粘附成分附着·无上皮羊膜等构建的组织再建用材料，从操作简便等理由出发，优选使用以粘附成分附着·无上皮羊膜构建的组织再建用材料。使用该组织再建用材料时，主要可利用粘附成分实现固定于应用部位。

B.具有细胞层的片状组合物的应用例

具有细胞层的片状组合物可以应用于角膜或视网膜的再建(对于史蒂芬强森综合症、热化学外伤、眼类天疱疮、视网膜脱落、老年性黄斑变性症、青光眼、视网膜色素变性症等的治疗)、表皮-糖尿病性溃疡(表皮)、表皮水疱症、或者烫伤的治疗等。

(片状组合物的制作方法)

本发明的其他方面涉及片状组合物的制作方法。本发明的制作方法包括下面的步骤。即，(a)制备羊膜的步骤和(b)对上述羊膜附加海藻糖的步骤。

1.羊膜的制备：步骤(a)

“羊膜”是哺乳动物中覆盖子宫和胎盘的最表层的膜，在胶原丰富的软组织上形成基底膜、上皮层而构成。作为羊膜，优选使用人羊膜。人羊膜可以从例如分娩时产后得到的人胎膜、胎盘等中获取。具体地说，通过将分娩后立即得到的含有人胎膜、胎盘及脐带的一体物进行处理、精制，可以制备人羊膜。处理、精制方法可以采用特开平5-56987号中记载的方法等公知的方法。即，可以从分娩时得到的胎膜剥离羊膜，通过超声波清洗等物理处理及酶处理等将残存组织去除，经过适当的清洗工序来制备人羊膜。

这样制备得到的人羊膜可以事先冻结保存到使用时为止。人羊膜的冻结可以在例如-80℃、将DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′smedium)和甘油以体积比等量混合而得的溶液中进行。通过冻结保存可提高操作性是勿庸置疑的，还有望降低抗原性。

还可以直接利用羊膜，优选利用通过进行刮除处理等从羊膜上去除了上皮的羊膜。由于去除上皮，所以抗原性降低。例如，将如上那样冻结保存的人羊膜解冻之后，用EDTA或蛋白分解酶处理，缓解细胞间的粘附，接着用细胞刮器等刮除上皮，从而可以制备去除了上皮的人羊膜。

优选以包括以下步骤的方法去除羊膜的上皮。

(1)准备由活体分离的羊膜的步骤。

(2)对上述羊膜实施冻融处理的步骤。

(3)对冻融处理后的羊膜实施胰蛋白酶处理的步骤。

(4)清洗胰蛋白酶处理后的羊膜的步骤。

根据该上皮去除法，可以与以往的用手的上皮去除法同等程度地在抑制基底膜损伤的同时完全去除上皮。即，根据该上皮去除法，可获得上皮被完全去除，并且具有良好地保持了本来结构的基底膜的羊膜。该羊膜例如作为细胞培养用的基质(基材)发挥良好功能。另一方面，以下的上皮去除法与以往的用手方法相比，操作非常简便，操作时间也缩短了。并且，同时还可以容易地处理多数羊膜。进而，不特殊要求熟练的技术，因而也容易进行自动化。

以下，详细说明上皮去除法的各步骤。

(羊膜的准备：步骤1)

在步骤(1)中准备羊膜。这里的羊膜优选人羊膜。人羊膜可以从例如分娩时产后得到的人胎膜、胎盘等中获取。具体地说，可以通过将分娩后立即得到的含有人胎膜、胎盘及脐带的一体物进行处理、精制，来制备人羊膜。这样的人羊膜制备方法可以采用特开平5-56987号中记载的方法等公知的方法。典型地按着以下顺序实施该步骤。

(1-1)羊膜的采取

分娩时采取胎盘组织的一部分，接着用手将羊膜组织从胎盘组织剥离。还可以在该阶段暂时冻结。

(1-2)血球成分等的去除

将羊膜上附着的血球成分用生理盐水等清洗·去除。并且，用手将绒毛膜剥离、去除。如此，优选在这个阶段制成去除了血球成分和绒毛膜的羊膜，在后述的冻融处理(步骤2)后，还可以进行血球成分的去除和/或绒毛膜的剥离。

这样制备得到的人羊膜可以冻结保存直到下面的处理为止。人羊膜的冻结可以在例如-80℃、将DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′smedium)和甘油以体积比等量混合而得的溶液中进行。通过冻结保存可提高操作性是勿庸置疑的，还有望降低抗原性。

(框固定)

将按着以上顺序制备的羊膜固定于框后，优选进行以下处理。通过以框固定羊膜，操作变得容易。

羊膜的固定方法的具体例如图2所示。可使用与图2a的例同样形状的两个框(1、2)。羊膜10被这两个框夹住其边缘部而被固定。另外，以羊膜展开的状态固定。图2b的例中，使用框3和板状部件4固定羊膜10。首先，将羊膜10以展开的状态置于板状部件4上。此时羊膜10的上皮侧朝上。接着，在羊膜10的上面放置框3，以板状部件4和框3夹持羊膜10的边部。其结果是仅有羊膜10的上皮侧露出。因此，在实施后述的胰蛋白酶处理时，可以使胰蛋白酶溶液仅与羊膜的上皮侧接触(例如，向框3的内侧添加胰蛋白酶溶液)。由此，可以在不影响上皮以外的部分(羊膜致密层以及基底膜)的情况下进行胰蛋白酶处理。即，使胰蛋白酶作用于羊膜上皮，同时保护羊膜致密层等使其免受胰蛋白酶的作用。

(冻融处理：步骤2)

在该步骤中，使羊膜暂时冻结，之后使其融解。通过该冻融处理，在后面的胰蛋白酶处理时，羊膜上皮层容易剥离。考虑这是由于羊膜上皮层与基底膜之间的粘附状态(粘接状态)松散引起的。

冻结温度可采用约-20℃～约-80℃。从可以获得足够的冻结状态、可以利用通用的冷冻装置等角度进行考虑，优选在约-80℃下使其冻结。另一方面，融解温度可以采用约4℃～约50℃。优选将融解温度设为约37℃。

优选反复实施冻融处理。通过反复实施，在之后的胰蛋白酶处理中，增强了容易剥离上皮的这种冻融处理的效果。但是，反复进行必要以上的处理时，预想到还会对上皮以外的部分产生坏影响。因此，优选例如反复实施2～4次冻融处理。本发明人等经研究，结果发现通过实施2次冻结温度-80℃、融解温度37℃的冻融处理，可获得足够必要的效果。基于上述见解，优选在冻结温度-80℃、融解温度37℃的条件下实施2次冻融处理。

反复实施冻融处理时的各次的条件(冻结温度、融解温度)可以全部相同，也可以一部分不同，或者也可以互不相同。但是从操作性的角度出发，优选各次的条件相同。

(胰蛋白酶处理：步骤3)

在该步骤中，将冻融处理后的羊膜用胰蛋白酶处理。胰蛋白酶处理是通过使羊膜与胰蛋白酶溶液接触而实施的。作为胰蛋白酶溶液，可使用例如胰蛋白酶浓度为约0.01％(w/v)～约0.05％(w/v)的胰蛋白酶溶液。优选使用胰蛋白酶浓度为约0.02％(w/v)的胰蛋白酶溶液。如果胰蛋白酶溶液的胰蛋白酶浓度过低，则不能发挥充分的胰蛋白酶作用。另一方面，如果胰蛋白酶溶液的胰蛋白酶浓度过高，则能够使胰蛋白酶良好地作用于羊膜上皮相反地，胰蛋白酶也对羊膜致密层以及基底膜发生作用，该部分被损伤。

胰蛋白酶大多是市场上出售的牛来源、猪来源、人来源等的胰蛋白酶。例如可以优选使用Trypsin-EDTA(Invitrogen公司)、trypsin1：250(Sigma公司)。

预先向胰蛋白酶溶液中添加普通的螯合剂，螯合剂不是必须的。作为螯合剂可使用EDTA、NTA、DTPA、HEDTA、GLDA等。可以将这些任意组合使用。添加螯合剂使其浓度为例如约0.1mM～约0.6mM。

优选在仅使羊膜上皮侧与胰蛋白酶溶液接触的条件下实施胰蛋白酶处理。这是为了保护羊膜上皮以外的部分使其免受胰蛋白酶的作用。例如，通过仅使羊膜上皮侧浸渍于胰蛋白酶溶液，在羊膜上皮侧添加涂布胰蛋白酶溶液，封闭羊膜绒毛膜侧以使其不与溶液接触而进行加工之后，全部浸渍于胰蛋白酶溶液等，由此可以仅使羊膜上皮侧与胰蛋白酶溶液接触。如上所述，如果使用预先固定于图2b所示的框的羊膜(框固定羊膜)，则成为仅露出羊膜的上皮侧的状态，所以例如即使通过将框固定羊膜浸渍于胰蛋白酶溶液，也可以仅使羊膜上皮侧与胰蛋白酶溶液接触。在该方法中，还具有以框固定的羊膜进行浸渍这种简便操作就能够实施胰蛋白酶处理的这个优点。另外，在使用如此固定于框的羊膜时，不仅可以连同框一起浸渍于胰蛋白酶溶液的方法，还可以通过仅使羊膜的上皮侧部分浸渍于胰蛋白酶溶液(例如将羊膜的上皮侧朝下浸渍于胰蛋白酶溶液)、向框内添加胰蛋白酶溶液或者将胰蛋白酶溶液涂布于羊膜上皮侧，从而仅使羊膜的上皮侧与胰蛋白酶溶液接触。

胰蛋白酶处理时间(胰蛋白酶溶液的接触时间)例如为约5分钟～约60分钟。优选约10分钟～约20分钟，更优选约15分钟。如果处理时间过短，则不能使胰蛋白酶充分地作用，结果是羊膜上皮的除去不充分。另一方面，如果处理时间过长，则有时胰蛋白酶也对羊膜的基底膜、致密层产生作用，可能使该部分损伤。

胰蛋白酶处理的温度条件为例如约25℃～约42℃，以使得胰蛋白酶良好地发挥作用。

与胰蛋白酶溶液接触期间优选维持羊膜在静置的状态。因为考虑这样使胰蛋白酶溶液更难于浸透到基底膜、致密层。

也可以分多次实施胰蛋白酶处理。

(清洗：步骤4)

用以上的方法与胰蛋白酶溶液接触后，清洗羊膜。通过该清洗，去除附着的胰蛋白酶溶液，同时去除羊膜上皮(上皮细胞)。例如，通过置于具有适当流动性的液体中(例如流水中)、以浸于适当的液体中的状态使其振荡(例如上下振荡)、或者以浸于适当的液体中的状态施加超声波等，由此清洗胰蛋白酶处理后的羊膜。作为清洗中所使用的液体，可示例生理盐水、磷酸系缓冲液、精制水、DMEM。

清洗后的羊膜也可以预先冷藏或者冷冻保存直到使用时。例如可以在浸渍于含有甘油的保存液(例如含有50％甘油的DMEM(Dulbecco’sModified Eagle’s Medium：GIBCOBRL公司))的状态进行保存。

2.海藻糖的附加：步骤(b)

对羊膜附加海藻糖，可通过例如将羊膜浸渍于海藻糖溶液来进行。例如将羊膜浸渍于将海藻糖溶解于蒸馏水、磷酸缓冲的生理盐水(PBS(-))使其浓度为5％(w/v)～20％(w/v)所得到的溶液中。浸渍时的温度在例如4℃～37℃的范围内。浸渍时间在例如1小时～1天的范围内。另外，海藻糖可利用例如株式会社林原商事提供的“Toreha”(注册商标)或H plus V Lifescience公司提供的“Torehainochi”等。

作为向羊膜附加海藻糖的方法，可采用将海藻糖溶液涂布于羊膜表面的方法、将海藻糖溶液喷到羊膜表面的方法、将海藻糖直接添加在羊膜表面的方法等。

另外，在从羊膜除去上皮的步骤(例如上述步骤2～4)之前，可实施附加海藻糖的步骤。

3.冻结处理或者干燥处理：步骤(c)

本发明的一种实施方式是将附加了海藻糖后的羊膜冻结或者干燥。通过该处理提高保存性、操作也变得容易。特别是通过干燥处理，可制成在保存性方面以及操作方面极其优异的片状组合物。并且，由于伴随着干燥的表面形态的变化，可期待羊膜对活体组织的亲和性(粘附性)提高。羊膜的干燥优选以冻干处理实施。这是由于可抑制羊膜的柔软性的降低。并且，冻干处理从保持羊膜的基底膜成分的结构的角度也优选。在冻干处理中，一般通过在沸点约-20℃(107Pa、0.8托)～约-50℃(4Pa、0.03托)这样的低气压环境(真空)下，从冻结固化状态的试样(例如在约-40℃下冻结后的试样)升华来除去水分。通过冻干处理，可以从内部均匀地脱水并且实现高干燥度，因此可以将本来的功能以及形态以高度地保持的状态使其干燥。并且冻干处理具有如下特征：1.处理中的劣化少；2.能够容易地无菌化；3.得到复元性优异的干燥体；4.得到保存性优异的干燥体等。

冻干处理可通过具有真空室、冷却-加热装置、排气装置(冷凝管以及真空泵)的冻干机进行。多数的冻干装置为市场上出售的，可以使用从其中进行任意选择的装置实施干燥处理。另外，处理条件可基于所使用的装置中附有的使用说明书进行设定。此时，可以考虑进行干燥处理的试样的大小、干燥度等。干燥度可以设定成例如水活性(AW)小于0.5。

通过切断冻干后的羊膜，或者剪断羊膜，可得到期望大小以及形状的干燥羊膜。也可以将得到的干燥羊膜固定于支持体或框。

本发明的一种实施方式，是将经干燥处理得到的干燥羊膜以基本上不与氧接触的状态收纳于适当的容器中。以基本上隔绝于氧的状态包装，由此制成保存性极其优异的不含上皮的干燥羊膜。

例如，将干燥处理后的羊膜收纳于适当的容器内后，通过吸除容器内的空气形成真空状态或者对容器内进行氮置换等，羊膜可以以基本上隔绝于氧的状态进行包装。或者，也可以通过将脱氧剂一同封入容器内，来除去残存的氧。另外，还可以将上述方法任意组合使用。作为容器可以使用例如包含可塑性合成树脂的袋状或者管状的容器(将两张片材重叠将周边部密封后的容器)或者由玻璃等无机材料形成的瓶状容器等。

在实施冻结处理或者干燥处理之前或者之后，还可以实施以活体吸收性材料被覆羊膜的绒毛膜侧的步骤。通过该处理可提高羊膜的强度。作为活体吸收性材料可例示聚乳酸羟基乙酸910(polyglactin)、明胶、胶原、聚乳酸等。

4.灭菌处理步骤：步骤(d)

通过实施灭菌处理可以将混入菌的风险最小化。可以通过EOG(环氧乙烷气体)、UV(紫外线)、γ-射线处理等进行羊膜的灭菌。其中，优选采用γ射线灭菌。这是由于羊膜的物性降低少。在γ-射线灭菌中，辐射剂量为例如2kGy～50kGy，优选为10kGy～30kGy，更优选为15kGy～25kGy。

优选在将实施了一系列处理后的羊膜收纳于容器中的状态或者以膜或者片等包装的状态下实施灭菌处理。因此，优选在灭菌处理前实施将羊膜在容器等中收纳等的步骤。另外，优选以基本上不与氧接触的状态将羊膜进行收纳或者包装。这是由于可以抑制品质的劣化、能够长期保存。

5.粘附成分的附着：步骤(e)

本发明的一种实施方式是将纤维蛋白原以及凝血酶附着于羊膜的表面。这些成分的附着可以在例如上述干燥处理后实施。通过使用干燥状态的羊膜，可以使纤维蛋白原等粘附成分更好地附着。

纤维蛋白原及凝血酶向羊膜表面的附着可分别单独进行或者同时进行。附着方法没有特别限定。作为附着方法的例子，可以举出将附着成分的溶解液涂布、滴加、或者喷雾到羊膜表面的方法，或者将羊膜浸渍在附着成分的溶解液中的方法。此外，将纤维蛋白原自身(或者凝血酶自身)、或者将纤维蛋白原(或者凝血酶)溶解到适当的溶剂中之后而析出的成分添加(涂抹)到羊膜表面，从而可以使纤维蛋白原(或者凝血酶)附着在羊膜表面。

优选制备这2种成分的混合液，使用该混合液来涂布、滴加等，由此使纤维蛋白原及凝血酶同时附着在羊膜表面。以下，说明这样的将2种成分同时附着的方法的具体例。

首先，制备纤维蛋白原溶解液。具体地说，将纤维蛋白原溶解在乙醇(例如94％乙醇)等的溶剂(溶媒)中，使之达到所希望的浓度。除了乙醇之外，还可以使用无水乙醇、异丙醇、甲醇等醇类或丙酮等作为溶剂。另一方面，以同样的顺序另外制备凝血酶溶解液。作为此时的溶剂，可以使用例如乙醇(例如99.5％乙醇)、无水乙醇、异丙醇、甲醇等醇类或丙酮等。

接着，混合以以上的顺序准备好的纤维蛋白原溶解液及凝血酶溶解液。使用如此得到的混合液，如上所述，实施向羊膜上的涂布、滴加等。如上这样将纤维蛋白原溶解液和凝血酶溶解液混合，使用混合液实施附着操作，此时，优选注意不让混合液中的水分量增多。如果混合液中的水分量增多，则在附着操作前会发生纤维蛋白原、凝血酶间的反应，给附着操作带来障碍。此外，为了移植后获得良好的粘附力，优选在事前不发生作用的状态下将纤维蛋白原和凝血酶附着在羊膜上。如果考虑以上方面，则优选采用水溶性且水分量少的挥发性溶剂分别作为纤维蛋白原的溶剂及凝血酶的溶剂。

纤维蛋白原溶解液及凝血酶溶解液、或者纤维蛋白原和凝血酶的混合液的涂布、滴加等，典型地说，是对羊膜表面的全部区域均匀地实施，但例如也可以仅在一部分区域实施(例如，以点滴的方式间隔设置并在多个区域实施，或仅在周边部实施)，或以不同的附着量来实施。

在上述方法中，可以同时进行纤维蛋白原以及凝血酶的附着，也可以在不同的步骤中将各自的成分附着。即，还可以将纤维蛋白原的附着和凝血酶的附着作为2阶段的步骤实施。但是，从可简化操作方面、以及能够使纤维蛋白原以及凝血酶以更加均匀的分散状态附着的方面，优选使用纤维蛋白原和凝血酶的混合液以一步进行附着操作。

另外，纤维蛋白原及凝血酶可以依照常规方法由血液来制备。还可以使用重组体的纤维蛋白原等，此时可以由适当的培养细胞的培养液或者细胞破碎液通过常规方法来制备。此外，还可以使用市场上出售的纤维蛋白原等。例如，人来源的纤维蛋白原可以从Baxter公司购入。同样地，人来源的凝血酶可以从Baxter公司购入。

除了纤维蛋白原及凝血酶以外，还可以使抑肽酶附着在羊膜表面。即，在该实施方式中，进一步实施使抑肽酶附着的步骤(步骤b-1)。抑肽酶的附着可以通过与纤维蛋白原同样的方法及顺序来实施。即，通过采用抑肽酶溶解液的涂布、滴加、喷雾、浸渍等，可以在羊膜表面附着抑肽酶。抑肽酶溶解液可以通过将抑肽酶溶解在氯化钠溶液(例如0.85％溶液)、氯化钾溶液、氯化钙溶液、氯化镁溶液等中来制备。

应说明的是，抑肽酶可以依照常规方法由牛的胰脏来制备。还可以使用重组体的抑肽酶，此时可以由适当的培养细胞的培养液或者细胞破碎液通过常规方法来制备。此外，还可以使用市场上出售的抑肽酶。例如，牛来源的抑肽酶可以从Bayer药品公司购入。

使抑肽酶附着的步骤还可以单独实施，优选与使纤维蛋白原及凝血酶附着的步骤同时实施。这是因为粘附成分的附着操作作为整体被简化了。此外，还因为能够将纤维蛋白原、凝血酶及抑肽酶以更均匀分散的状态附着在羊膜表面。例如，制备纤维蛋白原、凝血酶、及抑肽酶的混合液，将其涂布等，从而可以实施这3种成分向羊膜的同时附着。这3种成分的混合顺序没有特别限定。

纤维蛋白原等的附着可以对羊膜的单面或者两面实施。在前者的情况下，原则上无论羊膜中有无上皮，在与上皮侧(上皮存在的一侧)呈相反侧的表面(即绒毛膜侧)进行纤维蛋白原等的附着。

附着纤维蛋白原及凝血酶(根据情况还有抑肽酶)之后，根据需要实施干燥处理。如此，形成保存稳定性优异的片状组合物。此外，成为在处理(输送、移植操作等)方面也优选的形态。

作为干燥处理，可以采用风干、真空干燥、减压干燥、冻干等一般的干燥处理方法。

(含有细胞层的片状组合物的制备方法)

在本发明的一种实施方式中，在羊膜上形成使用活体来源的细胞的细胞层。形成细胞层的步骤可以按着下面的顺序实施。首先，准备适当的活体来源的细胞(制备活体来源的细胞的步骤)。作为活体来源的细胞，使用适合于最终得到的片状组合物的用途的细胞。例如，制作皮肤表皮组织的再生用片时，优选使用皮肤表皮细胞(包括其干细胞、前体细胞)或毛囊上皮细胞(包括其干细胞、前体细胞)等。同样地，以角膜上皮组织的再生为目的时，优选使用角膜上皮细胞(包括其干细胞、前体细胞)；以粘膜上皮组织的再生为目的时，优选使用粘膜上皮细胞(包括其干细胞、前体细胞)。作为粘膜上皮细胞的例子，可以举出口腔粘膜上皮细胞、肠道粘膜上皮细胞、呼吸道粘膜上皮细胞等。

对于活体来源的细胞的制备方法，以皮肤表皮细胞、角膜上皮细胞、口腔粘膜上皮细胞、肠道粘膜上皮细胞及呼吸道粘膜上皮细胞为例进行说明。

(皮肤表皮细胞)

首先，采取皮肤时，预先用聚乙烯吡咯酮碘等消毒药预防性地消毒采取部位，进行抗真菌剂的外用涂布之后，依照皮肤活检采取小皮肤片。培养表皮角化细胞时，用剪子从皮肤片中尽可能地剔除脂肪组织和真皮，用杜氏磷酸缓冲液(PBS)清洗数次。在70％乙醇中浸泡1分钟来进行灭菌。切成长方条状，浸于分散酶液中，在4℃下静置一晚。接着将表皮从真皮上剥离。把剥离得到的表皮清洗后，切碎表皮片，调配表皮角化细胞悬浮液。把细胞悬浮在无血清培养基中，播种于胶原被覆培养皿上，进行传代培养。

(角膜上皮细胞)

角膜上皮细胞可从角膜缘部组织中获得。例如，从角膜缘部组织剥离去除内皮细胞，切除结膜，制作单一细胞悬浮液。然后把它保存于氮罐中，接着迅速在37℃下融解来调配角膜上皮细胞悬浮液。根据需要，进行传代培养。对传代培养而言，例如，可使用无血清培养基Epilife^TM(CASCADE公司)、MCDB153培养基(日水制药株式会社)或改变这些培养基的氨基酸组成等而制成的培养基等。

(口腔粘膜上皮细胞)

作为口腔粘膜上皮细胞，可以使用存在于齿根部的细胞(口腔内缘粘膜上皮细胞)、口唇部细胞、口上颚部细胞、颊部细胞等。其中，口腔内缘粘膜上皮细胞因其增殖能力高且抗原性低，而特别优选使用它。口腔粘膜上皮细胞可以用手术刀等切除目标细胞存在的部位，或通过进行刮除来采取。对于口腔内缘粘膜上皮细胞，可以通过将拔牙时附着的口腔粘膜上皮从牙釉质牙骨质移行部分离出来，由此进行采取。在此，为了去除结缔组织等杂质，优选进行用分散酶或胰蛋白酶等酶的处理或过滤器处理。

(肠道粘膜上皮细胞)

肠道粘膜上皮细胞是在大肠内窥镜下从肠道上皮活检组织中采取，或者用剖腹手术时常规的手法采取。还可以用激光捕捉显微解剖(lazercapture microdissection)方法从组织中切除上皮细胞。本发明技术也适用于食道、胃、十二指肠、小肠、大肠的人的所有消化道上皮细胞而制作的片状组合物。由于溃疡、炎症等，人的消化道上皮受到损伤时，骨髓来源细胞发挥应对紧急事态的急救作用，而修复上皮。消化道上皮细胞的一部分也可以由骨髓制作。从这个意义上本发明的意义可以与使用角膜上皮细胞视为同等。通常1000个中只有少数几个可以由骨髓生成的上皮细胞，在胃溃疡、大肠炎等引起的消化道内面的溃疡(伤口)治愈的过程中增加50倍到100倍，已确认大约10个中有1个消化道上皮细胞为骨髓来源。这里制作的消化道粘膜上皮细胞来源片状组合物，认为对于认定为难症的重症肠道感染症、溃疡性大肠炎、克隆病、贝切特病等肠道病的难治溃疡、炎症而言，在促进肠道上皮的再生方面也是颇有意义的。也期待着对肠道变态反应的可用性。

(呼吸道粘膜上皮细胞)

呼吸道粘膜上皮细胞容易从呼吸道粘膜的活检组织中得到，与上述的组织相同，为了去除结缔组织等杂质，优选进行用分散酶或胰蛋白酶等酶处理或过滤器处理。呼吸道粘膜上皮细胞通过β防御素的生物合成、释放等，对各种感染症的病情发展起重要的作用。而且，呼吸道粘膜上皮对哮喘、变态反应疾病中所起的作用也高。对受到组织损伤的呼吸道粘膜提供本发明的由呼吸道粘膜上皮细胞制作的片状组合物，不仅是紧急时进行应对，还可用于人工呼吸道的提供。尤其羊膜上制作的片所具有的免疫抑制作用是有益的。

口腔粘膜上皮细胞、肠道粘膜上皮细胞等，特别是在采取组织之后，为了去除结缔组织等杂质，优选进行用分散酶或胰蛋白酶等酶的处理或过滤器处理。

活体来源的细胞优选由接受片状组合物移植的受者(recipient)制备。即、优选活体来源的细胞的供体和活体移植片的受者是相同的人。通过使用这样的自体细胞，可解决免疫排斥的问题。

制备好的活体来源的细胞被播种到羊膜上(将活体来源的细胞播种到羊膜上的步骤)，供给其后的培养(培养经播种的活体来源的细胞并使其增殖的步骤)。

在该实施方式中，特别优选使用去除了上皮的羊膜。通过去除上皮，可以期待抗原性的降低，此外，通过事先去除不需要的细胞，可以良好地形成目的细胞层。使用去除了上皮的羊膜时，优选在去除上皮而表露出的面侧(即基底膜侧)播种活体来源的细胞。这是因为在该面侧含有丰富的IV型胶原，认为播种的活体来源的细胞的增殖、多层化会良好地进行。

在此，也可以通过使用二种以上的细胞，形成经杂化的细胞层。对于这种情况的细胞层的具体形成方法，以制作角膜上皮再建用的片状组合物为例，详述如下。

首先，作为细胞层形成中使用的细胞种之一(第1细胞)，优选使用口腔粘膜上皮细胞、结膜上皮细胞、鼻腔粘膜上皮细胞、或其他粘膜上皮细胞、或者能够构建这些中的任意一种粘膜上皮的未分化细胞。另一方面，作为与第1细胞一起用于细胞层形成的细胞种(第2细胞)，优选使用角膜上皮细胞、结膜上皮细胞、或羊膜上皮细胞。这些细胞从其存在的活体组织中采取。具体地说，例如，用手术刀等采取目的细胞存在的组织的一部分之后，经过结缔组织的去除、细胞的分离等处理，制备成细胞悬浮液(悬浊液)的形态。另外，作为第1细胞可以使用不同的二种以上的细胞。对于第2细胞也同样地可以使用不同的二种以上的细胞。

在优选作为第1细胞采取源的口腔粘膜上皮中提示有干细胞的存在，可认为容易实施向形成上皮样细胞层的细胞分化诱导。另外，利用口腔粘膜上皮细胞具有如下优点：容易采取，可大量采取细胞，进而在处置双眼性患者的情况下也可以用自体的细胞制备移植材料等。尤其是，对于不能采取角膜上皮细胞的患者，可以应用自体细胞来源的移植材料，其优点是，可以大幅度地解除临床上极其重要的排斥反应问题。

作为口腔粘膜上皮细胞可以采用存在于齿根部的细胞(口腔内缘粘膜上皮细胞)、口唇部细胞、口上颚部细胞、颊部细胞等。其中，口腔内缘粘膜上皮细胞由于其增殖性能高，而且抗原性低，故特别优选采用它。口腔粘膜上皮细胞可以从目标细胞所在部位用手术刀等切除，或进行刮除来采取。对于口腔内缘粘膜上皮细胞，可以通过将拔牙时附着的口腔粘膜上皮从牙釉质牙骨质移行部分离来采取。另外，为了去除结缔组织等杂质，优选实施用分散酶或胰蛋白酶等酶处理或过滤器处理。

也可以采用从准备移植本发明制作的片状组合物的患者以外的口腔所采取的口腔粘膜上皮细胞，但若考虑免疫排斥反应，优选从患者自身的口腔采取口腔粘膜上皮细胞进行培养。

由于口腔粘膜增殖能力高，通常，术后数日内服抗生素，通过漱口药水(Isodine)消毒等来治愈创伤，因而认为通过采取粘膜引起的患者自身的侵害是轻度的。

另一方面，作为第2细胞，可以优选用他人(allo)的角膜上皮细胞。这样的角膜上皮细胞，例如可以从眼库(Northwest lions eye bank等)中获得没有感染症的供者的眼球。作为第2细胞可以使用的细胞不限于角膜上皮细胞，也可以使用结膜上皮细胞、羊膜上皮细胞等。但是，若采用作为在活体中构成角膜上皮的细胞的角膜上皮细胞、或在其附近存在的结膜上皮细胞，则认为可构建更好地再现角膜上皮特性的片状组合物。本发明人等的研究结果确认，使用角膜上皮细胞作为第2细胞时，可以构建类似于角膜上皮的细胞层。这一事实支持上述的预想，并且印证了特别优选角膜上皮细胞作为第2细胞。另一方面，使用羊膜上皮细胞作为第2细胞时，也被确认可形成良好地再现角膜所要求的特性的细胞层。这一事实表明，还可以优选使用羊膜上皮细胞作为第2细胞。

可以利用自体的细胞作为第2细胞，但是如果采用他人的细胞则可以更容易获得细胞。例如，即使为双眼性患者制作治疗用片状组合物时，也可以获得作为第2细胞的角膜上皮细胞。

将分别调制好的第1细胞和第2细胞(以下，把这些统称为“第1细胞等”)播种在羊膜上，进行培养。通常，将调制成细胞悬浮液形态的第1细胞和第2细胞分别往羊膜上滴加，实施培养。

典型地说，第1细胞的播种和第2细胞的播种同时(这里的“同时”当然包括文字所表示的同时，也包括一方播种后没有实质性的时间间隔地播种另一方的情况)实施，例如，在播种第1细胞后经过数分～数小时的时间，播种第2细胞等，也可以在不同的时机播种两者。这样通过错开播种时机，可以构建例如富有来源于第1细胞的细胞的区域局部存在的细胞层等，可以构建非均质的细胞层。

播种的第1细胞等的比率没有特别限定，典型地说，播种大体等数的第1细胞和第2细胞。应说明的是，在采用口腔粘膜上皮细胞作为第1细胞，采用角膜上皮细胞作为第2细胞的实验中，比较第1细胞数与第2细胞数的比为3∶7的情况、5∶5的情况以及7∶3的情况，结果表明在细胞增殖及多层化方面，它们之间没有明显的差异(未出示数据)。

通过在羊膜上培养第1细胞及第2细胞，这些细胞增殖而形成细胞层(认为该过程中至少一部分细胞分化)。形成细胞层之后，实施使该细胞层的表层接触空气的步骤。另外，在本说明书中也将该步骤称为空气上举(Air-lifting)。该步骤是为了使形成细胞层的细胞分化以及诱导屏障功能而实施的。

该步骤可以如下进行：通过用滴液管、移液管等暂时去除一部分培养液而使培养液表面降低，由此使细胞层的最表层暂时露出于培养液外。或者，也可以通过将细胞层连同羊膜一起往上提升，将最表层暂时从培养液表面露出。进而，可以用管等把空气送入培养液中，使细胞层的最上层与空气接触。从操作容易性的观点出发，优选通过降低培养液表面而使细胞层的最表层露出的方法进行。

进行该步骤的时间，即是多层化细胞层的最表层与空气接触的时间，根据细胞的状态、培养条件等而变化，例如3天～2周左右，优选为1周以内，更优选为3日以内。

根据以上的本发明的方法，在羊膜上形成第1细胞等多层化的角膜上皮样的细胞层。这样得到的片状组合物，可以与作为第1细胞等的培养基质而采用的羊膜一起用作对于角膜损伤、缺损等的患者的移植材料(代替角膜上皮)。在这种情况下，以羊膜成为眼球侧的方式移植到角膜上皮缺损部位。

在本发明的一种实施方式中，在支持细胞的存在下进行活体来源的细胞的培养。所谓支持细胞也称饲养(feeder)细胞，在培养液中供给成长因子等等。由于在与支持细胞的共存下进行培养，提高细胞的增殖效率。支持细胞可以使用例如3T3细胞(瑞士小鼠3T3细胞、小鼠NIH3T3细胞、3T3J2细胞等)等。其中，从增殖效率和操作容易等观点出发，优选使用小鼠NIH3T3细胞作为支持细胞。

优选预先用丝裂酶素C等对支持细胞实施非活性化。这是为了防止随着支持细胞自身增殖而阻碍活体来源的细胞的增殖，来提高活体来源的细胞的增殖效率。这种非活性化也可以通过放射线处理等来实施。

支持细胞的细胞密度可以是，例如约1×10²个/cm²以上，优选约1×10²个/cm²～约1×10⁷个/cm²，更优选约1×10³个/cm²～约1×10⁵个/cm²。用与第1细胞等的对比来说，例如，可以在使用的支持细胞数相对于活体来源的细胞的总数为1/10³倍～1×10²倍、优选1/10²～1倍的条件下进行培养。若支持细胞数少，则活体来源的细胞的增殖率降低，在过少的情况下，得不到活体来源的细胞良好的增殖及多层化。另一方面，在支持细胞数过多的情况下，活体来源的细胞的增殖率反而下降，因而不优选。

在支持细胞共存下进行活体来源的细胞的培养时，优选在支持细胞与羊膜之间设置支持细胞不能通过的孔径尺寸的隔离膜。通过利用该隔离膜，在培养时可防止支持细胞侵入到羊膜侧(即活体细胞侧)。其结果是不用担心最终获得的片状组合物内混有支持细胞。这就意味着可以制作没有因支持细胞所致的免疫排斥问题的片状组合物，在临床上有极其重要的意义。

作为隔离膜，可以适当选择使用具有支持细胞不能通过的孔径尺寸的公知的隔离膜。例如，可以使用聚碳酸酯制的、孔径尺寸约0.4μm～3.0μm的膜。隔离膜的材质没有特别限定，除了聚碳酸酯以外，也可以是聚酯等。这样的隔离膜在市场上出售，能容易地得到。

作为使用隔离膜时的培养方法的例子可举出以下的方法。首先，通过在培养皿等容器(第1容器)中播种培养非活性化的支持细胞，从而在容器表面形成支持细胞层。其次，把用隔离膜形成底面的第2容器设置于第1容器内。这时，调整第2容器的位置，使得第2容器的底面处于培养液中。继而，在第2容器的底面、即隔离膜上载置或附着羊膜。然后，在羊膜上播种活体来源的细胞，进行培养。

在第2容器的底面预先载置或附着羊膜(例如，在第2容器的底面载置去除了上皮的羊膜，在该状态下暂时进行干燥处理)，将该第2容器设置于播种了支持细胞的第1容器内，然后可以在羊膜上播种活体来源的细胞，进行培养。

培养活体来源的细胞时使用的培养液，只要能使该细胞增殖、多层化就没有特别限定。例如，可以使用如下的培养基：以规定比例混合在上皮细胞的成长中通常使用的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’smedium)和Ham’s F12培养基(Ham’s F12 medium)，添加FBS、成长因子、抗生素等而得到的培养基。具体例可举出，添加有FBS(10％)、胰岛素(5mg/ml)、霍乱毒素(0.1nM)、上皮细胞生长因子(EGF)(10ng/ml)以及青霉素-链霉素(50IU/ml)的、DMEM和Ham’s F12培养基的混合培养基(混合体积比1∶1)。此外，还可以使用进一步添加有三碘甲状腺原氨酸(例如2nM)、谷氨酰胺(例如4mM)、转铁蛋白(例如5mg/ml)、腺嘌呤(例如0.18mM)和/或氢化可的松(例如0.4mg/ml)的DMEM/Ham’s F12混合培养基。

还可以在异种动物细胞不存在的条件下进行活体来源的细胞的培养。本发明中的“异种动物细胞不存在的条件下”是指，作为培养活体来源的细胞时的条件，不使用对该活体来源的细胞而言为异种的动物细胞。具体地说，是指使用人细胞(例如人皮肤表皮细胞或人角膜上皮细胞)作为活体来源的细胞时，小鼠或大鼠等人以外的动物种的细胞在培养液中不存在(不共存)的条件。通过在这样的条件下实施培养，不用担心在最终得到的移植材料(即片状组合物)中混入异种来源的成分(包括异种细胞自身)。

培养活体来源的细胞时使用的培养基，只要能使该细胞增殖就没有特别限定。例如，可以使用如下培养基：MCDB153培养基(日水制药株式会社)、或EpiLife^TM(Cascade公司)、改变这些培养基的氨基酸组成等而制成的培养基、以规定比例混合上皮细胞的成长中通常使用的DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′s medium)和Ham′s F12培养基(Ham′s F12 medium)而得的培养基等。特别优选在本发明中使用无血清且不含异种动物来源的蛋白质的培养基。另一方面，可以使用添加有成长因子或抗生素等的培养基。但是，优选使用不含血清的培养基。即，优选采用无血清培养法作为本发明中的培养方法。这是因为可以避免因混入血清来源的成分而导致的免疫排斥等问题。还可以在含有血清的培养基中培养，此时，优选使用同种来源的血清(培养人的活体来源的细胞时为人来源的血清)、或者使用自体血清。当然，只要可能，优选使用不会担心引起免疫排斥反应的自体血清。

为了良好地增殖活体来源的细胞，在培养步骤过程中也可以变更培养条件。

培养步骤的结果是活体来源的细胞在羊膜上增殖。在有必要将这样得到的细胞层的表层角化时(例如使用皮肤表皮细胞制作皮肤表皮片时、使用角膜上皮细胞制作角膜上皮片时)，可以实施上述的空气上举(Air-lifting)。

将活体来源的细胞播种到羊膜上，使得例如细胞密度达到约1×10³个/cm²以上、优选约1×10³个/cm²～约1×10⁷个/cm²、进一步优选约1×10⁴个/cm²～约1×10⁶个/cm²。

在优选的一种实施方式中，在预先制备好的含有人成纤维细胞的胶原基质上载置羊膜，其后，在羊膜上播种活体来源的细胞，进行培养。即，在该实施方式中，实施如下步骤：在胶原凝胶内培养人成纤维细胞的步骤(步骤B)、及在上述胶原凝胶上载置羊膜之后，将上述活体来源的细胞播种或载置在该羊膜上的步骤(步骤C)。按这样的顺序制成的片状组合物含有在载置于含人成纤维细胞的胶原凝胶上的羊膜上增殖的活体来源的细胞。该实施方式的片状组合物在去除胶原基质之后可以用作移植材料。此外，也可以与胶原基质一起用作移植材料。

“胶原凝胶”是作为人成纤维细胞的培养基质而发挥作用。作为胶原凝胶原材料的胶原种类没有特殊限定，可以使用I型胶原、III型胶原、IV型胶原等。也可以使用多种胶原混合存在的胶原。这些胶原可以通过酸溶解法、碱溶解法、酶溶解法等从猪、牛、羊等动物的皮肤、软骨等结缔组织中提取、精制。在此，为了降低抗原性，优选使用通过用胃蛋白酶或胰蛋白酶等分解酶处理来去除端肽的、所谓的组织修复胶原(atherocollagen)。作为胶原凝胶的材料，可以使用羊膜来源的、特别是人羊膜来源的胶原。在此，所谓的羊膜来源是指广义的以羊膜为初始原材料而得到的物质。

胶原凝胶所含有的人成纤维细胞的来源没有特别限定，只要产生胶原则哪一种组织来源都可以，例如可以使用由皮肤组织、口腔粘膜组织等制备得到的人成纤维细胞。

显示胶原基质的制作方法的具体例子。首先，按以下的顺序制备人成纤维细胞。采取皮肤，接着从皮肤剥离真皮。把真皮切碎，使其附着于I型胶原被覆试皿。静置培养，将从真皮片游离的人成纤维细胞进行传代培养。使细胞从试皿底面剥离，调配细胞悬浮液，播种于细胞培养用试皿。适当地冻存(例如在液氮中保存)细胞。

另一方面，用I型胶原调制中和胶原液(参照后述的实施例)。把它添加到培养容器(例如培养嵌套)中，在室温中静置10分钟左右，使其凝胶化。接着，用上述方法将预先培养好的对数增殖期的人成纤维细胞混合于该凝胶中，再次使其凝胶化。然后，静置培养。通过以上顺序得到含有人成纤维细胞的胶原基质。通过该创意努力，形成了有必要的强度、且能够载置羊膜层、活体来源的细胞的胶原基质，成为本发明的基础。在胶原基质上载置(附着)另行准备的羊膜。其后，按上述顺序实施细胞的播种、培养。

另外，伴随着使粘附成分(纤维蛋白原等)附着于羊膜表面的操作，在粘附成分的附着操作之前形成细胞层。即，在该实施方式中，在羊膜上形成细胞层之后，使纤维蛋白原等粘附成分附着于羊膜表面(未形成细胞层一侧的表面)。

实施例1

1.海藻糖处理·冻干羊膜的制备

1-1.羊膜的采取

对于没有全身合并症的准备剖腹产的孕妇事先会同妇产科医生进行认真的说明、取得同意后，在手术室剖腹产时采取羊膜。操作要注意清洁，按手术操作洗手后穿上手术袍。分娩前准备清洁的采取羊膜用搪瓷盘和清洗用生理盐水。分娩后将胎盘组织移到搪瓷盘上，用手把羊膜组织从胎盘剥离。羊膜与胎盘的粘连牢固的部分用剪刀切除。

1-2.羊膜的处理

羊膜处理的过程按(1)清洗、(2)修整、(3)保存的顺序实施。在全部过程中，优选在清洁的通风橱内操作，全部使用经灭菌的容器和器具，培养皿等使用经灭菌的一次性(可任意处理的)培养皿。用生理盐水边清洗边去除附着于所采取的羊膜上的血液成分，再用足够量的生理盐水(添加0.005％氧氟沙星)清洗。接着，用添加有青霉素-链霉素(50IU)的磷酸缓冲液(PBS)总计清洗3次。接着，把羊膜移到培养皿内，用剪刀进行约4×3cm左右大小的分割。分割后以形状、厚度等为基准，选择状态良好的羊膜。

1-3.羊膜的保存

在2cc的灭菌低温管中各注入1cc的保存液，把每一片经采取、清洗后选出的羊膜装入，加上标记后，保存于-80℃的低温冰箱中。保存液使用含有50％灭菌过的甘油的DMEM(Dulbecco’S Modofied EagleMedium：GIBCOBRL公司)。保存的羊膜使用期限是3个月，若过期就进行焚烧处理。另外，未进行这样的保存处理也可以实施以下的上皮处理。

1-4.羊膜上皮的处理

将在-80℃下保存的羊膜在室温下解冻之后，用添加有青霉素-链霉素(50IU)的磷酸缓冲液(PBS)清洗2次。将清洗后的羊膜浸于0.02％EDTA溶液(Nacalai tesque公司)(100mm培养皿)中、在37℃的CO₂培养箱内反应1小时。反应后用足量的PBS清洗羊膜2次，在实体显微镜下，用细胞刮器(Nunc公司USA)用手刮除(去除)上皮。另外，以光学以及电子显微镜操作(扫描型电子显微镜)确认用这种处理方法是否完全去除刮除了一层羊膜上皮。

1-5.海藻糖处理·冻干羊膜的制备

将去除了上皮的羊膜在10％(w/v)海藻糖溶液中在37℃浸渍2小时。海藻糖溶液是将海藻糖(Torehainochi，H plus V Lifescience公司、林原制)以蒸馏水稀释而制备的。溶液的pH保持在7～10的范围。将羊膜用一组灭菌后的塑料框夹持，之后以夹具固定。和框一起移入-80℃的低温冰箱内，待确认羊膜冻结后，使用真空冻干机(Yamato、NEOCOOL)进行冻干处理(-110℃、约1小时)。根据使用说明书，以能获得充分干燥体来进行条件设定。从框中将冻干处理后的羊膜取下，移入外侧为聚酰胺尼龙、内侧为聚乙烯所制成的双层结构的袋内，使用家用真空包装器(FLAME NUOVA、MAGIC VAC)进行真空包装。对如此获得的真空袋状态的羊膜进行γ射线照射(约25kGy)来灭菌。将灭菌处理后的羊膜直接以真空袋状态常温保存至即将使用时。另外，从保存开始经12个月，也能维持刚冻干后的状态。下面的实验使用常温保存一个月后的干燥羊膜。

2.海藻糖处理·冻干羊膜的物性评价

以上述顺序制备的海藻糖处理·冻干羊膜(也称作海藻糖处理FD-AM)在室温下浸渍于PBS至充分复元后，进行其物性评价。试验项目、试验方法如下。另外，将分别制备的五片海藻糖处理·冻干羊膜供给各试验，将得到的测定值的平均值用于评价。此外，准备未实施上皮处理、海藻糖处理以及冻干处理的羊膜(未加工羊膜)以及除了未实施海藻糖处理以外以同样顺序制备的冻干羊膜，作为物性评价的基准(比较对照)。

(1)厚度

用Keyence公司制的双扫描高精度激光测定器(LT-9010M)进行厚度的测定。

(2)透明度

使用日本电色社制造的浊度计(NDH2000)测定浊度，用于透明度的评价。浊度以下式计算。雾度(浊度)＝漫透射率(DF)/全光线透射率(TT)

(3)拉伸强度

拉伸强度的测定使用A&D公司制造的拉伸强度计(TensilonRTC-1210A)。

(4)柔软性

为了测定柔软性，使用Karlzeiss制、显微外科手术用显微镜以肉眼检测褶皱的存在。用3人分别测定在眼球整个面的范围内褶皱的个数，由其平均值评价柔软性。

试验结果如图3～图6所示。首先，如图3所示可知海藻糖处理·冻干羊膜比冻干羊膜厚。认为是由于经海藻糖处理后水分保持能力提高的缘故。另外，反映出去除上皮层的情况，即海藻糖处理·冻干羊膜比未加工羊膜(AM)还薄很多。

其次，如图4所示海藻糖处理·冻干羊膜比冻干羊膜的透明度高。如此，表明了海藻糖处理导致透明性提高这个令人惊讶的事实。与海藻糖处理·冻干羊膜相比，未加工羊膜的透明度差是由于上皮层的存在引起的。

另一方面，如图5所示，海藻糖处理·冻干羊膜比冻干羊膜的拉伸强度高。令人惊讶的是，即使与具备上皮的羊膜(未加工羊膜)相比，也是海藻糖处理·冻干羊膜的强度高。如此，就表明了海藻糖处理对于提高羊膜的强度是非常有效的。

并且，如图6所示，海藻糖处理·冻干羊膜的柔软性与冻干羊膜大为差异，和未加工羊膜是同等的。如此，海藻糖处理因提高羊膜的柔软性而非常有效。

3.海藻糖处理·冻干羊膜的活体适合性评价

对于移植于活体的材料的活体适合性要求高。因此，海藻糖处理·冻干羊膜的活体适合性按着以下顺序评价。

用手术刀由6周龄日本家兔的眼表面切入角膜实质层。继而，将修整为适当大小的海藻糖处理·冻干羊膜插入到实质层的切口内。在以上移植术后，经时观察眼表面的状态。刚移植完和移植后一个月眼表面的状态示于图7。在移植后一个月时，没有看到从周围新生血管，也没有炎症反应。并且，眼表面的透明性也比刚移植完显著提高了。从该结果判断，海藻糖处理·冻干羊膜的活体适合性与未处理的羊膜是同等的。

为了对活体适合性作更详细调查，在移植后一个月时，将包含移植部的角膜的一部分摘出进行HE染色。HE染色图像示于图8。移植片(即，海藻糖处理·冻干羊膜)用箭头指示。由图8所示，上皮的分化异常、角膜内血管新生、上皮浮肿、以及细胞浸润都没有看到。由该结果确认了海藻糖处理·冻干羊膜的抗原性极低、活体适合性优异。

4.使用海藻糖处理·冻干羊膜制备培养角膜上皮片

4-1.回收角膜上皮细胞

从6周龄的日本白色家兔采取的角膜浸渍于含有10％牛胎儿血清(FBS)的DMEM中，切除结膜、角膜内皮等不需要的组织。之后，将组织用磷酸缓冲液(PBS)清洗，在37℃下浸渍于含有1.2U/ml分散酶的(Nacalai tesque公司)的磷酸缓冲液(PBS)中1小时。取出处理后的组织，在室温下浸渍于0.02％EDTA中2分钟，接着在室温下浸渍于磷酸缓冲液中2分钟，使分散酶活性停止。在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中刮除角膜上皮细胞，之后经离心处理来浓缩、回收角膜上皮细胞。

4-2.制备共培养细胞

作为共培养细胞(支持细胞)，使用NIH-3T3细胞(以下简称“3T3细胞”)。将事先培养的长满75F烧瓶(BD Falcon公司)的3T3细胞在0.05％丝裂酶素C溶液中浸渍2小时，抑制3T3的增殖活性。接着，用磷酸缓冲液(PBS)清洗数次去除丝裂酶素C。用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液处理细胞后，移液操作制作细胞悬浊液(3T3细胞悬浊液)。

4-3.细胞层的形成

将在1.中得到的海藻糖处理·冻干羊膜在室温下浸渍于PBS中直至充分复元。将如此制备的人羊膜作为基质，将角膜上皮细胞和3T3细胞按以下的顺序进行共培养。培养器具使用6孔的培养皿(culture dish)(Corning公司，NY)和培养嵌套(培养插入容器)(聚碳酸酯制、平均孔径尺寸3.0μm、Corning公司，NY)。

首先，在培养皿上以约1×10⁴个/cm²的细胞密度播种3T3细胞悬浮液，在37℃、5％CO₂的条件下培养。此外，在培养嵌套上将基底膜侧(存在上皮的一侧)朝上贴附羊膜，在室温下干燥10分钟。其后，在贴附羊膜的培养嵌套上以约1×10⁵个/cm²的细胞密度播种角膜上皮细胞悬浮液。

以上操作后，如图9所示，在培养皿内设置培养嵌套，在同一个培养基中培养3T3细胞以及角膜上皮细胞。另外，图9是表示培养中的状态的剖面模式图。培养嵌套12静置于培养皿11内，在培养皿11底面形成3T3细胞层15。此外，还显示了如下状态：在培养嵌套12的底面上静置羊膜13，在其上培养有角膜上皮细胞14。符号16为培养基。

使用如下培养基：在DMEM/Ham’s F12混合培养基(混合体积比1∶1)中添加10％FBS、胰岛素(5mg/ml)、霍乱毒素(0.1nM)、青霉素-链霉素(50IU/ml)、人重组上皮细胞生长因子(EGF)(10ng/ml)。

在上述的培养基中培养了3周(Submerge)。之后，为了分化诱导粘膜上皮，利用所谓的空气上举(Air-lifting)法培养一周。所谓空气上举法是将培养基的液面达到细胞层面为止，把该细胞层的表面暴露在空气中的方法，所述细胞层面是在羊膜上形成的角膜上皮细胞来源的细胞层面。Submerge中隔天更换培养基，空气上举后每天更换培养基进行培养。其结果是在羊膜上形成细胞层。

5.培养角膜上皮片的组织学特征的验证

空气上举后在培养2天时，形成了近似于角膜上皮的细胞层(图10右栏)。可知细胞层与正常角膜上皮同样细胞多层化为5～7层。在该细胞层的羊膜侧存在类圆柱形的类似基底细胞的细胞群。并且，最表层的细胞呈扁平形但具有核，与皮肤不同其表面没有角化。如此确认羊膜上形成了类似角膜上皮的细胞层(角膜上皮样层)。另外，以未进行海藻糖处理而冻干的羊膜(冻干羊膜)作为基质，同样地进行角膜上皮细胞培养时，虽然形成了细胞层，但是只看到1～2层的多层化(图10左栏)。由上述事实可以说，实施了海藻糖处理的冻干羊膜发挥了促进角膜正常分化的功能。

其次，为了进一步研究细胞层的组织学特性进行免疫染色。首先，将得到的细胞层与羊膜一起切成适当的大小，冻结包埋于OCT化合物中。之后，用冷冻切片机进行薄切，制作载物切片。在进行免疫染色时，对作为代表性的细胞骨架蛋白的角蛋白相关内容进行研究。即，检查角膜特异性角蛋白3、表皮特异性角蛋白10以及结膜特异性角蛋白13的表达。方法如下：以磷酸缓冲液(PBS)清洗载物切片后，用1％胎牛血清(FBS)进行封闭，抑制非特异性抗体反应。然后，在室温下使对于各角蛋白的抗体(一次抗体)反应1小时。反应后，以含有triton-X的PBS在15分钟、3次的条件下进行洗涤，接着在室温下使荧光标记抗体(2次抗体)反应1小时。反应后，用磷酸缓冲液(PBS)在15分钟、3次的条件下进行洗涤，封入后用共聚焦显微镜观察组织。

对细胞层的各种角蛋白的抗体反应如下。首先都未看到对表皮特异性角蛋白10以及结膜特异性角蛋白13的染色性(图11下边)。另一方面，在大范围内看到对角膜特异性角蛋白3的染色性(图11右上边)。对角蛋白3的染色性在细胞层的上部强。从以上结果可确认形成了近似于正常角膜上皮的上皮细胞层。

6.使用培养角膜上皮片的移植实验

使用4.制作的、在羊膜上形成有角膜上皮样细胞层的片(培养角膜上皮片)进行以下的移植实验。

首先，对家兔进行角膜上皮细胞的采取，使用月型刀从距离缘部4mm的外侧将角膜和结膜上皮以100μm的厚度全部去除。通过该操作，由于含有角膜上皮干细胞的上皮细胞消失，所以可认为再现了人为的眼表面干细胞缺乏症。

接着，将培养角膜上皮片移植到缘部偏内侧的区域。移植时使用10-0尼龙线缝合周围组织。移植后，在移植片上缝上治疗用软性隐形眼镜。术后，涂上抗生素和类固醇眼用软膏2次/日。在移植后的时间点，显示出与移植前的培养角膜上皮片同样的透明度。

在移植后2天以及14天观察实施移植术的眼表面。并且，实施荧光素染色试验。另外，荧光素染色试验如下进行：使荧光素试纸含抗生素的眼药等水分，并直接涂于眼表面，使之眨眼2、3次后，观察眼表面的荧光素染色性。如果角膜上皮残存，则由于其紧密的细胞间粘附结构而荧光色素不浸润，未见到由荧光素引起的染色。

在移植后2天，眼表面维持透明性(图12左上边)。另外，通过荧光素染色，确认了培养角膜片无缺损地残存在眼表面(图12左下边)。另一方面，移植的培养角膜上皮片未显示荧光素染色性，由此确认了培养角膜上皮片具备角膜上皮同样的屏障功能。另外，在移植的培养角膜上皮片周围的周边范围看到了荧光素染色性，确认了存在于移植部的组织没有污染周围残存的结膜上皮。

另外，对于一般的角膜上皮而言，细胞之间以紧密粘附结构结合，因此荧光色素不会浸润其表面。即，在荧光素染色试验中不显示染色性。另一方面，当细胞间的粘附松弛，细胞自身剥离屏障功能受损时，发生荧光色素浸润而将组织染色。因此，通过检查由荧光素染色引起的染色性，可以确认移植的培养角膜上皮片是否具有与角膜上皮同样的屏障功能。

另一方面，即使是在移植后14天培养角膜上皮片仍残存于眼表面，并且与移植后2天的状态比较向周围扩展，被覆了眼表面整体(图12右上边)。并且，眼表面未显示荧光素染色性，确认了培养角膜上皮片维持了屏障功能(图12右下边)。就透明性而言，与移植后2天的时间点比较无变化，依然维持高透明性(图12右上边)。

由以上结果证实了：将海藻糖处理·冻干羊膜作为基质得到的培养角膜上皮片具备对眼表面良好的成活性，其经长期仍能维持。并且，还确认了在移植后向周围扩展，同时在长时间发挥作为角膜上皮所必需的屏障功能，并且维持高透明性。即，确认了：用上述方法得到的培养角膜上皮片作为角膜上皮的替代发挥着良好功能，并且可适合用作在角膜损伤、缺损等情况下再建眼表面的移植材料。

7.移植后的培养角膜上皮片的组织学特性评价

然后，将移植后2周的培养角膜上皮片摘出，研究其组织学特性。在图13的左上边显示了培养角膜上皮片的HE染色图像。可以确认在海藻糖处理·冻干羊膜(TH-AM、记号^＊＊)上，与正常角膜上皮同样，细胞是规则整齐排列而构成的细胞层。该细胞层越往上层扁平形状的细胞越多，维持了极其近似于角膜上皮的结构。

在图13的右上边以及下边，显示了对各种角蛋白染色试验的结果。大体上，显示与移植前的培养角膜上皮片同样的染色性。即，都没有见到对表皮特异性角蛋白10以及结膜特异性角蛋白13的染色性(图13下边)；在细胞层整体看到了对角膜特异性角蛋白3的染色性(图13右上边)。如上述确认了即使在移植培养角膜上皮片后，也维持了角膜特异性的角蛋白。其结果是，从组织学的观点强有力地支持了培养角膜上皮片在长时间发挥着与角膜上皮同样的功能。

8.对基底膜成分以及致密层成分的免疫染色

为了使羊膜良好地作为细胞培养用的基质而发挥作用，认为优选基底膜和致密层保持其本来的结构。基底膜和致密层是否保持其本来的结构，可以通过分别对其有无特征成分(是否残存)进行检查而评价。因此，以下面所示的免疫染色法来检查海藻糖处理·冻干羊膜中是否残存基底膜成分和致密层成分。另外，以未进行上皮处理、海藻糖处理以及冻干处理的羊膜(未加工羊膜)以及除了未进行海藻糖处理以外与海藻糖处理·冻干羊膜同样的方法制备的羊膜(冻干羊膜)作为比较对象。

首先，将各羊膜分别切成1.5×1.5cm的大小，用OCT化合物进行包埋，在-80℃冻结制成冻结标本。将该标本直接以冻结状态使用冷冻切片机(CM1900 Leica公司制)以厚度8μm在垂直方向对着羊膜面切下，固定于载玻片上制作冻结切片。使用该切片以下面的顺序进行免疫染色。

1.丙酮固定5分钟、2.PBS清洗30分钟、3.利用PBS/3％BSA进行封闭15分钟、4.一次抗体1小时、5.PBS清洗30分钟、6、利用PBS/3％BSA进行封闭15分钟、7.二次抗体1小时、8.PBS清洗30分钟、9.封入。

在荧光显微镜(Leica DMIRB)下观察封入后的样品。

另外，所使用的抗体如下，应用量遵从各制造商的操作指南。

胶原I(collagen I)：LSL LB-1190；胶原III(collagen III)：LSLLB1300；胶原IV(collagen IV)：LSL LB-1407；胶原V(collagen V)：LSLLB1581；胶原VII(collagen VII)：Chemicon MAB1345；层粘连蛋白5(Laminin-5)：Chemicon MAB19562；纤连蛋白(fibronectin)：LSLLB-1021。

在羊膜基底膜层有胶原IV、VII、层粘连蛋白5表达，在致密层有胶原I、III、V、纤连蛋白表达。为此，通过进行各抗体的免疫染色能够观察羊膜基底膜以及致密层的残存。并且，在本实验中还进行PI染色，因此也可同时辨别羊膜上皮细胞的有无。

免疫染色的结果如图14所示。A列为未加工羊膜的染色图像、B列为冻干羊膜的染色图像、C列为海藻糖处理·冻干羊膜的染色图像。各列中从上开始按顺序为(1)胶原I的染色图像；(2)胶原III的染色图像；(3)胶原IV的染色图像；(4)胶原V的染色图像；(5)胶原VII的染色图像；(6)层粘连蛋白5的染色图像；(7)纤连蛋白的染色图像。

由染色结果表明以下事项。首先，相比于冻干羊膜，海藻糖处理·冻干羊膜的基底膜成分(胶原IV、胶原VII、层粘连蛋白5)的信号强，即基底膜成分所涉及的染色性近似于未加工羊膜的染色性。这个事实暗示着海藻糖处理·冻干羊膜高度保持了基底膜本来的结构。

在一部分的染色结果(胶原IV、纤连蛋白)中，冻干羊膜在整体确认了染色性，而海藻糖处理·冻干羊膜与未加工羊膜同样，染色的部位和未染色的部位的边界比较明确。这个事实暗示着海藻糖处理·冻干羊膜高度保持了基底膜和致密层各自的本来结构。

由致密层所涉及的染色结果可知，海藻糖处理·冻干羊膜的致密层比冻干羊膜的致密层厚。由上述事实可知：通过实施海藻糖处理在回到至湿润状态时，致密层良好地膨润，恢复至接近于未加工羊膜的厚度。

如上述表明了海藻糖处理·冻干羊膜的基底膜和致密层的结构近似于未加工羊膜的基底膜和致密层结构。即，确认了通过实施海藻糖处理，能防止在冻干时基底膜和致密层结构的损伤，并且可获得具备近似于未加工羊膜的结构的基底膜和致密层的羊膜。

9.上皮去除法的研究

以图15所示的顺序处理羊膜，制备上皮去除后的羊膜(不含上皮羊膜)。以下，详细说明各步骤的操作方法(处理方法)、操作条件(处理条件)等。

9-1.羊膜的采取

对于没有全身合并症的准备剖腹产的孕妇事先会同妇产科医生进行认真的说明、取得同意后，在手术室剖腹产时采取羊膜。操作要注意清洁，按手术操作洗手后穿上手术袍。分娩前准备清洁的采取羊膜用搪瓷盘和清洗用生理盐水。分娩后将胎盘组织移到搪瓷盘上，用手把羊膜组织从胎盘剥离。羊膜与胎盘的粘连牢固的部分用剪刀切除。

9-2.血液成分的去除、绒毛膜的剥离

首先，用生理盐水边清洗边去除附着于所采取的羊膜上的血液成分，再用足量的生理盐水(添加0.005％氧氟沙星)清洗。接着，用手去掉粘附于羊膜的绒毛膜。

9-3.羊膜的固定

以图2b所示的方法固定羊膜。首先，上皮侧朝上将羊膜放在已灭菌的氟树脂片上。之后，以不变得褶皱、松弛的状态拉伸羊膜，将已灭菌的氟树脂片框放在羊膜上。用夹具等固定氟树脂片和氟树脂片框。由此，羊膜就成为被氟树脂片和氟树脂片框夹持的状态(框固定)。将向外侧伸出的多余部分的羊膜切下来。在实体显微镜下观察，确认上皮侧是朝上的。

9-4.冻融处理

将框固定的羊膜移入-80℃的低温冰箱内，放置约30分钟(冻结)。从低温冰箱中取出后，移入37℃的培养箱内，放置约30分钟(融解)。再进行一次以上操作。

9-5.胰蛋白酶处理

冻融处理后，将羊膜的上皮侧浸渍于胰蛋白酶溶液(0.02％胰蛋白酶、含0.2mM EDTA的磷酸缓冲液)，放置约15分钟(37℃)。浸渍方法采用图16a所示的方法。即，在保持被框固定的羊膜10在氟树脂片4朝下面的状态下，将胰蛋白酶溶液5加到氟树脂片框3内。由此，仅是羊膜10的上皮部分浸渍于胰蛋白酶溶液5中。另外，如图16b所示，将框固定的羊膜10，以其上皮侧朝下的状态放入容器6内，由此也可以实施向胰蛋白酶溶液5的浸渍。在该例中，设置于容器6内侧的突起7卡住氟树脂片框3，由此实现了胰蛋白酶溶液5的液面5a和羊膜10处于所期望的位置关系。

9-6.清洗

将胰蛋白酶处理后的羊膜从氟树脂片和氟树脂片框取下移入PBS中，使其振荡来进行清洗(140rpm 15分钟2次)。通过该操作，去除胰蛋白酶溶液以及羊膜上皮细胞。

9-7.冻干

将清洗后的羊膜用一组灭菌后的塑料框夹持，之后以夹具固定。和框一起移入-80℃的低温冰箱内，待确认羊膜冻结后，使用真空冻干机(Yamato、NEOCOOL)进行冻干处理(-110℃、约1小时)。根据使用说明书，以能获得充分干燥体来进行条件设定。由塑料框将冻干处理后的羊膜取下，移入外侧为聚酰胺尼龙、内侧为聚乙烯所制成的双层结构的袋内，使用家用真空包装器(FLAEM NUOVA、MAGIC VAC)进行真空包装。对如此获得的真空袋状态的羊膜进行γ射线照射(约25kGy)进行灭菌。将灭菌处理后的羊膜直接以真空袋状态常温保存至即将使用时。

9-8.利用冻融处理以及胰蛋白酶处理的上皮去除法的评价

用以下手法评价上述的羊膜上皮去除法。评价实验中使用胰蛋白酶处理后，清洗得到的不含上皮的羊膜(胰蛋白酶处理羊膜)。

(1)HE染色

按着下面的顺序将不含上皮的羊膜(胰蛋白酶处理羊膜)进行HE染色。另外，将未去除上皮的羊膜(未加工羊膜)和用手去除上皮的羊膜(用手处理的羊膜)作为比较对象。

首先，将不含上皮的羊膜(胰蛋白酶处理羊膜)、未加工羊膜、用手去除上皮的羊膜(用手处理的羊膜)分别切成1.5×1.5cm的大小，用OCT化合物进行包埋，在-80℃冻结制成冻结标本。将该标本直接以冻结状态使用冷冻切片机(CM1900 Leica公司制)在垂直方向对着羊膜面以厚度8μm切下，固定于载玻片上制作冻结切片。

HE染色的顺序以及条件如下。1.10％福尔马林5分钟、2.流水清洗15分钟、3.苏木精溶液10秒、4.流水清洗15分钟、5.曙红溶液10秒、6.流水清洗15分钟、7.70％乙醇10秒、8.90％乙醇10秒、9.95％乙醇10秒、10.100％乙醇10秒、11.100％二甲苯10秒、12.100％二甲苯30分钟、13.封入。

在光学显微镜(奥林巴斯BX50)下观察封入后的样品。

使用羊膜以苏木精进行染色时，羊膜上皮细胞和致密层有核细胞被染色。另一方面，以曙红进行染色时，致密层被染色。因此，根据HE染色可辨别上皮细胞有无剥离、致密层有无损伤。

HE染色结果示于图17。在未加工羊膜中能确认细胞层(上皮)。在经胰蛋白酶处理羊膜中未观察到与用手处理的羊膜同样的细胞层(上皮)。由该结果可确认根据上述方法可以将上皮完全地、并且均匀地去除。并且，未看到有致密层的损伤。

(2)对基底膜成分和致密层成分的免疫染色

为了良好地发挥出作为细胞培养用基质的作用，认为除了完全去除上皮层以外，还优选使基底膜和致密层保持其本来的结构。可以通过分别对其特征性成分有无(是否残存)的检查来评价基底膜和致密层是否维持了结构。因此，对于胰蛋白酶处理羊膜而言，以下面显示的免疫染色法来检查是否残存基底膜成分和致密层成分。另外，和HE染色的情况相同地，将未去除上皮的羊膜(未加工羊膜)和用手去除上皮的羊膜(用手处理的羊膜)作为比较对象。

羊膜冻结切片的制作方法和HE染色的情况相同。使用该切片按着以下的顺序进行免疫染色。

1.丙酮固定5分钟、2.PBS清洗30分钟、3.利用PBS/3％BSA进行封闭15分钟、4.一次抗体1小时、5.PBS清洗30分钟、6、利用PBS/3％BSA进行封闭15分钟、7.二次抗体1小时、8.PBS清洗30分钟、9.封入。

在荧光显微镜(Leica DMIRB)下观察封入后的样品。

另外，所使用的抗体如下，应用量遵从各制造商的操作指南。

胶原I(collagen I)：LSL LB-1190；胶原III(collagen III)：LSLLB1300；胶原IV(collagen IV)：LSL LB-1407；胶原V(collagen V)：LSLLB1581；胶原VII(collagen VII)：Chemicon MAB1345；层粘连蛋白5(Laminin-5)：Chemicon MAB19562；纤连蛋白(fibronectin)：LSLLB-1021。

在羊膜基底膜层有胶原IV、VII、层粘连蛋白5表达，在致密层有胶原I、III、V、纤连蛋白表达。为此，通过进行各抗体的免疫染色能够观察羊膜基底膜以及致密层的残存。并且，在本实验中还进行PI染色，因此也可同时辨别羊膜上皮细胞的有无。

免疫染色的结果如图18～图21所示。图18和19为胰蛋白酶处理的羊膜的免疫染色图像、图20为未加工羊膜(有上皮)的免疫染色图像、图21为用手处理的羊膜的免疫染色图像。将免疫染色的结果汇总后的表示于图22中。从这些结果可知，在胰蛋白酶处理的羊膜中，还残存着与用手处理的羊膜同等程度的基底膜成分、致密层成分。即，依照上述处理方法，能够残存与以往用手处理方法同等的基底膜成分和致密层成分。

9-9.总结

由以上的实验结果可确认：用组合了冻融处理和胰蛋白酶处理的方法处理羊膜，可以使羊膜的基底膜和致密层基本上没有损伤(即以良好地保持本来结构的状态)地、完全地去除上皮。

产业上的可应用性

本发明的片状组合物作为组织再建用移植材料、抗粘连剂等用于广泛的领域。作为本发明的片状组合物的适用领域，可示例眼科领域、消化器外科领域、妇科领域、皮肤科领域。

本发明不限于上述发明的实施方式及实施例的说明。在不超出所要求保护范围的记载、且是本领域技术人员能容易想到的范围内，各种变形方式都包括在发明中。

本说明书中写明的论文、公开专利公报及专利公报等的内容，通过援引其全部内容而引用。

Claims (29)

1.一种片状组合物，具备附加了海藻糖的羊膜而成。

2.根据权利要求1所述的片状组合物，是冻结状态或者干燥状态。

3.根据权利要求2所述的片状组合物，是冻干状态。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的片状组合物，所述羊膜是去除了上皮细胞层的羊膜。

5.根据权利要求4所述的片状组合物，所述羊膜残存有作为基底膜成分的胶原IV、胶原VII、以及层粘连蛋白5。

6.根据权利要求4所述的片状组合物，所述羊膜是人羊膜。

7.根据权利要求1～3中任一项所述的片状组合物，在所述羊膜上形成含有活体来源的细胞的细胞层。

8.根据权利要求4所述的片状组合物，在所述羊膜上形成含有活体来源的细胞的细胞层。

9.根据权利要求5所述的片状组合物，在所述羊膜上形成含有活体来源的细胞的细胞层。

10.根据权利要求6所述的片状组合物，在所述羊膜上形成含有活体来源的细胞的细胞层。

11.根据权利要求7所述的片状组合物，在所述细胞层中所述活体来源的细胞是多层化的。

12.根据权利要求7所述的片状组合物，所述活体来源的细胞是来源于角膜上皮、结膜上皮、皮肤表皮、毛囊上皮、口腔粘膜上皮、虹膜色素上皮、视网膜色素上皮、呼吸道粘膜上皮或者肠管粘膜上皮的细胞。

13.根据权利要求7所述的片状组合物，所述细胞层是由多层化为5～7层的细胞构建的，并且具备角膜上皮的性质。

14.根据权利要求1～3中任一项所述的片状组合物，作为抗粘连用材料、或者作为由于手术侵害导致的脏器或器官的表面组织损害的再建用材料而使用。

15.根据权利要求1～3中任一项所述的片状组合物，在所述羊膜的绒毛膜侧的表面附着有粘附成分。

16.根据权利要求15所述的片状组合物，所述粘附成分为纤维蛋白原及凝血酶。

17.根据权利要求15所述的片状组合物，所述粘附成分为纤维蛋白原、凝血酶和抑肽酶。

18.根据权利要求1～3中任一项所述的片状组合物，用活体吸收性材料被覆所述羊膜的绒毛膜侧的表面。

19.一种片状组合物的制作方法，包括以下步骤：

(a)制备羊膜的步骤；

(b)向所述羊膜附加海藻糖的步骤。

20.根据权利要求19所述的制作方法，还包括以下步骤：

(c)在步骤b之后进行冻结处理或干燥处理的步骤。

21.根据权利要求20所述的制作方法，还包括以下步骤：

(d)在步骤c之后进行灭菌处理的步骤。

22.根据权利要求19～21中任一项所述的制作方法，所述步骤a包括以下步骤：

(a1)从羊膜去除上皮的步骤。

23.根据权利要求22所述的制作方法，所述步骤a1包括以下步骤：

(1)准备由活体分离的羊膜的步骤；

(2)对所述羊膜实施冻融处理的步骤；

(3)对冻融处理后的羊膜实施胰蛋白酶处理的步骤；

(4)清洗胰蛋白酶处理后的羊膜的步骤。

24.根据权利要求23所述的制作方法，其特征在于，在所述冻融处理中，冻结温度为-20℃～-80℃，融解温度为4℃～50℃。

25.根据权利要求23或24所述的制作方法，其特征在于，所述冻融处理反复实施2次以上。

26.根据权利要求23或24所述的制作方法，其特征在于，使用胰蛋白酶浓度为0.01％～0.05％的胰蛋白酶溶液实施所述胰蛋白酶处理，所述胰蛋白酶浓度为质量体积浓度。

27.根据权利要求26所述的制作方法，其特征在于，所述胰蛋白酶溶液含有0.1mM～0.6mM的从EDTA、NTA、DTPA、HEDTA、GLDA以及它们的任意组合中选择的螯合剂。

28.根据权利要求23或24所述的制作方法，其特征在于，在胰蛋白酶溶液仅接触羊膜上皮侧的条件下，实施所述胰蛋白酶处理。

29.根据权利要求20所述的制作方法，在步骤b之后实施以下的步骤：

(A)在所述羊膜上形成含有活体来源的细胞的细胞层。

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