NL1019308C2 - Werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen. - Google Patents

Werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen. Download PDF

Info

Publication number
NL1019308C2
NL1019308C2 NL1019308A NL1019308A NL1019308C2 NL 1019308 C2 NL1019308 C2 NL 1019308C2 NL 1019308 A NL1019308 A NL 1019308A NL 1019308 A NL1019308 A NL 1019308A NL 1019308 C2 NL1019308 C2 NL 1019308C2
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
nucleotide sequence
selection
cell
trehalose
transformed
Prior art date
Application number
NL1019308A
Other languages
English (en)
Inventor
Josephus Christianus Smeekens
Henriette Schluepmann
Original Assignee
Stichting Tech Wetenschapp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to NL1019308A priority Critical patent/NL1019308C2/nl
Application filed by Stichting Tech Wetenschapp filed Critical Stichting Tech Wetenschapp
Priority to JP2003542623A priority patent/JP4413615B2/ja
Priority to CA002466088A priority patent/CA2466088A1/en
Priority to AT02781311T priority patent/ATE317446T1/de
Priority to ES02781311T priority patent/ES2258655T3/es
Priority to EP02781311A priority patent/EP1442126B1/en
Priority to CNB028231279A priority patent/CN100560726C/zh
Priority to DE60209137T priority patent/DE60209137T2/de
Priority to US10/494,651 priority patent/US7449290B2/en
Priority to IL16177302A priority patent/IL161773A0/xx
Priority to DK02781311T priority patent/DK1442126T3/da
Priority to NZ532720A priority patent/NZ532720A/en
Priority to PCT/EP2002/012478 priority patent/WO2003040377A1/en
Priority to PT02781311T priority patent/PT1442126E/pt
Application granted granted Critical
Publication of NL1019308C2 publication Critical patent/NL1019308C2/nl
Priority to ZA200403307A priority patent/ZA200403307B/en
Priority to IL161773A priority patent/IL161773A/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01028—Alpha,alpha-trehalase (3.2.1.28)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

WERKWIJZE VOOR HET SELECTEREN VAN GENETISCH GETRANSFORMEERDE CELLEN
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op 5 een werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen.
Het is bekend dat, wanneer genetisch materiaal in een populatie van cellen wordt geïntroduceerd door middel van transformatie, slechts een aantal van de 10 cellen succesvol zal worden getransformeerd. De getransformeerde cellen moeten na transformatie uit een populatie van getransformeerde en niet-getransformeerde cellen worden geïdentificeerd en geselecteerd. Hiertoe wordt derhalve in het algemeen, naast het gewenste 15 transgen, ook een selectiegen in de cel geïntroduceerd. Het selectiegen codeert daarbij bijvoorbeeld voor een eigenschap waarmee de genetisch getransformeerde cellen kunnen worden geïdentificeerd. Voorbeelden van dergelijke selectiegenen zijn bijvoorbeeld genen die coderen voor 20 resistentie tegen antibiotica of herbiciden. Na de transformatie wordt de populatie van getransformeerde en niet-getransformeerde cellen in contact gebracht met het voor de niet-getransformeerde ("wild-type") cellen toxische antibioticum of herbicide, zodat alleen de 25 getransformeerde cellen, door de aanwezigheid van het geïntroduceerde selectiegen, in staat zijn te overleven en te groeien.
Het gebruik van dergelijke selectiegenen die coderen voor antibioticum- of herbicide-resistentie is 30 echter in het algemeen niet gewenst voor transgene gewassen die op grote schaal in het milieu worden gebracht, en in het bijzonder in voedingsgewassen. Een ander nadeel van een dergelijk selectiemechanisme is verder bijvoorbeeld dat de niet-getransformeerde cellen 35 in het algemeen zullen afsterven, en bovendien dat, wanneer de populatie van cellen een coherent weefsel van cellen of een geheel organisme betreft, ook de getransformeerde cellen kunnen afsterven, als gevolg van * 2 bijvoorbeeld door de afstervende niet-getransformeerde cellen uitgescheiden schadelijke verbindingen.
Het doel van onderhavige uitvinding is het verschaffen van een werkwijze voor het selecteren van S getransformeerde cellen uit een populatie van getransformeerde en niet-getransformeerde cellen, waarbij de hiervoor genoemde nadelen worden opgeheven.
Dit doel wordt door de uitvinding bereikt door het verschaffen van een werkwijze omvattende: 10 a) het in een cel introduceren van ten minste een gewenste nucleotidensequentie en ten minste een selectie-nucleotidensequentie voor het verkrijgen van een genetisch getransformeerde cel, waarbij de selectie-nucleotidensequentie 15 een gebied omvat dat codeert voor een eiwit dat betrokken is bij het metabolisme van trehalose; b) het in contact brengen van een populatie met getransformeerde en niet-getransformeerde cellen met trehalose en/of derivaat hiervan; en 20 c) het selecteren van de getransformeerde cellen uit de populatie op basis van het vermogen van de getransformeerde cellen het trehalose en/of derivaat te metaboliseren.
Trehalose is het a-1,1-disaccharide van 25 glucose, dat wordt geproduceerd door vele organismen, waaronder bacteriën, gisten en fungi, alsmede enkele hogere planten. Het is het belangrijkste bloedsuiker in insecten. Trehalose wordt onder meer in toenemende mate gebruikt voor de bereiding van vaccins en in 30 orgaantransplantatieprotocoilen doordat het bescherming biedt tegen eiwitdenaturatie en membraanbeschadiging.
Cellen, in het bijzonder plantencellen, kunnen gewoonlijk niet ontwikkelen in een medium waarin een verhoogde concentratie trehalose aanwezig is zonder dat 35 een andere metaboliseerbare koolstofbron aanwezig is. In de werkwijze volgens de uitvinding wordt hiervan gebruik gemaakt voor het selecteren van getransformeerde cellen. Hiertoe worden de cellen, behalve met het gewenste 3 transgen, tevens getransformeerd met een selectie-nucleotidensequentie, waarbij de selectie-nucleotidensequentie een gebied omvat dat codeert voor een eiwit dat betrokken is bij het metabolisme van 5 trehalose. Vervolgens wordt een populatie met getransformeerde en niet-getransformeerde cellen met trehalose en/of een derivaat hiervan in contact gebracht, bijvoorbeeld door trehalose en/of derivaat hiervan aan het kweekmedium toe te voegen. De getransformeerde cellen 10 onderscheiden zich dus behalve door het betreffende geïntroduceerde transgen van de niet-getransformeerde cellen door de aanwezigheid van een nucleotidensequentie in hun genoom die codeert voor een eiwit dat het trehalose kan metaboliseren. Hierdoor zullen de 15 getransformeerde cellen wel in staat zijn te overleven en te groeien in het medium met trehalose en/of derivaat van trehalose, terwijl de niet-getransformeerde cellen niet verder zullen ontwikkelen. De getransformeerde cellen kunnen op deze wijze dus uit de totale populatie van 20 cellen worden geselecteerd op basis van hun vermogen het trehalose en/of derivaat te metaboliseren.
De term "eiwit dat betrokken is bij het metabolisme van trehalose" heeft hierbij betrekking op een eiwit, bijvoorbeeld een enzym, dat in staat is 25 trehalose en/of het derivaat hiervan af te breken, en daardoor de concentratie van trehalose en/of derivaat te verlagen.
De term "derivaat van trehalose" heeft betrekking op gemodificeerde vormen van trehalose, die 30 ook door het betreffende eiwit kunnen worden gemetaboliseerd en dezelfde response in de cellen induceren als trehalose, zoals bijvoorbeeld gemethyleerde of gehalogeneerde vormen van trehalose.
In een voorkeursuitvoeringsvorm van de 35 werkwijze volgens de uitvinding omvat de geïntroduceerde selectie-nucleotidensequentie een gebied dat codeert voor een intracellulair eiwit met trehalase-aciviteit, dat wil zeggen een enzym dat in staat is intracellulair trehalose 4 en/of derivaat hiervan te hydrolyseren tot glucose. Door de aanwezigheid van dit eiwit in de getransformeerde cellen, en de afwezigheid daarvan in de niet-getransformeerde cellen, zullen alleen de 5 getransformeerde cellen in staat zijn het trehalose en/of derivaat dat de cel binnenkomt af te breken. Hierdoor wordt de intracellulaire concentratie van het trehalose in de getransformeerde cellen verlaagd, terwijl het vrijkomende glucose bovendien door de getransformeerde 10 cellen kan worden gebruikt als extra voedingsbron.
Vele cellen, in het bijzonder cellen van hogere planten, zoals Glycine max, en Arabidoosis thaliana bezitten in hun genoom het gen voor een endogeen trehalase (Aeschbacher R.A. et al., Plant Physiol.
15 119(2): 489-496, 1999; Mueller et al. Plant Physiol.
125(2) : 1086-1093, 2001) . Deze endogene trehalase-genen coderen echter in het algemeen voor een extracellulair trehalase, dat in de cel niet actief is. Het is mogelijk dergelijke endogene genen met behulp van standaard 20 moleculair biologische technieken te modificeren. In een voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding omvat de selectie-nucleotidensequentie derhalve een gemodificeerd endogeen trehalase-gen dat codeert voor een intracellulair actief trehalase. Hierbij 25 wordt het endogene trehalase-gen zodanig gemodificeerd dat het trehalase dat tot expressie wordt gebracht intracellulair actief is, zoals bijvoorbeeld door het inactiveren van het eiwit-secretiesignaal via deletie of mutagenese, door verandering van de eiwit targetting 30 sequenties, of van de pH gevoeligheid van de enzymatisch actieve site.
In een bijzonder geschikte uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding omvat de geïntroduceerde selectie-nucleotidensequentie het TreF 35 gen uit E. coli (Horlacher R. et al., J. Bacteriol. 178(1): 6250-6257, 1996). Dit gen is eenvoudig te isoleren en met behulp van standaard moleculair biologische technieken in diverse cellen te introduceren.
5
In een andere voordelige uitvoeringsvorm van de uitvinding omvat de selectie-nucleotidensequentie hét AtTREl gen uit Arabidopsis (Locus At4G24040, AGI nr. 2134960).
5 De werkwijze volgens de uitvinding omvat bij voorkeur verder het voor of tijdens stap b) tevens in contact brengen van de populatie van cellen met ten minste een remmer van endogeen extracellulair trehalase. Door het eventueel aanwezige endogene extracellulaire 10 trehalase te remmen wordt voorkomen dat het trehalose uit het medium reeds buiten de cellen geheel of gedeeltelijk wordt afgebroken waardoor ook de niet-getransformeerde cellen in staat zullen verder te ontwikkelen.
Voorbeelden van geschikte remmers voor gebruik 15 in de werkwijze volgens de uitvinding zijn suidatestrine en een gemodificeerde vorm van het pseudo-oligosaccharide antibioticum validamycine (Asano N. et al., J. Antibiot. 40(4): 526-532, 1987; Goddijn O.J. et al., Plant Physiol. 113(1): 181-190, 1997; Knuesel I. et al., Comp. Biochem. 20 Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 120(4): 639-646, 1998).. Het validamycine dient hierbij zodanig te zijn gemodificeerd dat het niet meer de cel kan binnengaan.
Ook andere verbindingen die de activiteit van endogeen extracellulair trehalase remmen en niet in de cel worden 25 opgenomen kunnen echter volgens de uitvinding worden gebruikt.
Met de term "populatie van cellen" wordt volgens de uitvinding bedoeld een populatie van individuele cellen, maar ook cellen in weefsels en 30 organen of gedeelten daarvan; of cellen in gehele organismen, zoals bijvoorbeeld planten, waarbij de gehele planten of gedeelten daarvan uit de genetisch getransformeerde cellen kan bestaan.
De werkwijze volgens de uitvinding wordt bij 35 voorkeur gebruikt voor het selecteren van genetisch gemodificeerde plantencellen. Zaailingen van bijvoorbeeld Arabidopsis kunnen niet verder ontwikkelen op media die verhoogde concentraties van trehalose bevatten. Zaden 1 6 zullen wel ontkiemen, maar het vormen van een uitgebreid wortelstelsel, en de ontwikkeling van het eerste bladstadium wordt door de aanwezigheid van trehalose geremd. Doordat de genetisch getransformeerde planten, 5 door de introductie van de select ie-nucleotidensequentie, in staat zijn een trehalase tot expressie te brengen, in het bijzonder in het cytoplasma van de cel, kan het trehalose dat de cel binnenkomt worden afgebroken tot glucose. Het glucose kan vervolgens als voedingsbron voor 10 de plant worden gebruikt. De genetisch getransformeerde plantjes zullen zich derhalve verder ontwikkelen terwijl de ontwikkeling van de niet-getransformeerde plantjes achterblijft. Wanneer de werkwijze volgens de uitvinding wordt gebruikt voor het selecteren van genetisch 15 getransformeerde cellen in planten, kunnen de getransformeerde planten eenvoudig visueel worden geïdentificeerd.
De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding verschaft derhalve een eenvoudig, milieuvriendelijk 20 selectiesysteem voor getransformeerde cellen, in het bijzonder voor genetisch getransformeerde planten. Trehalose is een eenvoudig en relatief goedkoop te produceren verbinding, die bovendien niet-toxisch is gebleken voor mens en dier. Zo heeft de mens reeds lange 25 tijd grote hoeveelheden trehalose geconsumeerd in producten van gist - fermentatie, zoals brood en bier, en worden mens en dier continu aan trehalose blootgesteld door de aanwezigheid van trehalose-producerende microben in de darmflora.
30 Volgens de uitvinding kan elke nucleotidensequentie die codeert voor een eiwit met trehalase-activiteit worden gebruikt als selectie-nucleotidensequentie in de genetisch getransformeerde cellen. Er kan bijvoorbeeld gebruik worden gemaakt van 35 exogene trehalase-genen, zoals bijvoorbeeld afkomstig uit bacteriën, zoals E. coli, maar er kan ook gebruik worden gemaakt van endogene trehalase-genen, waarbij de genen zodanig worden gemodificeerd dat ze coderen voor 1 7 gemodificeerde vormen van het endogene trehalase, bijvoorbeeld voor een intracellulaire vorm van het normaal alleen extracellulair actieve trehalase. Het voordeel van het gebruik van dergelijke endogene 5 trehalase-genen is dat er geen extra vreemd genetisch materiaal in de cel wordt gebracht.
Het gewenste transgen en de selectie-nucleotidensequentie kunnen met behulp van standaard moleculair-biologische technieken in de te transformeren 10 cel worden geïntroduceerd. Hierbij kunnen, maar dit is niet noodzakelijk, het transgen en selectiegen aan elkaar gekoppeld zijn zodat de aanwezigheid van het selectiegen altijd inhoudt dat ook het transgen aanwezig is. Het transgen en het selectiegen kunnen eventueel deel 15 uitmaken van eenzelfde genetisch construct en via dezelfde vector in de cel worden geïntroduceerd. Om ervoor te zorgen dat de selectie-nucleotidensequentie in de getransformeerde cellen tot expressie wordt gebracht zal een dergelijk genetisch construct verder ook 20 regulatoire sequenties omvatten, zoals bijvoorbeeld een constitutieve of reguleerbare promotor.
De werkwijze volgens de uitvinding kan op bijzonder geschikte manier worden gebruikt voor het selecteren van transgene planten. Voorbeelden van planten 25 waarvoor de werkwijze volgens de uitvinding kan worden gebruikt zijn bijvoorbeeld mais (Zea mays L.), tarwe (Triticum aestivm L.), gerst (Hordeum vulaare L.), rijst (Orvza sativa L.), sojaboon (Phaseolus vulaaris L.), suikerbiet (Beta vulgaris L.), witlof (Cichorum intvbus 30 L_J , raapzaad (Brassica napus L.), suikerriet cane (Saccharum officinarum L.), zoete aardappel (Diocorea esculenta L.), cassava (Manihot esculenta L.), aardappel (Solanum tuberosum L.), tomaat (lvcopersicon esculentum L.) en grassen (bijvoorbeeld Lolium spp., Poa spp. en 35 Festuca spp.).
De onderhavige uitvinding heeft verder betrekking op de getransformeerde cellen die zijn geselecteerd met behulp van de werkwijze volgens de 8 uitvinding, in het bijzonder plantencellen, evenals de hieruit geregenereerde planten, en hun zaden en nakomelingen.
De uitvinding wordt verder toegelicht aan de 5 hand van de bijgaande voorbeelden en figuren.
Figuur 1 toont de gevoeligheid van twee verschillende accessies van Arabidopsis thaliana voor trehalose. A: zaden gekweekt in aanwezigheid van 100 mM mannitol (controle); B: zaden gekweekt in aanwezigheid 10 van 100 mM trehalose.
Figuur 2 toont verschillende constructen voor cytoplasmatische expressie van het E. coli trehalase gen.
Figuur 3 toont een kweek van getransformeerde en niet-getransformeerde Arabidopsis thaliana Col.O 15 zaailingen in aanwezigheid van 100 mM trehalose.
Figuur 4 toont de nucleotidensequentie van het TreF gen uit E.coli.
Figuur 5 toont de mRNA sequentie van Arabidopsis thaliana AtTrel.
20 Figuur 6 toont de mRNA sequentie van GMTrel uit
Glycine max..
VOORBEELDEN
25 VOORBEELD 1
Gevoeligheid voor trehalose van zaailingen van Arabidopsis thaliana Col. O en La-er
Zaden werden gesteriliseerd met behulp van het 30 gas-fase protocol van Clough en Bent (1998) (Clough S.J., Bent A.F., Plant J. 16(6) : 735-743, 1998) in Eppendorf buisjes. Vervolgens werden de gesteriliseerde zaden geresuspendeerd in steriel water en aangebracht op 0.8% w/v agar medium dat halve sterkte Murashigue and Koog 35 medium (MS medium; Murashige T, Skoog F, Physiol. Plant. 15: 473-497, 1977), vitamines en MES buffer (pH 5.7), aangevuld met mannitol of trehalose in een eindconcentratie van 100 mM, bevatte.
' 9
De zaden die werden gekweekt in aanwezigheid van 100 mM mannitol ontwikkelden zich tot plantjes met een uitgebreid wortelstelsel, terwijl een verminderde ontwikkeling werd waargenomen bij de plantjes gekweekt in 5 aanwezigheid van 100 mM trehalose, zoals getoond in Fig. 1. Fig. IA toont hierbij de zaden die werden gekweekt in aanwezigheid van 100 mM mannitol (controle) en Fig. 1B de zaden die werden gekweekt in aanwezigheid van 100 mM trehalose. De bovenste rij plantjes betreft de 10 Arabidoosis thaliana Landsberg erecta (La-er), en de onderste rij plantjes de Arabidopsis thaliana Colombia (Col.0).
VOORBEELD 2 15
Expressievectoren met het E.coli cvtoplasmatische trehalase-aen (TreF) als selectiecen
TreF werd geamplificeerd uit het genomisch DNA van E.coli met behulp van de PCR-primers Treld (CTC TGC 20 AGA TGC TCA ATC AGA AAA TTC AAA ACC) en Trelu (TGC ACT
GCA GTT ATG GTT CGC CGT ACA AAC CAA) . Vervolgens werd het
geamplificeerde TreF gekloneerd in de pGEMT vector (Promega, VS). Het TreF gen werd verder gemodificeerd voor het introduceren van een myc-tag aan het C-terminale 25 eind van het eiwit met behulp van de PCR primers TRe2d (AGC ACT GCA GCC ATG GCT TTG GTT ACC CTC AAT CAG AAA ATT CAA AAC CCT) en Tremyc (TTA CAG ATC TTC TTC AGA AAT AAG
TTT TTG TTC TGG TTC GCC GTA CAA ACC AAT TAA) en opnieuw in pGEMT gekloneerd voor sequentie-validatie. De 30 resulterende gemodificeerde TreF sequentie werd geknipt met Pstl restrictie enzym in geïntroduceerd in: A. pCAMBIA2201 (CAMBIA, Australië). De uiteinden van het TreF fragment werden afgevlakt ("blunted") en het 35 fragment geligeerd in met Ncol en BstEII gedigesteerd an afgevlakt pCAMBIA220 plasmide.
B. Pstl knipplaats ("site") van pCambia 2380; hiertoe werd de ubiquitine 10 promotor van Arabidoosis 10 thaliana toegevoegd als afgevlakt ("blunted") Xhol-Spe 1 fragment in de afgevlakte HindlII site van pCambia 2380-TreF.
C. Pstl site van het pACN plasmide (Zeneca, Caddick 5 M.X. et al., Nat. Biotechnol. 16(2): 177-180, 1998). Het resulterende construct werd vervolgens gedigesteerd met HindlII waarbij een fragment werd vrijgemaakt met daarop de hybride AlcA/minimale 35S promotor, gevolgd door de TreF sequentie en de Nos PolyA terminator. Dit fragment 10 werd geinsereerd in de HindlII site van de SRN binaire vector (Zeneca), waardoor het getoonde construct werd verkregen.
In Fig. 2 worden de verkregen constructen getoond. LB: linker T-DNA grens; RB: rechter T-DNA grens; 15 treF: E. coli gen coderend voor het cytoplasmatische trehalase; Nptll: neomycine fosfotransferase gen II:
AlcR: gen coderend voor regulator van het alcohol induceerbare systeem; CaMV35S: cauliflower mosaic virus 35S promotor; UbilO: promotor van het ubiquitine 10 gen 20 van Arabidopsis thaliana; AlcA/35S: AlcA promotor element reagerend op ethanol inductie, gefuseerd met de CaMV35S promotor.
VOORBEELD 3 25
Selectie van transgene Arabidopsis zaalingen
Arabidoosis thaliana Col.O planten werden getransformeerd met Agrobacterium met de binaire plasmide zoals beschreven in Voorbeeld 2C, via het bloeiwijze-30 onderdompelingsprotocol ("floral dip" protocol) (Clough en Bent, supra) . De verkregen droge zaden werden gesteriliseerd en uitgezaaid op 0.8% w/v vaste agar medium met daarin halve sterkte MS-zouten (1/2 MS-zouten), vitamines en MES buffer pH 5.7, aangevuld met 35 trehalose in een eindconcentratie van 100 mM. De schaaltjes werden 3 dagen bij 4°C geincubeerd (stratificatie) , waarna een druppel ethanol werd 11 aangebracht op de binnenzijde van de deksel en de schaaltjes werden overgebracht naar 22°C.
Fig.3 toont de zaailingen verkregen na 12 dagen. De getransformeerde resistente zaailingen zijn 5 groen, bezitten lange wortels en primaire bladeren. De niet-getransformeerde gevoelige zaailingen daarentegen accumuleren anthocyaninen, ontwikkelen geen primaire bladeren en de wortels worden niet langer dan 3 mm. Ónder vochtige omstandigheden worden de cotylen bleek.
10 Van de ongeveer 4000 uitgezaaide plantjes, werden 24 resistente zaailingen geïdentificeerd. Hieruit blijkt dat de transformatie-frequentie vergelijkbaar is met die verkregen met andere selectiesystemen. Twaalf zaailingen werden overgebracht op teelaarde en ontwikkeld 15 tot planten die niet te onderscheiden waren van niet-getransformeerde wild-type planten.
VOORBEELD 4 20 Stabiele expressie van het trehalase-coderende selectieoen in Arabidoosis transgene lijnen
De stabiliteit van de expressie van het voor trehalase-coderende selectiegen werd getest in onafhankelijke Arabidoosis transgene lijnen met behulp 25 van het aan het selctiegen volgens de uitvinding gekoppelde conventionele kanamycine selectiegen.
T2 zaden, verkregen van tien zelfbestoven Tl planten uit Voorbeeld 3 werden gesteriliseerd en uitgezaaid op 0.8% vaste agar medium met daarin 1/2MS-30 zouten, aangevuld met 1% w/v sucrose en 25 mg/1 kanamycine, gedurende 3 dagen geïncubeerd bij 4° C, overgebracht naar 22 °C en 12 dagen gegroeid bij een 16 uur licht/8 uur donker cyclus. De kiemingsfrequentie was 100%.
35 Kanamycine-gevoelige zaailingen ontkiemden maar hadden gebleekte cotylen, geen wortelontwikkeling en geen primair bladstadium. Kanamycine-resistente zaailingen waren groen, ontwikkelden primaire bladeren en wortels.
12
Zoals getoond in tabel 1 werd het transgene construct van de Tl planten altijd overgedragen op de T2 generatie. Tabel 1 toont het aantal zaailingen dat resistent was tegen kanamycine in elke geteste lijn.
5 Arabidopsis produceert zaden door zelfbevruchting en is een diploïde plant. Wanneer de Tl generatie plant ten minste een stabiel transgen in zijn genoom bezit, zal de T2 generatie bestaan uit ten minste 3/4 resistente planten en ten hoogste 1/4 gevoelige 10 planten. Wanneer het transgen niet stabiel is geïnsereerd in het genoom van de Tl planten, zal het transgen niet worden gevonden in de T2 generatie. Tabel 1 toont dat, gebruik makend van kanamycine-selectie op de T2 generatie, T2 zaailingen met het transgen kunnen worden 15 gevonden uit elke Tl lijn.
Tabel 1
Tl lijn kanaxnycine-gevoelige kanamycine-resistente zaailingen zaailingen TF1 5 23 20 TF2 3 7 TF4 21 54 TF5 14 48 TF7 24 65 TF8 13 42 25 TF9 0 80 TF10 9 28 TF11 10 47 TF12 15 54 30

Claims (22)

1. Werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen uit een populatie van cellen, 5 omvattende a) het in een cel introduceren van ten minste een gewenste nucleotidensequentie en ten minste een selectie-nucleotidensequentie 10 voor het verkrijgen van een genetisch getransformeerde cel, waarbij de selectie-nucleotidensequentie een gebied omvat dat codeert voor een eiwit dat betrokken is bij het 15 metabolisme van trehalose; b) het in contact brengen van een populatie met getransformeerde en niet-getransformeerde cellen met trehalose en/of derivaat hiervan,· en 20 c) het selecteren van de getransformeerde cellen uit de populatie op basis van het vermogen van de getransformeerde cellen het trehalose en/of derivaat te 25 metaboliseren.
1 13
2. Werkwijze volgens conclusie 1 met het kenmerk dat de selectie-nucleotidensequentie een gebied omvat dat codeert voor een intracellulair eiwit met trehalase-aciviteit.
3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2 met het kenmerk dat de selectie-nucleotidensequentie een gemodificeerd endogeen trehalase-gen omvat, dat codeert voor een intracellulair actief trehalase.
4. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2 met het 35 kenmerk dat de selectie-nucleotidensequentie het TreF gen uit E. Coli omvat.
5. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2 met het kenmerk dat de selectie-nucleotidensequentie het AtTREl gen uit Arabidopsis omvat.
6. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-5 5 met het kenmerk dat de werkwijze verder omvat: het voor of tijdens stap b) tevens in contact brengen van de populatie van cellen met ten minste een remmer van endogeen extracellulair trehalase.
7. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-6 met het kenmerk dat de cel een plantencel is.
8. Genetisch getransformeerde cel welke is geselecteerd met de werkwijze volgens een van de conclusies 1-7, waarbij het genoom van de cel ten minste 15 een selectie-nucleotidensequentie omvat welke een gebied omvat dat codeert voor een eiwit dat betrokken is bij het metabolisme van trehalose.
9. Cel volgens conclusie 8 met het kenmerk dat de selectie-nucleotidensequentie een gebied omvat dat 20 codeert voor een intracellulair eiwit met trehalase-activiteit.
10. Cel volgens conclusie 8 of 9 met het kenmerk dat de selectie-nucleotidensequentie een gemodificeerd endogeen trehalase-gen omvat, dat codeert 25 voor een intracellulair actief trehalase.
11. Cel volgens conclusie 8 of 9 met het kenmerk dat de selectie-nucleotidensequentie het TreF gen uit E. Coli omvat.
12. Cel volgens conclusie 8 of 9 met het 30 kenmerk dat de selectie-nucleotidensequentie het AtTREl gen uit Arabidopsis omvat.
13. Cel volgens een van de conclusies 8-12 met het kenmerk dat het een plantencel is.
14. Plant, welke is geregenereerd uit een 35 getransformeerde plantencel volgens conclusie 13.
15. Zaden van een plant volgens conclusie 14.
16. Nakomelingen van een plant volgens conclusie 14.
17. Gebruik van trehalose en/of derivaat hiervan voor de selectie van getransformeerde cellen uit een populatie van getransformeerde en niet-getransformeerde cellen, waarbij het genoom van de 5 getransformeerde cellen ten minste een selectie- nucleotidensequentie omvat welke een gebied omvat dat codeert voor een eiwit dat betrokken is bij het metabolisme van trehalose.
18. Gebruik volgens conclusie 17 met het 10 kenmerk dat de selectie-nucleotidensequentie een gebied omvat dat codeert voor een intracellulair eiwit met trehalase-activiteit.
19. Gebruik volgens conclusie 17 of 18 met het kenmerk dat de selectie-nucleotidensequentie een 15 gemodificeerd endogeen trehalase-gen omvat, dat codeert voor een intracellulair actief trehalase.
20. Gebruik volgens conclusie 17 of 18 met het kenmerk dat de selectie-nucleotidensequentie het TreF gen uit E. Coli omvat.
21. Gebruik volgens conclusie 17 of 18 met het kenmerk dat de selectie-nucleotidensequentie het AtTREl gen uit Arabidopsis omvat.
22. Gebruik volgens een van de conclusies 17-21 met het kenmerk dat de cel een plantencel is. 25 * * *
NL1019308A 2001-11-06 2001-11-06 Werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen. NL1019308C2 (nl)

Priority Applications (16)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL1019308A NL1019308C2 (nl) 2001-11-06 2001-11-06 Werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen.
DK02781311T DK1442126T3 (da) 2001-11-06 2002-11-06 Fremgangsmåde til at udvælge genetisk transformerede celler
AT02781311T ATE317446T1 (de) 2001-11-06 2002-11-06 Verfahren zur selektion von transformierten zellen
ES02781311T ES2258655T3 (es) 2001-11-06 2002-11-06 Metodo para seleccionar celulas transformadas geneticamente.
EP02781311A EP1442126B1 (en) 2001-11-06 2002-11-06 Method for selecting genetically transformed cells
CNB028231279A CN100560726C (zh) 2001-11-06 2002-11-06 用于选择遗传转化细胞的方法
JP2003542623A JP4413615B2 (ja) 2001-11-06 2002-11-06 遺伝的に形質転換された細胞の選択方法
US10/494,651 US7449290B2 (en) 2001-11-06 2002-11-06 Method for selecting genetically transformed cells
IL16177302A IL161773A0 (en) 2001-11-06 2002-11-06 Method for selecting genetically transformed cells
CA002466088A CA2466088A1 (en) 2001-11-06 2002-11-06 Method for selecting genetically transformed cells
NZ532720A NZ532720A (en) 2001-11-06 2002-11-06 Method for selecting genetically transformed cells based on their ability to metabolize trehalose and/or a derivative thereof
PCT/EP2002/012478 WO2003040377A1 (en) 2001-11-06 2002-11-06 Method fro selecting genetically transformed cells
PT02781311T PT1442126E (pt) 2001-11-06 2002-11-06 Metodo para seleccao de celulas geneticamente transformadas
DE60209137T DE60209137T2 (de) 2001-11-06 2002-11-06 Verfahren zur selektion von transformierten zellen
ZA200403307A ZA200403307B (en) 2001-11-06 2004-04-30 Method for selecting genetically transformed cells.
IL161773A IL161773A (en) 2001-11-06 2004-05-04 Method for selecting genetically transformed cells

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL1019308A NL1019308C2 (nl) 2001-11-06 2001-11-06 Werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen.
NL1019308 2001-11-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NL1019308C2 true NL1019308C2 (nl) 2003-05-07

Family

ID=19774265

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL1019308A NL1019308C2 (nl) 2001-11-06 2001-11-06 Werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen.

Country Status (15)

Country Link
US (1) US7449290B2 (nl)
EP (1) EP1442126B1 (nl)
JP (1) JP4413615B2 (nl)
CN (1) CN100560726C (nl)
AT (1) ATE317446T1 (nl)
CA (1) CA2466088A1 (nl)
DE (1) DE60209137T2 (nl)
DK (1) DK1442126T3 (nl)
ES (1) ES2258655T3 (nl)
IL (2) IL161773A0 (nl)
NL (1) NL1019308C2 (nl)
NZ (1) NZ532720A (nl)
PT (1) PT1442126E (nl)
WO (1) WO2003040377A1 (nl)
ZA (1) ZA200403307B (nl)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2437865T3 (es) * 2005-07-25 2014-01-14 Foundation For Biomedical Research And Innovation Composición en forma de lámina
BRPI0806995A2 (pt) * 2007-02-08 2014-04-08 Basf Plant Science Gmbh Planta transgênica, semente, vetor de expressão, método para aumentar a resistência a nematódeo em uma planta
ES2461896B1 (es) * 2010-12-21 2015-03-18 Centro De Investigación Y De Estudios Avanzados Del Instituto Politécnico Nacional Métodos para obtener plantas resistentes a sequía

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0870836A1 (de) * 1997-04-09 1998-10-14 IPK Gatersleben 2-Desoxyglucose-6-Phosphat (2-DOG-6-P) Phosphatase DNA-Sequenzen als Selektionsmarker in Pflanzen
WO2000009705A2 (en) * 1998-08-11 2000-02-24 Danisco A/S Selection method
DE10045182A1 (de) * 2000-02-14 2001-08-16 Ipk Inst Fuer Pflanzengenetik Verwendung von Palatinase- und Trehalulase-Sequenzen als nutritive Marker in transformierten Zellen

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9304200D0 (en) 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
DK152291D0 (da) 1991-08-28 1991-08-28 Danisco Fremgangsmaade og kemiske forbindelser
CN1155713C (zh) * 1995-04-06 2004-06-30 塞迷尼思蔬菜种子公司 选择转基因植物细胞的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0870836A1 (de) * 1997-04-09 1998-10-14 IPK Gatersleben 2-Desoxyglucose-6-Phosphat (2-DOG-6-P) Phosphatase DNA-Sequenzen als Selektionsmarker in Pflanzen
WO2000009705A2 (en) * 1998-08-11 2000-02-24 Danisco A/S Selection method
DE10045182A1 (de) * 2000-02-14 2001-08-16 Ipk Inst Fuer Pflanzengenetik Verwendung von Palatinase- und Trehalulase-Sequenzen als nutritive Marker in transformierten Zellen

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GODDIJN O J M ET AL: "INHIBITION OF TREHALASE ACTIVITY ENHANCES TREHALOSE ACCUMULATION IN TRANSGENIC PLANTS", PLANT PHYSIOLOGY, AMERICAN SOCIETY OF PLANT PHYSIOLOGISTS, ROCKVILLE, MD, US, vol. 113, no. 1, 1997, pages 181 - 190, XP002043745, ISSN: 0032-0889 *
MULLER JOACHIM ET AL: "Trehalose and trehalase in Arabidopsis.", PLANT PHYSIOLOGY (ROCKVILLE), vol. 125, no. 2, February 2001 (2001-02-01), pages 1086 - 1093, XP002216267, ISSN: 0032-0889 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE60209137T2 (de) 2006-08-31
US7449290B2 (en) 2008-11-11
ES2258655T3 (es) 2006-09-01
EP1442126B1 (en) 2006-02-08
CN1622999A (zh) 2005-06-01
CN100560726C (zh) 2009-11-18
ZA200403307B (en) 2005-01-24
IL161773A0 (en) 2005-11-20
EP1442126A1 (en) 2004-08-04
DE60209137D1 (de) 2006-04-20
JP2005508190A (ja) 2005-03-31
DK1442126T3 (da) 2006-05-22
ATE317446T1 (de) 2006-02-15
WO2003040377A1 (en) 2003-05-15
JP4413615B2 (ja) 2010-02-10
US20050084971A1 (en) 2005-04-21
PT1442126E (pt) 2006-06-30
NZ532720A (en) 2006-06-30
IL161773A (en) 2009-09-22
CA2466088A1 (en) 2003-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0658207B1 (en) Method for the genetic containment of plants
ES2256856T3 (es) Proceso de seccion de celulas transgenicas.
Takaichi et al. Transgenic carrots with enhanced resistance against two major pathogens, Erysiphe heraclei and Alternaria dauci
HU215090B (hu) Eljárás növényi génszerkezetek és az azokkal transzformált növények előállítására
KR20150085846A (ko) Tal-매개 전이 DNA 삽입방법
HU213580B (en) Method for producing by genetic engineering plant and plant cells resistant to glutamine-synthetase inhibitors, and method for protecting plants by elimination of weeds and fungi
US20170204429A1 (en) ACETYL-CoA CARBOXYLASE HERBICIDE RESISTANT SORGHUM
EA028662B1 (ru) Рнк-интерференция для борьбы с грибами и оомицетами путем ингибирования гена сахаропиндегидрогеназы
NL1019308C2 (nl) Werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen.
JP2000253768A (ja) 高等植物の生産性を向上させる方法および形質転換植物
CN110475471A (zh) 展现增加的产量和干旱耐受的转基因玉米植物
WO2006057306A1 (ja) ストレス耐性及び／又は生産性を改良したイネ科植物、及びその作出方法
AU2002349026B2 (en) Method for selecting genetically transformed cells
JP3964701B2 (ja) 病害抵抗性イネ科植物
AU2002349026A1 (en) Method for selecting genetically transformed cells
US20060288438A1 (en) Novel miniature inverted-repeat transposable elements (MITEs)-like element and transcriptional activation element
US6881433B1 (en) Food products containing altered starch
Almeida et al. Electroporation of maize embryogenic calli with the trehalose-6-phosphate synthase gene from Arabidopsis thaliana
CA2323729A1 (en) Adp-glucose transporter of the amyloplast
CN108795975A (zh) 野生大豆相关蛋白在提高植物抗虫性中的应用
AU5990999A (en) Method for obtaining transgenic plants expressing a protein with activity producing hydrogen peroxide by transformation by Agrobacterium rhizogenes

Legal Events

Date Code Title Description
PD2B A search report has been drawn up
SD Assignments of patents

Owner name: EXPRESSIVE RESEARCH B.V.

Effective date: 20051205

V1 Lapsed because of non-payment of the annual fee

Effective date: 20110601