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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Selektion genetisch
transformierter Zellen.
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Es
ist bekannt, dass, wenn genetisches Material durch Transformation
in eine Zellpopulation eingeführt
wird, nur eine Anzahl der Zellen erfolgreich transformiert wird.
Nach der Transformation müssen
die transformierten Zellen aus einer Population transformierter
und nicht transformierter Zellen identifiziert und selektiert werden.
Ein Selektionsgen wird daher im Allgemeinen ebenfalls in die Zelle
zu diesem Zweck zusätzlich zu
dem gewünschten
Transgen eingeführt.
Das Selektionsgen kodiert hierbei z.B. für eine Eigenschaft, mit der die
genetisch transformierten Zellen identifiziert werden können. Beispiele
für solche
Selektionsgene sind z.B. Gene, die für Resistenzen gegenüber Antibiotika
oder Herbiziden kodieren. Nach der Transformation wird die Population
transformierter und nicht transformierter Zellen mit dem Antibiotikum
oder Herbizid in Kontakt gebracht, das für die nicht transformierten
("Wildtyp"-)Zellen toxisch
ist, so dass nur die transformierten Zellen durch die Gegenwart
des eingeführten
Selektionsgens überleben
und wachsen können.
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Die
Verwendung solcher Selektionsgene, die für Antibiotikum- oder Herbizidresistenz
kodieren, ist jedoch nicht allgemein erwünscht für transgene Nutzpflanzen, die
in großem
Maßstab
in die Umwelt eingeführt werden,
und insbesondere in Nahrungsmittel-Nutzpflanzen. Ein weiterer Nachteil
eines solchen Selektionsmechanismus besteht zusätzlich z.B. darin, dass die
nicht transformierten Zellen im Allgemeinen absterben werden und
darüber
hinaus, dass, wenn die Zellpopulation ein zusammenhängendes Zellgewebe
oder einen ganzen Organismus darstellt, die transformierten Zellen
auch infolge von z.B. schädlichen
Substanzen, die von den sterbenden, nicht transformierten Zellen
abgegeben werden, sterben können.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren
zur Selektion transformierter Zellen aus einer Population transformierter
und nicht transformierter Zellen bereitzustellen, bei welchem die
ausgeführten
Nachteile vermieden werden.
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Diese
Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst, indem ein Verfahren bereitgestellt
wird, mit:
- a) Einführen mindestens einer gewünschten
Nucleotidsequenz und mindestens einer Selektions-Nucleotidsequenz
in eine Zelle, um eine genetisch transformierte Zelle zu erhalten,
wobei die Selektions-Nucleotidsequenz einen Bereich umfasst, der
für ein
Protein kodiert, das an der Metabolisierung von Trehalose beteiligt
ist;
- b) in Kontakt bringen einer Population mit transformierten und
nicht transformierten Zellen mit Trehalose und/oder deren Derivat;
und
- c) Selektieren der transformierten Zellen aus der Population
auf Basis des Vermögens
der transformierten Zellen, die Trehalose und/oder Derivate zu metabolisieren.
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Trehalose
ist das α-1,1-Disaccharid
von Glucose, das von vielen Organismen produziert wird, einschließlich Bakterien,
Hefen und Pilzen, sowie verschiedenen höheren Pflanzen. Es ist der
wichtigste Blutzucker bei Insekten. Trehalose wird zunehmend unter
anderem bei der Herstellung von Impfstoffen und in Organtransplantationsprotokollen
verwendet, da es vor Proteindenaturierung und Membranschädigung schützt.
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Zellen,
insbesondere Pflanzenzellen, können
sich in einem Medium, in dem eine erhöhte Trehalosekonzentration
vorhanden ist, nicht ohne die Gegenwart einer anderen metabolisierbaren
Kohlenstoffquelle normal entwickeln. In dem erfindungsgemäßen Verfahren
wird hiervon Verwendung gemacht, um transformierte Zellen zu selektieren.
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Dazu
werden die Zellen, zusätzlich
zur Verwendung des gewünschten
Transgens, mit einer Selektions-Nucleotidsequenz transformiert,
wobei die Selektions-Nucleotidsequenz einen Bereich umfasst, der
für ein
Protein kodiert, das an der Metabolisierung von Trehalose beteiligt
ist. Eine Population mit transformierten und nicht transformierten
Zellen wird dann mit Trehalose und/oder deren Derivat in Kontakt
gebracht, z.B. indem Trehalose und/oder deren Derivat in das Kulturmedium
gegeben wird. Die transformierten Zellen unterscheiden sich somit
von den nicht transformierten Zellen nicht nur durch das relevante
eingeführte
Transgen, sondern auch durch die Gegenwart einer Nucleotidsequenz
in ihrem Genom, die für
ein Protein kodiert, das die Trehalose metabolisieren kann. Die
transformierten Zellen werden hierdurch in der Lage sein, in dem
Medium mit Trehalose und/oder deren Derivat zu überleben und zu wachsen, während sich
die nicht transformierten Zellen nicht weiter entwickeln. Auf diese
Weise können
daher die transformierten Zellen aus der Gesamtzellpopulation auf
Basis ihrer Fähigkeit,
die Trehalose und/oder Derivate zu metabolisieren, selektiert werden.
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Der
Begriff "Protein,
das an der Metabolisierung von Trehalose beteiligt ist" bezieht sich hierbei
auf ein Protein, z.B. ein Enzym, das Trehalose und/oder deren Derivat
abbauen kann und dadurch die Konzentration von Trehalose und/oder
deren Derivat verringern kann.
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Der
Begriff "Derivat
von Trehalose" betrifft
modifizierte Formen von Trehalose, die ebenfalls durch das relevante
Protein metabolisiert werden können
und in den Zellen die gleiche Antwort wie Trehalose induzieren können, wie
z.B. methylierte oder halogenierte Formen von Trehalose.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
umfasst die eingeführte Selektions-Nucleotidsequenz
einen Bereich, der für
ein intrazelluläres
Protein mit Trehalaseaktivität
kodiert, d.h. ein Enzym, das intrazelluläre Trehalose und/oder deren
Derivat zu Glucose hydrolysieren kann. Auf Grund der Anwesenheit
dieses Proteins in den transformierten Zellen und seiner Abwesenheit
in den nicht transformierten Zellen können nur die transformierten
Zellen die Trehalose und/oder deren Derivat, die in die Zelle gelangen,
abbauen. Die intrazelluläre
Konzentration der Trehalose in den transformierten Zellen wird dadurch verringert,
während
die freigesetzte Glucose darüber
hinaus von den transformierten Zellen als zusätzliche Nährstoffquelle verwendet werden
kann.
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Viele
Zellen, insbesondere Zellen höherer
Pflanzen, wie etwa Glycine max. und Arabidopsis thaliana, enthalten
in ihrem Genom das Gen für
eine endogene Trehalase (Äschbacher
R. A. et al., Plant Physiol. 119(2): 489–496, 1999; Müller et
al., Plant Physiol. 125(2): 1086–1093, 2001). Diese endogenen
Trehalasegene kodieren jedoch im Allgemeinen für eine extrazelluläre Trehalase,
die innerhalb der Zelle nicht aktiv ist. Es ist möglich, solche
endogenen Gene unter Verwendung herkömmlicher molekularbiologischer
Techniken zu verändern.
In einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
umfasst die Selektions-Nucleotidsequenz daher ein modifiziertes
endogenes Trehalasegen, das für
eine intrazellulär
aktive Trehalase kodiert. Das endogene Trehalasegen wird dabei derart
modifiziert, dass die exprimierte Trehalase intrazellulär aktiv
ist, z.B. durch Deaktivieren des Proteinsekretionssignals durch
Deletion oder Mutagenese, durch Ändern
der Proteinzielsequenzen oder der pH-Sensitivität des enzymatisch aktiven Zentrums.
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In
einer besonders geeigneten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
umfasst die eingeführte
Selektions-Nucleotidsequenz das TreF-Gen von E. coli (Horlacher
R. et al., J. Bacteriol. 178(1): 6250–6257, 1996). Dieses Gen lässt sich
unter Verwendung herkömmlicher
molekularbiologischer Techniken leicht isolieren und in verschiedene
Zellen einführen.
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In
einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung umfasst
die Selektions-Nucleotidsequenz
das AtTRE1-Gen aus Arabidopsis (Locus At4G24040, AGI-Nr. 2134960).
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
umfasst bevorzugt zusätzlich
ebenfalls in Kontakt bringen der Zellpopulation mit mindestens einem
Inhibitor endogener extrazellulärer Trehalase
vor oder während
Schritt b). Die Inhibierung möglicherweise
vorhandener endogener extrazellulärer Trehalase verhindert, dass
Trehalose aus dem Medium bereits außerhalb der Zellen teilweise
oder vollständig
abgebaut wird, wodurch sich auch die nicht transformierten Zellen
weiter entwickeln könnten.
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Beispiele
geeigneter Inhibitoren zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren
sind Suidatestrin und eine modifizierte Form des Pseudo-Oligosaccharid-Antibiotikums
Validamycin (Asano N. et al., J. Antibiot. 40(4): 526–532, 1987;
Goddijn O. J. et al., Plant Physiol. 113(1): 181–190, 1997; Knuesel I. et al.,
Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 120(4): 639–646, 1998).
Das Validamycin muss dabei so modifiziert sein, dass es nicht mehr
in die Zelle gelangen kann. Es können
jedoch auch andere Verbindungen, welche die Aktivität von endogener
extrazellulärer
Trehalase inhibieren und nicht in die Zelle aufgenommen werden,
erfindungsgemäß verwendet
werden.
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Der
Begriff "Zellpopulation" bedeutet erfindungsgemäß eine Population
individueller Zellen sowie Zellen in Geweben und Organen oder deren
Teilen; oder Zellen in gesamten Organismen, wie z.B. Pflanzen, wobei
die gesamten Pflanzen oder deren Teile aus den genetisch transformierten
Zellen bestehen können.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
wird bevorzugt verwendet, um genetisch modifizierte Pflanzenzellen
zu selektieren. Keimlinge von z.B. Arabidopsis können sich auf einem Medien
mit erhöhten
Konzentrationen von Trehalose nicht weiterentwickeln. Obwohl die
Samen auskeimen, wird die Bildung eines ausgedehnten Wurzelsystems
und die Bildung des Einblattstadiums durch die Gegenwart von Trehalose
inhibiert. Da die genetisch transformierten Pflanzen durch die Einführung der
Selektions-Nucleotidsequenz Trehalase exprimieren können, insbesondere
im Cytoplasma der Zelle, kann die Trehalose, welche in die Zelle
gelangt, zu Glucose abgebaut werden. Die Glucose kann dann als Nährstoffquelle
für die
Pflanze verwendet werden. Die genetisch transformierten Pflanzen
entwickeln sich daher weiter, während
die Entwicklung der nicht transformierten Pflanzen zurückbleibt.
Wenn das erfindungsgemäße Verfahren
zur Selektion genetisch transformierter Zellen in Pflanzen verwendet
wird, können
die transformierten Pflanzen leicht visuell identifiziert werden.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
stellt daher ein einfaches, umweltfreundliches Selektionssystem
für transformierte
Zellen dar, insbesondere für
genetisch transformierte Pflanzen. Trehalose ist eine einfache Verbindung,
die relativ kostengünstig
herzustellen ist und die sich darüber hinaus als nicht toxisch
für Menschen und
Tiere herausgestellt hat. Menschen haben daher seit langer Zeit
große
Mengen von Trehalose in Produkten aus der Hefefermentation, wie
etwa Brot und Bier, konsumiert und Menschen und Tiere sind durch
die Gegenwart von Trehalose produzierenden Mikroben in der Darmflora
kontinuierlich Trehalose ausgesetzt.
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Gemäß der Erfindung
kann jede Nucleotidsequenz, die für ein Protein mit Trehalaseaktivität kodiert, als
Selektions-Nucleotidsequenz in den genetisch transformierten Zellen
verwendet werden. Zum Beispiel können
exogene Trehalasegene, wie sie z.B. von Bakterien wie etwa E. coli
stammen, verwendet werden, obwohl ebenfalls endogene Trehalasegene
verwendet werden können,
wobei die Gene derart modifiziert werden, dass sie für modifizierte
Formen der endogenen Trehalase kodieren, z.B. für eine intrazelluläre Form
der normalerweise nur extrazellulär aktiven Trehalase. Der Vorteil
der Verwendung solcher endogenen Trehalasegene besteht darin, dass
kein zusätzliches
fremdes genetisches Material in die Zelle eingeführt wird.
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Das
gewünschte
Transgen und die Selektions-Nucleotidsequenz können unter Verwendung herkömmlicher
molekularbiologischer Techniken in die Zelle zum Transformieren
eingeführt
werden. Obwohl dies nicht wesentlich ist, können das Transgen und das Selektionsgen
dabei miteinander verbunden sein, so dass die Gegenwart des Selektionsgens
immer anzeigt, dass auch das Transgen vorhanden ist. Das Transgen
und das Selektionsgen können
wahlweise einen Teil desselben genetischen Konstrukts bilden und über denselben Vektor
in die Zelle eingeführt
werden. Um sicherzustellen, dass die Selektions-Nucleotidsequenz
in den transformierten Zellen exprimiert wird, wird ein sol ches
genetisches Konstrukt zusätzlich
Regulationssequenzen, wie etwa einen konstitutiven oder regulierbaren
Promotor enthalten.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann in besonders geeigneter Weise verwendet werden, um transgene
Pflanzen zu selektieren. Beispiele für Pflanzen, für welche
das erfindungsgemäße Verfahren
verwendet werden kann, sind z.B. Mais (Zea mays L.), Weizen (Triticum
aestiym L.), Gerste (Hordeum vulaare L.), Reis (Oryza sativa L.),
Sojabohne (Phaseolus vulgaris L.), Zuckerrübe (Beta vulgaris L.), Chicoree
(Cichorum intybus L.), Raps (Brassica napus L.), Zuckerrohr (Saccharum
officinarum L.), Süßkartoffel
(Diocorea esculenta L.), Maniok (Manihot esculents L.), Kartoffel
(Solanum tuberosum L.), Tomate (lycopersicon esculentum L.) und Gräser (z.B.
Lolium spp., Poa spp. und Festuca spp.).
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem transformierte Zellen,
die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens selektiert werden,
insbesondere Pflanzenzellen, und daraus regenerierte Pflanzen und
deren Samen und Nachkommenschaft.
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Die
Erfindung wird unter Bezug auf die begleitenden Beispiele und Figuren
weiter erläutert.
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1 zeigt die Sensitivität zweier unterschiedlicher
Akzessionen von Arabidopsis thaliana gegenüber Trehalose. A: in Gegenwart
von 100 mM Mannitol kultivierte Samen (Kontrolle); B: in Gegenwart
von 100 mM Trehalose kultivierte Samen.
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2 zeigt
unterschiedliche Konstrukte für
cytoplasmatische Expression des E.-coli-Trehalasegens.
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3 zeigt
eine Kultur transformierter und nicht transformierter Arabidopsis-thaliana-Col.O-Keimlinge in
Gegenwart von 100 mM Trehalose.
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4 zeigt die Nucleotidsequenz des TreF-Gens
aus E. coli.
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5 zeigt die mRNA-Sequenz von Arabidopsis
thaliana AtTre1.
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6 zeigt die mRNA-Sequenz von GMTre1 aus
Glycine max..
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BEISPIELE
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BEISPIEL 1
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Sensitivität gegenüber Trehalose
von Keimlingen von Arabidopsis thaliana Col. O und La-er
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Samen
wurden unter Verwendung des Gasphasenprotokolls von Clough und Bent
(1998) (Clough S. J., Bent A. F., Plant J. 16(6): 735–743, 1998)
in Eppendorf-Röhrchen
sterilisiert. Die sterilisierten Samen wurden dann in sterilem Wasser
resuspendiert und auf 0,8% G/V Agarmedium angeordnet, das halbstarkes
Murashigue- und Skoog-Medium (MS-Medium; Murashigue T., Skoog F.,
Physiol. Plant. 15: 473–497,
1977), Vitamine und MES-Puffer (pH 5,7) enthielt, ergänzt mit
Mannitol oder Trehalose in einer Endkonzentration von 100 mM.
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Die
in Gegenwart von 100 mM Mannitol kultivierten Samen entwickelten
sich zu Pflanzen mit einem ausgedehnten Wurzelsystem, während eine
geringere Entwicklung bei den Pflanzen beobachtet wurde, die in Gegenwart
von 100 mM Trehalose kultiviert wurden, wie in 1 gezeigt.
Hierbei zeigt 1A die in Gegenwart von 100
mM Mannitol kultivierten Samen (Kontrolle) und 1B die
in Gegenwart von 100 mM Trehalose kultivierten Samen. Die obere
Pflanzenreihe sind die Arabidopsis thaliana Landsberg erecta (La-er)
und die untere Pflanzenreihe sind die Arabidopsis thaliana Colombia
(Col.O).
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BEISPIEL 2
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Expressionsvektoren mit
dem E. coli cytoplasmatischen Trehalasegen (TreF) als Selektionsgen
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TreF
wurde aus der genomischen DNA von E. coli unter Verwendung der PCR-Primer
Treld (CTC TGC AGA TGC TCA ATC AGA AAA TTC AAA ACC) und Trelu (TGC ACT
GCA GTT ATG GTT CGC CGT ACA AAC CAA) amplifiziert. Das amplifizierte
TreF wurde dann in dem pGEMT-Vektor (Promega, US) kloniert. Das TreF-Gen
wurde für
die Einführung
eines myc-Tag am C-ständigen
Ende des Proteins unter Verwendung der PCR-Primer TRe2d (AGC ACT
GCA GCC ATG GCT TTG GTT ACC CTC AAT CAG AAA ATT CAA AAC CCT) und
Tremyc (TTA CAG ATC TTC TTC AGA AAT AAG TTT TTG TTC TGG TTC GCC
GTA CAA ACC AAT TAA) und erneut in pGEMT zur Sequenzvalidierung
geklont. Die resultierende modifizierte TreF-Sequenz wurde mit einem
Pst1-Restriktionsenzym ausgeschnitten und eingefügt in:
- A.
pCAMBIA2201 (CAMBIA, Australien). Die äußeren Enden des TreF-Fragments
wurden abgestumpft (blunted) und das in pCAMBIA220-Plasmid ligierte
Fragment wurde mit Nco1 und BstEII verdaut und abgestumpft.
- B. Pst1-Stelle von pCambia 2380; für diesen Zweck wurde der Ubiquitin-10-Promotor
von Arabidopsis thaliana als stumpfes Xho1-Spe-1-Fragment in die
stumpfe HindIII-Stelle von pCambia 2380-TreF eingefügt.
- C. Pst1-Stelle des pACN-Plasmids (Zeneca, Caddick M. X. et al.,
Nat. Biotechnol. 16(2): 177–180,
1998). Das resultierende Konstrukt wurde dann mit HindIII verdaut,
wobei ein Fragment freigesetzt wurde, das den Hybrid-AlcA/Minimal-35S-Promotor trägt, gefolgt
von der TreF-Sequenz und dem Nos-PolyA-Terminator. Dieses Fragment
wurde in die HindIII-Stelle des SRN-Binärvektors (Zeneca) eingefügt, wodurch
das gezeigte Konstrukt erhalten wurde.
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2 zeigt
die erhaltenen Konstrukte. LB: linker T-DNA-Rand; RB: rechter T-DNA-Rand; treF: E.-coli-Gen,
das für
cytoplasmatische Trehalase kodiert; NptII: Neomycinphosphotransferasegen
II; AlcR: für
den Regulator des alkohol-induzierbaren Systems kodierendes Gen;
CaMV35S: Blumenkohl-Mosaikvirus-35S-Promotor; Ubi10: Promotor des
Ubiquitin-10-Gens von Arabidopsis thaliana; AlcA/35S: auf Ethanolinduktion
reagierendes AlcA-Promotorelement, das mit dem CaMV35S-Promotor
fusioniert ist.
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BEISPIEL 3
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Auswahl von
transgenen Arabidopsis-Keimlingen
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Arabidopsis-thaliana-Col.O-Pflanzen
wurden mit Agrobacterium mit dem binären Plasmid, wie in Beispiel
2C beschrieben, mittels des "Floral-Dip"-Protokolls (Clough
und Bent, aaO) transformiert. Die erhaltenen trockenen Samen wurden
sterilisiert und auf 0,8% G/V Festagarmedium ausgesät, das halbstarke
MS-Salze (1/2 MS-Salze), Vitamine und MES-Puffer, pH 5,7, enthielt,
ergänzt
mit Trehalose in einer Endkonzentration von 100 mM. Die Schalen
wurden für
drei Tage bei 4°C
inkubiert (Stratifikation), wonach ein Tropfen Ethanol auf die Innenseite
des Deckels aufgebracht wurde und die Schalen auf 22°C umgesetzt
wurden.
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3 zeigt
die nach 12 Tagen erhaltenen Keimlinge. Die transformierten resistenten
Keimlinge sind grün,
weisen lange Wurzeln und Primärblätter auf.
Die nicht transformierten empfindlichen Keimlinge akkumulieren andererseits
Anthocyanine, entwickeln keine Primärblätter und die Wurzeln werden
nicht länger
als 3 mm. In feuchten Bedingungen werden die Cotyledonen bleich.
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Von
den ungefähr
4000 ausgesäten
Pflanzen wurden 24 resistente Keimlinge identifiziert. Dies zeigt, dass
die Transformationshäufigkeit
mit der durch andere Selektionssysteme erhaltenen vergleichbar ist.
12 Keimlinge wurden in Schwarzerde versetzt und entwickelten sich
zu Pflanzen, die nicht von nicht transformierten Wildtyppflanzen
unterschieden werden konnten.
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BEISPIEL 4
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Stabile Expression des
Trehalase kodierenden Selektionsgens in transgenen Arabidopsis-Linien
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Die
Stabilität
der Expression des Selektionsgens, das für Trehalase kodiert, wurde
in unabhängigen transgenen
Arabidopsis-Linien unter Verwendung des herkömmlichen Kanamycin-Selektionsgens,
das mit dem erfindungsgemäßen Selektionsgen
gekoppelt war, getestet.
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T2-Samen,
die aus 10 selbstbestäubten
T1-Pflanzen aus Beispiel 3 erhalten worden waren, wurden sterilisiert
und auf 0,8% Festagarmedium ausgesät, das 1/2MS-Salze enthielt,
ergänzt
mit 1% G/V Saccharose und 25 mg/l Kanamycin, für 3 Tage bei 4°C inkubiert,
auf 22°C
umgesetzt und für
12 Tage in einem 16-Stunden-Licht/8-Stunden-Dunkelheit-Zyklus gezüchtet. Die
Keimungshäufigkeit
betrug 100%.
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Kanamycin-empfindliche
Keimlinge keimten, hatten jedoch ausgeblichene Cotyledonen, keine
Wurzelentwicklung und kein Einblattstadium. Kanamycin-resistente
Keimlinge waren grün,
entwickelten Primärblätter und
Wurzeln.
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Wie
in Tabelle 1 gezeigt, wurde das transgene Konstrukt der T1-Pflanzen
immer an die T2-Generation weitergegeben. Tabelle 1 zeigt die Zahl
der gegen Kanamycin resistenten Keimlinge in jeder getesteten Linie.
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Arabidopsis
produziert Samen durch Selbstbefruchtung und ist eine diploide Pflanze.
Wenn die T1-Generationspflanze mindestens ein stabiles Transgen
in ihrem Genom aufweist, besteht die T2-Generation aus mindestens
3/4 resistenten Pflanzen und einem Maximum von 1/4 empfindlichen
Pflanzen. Wenn das Transgen nicht in stabiler Weise in das Genom
der T1-Pflanzen eingefügt
wird, wird das Transgen in der T2-Generator nicht gefunden. Tabelle
1 zeigt, dass durch Verwendung von Kanamycin-Selektion an der T2-Generation T2-Keimlinge
mit dem Transgen in jeder T1-Linie gefunden werden können.
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