DE19502053A1

DE19502053A1 - Verfahren und DNA-Moleküle zur Steigerung der Photosyntheserate in Pflanzen, sowie Pflanzenzellen und Pflanzen mit gesteigerter Photosyntheserate

Info

Publication number: DE19502053A1
Application number: DE19502053A
Authority: DE
Inventors: Uwe Dr Sonnewald; Jens Dr Kosmann; Botho Prof Dr Bowien
Original assignee: Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 1995-01-13
Filing date: 1995-01-13
Publication date: 1996-07-18
Also published as: AU715382B2; JPH11503304A; HUP9800420A3; HUP9800420A2; WO1996021737A1; CA2209932A1; AU4485896A; US6245967B1; EP0802982A1; IL116749A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und DNA-Moleküle zur Steigerung der Photosyntheserate in Pflanzen sowie zur Steigerung des Ertrags von Pflanzen. Die Steigerung der Photosyntheserate bzw. des Ertrags wird erreicht durch die Expression einer deregulierten oder unregulierten Fruktose-1,6-Bisphosphatase im Cytosol transgener Pflanzen. Die Erfindung betrifft ebenfalls die über das Verfahren erhältlichen Pflanzenzellen und Pflanzen, sowie die Verwendung von DNA-Sequenzen, die Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bis phosphatase kodieren, zur Herstellung von Pflanzen, die eine gesteigerte Photosyntheserate aufweisen. Ferner betrifft die Erfindung rekombinante DNA-Mo leküle, die in Pflanzenzellen und Pflanzen zur Steigerung der Photosyntheserate führen.

Bedingt durch den kontinuierlich steigenden Nahrungsmittelbedarf, der aus der ständig wachsenden Weltbevölkerung resultiert, ist eine der Aufgaben der biotechnologischen Forschung, sich um eine Steigerung des Ertrages von Nutzpflanzen zu bemühen. Eine Möglichkeit dies zu erreichen besteht in der gezielten gentechnischen Veränderung des Metabolismus von Pflanzen. Ziele sind dabei beispielsweise die primären Prozesse der Photosynthese, die zur CO₂- Fixierung führen, die Transportprozesse, die an der Verteilung der Photoassimilate innerhalb der Pflanze beteiligt sind, als auch Stoffwechselwege, die zur Synthese von Speicherstoffen, z. B. von Stärke, Proteinen oder Fetten, führen.

Beschrieben wurde beispielsweise die Expression einer prokaryontischen Asparaginsynthetase in pflanzlichen Zellen, wodurch es bei den transgenen Pflanzen unter anderem zu einer Steigerung der Biomasseproduktion kommt (EP 0 511 979).

Ebenfalls vorgeschlagen wurde die Expression einer prokaryontischen Polyphosphatkinase im Cytosol transgener Pflanzen, was in Kartoffelpflanzen zu einer Ertragsteigerung in bezug auf das Knollengewicht von bis zu 30% führt. Weiterhin wird in der EP 0 442 592 die Expression einer apoplastischen Invertase in Kartoffelpflanzen beschrieben, die zur Veränderung des Ertrages derartig veränderter transgener Pflanzen führt.

Weitere Versuche konzentrierten sich auf die Modifikation der Aktivitäten von Enzymen, die an der Synthese von Saccharose, dem wichtigsten Transportmetabolit in den meisten Pflanzenarten, beteiligt sind. In Pflanzen wird das im Verlauf der Photosynthese fixierte CO₂ in Form von Triosephosphaten (Glycerinaldehyd-3-Phos phat und Dihydroxyacetonphosphat) aus den Plastiden ins Cytosol transportiert. Im Cytosol wird durch Kondensation von Glycerinaldehyd-3-Phos phat und Dihydroxyacetonphosphat durch das Enzym Aldolase ein Molekül Fruktose-1,6-Bisphosphat gebildet. Dieses wird in ein Molekül Fruktose-6-Phosphat umgewandelt, das wiederum Substrat ist für die Synthese von Saccharosephosphat durch das Enzym Saccharosephosphat-Synthase nach der Gleichung

Fruktose-6-Phosphat + UDP-Glukose → Saccharose-Phosphat + UDP.

Die Umwandlung von Fruktose-1,6-Bisphosphat in Fruktose-6-Phosphat wird von dem Enzym Fruktose-1,6-Bisphosphatase (im folgenden: FBPase; EC 3.1.3.11) katalysiert, das durch verschiedene Substanzen reguliert wird. So sind beispielsweise Fruktose-2,6-Bisphosphat und AMP starke Inhibitoren dieses Enzyms, wobei AMP allosterisch inhibiert, wohingegen Fruktose-2,6-Bisphosphat an das aktive Zentrum des Enzyms bindet (Ke et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 1475-1479; Liu et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 161 : 689-695. In pflanzlichen Zellen gibt es sowohl eine cytoplasmatische als auch eine kernkodierte chloroplastische FBPase. Die Rückreaktion (Umwandlung von Fruktose-6-Phosphat in Fruktose-1,6-Bisphosphat) wird durch das Enzym Phospho-Fruktokinase (PFK) unter Verwendung von ATP katalysiert. Dieses Enzym wird durch Fruktose-6-Phos phat, P_i, und Fruktose-2,6-Bisphosphat aktiviert und von Glycerinaldehyd-3-Phos phat und Dihydroxyacetonphosphat gehemmt. Neben diesen Enzymen kommt in pflanzlichen Zellen ein weiteres Enzym vor, die Pyrophosphat:Fruktose-6- Phosphat-1-Phosphotransferase (PFP), die beide Reaktionen katalysiert, nach folgender Gleichung:

Fruktose-1,6-Bisphosphat + P_i ⇄ Fruktose-6-Phosphat + PP_i

Es wurden bisher bereits verschiedene Versuche unternommen, diesen Schritt in der Synthese der Saccharose derart zu manipulieren, daß es zu einer Erhöhung der CO₂-Fixierung und folglich zu einer gesteigerten Biomasseproduktion kommt. Beispielsweise wurde versucht, durch Überexpression einer pflanzlichen FBPase im Cytosol die Bildung von Fruktose-1,6-Bisphosphat zu steigern (Juan et al., 1994, Supplement to Plant Physiol., Vol. 105 : 118). Dies führte jedoch zu keiner meßbaren Steigerung der Saccharosesynthese. Auch die anti-sense-Inhibition der PFP resultierte in keiner nachweisbaren Steigerung der Saccharosesynthese in pflanzlichen Zellen (Hajirezaei et al., 1994, Planta 192 : 16-30). Ferner wurde versucht, durch Veränderung der Konzentration des allosterischen Inhibitors Fruktose-2,6-Bisphosphat Einfluß auf die durch FBPase katalysierte Reaktion zu nehmen (Kruger und Scott, 1994, Biochemical Society Transactions, Transgenic Plants and Plant Biochemistry 22 : 904-909). Hierbei wurde jedoch gefunden, daß eine Erhöhung der Konzentration der Fruktose-2,6-Bisphosphat-Konzentration keinen Effekt auf die Photosyntheserate und nur einen geringen Effekt auf die Synthese von Stärke bzw. Saccharose hat.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, allgemein bei Pflanzen anwendbare gentechnische Verfahren zur Steigerung der Photosyntheserate und folglich der Biomasseproduktion bzw. des Ertrages, sowie rekombinante DNA-Mo leküle für diesen Zweck zur Verfügung zu stellen.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß durch die Expression von DNA-Se quenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bis phosphatase kodieren, im Cytosol pflanzlicher Zellen eine drastische Erhöhung der Photosyntheserate in derart veränderten Pflanzen im Vergleich zu Wildtyppflanzen erreicht werden kann. Es handelt sich dabei vorzugsweise um DNA-Sequenzen, die für FBPasen kodieren, die im Vergleich zu normalerweise in pflanzlichen Zellen vorkommenden FBPasen dereguliert oder unreguliert sind. Dereguliert bedeutet dabei, daß diese Enzyme nicht in der gleichen Weise reguliert werden, wie die in pflanzlichen Zellen normalerweise exprimierten FBPase-En zyme. Insbesondere unterliegen diese Enzyme anderen Regulationsmechanismen, d. h. sie werden nicht in demselben Ausmaß durch die Inhibitoren inhibiert bzw. durch die Aktivatoren aktiviert, die normalerweise pflanzliche FBPasen inhibieren bzw. aktivieren. Sie werden z. B. nicht im gleichen Ausmaß wie normalerweise in Pflanzen vorkommende FBPasen von Fruktose-2,6-Bis phosphat oder von AMP inhibiert.

Unter unregulierten FBPase-Enzymen werden im Rahmen dieser Erfindung FBPase-Enzyme verstanden, die nicht durch AMP, ATP oder Fruktose-2,6-Bis phosphat reguliert werden.

Eine gesteigerte Photosyntheserate bedeutet, daß die Pflanzen, die mit einer DNA-Se quenz transformiert wurden, die zur Synthese einer deregulierten oder unregulierten FBPase im Cytosol der Zellen führt, im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzen eine erhöhte Photosyntheserate aufweisen, vorzugsweise eine Photosyntheserate, die um mindestens 10% erhöht ist, insbesondere eine, die um mindestens 20% erhöht ist, und besonders bevorzugt eine, die um 30-40% erhöht ist.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Verfahren zur Steigerung der Photosyntheserate und des Ertrages in Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß in pflanzliche Zellen eine DNA-Sequenz, die für eine deregulierte oder unregulierte FBPase kodiert, eingeführt wird, die derart mit Steuerelementen für die Transkription verknüpft ist, daß es im Cytosol transformierter Zellen zur Synthese einer aktiven, deregulierten oder unregulierten FBPase kommt.

Ein derartiges Verfahren besteht vorzugsweise aus den folgenden Schritten:

a) Herstellen eines rekombinanten, doppelsträngigen DNA-Moleküls, das folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
- i) einen in pflanzlichen Zellen funktionalen Promotor, der die Transkription einer nachfolgenden DNA-Sequenz gewährleistet,
- ii) eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bisphosphatase kodiert und in sense-Orientierung mit dem Promotor verknüpft ist,
- iii) gegebenenfalls eine 3′-nichttranslatierte Region, die die Termination der Transkription und die Polyadenylierung des Transkriptes gewährleistet,
b) Transfer des gemäß Schritt a) hergestellten DNA-Moleküls in pflanzliche Zellen, und
c) Regeneration ganzer Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen,

wobei es sich bei dem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bis phosphatase um ein dereguliertes oder unreguliertes Enzym handelt.

Das gemäß Verfahrensschritt konstruierte DNA-Molekül stellt eine Expressionskassette dar, die, wenn sie in pflanzliche Zellen eingeführt wird, zur Transkription eines RNA-Moleküls führt, das für ein funktionales dereguliertes oder unreguliertes FBPase-Enzym kodiert.

Für den in dem erfindungsgemäßen Verfahren unter i) genannten Promotor kommt im Prinzip jeder in Pflanzen funktionale Promotor in Betracht. Die Expression der besagten DNA-Sequenzen kann generell in jedem Gewebe einer transformierten Pflanze und zu jedem Zeitpunkt stattfinden, bevorzugt findet sie in photosynthetisch aktiven Geweben statt. Geeignet ist beispielsweise der 35S-Pro motor des Cauliflower-Mosaik-Virus (Odell et al., 1985, Nature 313 : 810-812), der eine konstitutive Expression in allen Geweben einer Pflanze gewährleistet. Es können jedoch auch Promotoren verwendet werden, die nur in einem bestimmten Gewebe der Pflanze zu einer Expression nachgeschalteter Sequenzen führen, vorzugsweise in photosynthetisch aktivem Gewebe (siehe z. B. Stockhaus et al., 1989, EMBO J. 8 : 2245-2251) oder nur zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt (siehe beispielsweise WO/9307279). Neben dem Promotor kann das gemäß Verfahrensschritt a) konstruierte DNA-Mo lekül auch DNA-Sequenzen enthalten, die eine weitere Steigerung der Transkription gewährleisten, beispielsweise sogenannte Enhancer-Elemente, oder DNA-Sequenzen, die im transkribierten Bereich liegen und die eine effizientere Translation der synthetisierten RNA in das entsprechende Protein gewährleisten. Derartige 5′-nichttranslatierte Regionen können von viralen Genen oder geeigneten eukaryontischen Genen gewonnen werden oder synthetisch hergestellt werden. Sie können homolog oder heterolog in bezug auf den verwendeten Promotor sein.

3′-nichttranslatierte DNA-Sequenzen von Genen, die die Termination der Transkription und die Polyadenylierung des entstehenden Transkriptes gewährleisten sind bekannt und beschrieben. Sie sind beliebig gegeneinander austauschbar. Beispiele für derartige Terminationssequenzen sind die 3′- nichttranslatierten Regionen, die das Polyadenylierungssignal des Nopalin-Syn thase-Gens (NOS-Gen) aus Agrobakterien umfassen, oder die 3′- nichttranslatierten Regionen der Gene der Speicherproteine aus Sojabohne, sowie die der Gene der kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-Bisphosphat-Carboxylase (ssRUBISCO).

Bei den unter Verfahrensschritt a)ii) genannten DNA-Sequenzen, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer FBPase kodieren, kann es sich sowohl um prokaryontische, insbesondere bakterielle, als auch um eukaryontische DNA-Sequenzen, d. h. um DNA-Sequenzen aus Pflanzen, Algen, Pilzen oder tierischen Organismen, handeln. Es handelt sich vorzugsweise um DNA-Se quenzen, die für Enzyme kodieren, die im Vergleich zu in Wildtyppflanzen vorkommenden FBPase-Enzymen einer veränderten, vorzugsweise einer verringerten Regulation durch Inhibitoren, insbesondere einer verringerten allosterischen Regulation, unterliegen. Bei den durch die Sequenzen kodierten Enzymen kann es sich sowohl um bekannte, in der Natur vorkommende Enzyme handeln, die eine abweichende Regulation durch verschiedene Substanzen aufweisen, als auch um Enzyme, die durch Mutagenese aus bekannten Enzymen aus Bakterien, Algen, Pilzen, Tieren oder Pflanzen hergestellt wurden.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sieht die Verwendung bakterieller DNA-Sequenzen vor, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer FBPase kodieren. Bakterielle FBPasen weisen den Vorteil auf, daß sie im Vergleich zu pflanzlichen FBPasen nicht durch Fruktose-2,6-Bis phosphat reguliert werden. Ferner werden viele der bakteriellen FBPasen im Gegensatz zu den pflanzlichen und tierischen FBPasen in ihrer enzymatischen Aktivität nicht durch AMP reguliert. DNA-Sequenzen, die für derartige FBPasen kodieren, werden bevorzugt verwendet.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sieht die Verwendung von DNA-Sequenzen aus Alcaligenes eutrophus vor, die für die Fruktose-1,6-Bisphosphatase kodieren. Geeignet sind beispielsweise Sequenzen, die die unter Seq ID No. 1 dargestellte DNA-Sequenz oder eine im wesentlichen identische Nukleotidsequenz aufweisen. Das FBPase-Enzym aus Alcaligenes eutrophus, das die unter Seq ID No. 1 angegebenen Aminosäuresequenz besitzt, weist im Gegensatz zu pflanzlichen und tierischen FBPase-Enzymen keine Inhibition durch AMP auf (Abdelal und Schlegel, 1974, J. Bacteriol. 120 : 304-310). Bei der unter Seq ID No. 1 dargestellten DNA-Sequenz handelt es sich um eine chromosomale DNA-Sequenz. Daneben existiert in Alcaligenes eutrophus eine durch ein Plasmid kodierte FBPase. Diese weist in ihrer Aminosäuresequenz das Motiv GQCMAGKS auf, das bei der chromosomal kodierten FBPase fehlt (J. Koßmann; Diplomarbeit, 1988, Georg-August-Universität, Göttingen, Deutschland). Diese Sequenz ist für die Phosphoribulokinase und viele andere Enzyme als ATP-Bindungsstelle identifiziert oder diskutiert worden. Die ermittelte Konsensussequenz (GXXXXGKT/S) ist in der oben genannten Sequenz vollständig enthalten. Es ist möglich, daß diese Sequenz für die Bindung von ATP und somit für eine Inhibierung der Enzymaktivität durch ATP, wie sie bei verschiedenen bakteriellen FBPasen beobachtet wird, verantwortlich ist.

Bekannt sind neben der genannten DNA-Sequenz aus Alcaligenes eutrophus auch weitere bakterielle DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer FBPase kodieren und die aufgrund ihrer Eigenschaften in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können.

So ist beispielsweise das für FBPase kodierende cfxF-Gen aus Xanthobacter flavus H4-14 (Meÿer et al., 1990, J. Gen. Microbiol. 136 : 2225-2230; Meÿer et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 225 : 320-330) sowie das fbp-Gen aus Rhodobacter spaeroides kloniert worden (Gibson et al., 1990, Biochemistry 29 : 8085-8093; GenEMBL-Datenbank; Zugriffsnummer J02922). Das fbp-Gen aus Rhodobacter spaeroides ist insbesondere geeignet, da das FBPase-Enzym, das durch dieses Gen kodiert wird, nicht durch AMP inhibiert wird.

Ferner ist die DNA-Sequenz des FBPase-kodierenden fbp-Gens aus Escherichia coli bekannt (Sedivy et al., 1984, J. Bacteriol. 158 : 1048-1053; Hamilton et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16 : 8707; Raines et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16 : 7931-7942), sowie eine mutierte FBPase, die insensitiv gegenüber AMP ist (Sedivy et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 1656-1659).

Ferner ist eine DNA-Sequenz aus Nitrobacter vulgaris bekannt, die für FBPase kodiert (GenEMBL-Datenbank; Zugriffsnummer L22884).

Gene, die für FBPase kodieren sind ebenfalls aus Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe isoliert worden (Rogers et al., 1988, J. Biol. Chem. 263 : 6051-6057; GenEMBL-Datenbank; Zugriffsnummer J03207 und J03213).

Bei Säugern ist beispielsweise eine cDNA-Sequenz bekannt, die für die FBPase aus Rattenleber kodiert (El-Maghrabi et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 8430-8434), sowie cDNA-Sequenzen, die für FBPase aus Schweineleber und Schweineniere kodieren (Marcus et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 7161-7165; Williams et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 3080-3082; Burton et al., 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 192 : 511-517; GenEMBL-Datenbank; Zugriffsnummer M86347). Bekannt ist ferner eine cDNA-Sequenz, die für FBPase aus Mensch kodiert (El-Maghrabi, 1993, J. Biol. Chem. 268 : 9466-9472; GenEMBL-Datenbank; Zugriffsnummer M19922 und L10320).

Pflanzliche DNA-Sequenzen, die für FBPasen kodieren, sind ebenfalls bekannt. So beschreiben Hur et al. (1992, Plant Mol. Biol. 18 : 799-802) eine cDNA, die für die cytosolische FBPase aus Spinat kodiert. Dieses Enzym wurde auch auf biochemischer Ebene ausgiebig untersucht (Zimmermann et al., 1978, J. Biol. Chem. 253 : 5952-5956; Ladror et al., 1990, Eur. J. Biochem. 189 : 89-94). Raines et al. (1988, Nucl. Acids. Res. 16 : 7931-7942) beschreiben eine cDNA-Sequenz, die für die chloroplastidäre FBPase aus Weizen kodiert. Eine genomische DNA-Sequenz, die für dieses Enzym kodiert, wird ebenfalls beschrieben (Lloyd et al., 1991, Mol. Gen. Gen. 225 : 209-216). Ferner sind cDNA-Sequenzen, die für FBPasen kodieren, aus Arabidopsis thaliana (GenEMBL-Datenbank; Zugriffsnummer X58148), Beta vulgaris (Zuckerrübe; GenEMBL-Datenbank; Zugriffsnummer M80597), Brassica napus (GenEMBL-Datenbank; Zugriffsnummer L15303), Pisum sativum (GenEMBL-Da tenbank; Zugriffsnummer X68826), Spinacia oleracea (GenEMBL-Datenbank; Zugriffsnummer X61690) und Solanum tuberosum (GenEMBL-Datenbank; Zugriffsnummer X76946) bekannt.

Neben DNA-Sequenzen, die für FBPase-Enzyme kodieren, sind aus einer großen Anzahl von Organismen auch die FBPase-Enzyme gereinigt, biochemisch charakterisiert und zum Teil sequenziert worden, z. B. die cytosolische und die chloroplastidäre FBPase aus Spinat (Zimmermann et al., 1978, J. Biol. Chem. 253 : 5952-5956; Ladror et al., 1990, Eur. J. Biochem. 189 : 89-94; Zimmermann et al., 1976, Eur. J. Biochem. 70 : 361-367; Soulie et al., 1991, Eur. J. Biochem. 195 : 671-678; Marcus und Harrsch, 1990, Arch. Biochem. Biophys. 279 : 151-157; Marcus et al., 1987, Biochemistry 26 : 7029-7035; Schimkat et al., 1990, 181 : 97-103), die FBPase aus Mais (Nishizawa und Buchanan, 1981, J. Biol. Chem. 256 : 6119-6126), die chloroplastidäre FBPase aus Weizen (Leegood und Walker, 1982, Planta 156 : 449-456), die FBPase aus Synechococcus leopoliensis (Gerbling et al., 1986, Plant Physiol. 716-720), aus Polysphondylium pallidum (Rosen, Arch. Biochem. Biophys. 114 : 31-37), aus Kaninchenleber (Pontremoli et al., 1966, Arch. Biochem. Biophys. 114 : 24-30), aus Schwein (Marcus et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79 : 7161-7165), aus Rhodopseudomonas palustris (Springgate und Stachow, 1972, Arch. Biochem. Biophys. 152 : 1-12; Springgate und Stachow, 1972, Arch. Biochem. Biophys. 152 : 13-20), aus E. coli (Fraenkel et al., 1966, Arch. Biochem. Biophys. 114 : 4-12), sowie zwei Isoformen aus Nocardia opaca 1b (Amachi und Bowien, 1979, J. Gen. Microbiol. 113 : 347-356).

Ferner wurden für die FBPasen aus Schwein die Kristallstrukturen der Komplexe des Enzyms mit Fruktose-6-Phosphat, AMP, Fruktose-2,6-Bisphosphat und Magnesium bestimmt (Seaton et al., 1984, J. Biol. Chem. 259 : 8915-8916; Ke et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 5243-5247; Ke et al., 1989, J. Mol. Biol. 212 : 513-539; Ke et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 2989-2993; Ke et al., 1991, Biochemistry 30 : 4412-4420). Hierdurch konnten die Bindungsstellen für Fruktose-6-Phosphat und AMP identifiziert werden, sowie die Aminosäurereste, die mit diesen Substanzen interagieren. Ferner wurde für die FBPase aus Schwein beschrieben, daß das Entfernen Nukleotide, die für die Aminosäurereste 1-25 kodieren, zur Synthese einer FBPase führt, die durch AMP nicht inhibiert wird, aber ihre katalytischen Eigenschaften beibehält (Chatterjee et al., 1985, J. Biol. Chem. 260 : 13553-13559).

Sequenzvergleiche auf der Ebene der Nukleotidsequenzen der FBPase-Gene, sowie auf der Ebene der Aminosäuresequenz der FBPase-Enzyme wurden ebenfalls bereits in umfangreichem Maße durchgeführt (Marcus et al., 1986, Biochem. Biophys. Res. Comm. 135 : 374-381). Dabei stellte sich heraus, daß bestimmte Domänen der FBPase selbst zwischen entfernt verwandten Organismen relativ stark konserviert sind (Gibson et al., 1990, Biochemistry 29 : 8085-8093; Marcus et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 5379-5383; Rogers et al., 1988, J. Biol. Chem. 263 : 6051-6057). So konnte z. B. gezeigt werden, daß die Aminosäurereste, die in FBPase aus Schwein, das katalytische Zentrum bilden, in der FBPase aus Xanthobacter flavus stark konserviert sind (Meÿer et al., 1990, J. Gen. Microbiol. 136 : 2225-2230).

Auch die Sequenzvergleiche der Aminosäuresequenz der FBPase aus Rhodobacter sphaeroides mit den bis dahin bekannten Sequenzen anderer FBPase-Enzyme geben Hinweise auf konservierte Regionen, sowie auf Aminosäurereste, die an der Katalyse bzw. an der Regulation der Enzymaktivität beteiligt sind (Gibson et al., 1990, Biochemistry 29 : 8085-8093).

Die Regulation der FBPase-Enzyme wurde ebenfalls intensiv untersucht und ist ausführlich beschrieben (Tejwani, 1983, Advances in Enzymology, Vol. 54 : 121-194).

Insgesamt geben die bisher bekannten Daten über DNA-Sequenzen, die FBPase-En zyme kodieren, über Aminosäuresequenzen von FBPase-Enzymen, über Kristallstrukturen, sowie über die Regulation und über kinetische und biochemische Eigenschaften der bisher bekannten FBPasen ein derart detailliertes Bild, daß es aufgrund dieser Informationen möglich ist, gezielt Mutationen in verfügbare DNA-Sequenzen einzuführen, die zu einer veränderten Regulation der Enzymaktivität des synthetisierten Proteins führen. Wie oben bereits erwähnt, ist es beispielsweise möglich, die Inhibition durch AMP bei der FBPase aus Schwein dadurch aufzuheben, daß man die 25 N-teminalen Aminosäuren des Enzyms entfernt. Die katalytische Aktivität des Enzyms wird dadurch nicht beeinflußt. Aufgrund der starken Konservierung der FBPase-Gene sollte es daher möglich sein, auch bei anderen FBPase-Enzymen eine Insensitivität gegenüber AMP dadurch hervorrufen zu können, daß ein ausreichend langer Bereich am N-Terminus des Enzyms deletiert wird.

Bekannt ist ferner im Falle der chromosomal bzw. plasmidär kodierten FBPasen aus Alcaligenes eutrophus, daß das plasmidär kodierte Enzym, eine charakteristische ATP-Bin dungsstelle aufweist, die dem chromosomal kodiertem Enzym fehlt (siehe oben). Es ist daher möglich, bakterielle DNA-Sequenzen, die für FBPasen kodieren und die durch ATP inhibiert werden, daraufhin zu untersuchen, ob sie eine vergleichbare ATP-Bindungsstelle aufweisen, und durch gängige molekularbiologische Techniken diese ATP-Bindungsstelle zu inaktivieren oder zu entfernen, um ein Enzym produzieren zu können, daß durch ATP nicht inhibierbar ist.

Ähnliches gilt für die Veränderung der Sensitivität gegenüber dem Inhibitor Fruktose-2,6-Bisphosphat. Die durch Röntgenstruktur-Analyse gewonnenen Daten von Kristallen der FBPase aus Schwein, sowie die Analyse verschiedener Mutanten ermöglichen inzwischen die Charakterisierung der Bindungsstelle für Fruktose-2,6- Bisphosphat im aktiven Zentrum der FBPase. Im Fall der FBPase aus Schwein wurden beispielsweise Aminosäurereste, von denen aufgrund der strukturellen Daten angenommen wird, daß sie von Bedeutung sind für die Funktion des Enzyms, durch punktspezifische Mutagenese modifiziert (Giroux et al., 1994, J. Biol. Chem. 269 : 31404-31409 und Referenzen darin). So konnte gezeigt werden, daß die Aminosäure Arginin 243 der FBPase aus Schweinenieren beteiligt ist an der Substratbindung, sowie an der Inhibition durch Fruktose-2,6-Bisphosphat. Durch Austausch dieser Aminosäure gegen einen Alaninrest konnte ein funktionales FBPase-Enzym hergestellt werden, dessen Affinität für Fruktose-2,6-Bisphosphat im Vergleich zum Wildtypenzym um den Faktor 1000 verringert ist, wohingegen die Affinität zu dem Substrat Fruktose-1,6-Bisphosphat nur um den Faktor 10 verringert ist (Giroux et al., 1994, J. Biol. Chem. 269 : 31404-31409). Ferner konnte für FBPase aus Rattenleber gezeigt werden, daß das Entfernen eines Lysinrestes im aktiven Zentrum, der ebenfalls für die Bindung von Fruktose-1,6-Bisphosphat und Fruktose-2,6-Bisphosphat, von Bedeutung ist, in einem Enzym resultiert, daß eine um den Faktor 1000 verringerte Affinität zu dem Inhibitor Fruktose-2,6-Bis phosphat besitzt (El-Maghrabi et al., 1992, J. Biol. Chem. 267 : 6526-6530). Die Mutagenisierung der relevanten Aminosäurereste sollte daher auch in diesem Fall die Erzeugung von Mutanten ermöglichen, die in ihrer Regulation durch Fruktose-2,6-Bisphosphat gegenüber Wildtypproteinen verändert sind. Aufgrund der starken Konservierung der Aminosäuresequenz der FBPase-Enzyme, insbesondere im Bereich des aktiven Zentrums, sollte es ferner möglich sein, Ergebnisse, die an Mutanten des Enzyms eines Organismus erhalten wurden, auf Enzyme, die aus anderen Organismen stammen, zu übertragen.

Eine weitere Möglichkeit zur Identifizierung von Aminosäureresten, die für die Katalyse sowie für die Inhibition durch Fruktose-2,6-Bisphosphat bedeutsam sind, besteht in der computergestützten Simulation der Molekülstruktur. Aminosäurereste, die auf diese Weise als relevant identifiziert werden, können anschließend gezielt durch punktspezifische Mutagenese verändert und Mutanten auf ihre Eigenschaften hin untersucht werden.

Für eine besonders effiziente Steigerung der Photosyntheserate bzw. der Synthese von Fruktose-6-Phosphat aus Fruktose-1,6-Bisphosphat werden FBPase-Enzyme verwendet, die nur noch einer reduzierten Regulation durch die Inhibitoren der pflanzlichen FBPase-Enzyme unterliegen (deregulierte FBPase-Enzyme), vorzugsweise Enzyme, die überhaupt keiner Regulation mehr unterliegen (unregulierte FBPase-Enzyme), wobei jedoch jeweils die katalytische Aktivität weitgehend erhalten bleibt. Die kodierenden Regionen von FBPase-Genen aus Bakterien, Pilzen, Tieren oder Pflanzen können in E. coli oder einem anderen geeigneten Wirt nach dem Fachmann bekannten Methoden mutagenisiert werden und anschließend hinsichtlich einer erhöhten FBPase-Aktivität analysiert werden. Die Einführung von Mutationen kann dabei zum einen gerichtet erfolgen (z. B. durch "site-directed mutagenesis") unter der Verwendung spezifischer Oligonukleotide, oder ungerichtet. Im Fall der ungerichteten Mutagenese gibt es beispielsweise die Möglichkeit der Amplifikation der betreffenden DNA-Sequenzen mittels der Polymerasekettenreaktion in Gegenwart von Mn²⁺-Ionen anstatt Mg²⁺-Ionen, bei der eine erhöhte Fehlerrate auftritt, oder die Vermehrung der betreffenden DNA-Moleküle in dem E. coli-Stamm XL1-Red, der eine hohe Fehlerrate bei der Replikation der in die Bakterien eingebrachten Plasmid-DNA aufweist.

Die mutagenisierten DNA-Sequenzen, die für FBPase-Enzyme kodieren, werden anschließend zur Analyse der FBPase-Aktivität in einen geeigneten Wirt eingebracht, vorzugsweise in einen E. coli-Stamm der FBPase-defizient ist. Ein derartiger Stamm ist beispielsweise der E. coli-Stamm DF657 (Sedivy et al., 1984, J. Bacteriol. 158 : 1048-1053). Zur Identifizierung von Klonen, die ein funktionales FBPase-Enzym exprimieren, werden die transformierten Zellen auf Minimalmedium ausplattiert, das als Kohlenstoffquelle beispielsweise Glycerin und Succinat (jeweils in der Konzentration von 0,4%) enthält. Zellen, die keine funktionale FBPase exprimieren können auf einem derartigen Medium nicht wachsen. Einen ersten Anhaltspunkt für die Aktivität der exprimierten FBPase können die Wachstumsraten transformierter, lebensfähiger Klone geben. Um Mutationen im Promotorbereich auszuschließen, die in einer erhöhten FBPase-Ak tivität resultieren, müssen die mutierten kodierenden DNA-Sequenzen, die ein Wachstum auf Minimalmedium ermöglichen, in nicht mutagenisierte Vektoren umkloniert werden und erneut auf eine FBPase-Aktiviät hin untersucht werden (wiederum durch Komplementation eines FBPase-defizienten E. coli-Stammes). Mutanten, die auch in der zweiten Screening-Runde eine Komplementation eines FBPase-defizienten E. coli-Stammes bewirken, werden hinsichtlich der FBPase-Ak tivität in Gegenwart der verschiedenen Inhibitoren und Aktivatoren verwendet. Hierzu werden die betreffenden Zellen aufgeschlossen, und die FBPase-Aktivität wird in vitro mittels eines Enzym-Tests nachgewiesen. Bei einem derartigen Test wird der Puffer, in dem der Test durchgeführt wird im Hinblick auf die Eigenschaften der FBPase, die mutagenisiert wurde, derart gewählt, daß pH-Op timum und Salzkonzentrationen im optimalen Bereich liegen. Der Puffer muß ferner das Substrat Fruktose-1,6-Bisphosphat (ca. 1 mM) und MgCl₂ (ca. 5 mM) enthalten. Werden pflanzliche oder tierische FBPasen exprimiert, sollte ein SH-Schutz gruppenreagenz wie DTT oder β-Mercaptoethanol im Puffer vorhanden sein. Die Messung der Enzymaktivität beruht darauf, daß dem Ansatz zwei weitere Enzyme, Phosphoglukose-Isomerase und Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase aus Hefe, die das Produkt der FBPase-Reaktion, die Fruktose-6-Phosphat weiter umsetzen, sowie NADP zugesetzt werden. Die Phosphoglukose-Isomerase überführt die Fruktose-6-Phosphat in Glukose-6-Phosphat, die wiederum von der Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase unter Bildung von NADPH in 6-Phosphoglucono-8-Lacton umgesetzt wird. Die Zunahme an NADPH läßt sich photometrisch durch Messung der Absorption bei 334 nm nachweisen. Anhand dieser Zunahme ist damit auch die Bestimmung der FBPase-Aktivität möglich. Durch Zusatz der verschiedenen Inhibitoren (AMP, ATP, Fruktose-2,6-Bisphosphat) läßt sich mittels des beschriebenen Enzym-Tests der Einfluß der Inhibitoren auf die Enzymaktivität der mutierten FBPasen bestimmen.

Durch Vergleiche mit der Aktivität des unmutierten Enzyms können geeignete Mutanten ausgewählt werden. DNA-Sequenzen, die für deregulierte oder unregulierte mutierte Proteine kodieren, können anschließend mit Hilfe bekannter Methoden in Pflanzen eingebracht und zur Expression gebracht werden.

Die Erzeugung von Mutationen in FBPase-Genen sowie die Selektion geeigneter Mutanten in einem FBPase-defizienten E. coli-Stamm kann ebenfalls durchgeführt werden wie in Sedivy et al. (1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 1656-1659) beschrieben. Durch dieses Verfahren gelang bereits die Isolierung einer AMP-in sensitiven FBPase.

Der Transfer des gemäß Verfahrensschritt a) hergestellten DNA-Moleküls erfolgt vorzugsweise unter Verwendung von geeigneten Plasmiden, insbesondere von Plasmiden, die eine stabile Integration des DNA-Moleküls in das Genom transformierter Pflanzenzellen gewährleisten, beispielsweise binären Plasmiden. Geeignete Pflanzentransformationsvektoren umfassen z. B. Vektoren, die von dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens abgeleitet wurden, sowie diejenigen, die von Herrera-Estrella et al. (1983, Nature 303 : 209), Bevan (1984, Nucl. Acids Res. 12 : 8711-8721), Klee et al. (1985, Bio/Technology 3 : 637-642) und in der EP-Anmeldung 120 516 (Schilperoort et al.) beschrieben wurden.

Zur Transformation gemäß Verfahrensschritt b) mit dem gemäß Verfahrensschritt a) konstruierten DNA-Molekül kommen grundsätzlich Zellen aller Pflanzenspezies in Frage. Von Interesse sind sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Für verschiedene monokotyle und dikotyle Pflanzenspezies sind bereits Transformationstechniken beschrieben worden. Bevorzugt werden in dem Verfahren Zellen landwirtschaftlicher Nutzpflanzen verwendet, insbesondere von Getreidearten (z. B. Roggen, Hafer, Gerste, Weizen), Kartoffel, Mais, Reis, Raps, Erbse, Zuckerrübe Sojabohne, Tabak, Baumwolle, Tomate etc., oder Zellen von Zierpflanzen.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls die über das Verfahren erhältlichen transgenen Pflanzenzellen und transgenen Pflanzen, die aufgrund der Expression einer deregulierten oder unregulierten FBPase im Cytosol der Zellen, eine Steigerung der Photosyntheserate und folglich eine erhöhte Biomasseproduktion aufweisen.

Die besagten transgenen Pflanzenzellen bzw. transgenen Pflanzen sind dadurch gekennzeichnet, daß sie ein rekombinantes DNA-Molekül, vorzugsweise stabil in das Genom integriert, enthalten, das ein gemäß Verfahrensschritt a) konstruiertes DNA-Molekül umfaßt, bei dem eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer FBPase kodiert, in sense-Orientierung an einen Promotor geknüpft ist, wobei es sich bei der FBPase um ein dereguliertes oder unreguliertes Enzym handelt. Gegenstand der Erfindung sind daher auch Pflanzenzellen und Pflanzen, die ein rekombinantes DNA-Molekül enthalten, das aus folgenden Sequenzen aufgebaut ist:

a) einen in pflanzlichen Zellen funktionalen Promotor, der die Transkription einer nachfolgenden DNA-Sequenz gewährleistet,
b) eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bisphosphatase kodiert und in sense-Orientierung mit dem Promotor verknüpft ist,
c) gegebenenfalls eine 3′-nichttranslatierte Region, die die Termination der Transkription und die Polyadenylierung des Transkriptes gewährleistet,

Bei den Pflanzen handelt es sich vorzugsweise um Nutzpflanzen, insbesondere um die oben erwähnten Nutzpflanzen.

Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen rekombinante DNA-Moleküle dar, die folgende DNA-Sequenzen umfassen:

Die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer FBPase kodierende DNA-Se quenz kann sowohl aus prokaryontischen als auch aus eukaryontischen Organismen stammen, insbesondere aus Bakterien, Pflanzen, Algen, Pilzen oder tierischen Organismen.

Vorzugsweise handelt es sich bei der DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität eine FBPase kodiert, um eine Sequenz aus Alcaligenes eutrophus, insbesondere um eine Sequenz mit der unter Seq ID No. 1 angegebenen Nukleotidabfolge, oder um eine DNA-Sequenz, die eine im wesentlichen damit identische Nukleotidabfolge aufweist und die enzymatische Aktivität einer FBPase besitzt.

Auch die in Pflanzenzellen und Pflanzen enthaltenen DNA-Sequenzen, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer FBPase kodieren, können aus den entsprechenden Organismen stammen.

Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle besteht in einem DNA-Molekül, das folgende DNA-Sequenzen umfaßt:

a) einen 35S-Promotor
b) eine DNA-Sequenz mit der unter Seq ID No. 1 angegebenen Nukleotidabfolge, die in sense-Orientierung an den Promotor geknüpft ist, und
c) die Terminationssequenz des Nopalinsynthase-Gens aus Agrobacterium tumefaciens.

Ein derartiges DNA-Molekül wird in Form des Plasmids p35S-FBPase-Ae bereitgestellt.

Bei den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen handelt es sich vorzugsweise um isolierte und gereinigte DNA-Moleküle, die im wesentlichen frei von Kontaminationen sind.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung von DNA-Se quenzen, die für deregulierte oder unregulierte FBPase-Enzyme kodieren, zur Transformation pflanzlicher Zellen sowie zur Herstellung von Pflanzen, die im Vergleich zu Wildtyppflanzen eine gesteigerte Photosyntheserate oder eine gesteigerte Biomasseproduktion aufweisen.

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt das Plasmid p35S-FBPase-Ae
Dabei bedeuten:
A= Fragment A: CaMV 35S-Promotor, nt 6909-7437 (Franck et al. (1980) Cell 21 : 285-294)
B = Fragment B: DNA-Sequenz aus Alcaligenes eutrophus kodierend die chromosomal kodierte Fruktose-1,6-Bisphosphatase; 1136 bp-Fragment mit der unter Seq ID No. 1 dargestellten DNA-Se quenz Orientierung zum Promotor: sense
C = Fragment C: nt 11748-11939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3 : 835-846)
In den Beispielen werden die folgenden Standardverfahren und Spezialtechniken verwendet:

1. Klonierungsverfahren

Zur Klonierung in E. coli wurde der Vektor pUC18 verwendet.

Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Sci. 66 : 221-230) kloniert.

2. Bakterienstämme

Für die pUC-Vektoren und für die pBinAR-Konstrukte wurde der E. coli-Stamm DH5α (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) verwendet.

Die Transformation der Plasmide in die Tabakpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes C58C1 pGV2260 durchgeführt (Deblaere et al., 1985, Nucl. Acids Res. 13 : 4777 : 4788).

3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens

Der Transfer der DNA erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen & Willmitzer (1988, Nucleic Acids Res. 16 : 9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim & Doly (1979, Nucleic Acids Res. 7 : 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.

4. Transformation von Kartoffeln

Zehn kleine mit dem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur (Solanum tuberosum L.cv. Desiree) wurden in 10 ml MS-Medium (Murashige & Skoog (1962) Physiol. Plant. 15 : 473) mit 2% Saccharose gelegt, welches 50 ml einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem, leichtem Schütteln erfolgte eine weitere Inkubation für 2 Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter zur Kallusinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 5 mg/l Naphthylessigsäure, 0,2 mg/l Benzylaminopurin, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin, und 0,80.% Bacto Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sproßinduktion auf MS-Me dium mit 1,6% Glukose, 1,4 mg/l Zeatinribose, 20 mg/l Naphthylessigsäure, 20 mg/l Giberellinsäure, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin, und 0.80.% Bacto Agar gelegt.

5. Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten

Die radiokative Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA-Ran dom Primer Labelling Kits der Firma Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.

6. Northern Blot-Analyse

RNA wurde nach Standardprotokollen aus Blattgewebe von Pflanzen isoliert. 50 µg der RNA wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt (1,5% Agarose, 1 × MEN-Puffer, 16,6% Formaldehyd). Das Gel wurde nach dem Gellauf kurz in Wasser gewaschen. Die RNA wurde mit 20 × SSC mittels Kapillarblot auf eine Nylonmembran vom Typ Hybond N (Amersham UK) transferiert. Die Membran wurde anschließend bei 80°C unter Vakuum für zwei Stunden gebacken.

Die Membran wurde in NSEB-Puffer für 2 h bei 68°C prähybridisiert und anschließend in NSEB-Puffer über Nacht bei 68°C in Gegenwart der radioaktiv markierten Probe hybridisiert.

7. Pflanzenhaltung

Kartoffelpflanzen wurden im Gewächshaus unter folgenden Bedingungen gehalten:

Lichtperiode: 16 h bei 25000 Lux und 22°C
Dunkelperiode: 8 h bei 15°C
Luftfeuchte: 60%

Verwendete Medien und Lösungen

20 × SSC:

175.3 g NaCl
88.2 g Natrium-Citrat
ad 1000 ml mit ddH₂O
pH 7,0 mit 10 N NaOH

10 × MEN:

200 mM MOPS
50 mM Natriumacetat
10 mM EDTA
pH 7,0

NSEB-Puffer:

0,25 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2
7% SDS
1 mM EDTA
1% BSA (w/v)

Die nachfolgenden Beispiele erläutern den Gegenstand der Erfindung ohne ihn einzuschränken, wobei die Verwendung einer DNA-Sequenz aus Alcaligenes eutrophus, die für eine deregulierte Fruktose-1,6-Bisphosphatase kodiert, zur Transformation von Kartoffelpflanzen mit dem Ziel der Expression dieses Enzyms im Cytosol transformierter Pflanzenzellen beschrieben wird, was in den transformierten Pflanzen zu einer Erhöhung der Photosyntheserate führt. Analog zu dem dargestellten Beispielen können auch andere Pflanzenspezies insbesondere landwirtschaftliche Nutzpflanzen wie z. B. Raps, Zuckerrübe, Getreidearten, Mais, Baumwolle, Tomate, Melone, etc. verändert werden. Ferner können neben der beschriebenen DNA-Sequenz aus Alcaligenes eutrophus auch andere DNA- Sequenzen, die für eine deregulierte oder unregulierte FBPase kodieren verwendet werden.

Beispiel 1 Konstruktion des Plasmids p35S-FBPase-Ae und Einführung des Plasmids in das Genom von Kartoffelpflanzen

Ein 1136 bp langes DNA-Fragment mit der unter Seq ID No. 1 angegebenen DNA-Se quenz wurde mit Hilfe der Restriktionsendonukleasen Nsi I und Bal I aus einem geeigneten Plasmid isoliert. Dieses DNA-Fragment umfaßt die gesamte kodierende Region für die chromosomal kodierte FBPase aus Alcaligenes eutrophus. Die überhängenden Enden wurden mit Hilfe der T4-DNA-Polymerase aufgefüllt und das Fragment wurde in den mit Sma I linearisierten Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Sci. 66 : 221-230) inseriert. Der Vektor pBinAR ist ein Derivat des binären Vektors Bin19 (Bevan (1984) Nucleic Acids Res. 12 : 8711-8721; kommerziell erhältlich bei Clontech Laboratories, Inc., USA).

pBinAR wurde folgendermaßen konstruiert:
Ein 529 bp langes Fragment, das die Nukleotide 6909-7437 des 35S-Promotor des Cauliflowermosaic-Virus umfaßt (Franck et al., 1980, Cell 21 : 285-294), wurde als EcoR I/Kpn I-Fragment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., Nucl. Acids Res. 14 : 5857-5868) isoliert und zwischen die EcoR I- und die Kpn I-Schnittstellen des Polylinkers von pBin19 ligiert. Dabei entstand das Plasmid pBin19-A.

Aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al., Nature 303 : 209-213) wurde mit Hilfe der Restriktionsendonukleasen Pvu II und Hind III ein 192 bp langes Fragment isoliert, das das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 : 835-846) umfaßt (Nukleotide 11749-11939). Nach Addition von Sph I-Linkern an die Pvu I-Schnittstelle wurde das Fragment zwischen die Sph I- und Hind III-Schnittstellen pBin19-A ligiert. Dabei entstand pBinAR.

Das DNA-Fragment wurde derart in den Vektor inseriert, daß die kodierende Region in sense-Orientierung zum 35S-Promotor orientiert war.

Das resultierende Plasmid wurde p35S-FBPase-Ae genannt und ist in Fig. 1 dargestellt.

Durch die Insertion des DNA-Fragmentes entsteht eine Expressionskassette, die folgendermaßen aus den Fragmenten A, B und C aufgebaut ist (Fig. 1):

Das Fragment A (529 bp) enthält den 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al. (1980) Cell 21 : 285-294).

Das Fragment B umfaßt die proteinkodierende Region für die chromosomal kodierte FBPase aus Alcaligenes eutrophus. Dieses wurde wie oben beschrieben als Nsi I/BalI-Fragment isoliert und in sense Orientierung an den 35S-Promotor in pBinAR fusioniert.

Fragment C (192 bp) enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3 : 835-846).

Die Größe des Plasmids p35S-FBPase-Ae beträgt ca. 12 kb.

Der Vektor p35S-FBPase-Ae wurde mittels Agrobacterium tumefaciens vermittelter Transformation in Kartoffelpflanzenzellen transferiert. Aus den transformierten Zellen wurden intakte Pflanzen regeneriert.

Die Überprüfung des Erfolges der genetischen Veränderung der Pflanzen erfolgt durch Analyse der Gesamt-RNA in einer Northern-Blot-Analyse bezüglich der Synthese einer mRNA, die für die FBPase aus A. eutrophus kodiert. Hierzu wird Gesamt-RNA aus Blättern transformierter Pflanzen nach Standardmethoden isoliert, gelelektrophoretisch auf einem Agarosegel aufgetrennt, auf eine Nylonmembran transferiert und mit einer radioaktiv markierten Probe hybridisiert, die die unter Seq ID No. 1 dargestellte Sequenz oder einen Teil dieser Sequenz aufweist. Erfolgreich transformierte Pflanzen weisen in der Northern-Blot-Analyse eine Bande auf, die das spezifische Transkript des FBPase-Gens aus Alcaligenes eutrophus darstellt.

Beispiel 2 Analyse transformierter Kartoffelpflanzen

Kartoffelpflanzen, die mit dem Plasmid p35S-FBPase-Ae transformiert worden waren, wurden hinsichtlich der Photosyntheserate im Vergleich zu nichttransformierten Pflanzen untersucht.

Die Messung der Photosyntheseraten erfolgte dabei mit Blattscheiben in einer Blattscheiben-Sauerstoffelektrode (LD2; Hansatech; Kinks Lynn, England). Die Messung wurde wie in von Schaewen et al. (1990, EMBO J. 9 : 3033-3044) beschrieben durchgeführt bei CO₂-Sättigung und 20°C. Die Lichtintensität betrug 550-600 PAR (photosynthetic active radiation).

Die Ergebnisse einer derartigen Bestimmung der Photosyntheserate von Pflanzen, die mit dem Plasmid p35S-FBPase-Ae (UF1-7) transformiert worden waren im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen ist in der folgenden Tabelle gezeigt.

Im Fall der Wildtyppflanzen wurden 10 Messungen durchgeführt, im Fall der transformierten Kartoffelpflanzen UF1-7 wurden 5 Messungen durchgeführt.

Claims

1. Verfahren zur Steigerung der Photosyntheserate und des Ertrages in Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß in pflanzliche Zellen eine DNA-Sequenz, die für eine deregulierte oder unregulierte FBPase kodiert, eingeführt wird, die derart mit Steuerelementen für die Transkription verknüpft ist, daß es im Cytosol transformierter Zellen zur Synthese einer aktiven, deregulierten oder unregulierten FBPase kommt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus folgenden Schritten besteht

wobei es sich bei dem Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bisphosphatase um ein dereguliertes oder unreguliertes Enzym handelt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA-Se quenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bis phosphatase kodiert, um eine prokaryontische DNA-Sequenz handelt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA-Se quenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bis phosphatase kodiert, um eine DNA-Sequenz aus dem Mikroorganismus Alcaligenes eutrophus handelt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA-Se quenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bis phosphatase kodiert, um eine DNA-Sequenz mit der unter Seq ID No. 1 angegebenen Nukleotidabfolge oder einer im wesentlichen identischen Nukleotidabfolge handelt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA-Se quenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bis phosphatase kodiert, um eine DNA-Sequenz aus Pflanzen oder Algen handelt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA-Se quenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bis phosphatase kodiert, um eine DNA-Sequenz aus Pilzen handelt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA-Se quenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bis phosphatase kodiert, um eine DNA-Sequenz aus einem tierischen Organismus handelt.

9. Rekombinante DNA-Moleküle, die folgende DNA-Sequenzen umfassen:

10. DNA-Moleküle gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bisphosphatase kodiert, um eine prokaryontische DNA-Sequenz handelt.

11. DNA-Moleküle gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bisphosphatase kodiert, um eine DNA-Sequenz aus dem Mikroorganismus Alcaligenes eutrophus handelt.

12. DNA-Moleküle gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bisphosphatase kodiert, um eine DNA-Sequenz mit der unter Seq ID No. 1 angegebenen Nukleotidabfolge oder einer im wesentlichen identischen Nukleotidabfolge handelt.

13. DNA-Moleküle gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bisphosphatase kodiert, um eine DNA-Sequenz aus Pflanzen oder Algen handelt.

14. DNA-Moleküle gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bisphosphatase kodiert, um eine DNA-Sequenz aus Pilzen handelt.

15. DNA-Moleküle gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bisphosphatase kodiert, um eine DNA-Sequenz aus einem tierischen Organismus handelt.

16. Pflanzenzellen, die ein rekombinantes DNA-Molekül enthalten, das aus folgenden Sequenzen aufgebaut ist:

17. Pflanzenzellen gemäß Anspruch 16, in denen die DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bisphosphatase kodiert, aus einem prokaryontischen Organismus stammt.

18. Pflanzenzellen gemäß Anspruch 17, in denen die DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bisphosphatase kodiert, aus dem Mikroorganismus Alcaligenes eutrophus stammt.

19. Pflanzenzellen gemäß Anspruch 18, in denen die DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bisphosphatase kodiert, die unter Seq ID No. 1 angegebenen Nukleotidabfolge oder eine im wesentlichen identische Nukleotidabfolge aufweist.

20. Pflanzenzellen gemäß Anspruch 16, in denen die DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bisphosphatase kodiert, aus Pflanzen oder Algen stammt.

21. Pflanzenzellen gemäß Anspruch 16, in denen die DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bisphosphatase kodiert, aus Pilzen stammt.

22. Pflanzenzellen gemäß Anspruch 16, in denen die DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Fruktose-1,6-Bisphosphatase kodiert, aus einem tierischen Organismus stammt.

23. Pflanzen bestehend aus Pflanzenzellen gemäß den Ansprüchen 16-22.

24. Pflanzen gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Nutzpflanzen handelt.

25. Pflanzen gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Pflanze aus der Gruppe Tomate, Kartoffel, Zuckerrübe, Mais, Reis, Gerste, Roggen, Hafer, Weizen, Erbse, Tabak, Baumwolle, Raps, Sojabohne und handelt.

26. Pflanzen gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Zierpflanzen handelt.

27. Verwendung von DNA-Sequenzen, die für deregulierte oder unregulierte FBPase-Enzyme kodieren, zur Transformation pflanzlicher Zellen.

28. Verwendung von DNA-Sequenzen, die für deregulierte oder unregulierte FBPase-Enzyme kodieren, zur Herstellung von Pflanzen, die im Vergleich zu Wildtyppflanzen eine gesteigerte Photosyntheserate oder eine gesteigerte Biomasseproduktion aufweisen.