DE4035756A1 - Neue plasmide zur herstellung von im habitus und ertrag veraenderten transgenen pflanzen - Google Patents
Neue plasmide zur herstellung von im habitus und ertrag veraenderten transgenen pflanzenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Plasmide, die eine DNA-Sequenz ent
halten, die für ein die Biosynthese löslicher Zucker modifizierendes
Protein kodiert und Pflanzenzellen, enthaltend diese Plasemide zur Her
stellung von in Habitus und Ertrag veränderten transgenen Pflanzen, wobei
die Pflanzen durch den Transfer und die Expression von in den Zuckermeta
bolismus oder die Zuckerpartitionierung innerhalb einer Pflanze ein
greifenden Genen verändert sind.
Das Wachstum, die Entwicklung und der Ertrag einer Nutzpflanze oder einer
Zierpflanze hängt von der Energie ab, die diese Pflanze durch die Fixierung
von CO2 in Kohlehydrate während der Photosynthese gewinnt. Die primären
Orte für die Photosynthese sind das Blatt und zu einem geringeren Ausmaß
das Stammgewebe, wohingegen andere Organe von Pflanzen, wie Wurzeln, Samen
oder Knollen nicht wesentlich zur Bildung von Photoassimilaten beitragen,
sondern im Gegenteil in ihrem Wachstum von der Versorgung durch photosyn
thetisch aktive Organe abhängig sind. Dieses bedeutet, daß es einen Fluß
von photosynthetisch gewonnener Energie von photosynthetisch aktiven Gewe
ben zu photosynthetisch inaktiven Teilen einer Pflanze gibt.
Die photosynthetisch aktiven Gewebe werden als Quellen oder "sources" be
zeichnet. Sie werden als Nettoexporteure des fixierten Kohlendioxids defi
niert. Die photosynthetisch inaktiven Teile einer Pflanze werden als Senken
oder "sinks" bezeichnet. Sie werden als Nettoimporteure des photosynthe
tisch fixierten Kohlendioxids definiert.
Es ist anzunehmen, daß sowohl die effiziente Nutzung von Photosynthesepro
dukten als auch ihre Verteilung innerhalb einer Pflanze diese in mehrerer
Hinsicht stark beeinflußt. Als Beispiel seien genannt der Habitus von
Pflanzen. Sich neu entwickelnde Organe wie sehr junge Blätter oder auch an
dere Bereiche wie Wurzel und Samen sind völlig von der Photosyntheselei
stung der "sources" abhängig. Das bedeutet, daß die Entwicklung solcher Or
gane abhängig ist von der Verteilung der in den "sources" gebildeten Photo
assimilate innerhalb der Pflanze. Die Möglichkeit der Ausbildung von jungen
Blättern oder auch der Ausbildung von Wurzeln könnte drastische Auswirkun
gen auf den Habitus einer Pflanze wie z. B. die Größe einer Pflanze, den In
ternodienabstand, die Größe und Form eines Blattes, das Aussehen eines
Blattes und die Menge und Form der gebildeten Wurzel haben. Weiterhin soll
te die Verteilung von Photoassimilaten von ganz entscheidender Bedeutung
für den Ertrag einer Pflanze sein. So hat sich die Gesamtphotosyntheselei
stung des Weizens in den letzten Jahrzehnten nicht wesentlich verändert,
während der für den Menschen erntebare Ertrag der Weizenpflanzen angestie
gen ist. Dies ist im wesentlichen darauf zurückzuführen, daß das Verhältnis
zwischen konkurrierenden "sinks" dahingehend geändert wurde, daß die für
den Ertrag wichtigen "sinks" wie Samen wesentlich mehr Photoassimilat auf
nahmen als andere, für den Ertrag unbedeutende Bereiche der Pflanze, wie
z. B. der Stengel. Durch eine in diesem Fall Verkürzung des Halmes konnte
somit ein für den Menschen sehr viel günstigeres "sink"-zu "source"-
Verhältnis bei Weizen erzielt werden. Dieses unterstreicht die Wichtigkeit
der Verteilung von in den primären "sources" gebildeten Photoassimilaten in
höheren Pflanzen in bezug auf sowohl Habitus als auch Ertrag von Pflanzen.
Die Veränderungen des Habitus, der Resistenz gegen Trockenheit und/oder
Frost und insbesondere die Veränderung des Ertrages der Pflanzen stellen
wesentliche Verbesserungen gegenüber bekannten Pflanzen dar.
Neue biotechnologische Verfahren zur genetischen Veränderung dikotyler und
monokotyler Pflanzen sind bekannt (Gasser und Fraley, 1989, Science 244
1293-1299).
Es ist unbekannt, durch welche biochemischen Mechanismen das Verhältnis von
"sink" und "source" reguliert wird.
Bei den meisten Pflanzen werden Photoassimilate innerhalb einer Pflanze in
Form von Zuckern, und zwar präferentiell in der Form von Saccharose ver
teilt. Dadurch, daß Saccharose die wichtigste Transportform für Kohlen
hydrate von " source" nach "sinks" darstellt, könnte eine andere wesentliche
Determinante für die Stärke einer "source", und damit die effiziente Ver
sorgung von "sinks", die Verfügbarkeit und der Gehalt an löslichen Zuckern
(verschiedene Mono-, Di- und Trisaccharide, wie z. B. Fruktose, Glukose und
Saccharose), in den Blättern sein. So sollte z. B. ein höherer Gehalt an
Saccharose in den "source" -Blättern zu einer verstärkten Versorgung der
"sinks" führen und damit auch zu einem erhöhten Anteil an Photoassimilaten
in den erntebaren Organen. Dies würde zu einer Ertragssteigerung führen.
Für die Partitionierung von Kohlehydraten zwischen "sink"- und "source"-
Teilen einer Pflanze sollte das Verhältnis zwischen löslichen Zuckern und
Stärke in den "source"-Blättern von entscheidender Bedeutung sein. Eine
effizientere Versorgung von "sinks" mit Saccharose aus den "source"-
Blättern sollte zu einer Veränderung des Habitus der Pflanze, insbesondere
aber zu einer Erhöhung des Ertrages führen, der in den meisten Fällen durch
den "sink"-Speicher, wie Samen und Knolle oder Wurzel, festgelegt wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nun, in ihrem Habitus wie Größe,
Blattform, Internodienabstand, Zellwandaufbau, Samen-, Knollen- und
Wurzelausbildung, sowie insbesondere in ihrem Ernteertrag veränderte
Pflanzen bereitzustellen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß in Pflanzen gezielt
Gene, die in den Zuckermetabolismus oder in die Zuckerpartionierung ein
greifen, eingeführt und in transgenen Pflanzen exprimiert werden, was zu
einer Erhöhung des Anteils von in Form von löslichen Zuckern in den
"source" -Blättern vorliegenden Photoassimilaten in diesen transgenen
Pflanzen führt.
Hierzu werden Plasmide bereitgestellt, die eine DNA-Sequenz enthalten, die
für ein die Biosynthese löslicher Zucker-modifizierendes Protein kodiert,
wobei diese Plasmide in Pflanzenzellen eingeführt werden und diese Zellen
zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die von der DNA-Sequenz kodierten
Produkte greifen in den Phosphat/Pyrophosphat-Metabolismus ein, wobei die
DNA-Sequenz eine DNA-Sequenz eines anorganischen Pyrphosphatase-Gens ist.
Einer der wesentlichen Kontrollpunkte bei der Saccharosebiosynthese ist die
Konversion des Fructose-1,6-bisphosphates (Fru-1,6-P2) in Fructose-6
phosphat (Fru-6-P). Eines der an diesem Schritt beteiligten Enzyme ist die
Pyrophosphat : Fruktose-6-Phosphat-1-Phosphotransferase (PFP). Dieses Enzym
kann auf der einen Seite Fru-1,6-P2 in Fru-6-P, unter Freisetzung an
organischen Pyrophosphats überführen, auf der anderen Seite Fru-6-P in
Fru-1,6-P2, unter Verbrauch anorganischen Pyrophosphats, aufphosphory
lieren. Die Richtung der Reaktion, die durch PFP katalysiert wird, wird
durch den relativen Gehalt an anorganischen Pyrophosphat und anorganischen
Phosphat gesteuert.
Eine fortwährende Entfernung des anorganischen Pyrophosphats durch eine an
organische Pyrophosphatase sollte eine Verschiebung des obigen Gleichge
wichtes in Richtung Fru-6-P und damit eine verstärkte Bildung von löslichen
Zuckern, wie z. B. Hexosen und/oder Saccharose, bewirken. Eine Verschiebung
der Partitionierung der Photoassimilate durch Entfernung des Pyrophosphats
durch eine anorganische Pyrophosphatase sollte auch bewirken, daß die von
der UDP-Glucose-Pyrophosphorylase katalysierte Reaktion
Glukose-1-Phosphat + UTP → UDP-Glukose + PPi
in Richtung UDP-Glukose verschoben wird. Die dadurch erfolgte vermehrte Be
reitstellung von UDP-Glukose führt zu weiteren veränderten Eigenschaften
der Pflanze, wie z. B. dickeren Zellwänden. Dies geschieht durch erhöhte
Bereitstellung der Precursor für die Zellwandbiosynthese. Die Verdickung
der Zellwände führt zu einer Erhöhung der Trockenresistenz in diesen Pflan
zen, bedingt durch eine verringerte Transpirationsrate.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen sind eine
große Anzahl Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssystem in
E. coli und einen Marker, der eine Selektion der transformierten Zellen
erlaubt, beinhalten. Die Vektoren beinhalten z. B. pBR 332 pUC-Serien, M13
mp-Serien, pACY 184 usw. Dementsprechend kann die Sequenz an einer passen
den Restriktionsstelle in den Vektor eingefügt werden. Das erhaltene Plas
mid wird für die Transformation in E. coli verwendet. Die E. coli-Zellen
werden in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet, anschließend geerntet und
lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethoden werden im
allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse, Elektrophoresen
und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt. Nach
jeder Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz gespalten und mit der
nächsten DNA-Sequenz verbunden werden. Jede Plasmid-Sequenz kann in den
gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden. Je nach Einführungsmethode
gewünschter Gene in die Pflanze können weitere DNA-Sequenzen erforderlich
sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder
Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig je
doch die rechte und die linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA, als
Flankenbereich der einzuführenden Gene, verbunden werden.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist
intensiv untersucht und ausreichend in EP 1 20 516; Hoekema, In: The Binary
Plant Vector System Offset-drukkerÿ Kanters B.V. , Alblasserdam, 1985,
Chapter V; Fraley, et al. , Crit. Rev, Plant Sci., 4: 1-46 und An et al.
EMBO J. (1985) 4: 277-287 beschrieben worden.
Ist die eingeführte DNA erst einmal im Genom integriert, so ist sie dort
auch relativ stabil und springt in der Regel nicht mehr heraus. Sie enthält
normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzel
len Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin,
G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Chloramphenicol u. a. vermittelt. Der in
dividuell verwendete Marker sollte daher die Selektion transformierter Zel
len gegenüber Zellen, denen die eingefügte DNA fehlt, gestatten.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Viel
zahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transforma
tion mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobac
terium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion, die Injektion oder
die Elektroporation sowie weitere Möglichkeiten. Werden für die Transforma
tion Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plas
mide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder
einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Se
quenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekom
bination in das Ti- oder Ri-Plasmid integriert werden. Dieses enthält
außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige Vir-Region. Intermediäre
Vektoren können sich nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Hel
ferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens
übertragen werden (Konjugation), Binäre Vektoren können sich sowohl in E.
coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektions
marker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und
linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agro
bakterien transformiert werden (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. (1978),
163: 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid,
das eine Vir-Region trägt, enthalten. Die Vir-Region ist für den Transfer
der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann enthalten
sein. Das so transformierte Bakterium wird zur Transformation von Pflanzen
zellen benutzt. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflan
zen-Explantate zweckmäßiger Weise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agro
bacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmate
rial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten
oder Suspensions-kultivierte Zellen) können dann in einem geeigneten Me
dium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion enthalten kann, wieder
ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann
auf Anwesenheit der eingeführten DNA getestet werden. Bei der Injektion und
Elektroporation sind keine speziellen Anforderungen an die Plasmide ge
stellt. Es können einfache Plasmide, wie z. B. pUC-Derivate, verwendet wer
den.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanzen in der üblichen
Weise. Diese Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die
die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, ge
kreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die ent
sprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Am 20.08.1990 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in
Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgendes Plasmid hinterlegt
(Hinterlegungsnummer):
Plasmid p 35 S-Ω-ppase (DSM 6141)
Fig. 1
zeigt die Struktur des 4,0 kb großen Plasmids p35S-Ω-ppase.
Das Plasmid enthält folgende Fragmente:
A = Fragment A (529 bp): Beinhaltet den 35S Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus
(CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437
des CaMV.
B = Fragment B (73 bp): Enthält 61 Nukleotide der Sequenz:
TTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATTA, den am
5′-Ende befindlichen Asp 718 Linker der Sequenz GGTACC und den am
3′-Ende befindlichen NcoI-Linker der Sequenz CCATGG.
C = Fragment C (554 bp): Enthält die proteinkodierende Region der anorganischen
Pyrophosphatase (ppa) aus E. coli (Nukleotide Position
+39 bis +565 der Sequenz nach Lahti et al.).
D = Fragment D (192 bp): Enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3
der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5.
Es werden ferner die im Ausführungsbeispiel beschriebenen Schnittstellen
gezeigt.
Fig. 2
zeigt den Nachweis der vom Pyrophosphatase-Gen kodierten RNA in transgenen
Kartoffel- und Tabakpflanzen mittels Northern-Blot-Analyse.
Positionen 1-19: Proben der aus Blättern gewonnenen Gesamt-RNA von
Kartoffelpflanzen, die mit dem Plasmid p35S-Ω-ppase
transformiert und regeneriert wurden.
Positionen 20-28: Proben der aus Blättern gewonnenen Gesamt-RNA von Tabakpflanzen, die mit dem Plasmid p35S-Ω-ppase transformiert und regeneriert wurden.
Position A: Probe einer nicht-transformierten Kartoffelpflanze.
Position B: Probe einer nicht-transformierten Tabakpflanze.
Positionen 20-28: Proben der aus Blättern gewonnenen Gesamt-RNA von Tabakpflanzen, die mit dem Plasmid p35S-Ω-ppase transformiert und regeneriert wurden.
Position A: Probe einer nicht-transformierten Kartoffelpflanze.
Position B: Probe einer nicht-transformierten Tabakpflanze.
Die schwarzen Flecken zeigen die von der Pyrophosphatase kodierte RNA.
Fig. 3
zeigt den Nachweis des Auftretens einer neuen Pyrophosphataseaktivität in
Proteinextrakten aus Blättern der mit dem p35S-Ω-ppase Plasmid trans
formierten transgenen Kartoffel- und Tabakpflanzen in einem SDS-Polyacryl
amid-Gel.
Positionen 1-7: Proteinextrakt aus Blättern transformierter Kartoffelpflanzen.
Positionen 8-9: Proteinextrakt aus Blättern transformierter Tabakpflanzen.
Position A: Proteinextrakt aus Blättern nicht-transformierter Tabakpflanzen.
Positionen B-C: Proteinextrakt aus Blättern nicht-transformierter Kartoffelpflanzen.
Positionen X und Y: Proteinextrakt aus E.coli.
Positionen 8-9: Proteinextrakt aus Blättern transformierter Tabakpflanzen.
Position A: Proteinextrakt aus Blättern nicht-transformierter Tabakpflanzen.
Positionen B-C: Proteinextrakt aus Blättern nicht-transformierter Kartoffelpflanzen.
Positionen X und Y: Proteinextrakt aus E.coli.
Fig. 4
zeigt den Vergleich des Gehalts an Glukose, Fruktose, Saccharose und Stärke
in mmol/m² in einer das 35S-Ω-ppase Gen exprimierten Tabakpflanze ()
und einer nicht transformierten Tabakpflanze () in Blättern verschie
denen Alters.
In der Abbildung bedeuten:
1 = sehr junge Blätter
2-4 = ausgereifte Blätter
5-6 = alte Blätter
2-4 = ausgereifte Blätter
5-6 = alte Blätter
Fig. 5
zeigt den Einfluß der Expression des 35S-Ω-ppase Gens in transgenen
Kartoffelpflanzen (Positionen 1-12) auf das Saccharose/Stärke-Verhältnis in
den Blättern transformierter Pflanzen.
C = nicht-transformierte Kartoffelpflanze.
Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrundeliegenden Ausfüh
rungsbeispiele wird vorab eine Aufstellung aller für diese Versuche notwen
digen und an sich bekannten Verfahren gegeben:
- 1. Klonierungsverfahren
Zur Klonierung wurden die Vektoren pUC18 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985), 33, 103-119) benutzt. - Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor BIN19 (Bevan, Nucl, Acids Res. (1984), 12, 8711-8720) kloniert.
- 2. Bakterienstämme
Für die pUC-Vektoren wurden die E. coli-Stämme BMH71-18 (Messing et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA (1977), 24, 6342-6346) oder TB1 benutzt. TB1 ist ein Rekombinations-negatives, Tetracyclin-resistentes Derivat des Stammes JM101 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985), 33, 103-119). Der Genotyp des TB1-Stammes ist (Bart Barrel, pers. Mitteilung): F (traD36, proAB, lacI, lacZΔM15), Δ(lac, pro), SupE, thiS, recA, Sr1: :Tn10(TcR). - Die Pflanzentransformation wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefa ciens-Stammes LBA4404 (Bevan, M., Nucl, Acids Res. 12, 8711-8721, (1984); B1N19 Derivat) durchgeführt.
- 3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens Bei Bin19-Derivaten erfolgt die Einführung der DNA in die Agrobakterien durch direkte Transformation nach der Methode von Holsters et al., (Mol. Gen. Genet, (1978), 163, 181-187). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim und Doly (Nucl. Acids Res, (1979), 7, 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktions spaltung gelelektrophoretisch aufgetrennt.
- 4. Pflanzentransformation
- A) Tabak: 10 ml einer unter Selektion gewachsenen Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens wurden abzentrifugiert, der Überstand verwor fen, und die Bakterien im gleichen Volumen Antibiotika-freien Mediums resuspendiert. In einer sterilen Petrischale wurden Blattscheiben steriler Pflanzen (ca. 1 cm2), denen die Mittelrippe entfernt wurde, in dieser Bakteriensuspension gebadet. Anschließend wurden die Blattschei ben in Petrischalen, die MS-Medium (nach Murashige und Skoog, Physiolo gia Plantarum (1962), 15, 473-497) mit 2% Saccharose und 0,8% Bacto Agar enthalten, dicht ausgelegt. Nach 2-tägiger Inkubation bei 25°C im Dunkeln wurden sie auf MS-Medium übertragen, welches 100 mg/l Kanamycin, 500 mg/l Claforan, 1 mg/l Benzylaminopurin (BAP), 0,2 mg/l Naphthyl essigsäure (NAA) und 0,8% Bacto-Agar enthielt. Wachsende Sprosse wurden auf hormonfreies MS-Medium mit 250 mg/l Claforan überführt.
- B) Kartoffel: 10 kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur wurden in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose ge legt, welches 30-50 µl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem, leichtem Schütteln wurden die Petrischalen bei 25°C im Dunkeln inkubiert. Nach 2 Tagen wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 2 mg/l Zea tinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Giberellinsäure, 500 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8 l Bacto-Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurde die Claforankonzen tration im Medium um die Hälfte reduziert. Die weitere Kultivierung er folgte wie von Rocha-Sosa et al. in EMBO Journal 8, 29 (1989) beschrieben,
Die Isolierung genomischer Pflanzen-DNA erfolgte nach Rogers und Bendich
(Plant Mol, Biol. (1985), 5, 69-76.
Für die DNA-Analyse wurden 10-20 µg DNA nach geeigneter Restriktions
spaltung mit Hilfe von "Southern Blots" auf Integration der zu untersu
chenden DNA-Sequenzen analysiert.
Die Isolierung pflanzlicher Gesamt-RNA erfolgte nach Logemann et al.
(Analytical Biochem. (1987), 163, 16-20).
Für die Analyse wurden je 50 µg Gesamt-RNA mit Hilfe von "Northern
Blots" auf die Anwesenheit der gesuchten Transkripte untersucht.
Zur Extraktion von Gesamtprotein aus Pflanzengewebe wurden Gewebestücke
in Proteinextraktionspuffer (25 mM Natriumphosphat pH 7,0, 2 mM Natrium
bisulfit, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)), unter Zusatz von 0,1%
(w/v) unlöslichem Polyvinylpyrrolidon (PVP) homogenisiert.
Nach Filtrieren durch Zellstoff wurden Zelltrümmer für 20 Minuten bei
10000 Umdrehungen pro Minute abzentrifugiert und die Proteinkonzentra
tion des Überstandes nach der Methode von Bradford (Anal. Biochem.
(1976)/72, 248-254) bestimmt.
Das Gesamtprotein wurde aus Pflanzen, wie unter Punkt 7 beschrieben,
extrahiert und mit nativem SB-Puffer (125 mM Tris/HCl pH 6,8, 1091
2-Mercaptoethanol, 20 , Glycol, 0,004% Bromphenolblau) versetzt und auf
10%ige SDS-Polyacrylamid-Gele gegeben. Die Ansätze wurden vor Auf
trennung in den SDS-Polyacrylamidgelen nicht durch Erhitzen denaturiert.
Nach elektrophoretischer Trennung wurden die Gele kurz in Wasser gespült
und für 1 Stunde bei 37°C in Pyrophosphat-Puffer (0,05 M Tris-HCl pH
9,0; 0,03 mM anorganisches Pyrophosphat (Na4P2O7) 5 mM MgCl2) inku
biert. Zu dieser Lösung wurde anschließend 17% Volumen Färbepuffer
(140 mg Ammoniummolybdat, 11,5 mg Malachitgrün in 10 ml 2,5 M H2SO4)
addiert. Die Bildung eines türkisfarbenen Präzipitates zeigte die Pyro
phosphataseaktivität an.
In flüssigem Stickstoff gefrorene Blattscheibchen (Durchmesser 10 mm)
wurden in 0,5 ml Puffer (80% (v/v) Ethanol; 10 mM HEPES pH 7,5) für
30 Minuten bei 80°C im Wasserbad extrahiert. Der Überstand mit den
löslichen Komponenten wurde abgeschüttet und das Volumen bestimmt.
Der Überstand wurde zur Bestimmung der löslichen Zucker eingesetzt.
Das verbliebene unlösliche Material wurde mit Wasser gespült und fein
gemörsert. Anschließend wurde der Extrakt 1 Stunde bei 95°C in 0,2 M
Kaliumhydroxyd-Lösung gekocht, mit 70 µl 1N Essigsäure neutralisiert und
anschließend zentrifugiert. Aliquots der so erhaltenen Stärkelösung
wurden zur Stärkebestimmung eingesetzt.
Die quantitative Bestimmung löslicher Glukose, Fruktose und
Saccharose erfolgte in folgendem Testansatz:
100,0 mM Imidazol-HCl, pH 6,9
1,5 mM MgCl₂
0,5 mM NADP⁺
1,3 mM ATP
10-50,0 µl Probe
1,0 U Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase aus Hefe.
1,5 mM MgCl₂
0,5 mM NADP⁺
1,3 mM ATP
10-50,0 µl Probe
1,0 U Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase aus Hefe.
Dieser Ansatz wurde für fünf Minuten inkubiert. Der Nachweis der
Zucker wurde anschließend durch sukzessive Zugabe von
1,0 U Hexokinase aus Hefe (für die Bestimmung von Glukose)
1,0 U Phosphorglukose-Isomerase aus Hefe (für die Bestimmung von Fruktose)
20,0 U Invertase aus Hefe (für die Bestimmung von Saccharose)
1,0 U Phosphorglukose-Isomerase aus Hefe (für die Bestimmung von Fruktose)
20,0 U Invertase aus Hefe (für die Bestimmung von Saccharose)
photometrisch bestimmt.
Die nach der ethanolischen Extraktion unter a) erhaltene Stärkelösung
wurde bei 55°C mit hydrolytischen Enzymen versetzt und für zwölf
Stunden in folgendem Ansatz inkubiert:
50,0 mM Na-Acetat, pH 4,8
1,4 U Amiloglukosidase aus Aspergillus niger
2,0 α-Amylase aus Schweinepankreas
1,4 U Amiloglukosidase aus Aspergillus niger
2,0 α-Amylase aus Schweinepankreas
Nach der Inkubation wurden die unlöslichen Bestandteile durch 4
minütige Zentrifugation bei 16000 g entfernt. Im Überstand wurde an
schließend die entstandene Glukose, wie unter b) beschrieben,
enzymatisch bestimmt.
Eine DNA-Sequenz aus E. coli K12, welche für die anorganische
Pyrophosphatase kodiert, wurde mit einem eine konstitutive Expression
bewirkenden Promotor der 35 s RNA des Cauliflower-Mosaik-Virus (CaMV),
einem als Translationsverstärker dienenden DNA-Segment aus dem Tabak-
Mosaik-Virus und einem pflanzlichen Terminationssignal versehen. Das
pflanzliche Terminationssignal beinhaltet das 3′-Ende der Poly-A Seite des
Octopin-Synthase Gens. Dabei wurde die Umgebung des Translations
initiationscodons ATG der Sequenz für die anorganische Pyrophosphatase
einer gerichteten Mutagenese unterzogen, um eine optimale Expression in
eukaryontischen Zellen zu erreichen. Das Plasmid p35S-Ω-ppase besteht aus
den vier Fragmenten A, B, C und D, die in die Schnittstellen des Poly
linkers von pUC 18 kloniert worden sind (Fig. 1).
Das Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des Cauliflower-Mosaik-
Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV
(Franck et al,, Cell 21, 285-294). Es wurde als Eco RI-Kpn I Fragment aus
dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., Nucleic Acids Research 14, 5857-5868)
isoliert und zwischen die Eco RI-Kpn I Schnittstellen des Polylinkers des
Plasmids pUC 18 kloniert.
Das Fragment B enthält ein Segment, das aus 61 Nukleotiden der Sequenz
TTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATTA
besteht, die homolog zu einem Teil des als Translationsverstärker
dienenden DNA-Segmentes aus dem Tabak-Mosaik-Virus-Stamm U sind (Gallie et
al., Nucleic Acids Res. 15, 3257-3273). Dieses Segment, das durch DNA-
Synthese hergestellt worden ist, wurde am 5′-Ende mit einem Asp 718 Linker
der Sequenz
GGTTACC
sowie am 3′-Ende mit einem Nco I-Linker mit der Sequenz
CCATGG
versehen.
Das Fragment 8 wurde zwischen die Kpn I und Sma I Schnittstelle des Poly
linkers von pUC 18 kloniert.
Das Fragment C umfaßt die proteinkodierende Region der anorganischen Pyro
phosphatase (ppa) aus E.coli. Es sind die Nukleotide, Position +39 bis
+565, der Sequenz nach Lahti et al., (J. Bacteriology 170, 5901-5907).
Das Fragment C wurde zwischen die Nco I Stelle des Fragments B und die
Sal I Stelle des Polylinkers von pUC 18 kloniert.
Fragment D (192 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der
T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835-846),
Nukleotide 11749-11939) welches als Pvu II-Hind III Fragment aus dem
Plasmid pAGV 40 (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303, 209-213)
isoliert worden ist und nach Addition von Sph I Linkern an die Pvu II
Schnittstelle zwischen die Sph I-Hind III Schnittstellen des Polylinkers
von pUC 18 kloniert worden war,
Die Größe des Plasmids p35S-stppase beträgt 4,0 kb.
Das Plasmid p35S-Ω-ppase wurde in binäre Vektoren eingeführt und mit Hilfe
des Agrobacteriensystems in Tabak- und Kartoffelpflanzen eingeführt. Aus
transformierten Zellen wurden intakte und fertile Pflanzen regeniert.
Die Analyse der transformierten Pflanzen mittels "Southern-Blot"-Analyse
zeigte das Vorhandensein des intakten chimären Pyrophosphatasegens in den
transgenen Pflanzen.
Für den Nachweis der vom Pyrophosphatase-Gen kodierten RNA in transgenen
Kartoffel- und Tabakpflanzen wurden 30 µg Gesamt-RNA aus den Blättern der
transformierten und regenerierten Kartoffel- und Tabakpflanzen sowie aus
nicht transformierten Kartoffel- und Tabakpflanzen isoliert. Diese RNA
wurde mittels Northern-Blot-Analyse untersucht. Die Analyse der regene
rierten Pflanzen (Kartoffel: Positionen 1, 2, 8, 11, 12, 15 und 18; und
Tabak:
Positionen 21-26) zeigte in den Geweben RNA, die spezifisch mit der kodierenden Sequenz der anorganischen Pyrophosphatase hybridisiert und die in nicht-transformierten Pflanzen (Kartoffelpflanze, Position A, Tabak pflanze, Position B) abwesend ist (Fig. 2).
Positionen 21-26) zeigte in den Geweben RNA, die spezifisch mit der kodierenden Sequenz der anorganischen Pyrophosphatase hybridisiert und die in nicht-transformierten Pflanzen (Kartoffelpflanze, Position A, Tabak pflanze, Position B) abwesend ist (Fig. 2).
Der Nachweis der neuen Pyrophosphataseaktivität in Proteinextrakten aus
Blättern der mit dem p35S-Ω-ppase Plasmid transformierten transgenen
Kartoffel- und Tabakpflanzen wurde in partiell denaturierten Gelen, wie
unter Punkt 8 beschrieben, durchgeführt.
Die Proteinextrakte transformierter Pflanzen, die eine spezifisch mit der
kodierenden Sequenz der anorganischen Pyrophosphatase hybridisierende RNA
enthalten, wiesen eine anorganische Pyrophosphataseaktivität auf
(Kartoffelpflanzen: Positionen 1-7 und Tabakpflanzen: Positionen 8 und 9),
die in nicht-transformierten Pflanzen, Positionen A-C, fehlten (s. Fig. 3),
Es wurden somit transgene Tabak- und Kartoffelpflanzen hergestellt, die
eine neue anorganische Pyrophosphataseaktivität enthalten, die von dem in
diese Pflanzen eingeführten E.coli Gen stammt (s. Fig. 3),
Die regenerierten Tabak- und Kartoffelpflanzen wiesen eine Reihe von Unter
schieden in bezug auf phänotypische als auch biochemische Parameter auf.
a) Transgene Tabakpflanzen
Transgene Tabakpflanzen, die eine hohe Expression des Pyrophosphatase- Gens aufwiesen, zeigten eine deutliche Reduktion in der Pflanzengröße, während Tabakpflanzen mit einer mittleren Expression des Pyro phosphatasegens nur eine geringe Reduktion der Größe aufwiesen. Die Stauchung ist dabei nicht auf eine Verringerung der Blattzahl zurückzu führen, sondern auf eine Verringerung des Internodienabstandes.
Transgene Tabakpflanzen, die eine hohe Expression des Pyrophosphatase- Gens aufwiesen, zeigten eine deutliche Reduktion in der Pflanzengröße, während Tabakpflanzen mit einer mittleren Expression des Pyro phosphatasegens nur eine geringe Reduktion der Größe aufwiesen. Die Stauchung ist dabei nicht auf eine Verringerung der Blattzahl zurückzu führen, sondern auf eine Verringerung des Internodienabstandes.
Die jungen Blätter der Pyrophosphatase-exprimierenden Tabakpflanzen
wiesen keine deutlichen phänotypischen Unterschiede im Vergleich zu
nicht-transformierten Kontrollpflanzen auf. Die älteren Blätter der
Pyrophosphatase-exprimierenden Blätter hingegen zeigten eine deutliche
Verdickung des Blattes. Bei Pflanzen, die das Pyrophosphatasegen sehr
hoch exprimieren, war eine Ausbleichung der älteren Blätter zu sehen.
Neben diesen phänotypischen Unterschieden wiesen die das Pyrophosphatae
gen exprimierenden Tabakpflanzen eine deutliche Veränderung der
Zusammensetzung der Kohlenhydrate in Blättern verschiedenen Alters auf
(s. Fig. 4). So waren die Mengen an löslichen Zuckern, insbesondere
Glukose, Fruktose und Saccharose in allen Blättern gegenüber Blättern
nicht-transformierter Pflanzen deutlich erhöht, wobei in den älteren
Blättern eine Erhöhung um einen Faktor bis zu 20-50 festgestellt wurde.
Gleichzeitig fand zumindest in den älteren Blättern eine Steigerung der
Menge an gebildeter Stärke statt, die jedoch nicht so groß war, wie die
Steigerung des Anteils an löslichen Zuckern, so daß insgesamt einerseits
eine deutliche Erhöhung des Gesamtgehaltes an Stärke und löslichen
Zuckern als Folge der Expression der Pyrophosphatase festgestellt wurde
und andererseits eine deutliche Verschiebung der Partitionierung der
Photophassimilate zwischen Stärke und löslichen Zuckern in Richtung lös
licher Zucker auftrat.
b) Transgene Kartoffelpflanzen
Transgene Kartoffelpflanzen, die das Pyrophosphatasegen exprimieren, zeigten als erste wesentliche phänotypische Veränderung eine deutlich gestauchte Größe. Diese Stauchung geht mit einer verstärkten Verzweigung der Pflanzen aufgrund der verstärkten Ausbildung von Achselsprossen ein her. Es ist offensichtlich, daß dieser gedrungene Wuchs viele Vorteile bezüglich Standfestigkeit und Windanfälligkeit hat.
Transgene Kartoffelpflanzen, die das Pyrophosphatasegen exprimieren, zeigten als erste wesentliche phänotypische Veränderung eine deutlich gestauchte Größe. Diese Stauchung geht mit einer verstärkten Verzweigung der Pflanzen aufgrund der verstärkten Ausbildung von Achselsprossen ein her. Es ist offensichtlich, daß dieser gedrungene Wuchs viele Vorteile bezüglich Standfestigkeit und Windanfälligkeit hat.
Die das Pyrophosphatasegen exprimierenden Kartoffelpflanzen wiesen
weiterhin drastische Veränderungen in bezug auf die Zusammensetzung der
Kohlenhydrate im Blatt auf (s. Fig. 5), So haben diese Kartoffelpflanzen
ein erhöhtes Saccharose/Stärke-Verhältnis. Die Erhöhung dieses Verhält
nisses kann bis Faktor 20 gehen. Im Unterschied zu den Tabakpflanzen
wiesen die transgenen Kartoffelpflanzen keine drastische Erhöhung der
Hexosen (Glukose und Fruktose) auf.
Durch die Expression des eine anorganische Phyrophosphatase kodierenden
Gens in transgenen Kartoffelpflanzen ist es somit gelungen, eine Ver
änderung der Saccharose/Stärke-Verhältnisse zu erreichen und damit die
Kapazität des "source"-Blattes zu verändern.
Claims (23)
1. Ein Plasmid, enthaltend eine DNA-Sequenz, die für ein die Biosynthese
löslicher Zucker modifizierendes Protein kodiert.
2. Eine Pflanzenzelle, enthaltend ein Plasmid gemäß Anspruch 1, mit einer
DNA-Sequenz, die für ein die Biosynthese löslicher Zucker modifizieren
des Protein kodiert.
3. Eine Pflanzenzelle gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die
DNA-Sequenz für ein Produkt kodiert, das in den Phosphat/Pyrophosphat-
Metabolismus eingreift.
4. Eine Pflanzenzelle gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die
DNA-Sequenz die DNA-Sequenz eines anorganischen Pyrophosphatase-Gens
ist.
5. Plasmid p35S-Ω-ppase (DSM 6141).
6. Ein Plasmid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es das Plasmid
p35S-Ω-ppase (DSM 6141) ist.
7. Eine Pflanzenzelle, enthaltend die auf dem Plasmid p35S-Ω-ppase (DSM
6141) enthaltene DNA-Sequenz.
8. Eine Pflanzenzelle gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die
DNA-Sequenz des anorganischen Pyrophosphatase-Gens die DNA-Sequenz des
Pyrophosphatase-Gens aus E. coli ist.
9. Eine Pflanzenzelle gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die
DNA-Sequenz des anorganischen Pyrophosphatase-Gens an die regula
torischen Regionen anderer Gene, die eine Expression des Pyro
phosphatase-Gens in pflanzlichen Zellen und Pflanzen sicherstellen,
fusioniert ist.
10. Eine Pflanzenzelle gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die
regulatorischen Regionen Promotoren und Terminationssignale von pflanz
lichen Genen sind.
11. Eine Pflanzenzelle gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der
Promotor der Promotor der 35S RNA des Cauliflower-Mosaik-Virus ist.
12. Eine Pflanzenzelle gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das
Terminationssignal das 3′-Ende der Poly-A-Seite des Octopin-Synthase-
Gens enthält.
13. Verwendung des Plasmids p35S-Ω-ppase (DSM 6141) zur Herstellung von
im Habitus, Trockenresistenz, Frostresistenz und/oder Ertrag ver
änderten transgenen Pflanzen.
14. Eine Pflanze, enthaltend eine DNA-Sequenz, die für ein die Biosynthese
löslicher Zucker modifizierendes Protein kodiert.
15. Eine Pflanze, enthaltend eine DNA-Sequenz, die für ein Produkt kodiert,
das in den Phosphat/Pyrophosphat-Metabolismus der Pflanze eingreift.
16. Eine Pflanze gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-
Sequenz die DNA-Sequenz eines anorganischen Pyrophosphatase-Gens ist.
17. Eine Pflanze gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die
DNA-Sequenz des anorganischen Pyrophosphatase-Gens die DNA-Sequenz des
anorganischen Pyrophosphatase-Gens aus E. coli ist.
18. Eine Pflanze gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-
Sequenz des anorganischen Pyrophosphatase-Gens an die regulatorischen
Regionen anderer Gene, die eine Expression des Pyrophosphatase-Gens in
pflanzlichen Zellen und Pflanzen sicherstellen, fusioniert ist.
19. Eine Pflanze gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die regula
torischen Regionen Promotoren und Terminationssignale von pflanzlichen
Genen sind.
20. Eine Pflanze gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der
Promotor der Promotor der 35S RNA des Cauliflower-Mosaik-Virus ist.
21. Eine Pflanze gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das
Terminationssignal das 3′-Ende der Poly-A-Seite des Octopin-Synthase-
Gens enthält.
22. Eine Pflanze, enthaltend die auf dem Plasmid p35S-Ω-ppase (DSM 6141)
enthaltene DNA-Sequenz.
23. Eine Pflanze gemäß Ansprüchen 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß es
eine Tabak- oder Kartoffelpflanze ist.
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DE4035756A DE4035756A1 (de) | 1990-11-08 | 1990-11-08 | Neue plasmide zur herstellung von im habitus und ertrag veraenderten transgenen pflanzen |
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AU87021/91A AU655209B2 (en) | 1990-11-08 | 1991-11-04 | Plasmids for the production of transgenic plants that are modified in habit and yield |
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DE69132758T DE69132758T2 (de) | 1990-11-08 | 1991-11-04 | Plasmide zur Herstellung von transgenen Pflanzen welche in Habitus und Ertrag verändert sind |
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ES91250301T ES2164636T3 (es) | 1990-11-08 | 1991-11-04 | Plasmidos para la produccion de plantas transgenicas que se modifican en su constitucion fisica y rendimiento. |
EP01106521A EP1114866A3 (de) | 1990-11-08 | 1991-11-04 | Plasmide zur Herstellung von transgenen Pflanzen welche in Habitus und Ertrag verändert sind |
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IE20020633A IE20020633A1 (en) | 1990-11-08 | 1991-11-07 | Plasmids for the Production of Transgenic Plants that are Modified in Habit and Yield |
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JP29106591A JP3431177B2 (ja) | 1990-11-08 | 1991-11-07 | 習性及び収量において変更されたトランスジェニック植物を作製するプラスミド |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4337597C2 (de) * | 1993-10-28 | 2002-07-18 | Aventis Cropscience Gmbh | DNA-Sequenzen für Ammoniumtransporter, Plasmide, Bakterien, Hefen, Pflanzenzellen und Pflanzen enthaltend den Transporter |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4220758A1 (de) * | 1992-06-24 | 1994-01-05 | Inst Genbiologische Forschung | DNA-Sequenz und Plasmide zur Herstellung von Pflanzen mit veränderter Saccharose-Konzentration |
EP0628636A1 (de) * | 1993-06-07 | 1994-12-14 | Stichting Agrotechnologisch Onderzoek ( Ato-Dlo) | Transgene Pflanzen mit verändertem Carbohydrat-Metabolismus |
EP0820518B1 (de) * | 1995-04-06 | 2005-12-07 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | Verfahren zur selektion von transgenen pflanzenzellen |
US6420629B1 (en) * | 1996-09-09 | 2002-07-16 | B.C. Research Inc. | Process of increasing plant growth and yield and modifying cellulose production in plants |
US6416985B1 (en) | 1996-10-15 | 2002-07-09 | Board Of Trustees Of Michigan State University | DNA encoding mannose 6-phosphate reductase and recombinants produced therefrom |
US7252966B2 (en) * | 1999-01-29 | 2007-08-07 | Evolutionary Genomics Llc | EG307 polynucleotides and uses thereof |
US20080047032A1 (en) * | 1999-01-29 | 2008-02-21 | Evolutionary Genomics Llc | Eg307 nucleic acids and uses thereof |
US6274319B1 (en) * | 1999-01-29 | 2001-08-14 | Walter Messier | Methods to identify evolutionarily significant changes in polynucleotide and polypeptide sequences in domesticated plants and animals |
US7439018B2 (en) * | 1999-01-29 | 2008-10-21 | Evolutionary Genomics, Inc. | EG1117 Polynucleotides and uses thereof |
ES2258489T3 (es) | 1999-12-22 | 2006-09-01 | Basf Plant Science Gmbh | Proteinas relacionadas con el estres por pirofosfatasas y metodos de utilizacion en plantas. |
AU2001230263B2 (en) | 2000-02-02 | 2006-12-07 | Universidad Publica De Navarra | Plant adpglucose pyrophosphatase, method for the production thereof, its use in the production of assay devices and for obtaining transgenic plants |
ES2164582B1 (es) * | 2000-02-02 | 2003-07-01 | Univ Navarra Publica | Adpglucosa pirofosfatasa vegetal alternativamente llamada adpglucosa fosfodiesterasa procedimiento de obtencion y su uso en la fabricacion de dispositivos de ensayo. |
US20040133944A1 (en) * | 2003-01-08 | 2004-07-08 | Delta And Pine Land Company | Seed oil suppression to enhance yield of commercially important macromolecules |
DE10313795A1 (de) * | 2003-03-20 | 2004-10-07 | Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt | Veränderte PPase-Expression in Zuckerrübe |
AU2006230352A1 (en) * | 2005-03-29 | 2006-10-05 | Evolutionary Genomics Llc | EG1117 and EG307 polynucleotides and uses thereof |
CA2620897A1 (en) * | 2005-09-02 | 2007-03-08 | Evolutionary Genomics, Inc. | Eg8798 and eg9703 polynucleotides and uses thereof |
WO2008022486A1 (fr) * | 2006-07-17 | 2008-02-28 | Beijing North Elite Biotechnology Co., Ltd. | Isozyme liée à la croissance végétale et à la tolérance au stress, gène codant et utilisation de ces derniers |
US20100257639A1 (en) * | 2009-02-26 | 2010-10-07 | Robert Edward Bruccoleri | Methods and compositions for altering sugar beet or root crop storage tissue |
CN108728478B (zh) * | 2017-04-20 | 2021-08-27 | 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 | 利用氢离子焦磷酸化酶提高产量及改良淀粉性质的方法 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4771002A (en) * | 1984-02-24 | 1988-09-13 | Lubrizol Genetics, Inc. | Transcription in plants and bacteria |
WO1989012386A1 (en) * | 1988-06-21 | 1989-12-28 | Calgene, Inc. | Methods and compositions for altering physical characteristics of fruit and fruit products |
GB8826356D0 (en) * | 1988-11-10 | 1988-12-14 | Ici Plc | Adp glucose-pyrophosphorylase |
DK198089D0 (da) * | 1989-04-24 | 1989-04-24 | Danske Spritfabrikker | Dna-materialer og anvendelse deraf |
AU644619B2 (en) * | 1989-12-21 | 1993-12-16 | Advanced Technologies (Cambridge) Limited | Modification of plant metabolism |
DE4004800C2 (de) * | 1990-02-13 | 2000-12-21 | Aventis Cropscience Gmbh | Im Habitus und Ertrag veränderte transgene Pflanzen |
IE913215A1 (en) * | 1990-09-13 | 1992-02-25 | Gist Brocades Nv | Transgenic plants having a modified carbohydrate content |
US5317404A (en) * | 1990-10-02 | 1994-05-31 | Canon Kabushiki Kaisha | Apparatus for recording an image on a photograph in a still-video camera |
-
1990
- 1990-11-08 DE DE4035756A patent/DE4035756A1/de not_active Ceased
-
1991
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Cited By (1)
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