DE4408629A1 - Verfahren zur Inhibierung der Blütenbildung in Pflanzen - Google Patents
Verfahren zur Inhibierung der Blütenbildung in PflanzenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inhibierung
der Blütenbildung in Pflanzen sowie DNA-Sequenzen und neue
Plasmide, enthaltend diese DNA-Sequenzen, die bei Integration in
ein pflanzliches Genom die Aktivität der Citrat-Synthase in der
Pflanze verändern. Ferner betrifft die Erfindung transgene Pflanzen,
bei denen durch Einführung dieser DNA-Sequenzen Veränderungen
der Aktivität der Citrat-Synthase hervorgerufen werden.
Bedingt durch den kontinuierlich steigenden Nahrungsmittelbedarf,
der aus der ständig wachsenden Weltbevölkerung resultiert, ist eine
der Aufgaben der biotechnologischen Forschung, sich um eine
Steigerung des Ertrages von Nutzpflanzen zu bemühen. Eine
Möglichkeit dies zu erreichen, besteht in der Veränderung des
Metabolismus der Pflanzen.
Das Wachstum, die Entwicklung und der Ertrag einer Nutzpflanze
hängt von der Energie ab, die diese Pflanze durch Bildung von
Kohlenhydraten während der Photosynthese gewinnt. Die primären
Orte für die Photosynthese sind das Blatt und zu einem geringen
Ausmaß das Stammgewebe. Andere Organe der Pflanze, wie
Wurzeln, Samen und Knollen tragen nicht wesentlich zur Produktion
von Photoassimilaten bei, sondern sind im Gegenteil in ihrem
Wachstum von der Versorgung durch photosynthetisch aktive
Organe abhängig. Die photosynthetisch aktiven Gewebe werden als
Quellen oder "sources" bezeichnet. Sie werden als Nettoexporteure
des während der Photosynthese fixierten CO₂ definiert. Die
photosynthetisch in aktiven Teile der Pflanze werden als Senken
oder "sinks" bezeichnet. Sie werden als Nettoimporteure des
photosynthetisch fixierten Kohlendioxids definiert.
Die Samen einer Pflanze beispielsweise sind völlig von der
Photosyntheseleistung der "sources" abhängig, d. h. von der
Verteilung der in den "sources" gebildeten Photoassimilate. Ein
Eingriff in den Metabolismus einer Pflanze, der die Verteilung der
Photoassimilate verändert, kann daher von ganz entscheidender
Bedeutung für den Ertrag einer Pflanze sein.
Im Fall der Kartoffel ist es beispielsweise wünschenswert, den
Metabolismus der Pflanze dahingehend zu verändern, daß es zu
einem möglichst effizienten Transport der Photoassimilate in die
Speicherorgane, die Knollen, und zu einer möglichst maximalen
Synthese von Stärke in den Knollen kommt.
Da die Vermehrung der Kartoffelpflanzen für landwirtschaftliche
Zwecke in erster Linie vegetativ über Kartoffelknollen und nicht
über Samen erfolgt, ist die Bildung von Blüten, d. h. potentiellen
"sinks", die mit den Knollen um die gebildeten Photoassimilate
konkurrieren, bei Kartoffelpflanzen, die lediglich für die
Bereitstellung von Kartoffelknollen zur Stärkeproduktion
vorgesehen sind, nicht notwendig.
Eine gezielte Inhibierung der Blütenbildung ist jedoch bei den
meisten Pflanzen bisher nicht möglich, da der Prozeß der Induktion
der Blütenbildung bei Pflanzen insgesamt noch nicht sehr gut
verstanden ist. Als Induktoren der Blütenbildung werden
verschiedene Substanzen wie z. B. Kohlenhydrate, Cytokinine, Auxin,
Polyamine und Calcium diskutiert. Insgesamt ergibt sich aber der
Eindruck, daß es sich bei der Blühinduktion um einen komplexen
Vorgang handelt, bei dem mehrere bisher noch nicht eindeutig
identifizierte Faktoren zusammenwirken (Bernier et al. (1993) Plant
Cell 5: 1147-1155).
Die Inhibierung der Blütenbildung bei Zuckerrohr, die zu einer
erheblichen Steigerung des Zuckerertrages führt, ist möglich durch
die exogene Applikation verschiedener synthetischer
Wachstumsregulatoren (Monuron, Diuron, Diquat). Doch auch wenn
durch den Einsatz derartiger synthetischer Wachstumsregulatoren
die gewünschte Ertragssteigerung erreicht werden kann, so ist doch
eine sorgfältige Abwägung von Nutzen und Schaden bei der
Verwendung derartiger synthetischer Stoffe an geraten. Neben den
sehr hohen Kosten, die meistens mit der Anwendung synthetischer
Stoffe verbunden sind, gilt es ins besondere, die Auswirkungen auf
die Umwelt durch biologisch nicht abbaubare oder nur bedingt
abbaubare Stoffe zu berücksichtigen. Da in der Regel nur
unzureichendes Wissen über die Umweltverträglichkeit vieler
synthetischer Wachstumsregulatoren besteht, bringt eine
umfangreiche Anwendung dieser Substanzen in der Landwirtschaft
immer ein erhebliches Risiko bezüglich der Langzeitwirkung auf die
Umwelt mit sich.
Es erscheint daher wünschenswert, Verfahren zur Verfügung zu
stellen, die eine gezielte Inhibition der Blütenbildung bei
verschiedenen Nutzpflanzen unter Vermeidung der Anwendung
synthetischer Substanzen erlauben.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, bei der es
aufgrund einer Veränderung der Aktivität eines Enzyms, das an
respiratorischen Prozessen in den Zellen beteiligt ist, zu einer
Veränderung des Blühverhaltens derartig veränderter Pflanzen
führt.
Respiratorische Prozesse spielen wie in Tieren auch in Pflanzen eine
essentielle Rolle bei der Versorgung der Zellen mit Energie zur
Aufrechterhaltung ihres Metabolismus. Hierbei werden durch den
Abbau organischer Substrate (Zucker, Fette oder Proteine), in dessen
Verlauf Wasserstoff auf molekularen Sauerstoff übertragen wird,
energiereiche Verbindungen, in erster Linie ATP, hergestellt. Diese
können anschließend für biosynthetische Prozesse im Rahmen von
Wachstums- und Entwicklungsprozessen verwendet werden.
Eine zentrale Rolle bei dem Abbau von Kohlenhydraten, Fettsäuren
und Aminosäuren sowie bei der Bereitstellung von
Ausgangssubstanzen für viele Biosynthesereaktionen spielt in
pflanzlichen wie in tierischen Zellen der Tricarbonsäure-Zyklus
(TCA-Zyklus, Zitronensäure-Zyklus, Krebs-Zyklus), der in den
Mitochondrien der Zellen abläuft.
In diesen Zyklus wird das Zwischenprodukt Acetyl-CoenzymA, das
sowohl beim Abbau von Kohlenhydraten über die Glykolyse, als
auch beim Abbau von Fettsäuren durch die β-Oxidation entsteht,
eingeschleust und im Verlauf des Zyklus in Kohlendioxid und
reduzierte Coenzyme (NADH, FADH₂) umgewandelt.
Das Enzym, das für den Eintritt des Acetyl-CoAs in den TCA-Zyklus
verantwortlich ist, ist die Citrat-Synthase (EC-Nr. 4.1.3.7.). Dieses
Enzym katalysiert die Aldolkondensation von Acetyl-CoenzymA und
Oxalacetat zu Citrat unter Freisetzung von reduziertem CoenzymA.
Die Citrat-Synthase nimmt innerhalb des Stoffwechsels eine zentrale
Stellung ein, da die von diesem Enzym katalysierte Reaktion
essentiell ist für die Einschleusung des Substrats Acetyl-CoenzymA
in den Citrat-Zyklus. Entsprechend der Schlüsselstellung, die dieses
Enzym im Metabolismus der Zelle einnimmt, wird seine Aktivität in
vielfältiger und komplexer Art und Weise reguliert.
Untersuchungen zu Struktur und Funktion der Citrat-Synthase
fanden bisher schwerpunktmäßig bei Prokaryonten, Pilzen und
Tieren statt. So sind beispielsweise bereits bei einer Reihe von
Prokaryonten Gene beschrieben, die für Citrat-Synthase kodieren,
z. B. bei E.coli, Acinetobacter anitratum, Pseudomonas aeruginosa,
Rickettsia prowazekii, Bacitlus sp. (Schendel et al. (1992) Appl.
Environ. Microbiol. 58: 335-345 und Referenzen darin), Coxiella
burnetii (Heinzen et al. (1991) Gene 109: 63-69) und Haloferax
volcanii (James et al. (1992) Biochem. Soc. Trans. 20: 12). Ebenso sind
bereits bei Saccharomyces cerevisiae (Suissa et al. (1984) EMBO J.
3: 1773-1781) und Neurospora crassa (Ferea et al. (1994), Mol. Gen.
Genet. 242: 105-110) derartige Gene bekannt. Bei Tieren ist lediglich
das Gen für die Citrat-Synthase aus Schwein bekannt (Bloxham et al.
(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 5381-5385).
Pflanzliche Citrat-Synthasen sind bisher nur in sehr geringem
Umfang untersucht worden. Lediglich in wenigen Fällen wurde das
Enzym angereinigt, z. B. aus Blättern von Pisum sativum (Unger und
Vasconcelos (1989) Plant Physiol. 89: 719-723) oder Ricinus-
Sämlingen (Kagawa und Gonzalez (1981) Plant Physiol. 68: 845-850).
Und nur in einem einzigen Fall, bei Arabidopsis thaliana, wurde
bisher eine cDNA-Sequenz isoliert, die für eine pflanzliche Citrat-
Synthase kodiert (Unger et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13: 411-418).
Angesichts der Bedeutung der Citrat-Synthase für den
Metabolismus der Zelle ist fraglich, ob Pflanzen eine Reduktion oder
Steigerung der Citrat-Synthaseaktivität in allen oder in bestimmten
Organen tolerieren. Insbesondere ist nicht bekannt, ob es möglich
ist, transgene Pflanzen mit einer reduzierten Citrat-
Synthaseaktivität herzustellen. Für die Herstellung von Pflanzen mit
reduzierter Citrat-Synthaseaktivität ist es notwendig, Citrat-
Synthase-Kodierregionen solcher Pflanzenspezies zur Verfügung zu
stellen, mit denen transgene Pflanzen in großer Anzahl erzeugt
werden können. Eine Pflanzenspezies, die dieser Anforderung
gerecht wird, ist Solanum tuberosum. Die genetische Veränderung
von Solanum tuberosum durch Agrobakterien vermittelten
Gentransfer ist ausreichend beschrieben (Fraley et al. (1985) Crit.
Rev. Plant. Sci. 4: 1-46).
Es wurde nun überraschend gefunden, daß eine starke Inhibierung
der Citrat-Synthaseaktivität in Kartoffelpflanzen zu einer
vollständigen Inhibierung der Blütenbildung bei diesen Pflanzen
führt (Fig. 5).
Des weiteren wurde gefunden, daß eine Inhibierung der Citrat-
Synthaseaktivität in Kartoffelpflanzen zu stark verringerten
Lagerungsverlusten bei der Lagerung von Kartoffelknollen sowie
einer Veränderung des Keimungsverhaltens der Knollen führt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur
Inhibierung der Blütenbildung in Pflanzen sowie ein Verfahren zur
Verbesserung der Speicherkapazität von Nutzpflanzen, beide
dadurch gekennzeichnet, daß die Expression endogener Citrat-
Synthasegene gehemmt wird.
Besonders bevorzugt sind in beiden Fällen Verfahren, in denen die
Inhibierung der Blütenbildung bzw. die Verbesserung der
Speicherkapazität dadurch erreicht wird, daß die Expression
endogener Citrat-Synthasegene durch den Einsatz von anti-sense-
DNA gehemmt wird.
Einen weiteren Gegenstand der Erfindung bilden die aus dem
erfindungsgemäßen Verfahren resultierenden Pflanzen, die dadurch
gekennzeichnet sind, daß sie eine veränderte Citrat-Synthase-
Aktivität aufweisen.
Desweiteren sind Gegenstand der Erfindung DNA-Sequenzen aus
Solanum tuberosum, die für eine Citrat-Synthase kodieren, sowie
Plasmide und Bakterien enthaltend diese DNA-Sequenzen.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von DNA-
Sequenzen aus Pflanzen, die für Citrat-Synthase kodieren, für die
Inhibierung der Blütenbildung, sowie die Verwendung der besagten
DNA-Sequenzen aus Solanum tuberosum in Kombination mit
Steuerelementen zur Expression in pro- und eukaryontischen Zellen
und die Verwendung dieser DNA-Sequenzen zur Isolierung
ähnlicher Sequenzen aus dem Genom von Pflanzen.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur
Herstellung genetisch veränderter Pflanzen, deren Aktivität der
Citrat-Synthase reduziert ist, dadurch gekennzeichnet, daß eine
Expressionskassette mit folgenden Bestandteilen in das Genom der
Pflanzen integriert und exprimiert wird:
- a) einem in Pflanzen funktionalen Promotor
- b) einer für Citrat-Synthase kodierenden DNA-Sequenz, die in anti-sense Orientierung an den Promotor fusioniert ist, so daß der nicht-kodierende Strang abgelesen wird
- c) einem in Pflanzen funktionalen Signal für die Transkrip tionstermination und Polyadenylierung eines RNA-Moleküls.
Die vorliegende Erfindung stellt ein DNA-Molekül, das eine derartige
Expressionskassette enthält, in Form des Plasmids pKS-CSa zur
Verfügung, dessen Zusammensetzung in Ausführungsbeispiel 3
beschrieben ist.
Als Promotor kann im Prinzip jeder in Pflanzen aktive Promotor
verwendet werden. Der Promotor soll sicherstellen, daß das
gewählte Gen in der Pflanze exprimiert wird. Der Promotor kann
dabei so gewählt werden, daß die Expression nur in einem
bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt in der
Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse
determinierten Zeitpunkt erfolgt. Der Promotor kann homolog oder
heterolog in bezug auf die Pflanze sein.
Der Einsatz gewebespezifischer Promotoren stellt einen bevorzugten
Gegenstand der Erfindung dar.
Die vorliegende Erfindung stellt DNA-Sequenzen zur Verfügung,
durch deren Verwendung Veränderungen der Citrat-
Synthaseaktivität in Kartoffelpflanzen tatsächlich und nachweisbar
möglich sind.
Es handelt sich dabei um Sequenzen mit der kodierenden Region
von Citrat-Synthase aus Solanum tuberosum.
Die in dem oben angegebenen Verfahren unter b) genannte
kodierende Sequenz für Citrat-Synthase ist vorzugsweise die
Sequenz aus Solanum tuberosum mit folgender Nukleotidabfolge:
Die anti-sense Orientierung der in b) genannten kodierenden DNA-
Sequenz in bezug auf den Promotor bewirkt, daß in den
transformierten Zellen eine nicht-translatierbare mRNA gebildet
wird, die die Synthese einer endogenen Citrat-Synthase verhindert.
Anstatt der gesamten unter Seq ID No. 1 angegebenen
erfindungsgemäßen DNA-Sequenz können auch Teilsequenzen
davon für die anti-sense-Inhibition verwendet werden. Es können
Sequenzen bis zu einer Mindestlänge von 15 bp verwendet werden.
Eine inhibierende Wirkung ist aber auch bei der Verwendung
kürzerer Sequenzen nicht ausgeschlossen. Bevorzugt werden
längere Sequenzen zwischen 100 und 500 Basenpaaren verwendet,
für eine effiziente anti-sense Inhibition werden insbesondere
Sequenzen mit einer Länge über 500 Basenpaaren verwendet. In
der Regel werden Sequenzen verwendet, die kürzer als 5000
Basenpaare sind, bevorzugt Sequenzen, die kürzer als 2500
Basenpaare sind.
Möglich ist auch die Verwendung von DNA-Sequenzen, die einen
hohen Grad an Homologie zu der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz
aufweisen, aber nicht vollkommen identisch sind. Die minimale
Homologie sollte größer als ca. 65% sein. Die Verwendung von
Sequenzen mit Homologien zwischen 95 und 100% ist zu
bevorzugen.
Die Erfindung betrifft darüberhinaus die Verwendung von
Sequenzen, die sich aus der unter Seq ID No. 1 dargestellten
Sequenz durch Insertion, Deletion oder Substitution ergeben, ohne
daß dadurch die inhibierende Wirkung der anti-sense-Sequenz
aufgehoben wird.
Bei den für die Konstruktion von anti-sense Konstrukten
verwendeten DNA-Fragmente kann es sich auch um synthetische
DNA-Fragmente handeln, die mit Hilfe der gängigen DNA-
Synthesetechniken hergestellt wurden.
Eine Reduktion der Citrat-Synthaseaktivität in Pflanzenzellen kann
ebenfalls erreicht werden durch die Einführung einer DNA-Sequenz,
die für ein Ribozym kodiert, das spezifisch Transkripte von
endogenen Citrat-Synthase-Genen endonukleolytisch spaltet.
Ribozyme sind katalytisch aktive RNA-Moleküle, die in der Lage
sind, RNA-Moleküle an spezifischen Zielsequenzen zu spalten. Mit
Hilfe gentechnologischer Methoden ist es möglich, die Spezifität von
Ribozymen zu verändern. Es existieren verschiedene Klassen von
Ribozymen. Für die praktische Anwendung mit dem Ziel, das
Transkript eines bestimmten Gens gezielt zu spalten, werden
bevorzugt Vertreter zweier verschiedener Gruppen von Ribozymen
verwendet. Die eine Gruppe wird gebildet von Ribozymen die dem
Typ der Gruppe I-Intron-Ribozymen zuzuordnen sind. Die zweite
Gruppe wird von Ribozymen gebildet, die als charakteristisches
Strukturmerkmal ein sogenanntes "hammerhead"-Motiv aufweisen.
Die spezifische Erkennung des Ziel-RNA-Moleküls kann modifiziert
werden durch Änderung der Sequenzen, die dieses Motiv
flankieren. Diese Sequenzen bestimmen über Basenpaarung mit
Sequenzen im Zielmolekül die Stelle, an der die katalytische
Reaktion und somit die Spaltung des Zielmoleküls erfolgt. Da die
Sequenzanforderungen für eine effiziente Spaltung äußerst gering
sind, erscheint es daher im Prinzip möglich, spezifische Ribozyme
für praktisch jedes beliebige RNA-Molekül zu entwickeln.
Die Herstellung genetisch veränderter Kartoffelpflanzen, deren
Aktivität der Citrat-Synthase drastisch reduziert ist, kann daher
auch erfolgen durch Einführung und Expression eines
rekombinanten doppelsträngigen DNA-Moleküls in Pflanzen, das
sich zusammensetzt aus:
- a) einem in Pflanzen funktionalen Promotor
- b) einer DNA-Sequenz, die für eine katalytische Domäne eines Ribozyms kodiert und die flankiert ist von DNA-Sequenzen, die homolog sind zu Sequenzen des Zielmoleküls, und
- c) einem in Pflanzen funktionalen Signal für die Transkrip tionstermination und Polyadenylierung eines RNA-Moleküls.
Für die unter Punkt b) genannte Sequenz kommt z. B. die
katalytische Domäne der Satelliten-DNA des SCMo-Virus (Davies et
al., 1990, Virology, 177: 216-224) oder die der Satelliten-DNA des
TobR-Virus (Steinecke et al.,1992, EMBO J., 11:1525-1530; Haseloff
and Gerlach, 1988, Nature 334: 585-591) in Betracht.
Die DNA-Sequenzen, die die katalytische Domäne flankieren, werden
gebildet von DNA-Sequenzen, die homolog sind zu den Sequenzen
endogener Citrat-Synthase-Gene.
Für die unter a) und c) genannten Sequenzen gilt dasselbe, das
schon oben für die Konstruktion von anti-sense-Konstrukten
angeführt wurde.
Es wurde gefunden, daß es nach der Einführung der auf dem
Plasmid pKS-CSa lokalisierten DNA in das Genom einer
Kartoffelpflanze neben der Inhibierung der Blütenbildung zu einer
verstärkten Synthese von Stärke in den Kartoffelknollen kommt.
Durch die Kultivierung derartig veränderter Pflanzen ist es möglich,
auf die Verwendung synthetischer Wachstumsregulatoren zu
verzichten und somit Kosten zu senken und Risiken für die Umwelt
zu vermeiden.
Die gezielte Inhibierung der Blütenbildung über die Reduktion der
Citrat-Synthaseaktivität ist daher nicht nur für die Kartoffel von
Interesse, sondern sollte von breiterer Bedeutung für die
Pflanzenzüchtung und die Landwirtschaft sein. Genannt sei z. B. die
Möglichkeit, durch Kombination der erfindungsgemäßen DNA-
Sequenzen mit exogen regulierbaren Steuerelementen eine zeitlich
determinierte Blühinduktion oder -inhibierung zu erreichen. Dies
kann für die Vermeidung von Frostschäden eine Rolle spielen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl auf dikotyle Pflanzen
als auch auf monokotyle Pflanzen angewendet werden. Pflanzen,
denen dabei besonderes Interesse gilt, sind Nutzpflanzen, wie
Getreidearten (z. B. Roggen, Weizen, Hafer, Gerste etc.), Obstarten
(z. B. Aprikose, Pfirsich, Apfel, Pflaume ect.), Gemüsearten (z. B.
Tomaten, Broccoli, Spargel etc.), Zierpflanzen oder andere
wirtschaftlich interessante Pflanzenarten (z. B. Tabak, Raps,
Sojabohne, Sonnenblume etc.).
Von besonderem Interesse ist die Anwendung der vorliegenden
Erfindung bei der Zuckerrübe. Ein wesentliches Problem beim
Zuckerrübenanbau betrifft das Auftreten von "Schossen" bereits im
ersten Jahr. Neben der damit einhergehenden Ertragseinbuße führt
diese Schossung zur Bildung von Blüten und damit von Samen, die
in der Fruchtwechselfolge stark störende Effekte aufweisen. Da die
Schossung durch niedrige Temperaturen induziert wird, wird
gegenwärtig das Saatgut relativ spät ausgesetzt (im April/Mai), um
eine Schossung zu vermeiden. Die Inhibierung der Citrat-
Synthaseaktivität führt, wie hier gezeigt, in transgenen Kartoffeln
zur Inhibierung der Blütenbildung. Aufgrund dieser Beobachtung ist
es offensichtlich, daß eine Inhibierung der Citrat-Synthase in
Zuckerrüben zu einer Reduktion der Schossung führt. Dieses erlaubt,
den Zuckerrübensamen früher auszulegen, was dann aufgrund der
verlängerten Vegetationsperiode zu einem erhöhten Ertrag führt.
Die Speicherorgane der Kartoffel enthalten als Speicherstoff im
wesentlichen Stärke. Die Metabolisierung der Stärke durch
Respiration liefert die Energie, die beim Auskeimen der Knolle
benötigt wird. Im Falle der Saatkartoffeln ist das jahreszeitlich
frühe Auskeimen der Knollen von Interesse; bei Kartoffelknollen,
die zu Speisezwecken verwendet werden, ist die Bildung von
Sprossen jedoch nachteilig. Einerseits steigt im Verlauf der
Auskeimung die Respiration stark an, was in erster Linie auf eine
Metabolisierung des Hauptspeicherstoffes Stärke zurückzuführen
ist, andererseits verändert sich auch die Konsistenz der Knolle, die
an Festigkeit verliert und im Geschmack nachläßt. Um das
Auskeimen während der Lagerung oder des Transports zu
verhindern, müssen diese trocken und kühl gehalten werden, da
Temperaturen über 8°C und Feuchtigkeit als Indikatoren des
Beginns der Vegetationsphase Signale für die Sproßbildung sind.
Diese Art der Lagerung ist zum einem sehr kostenintensiv, da sie
spezielle klimatisierte Räume erfordert, und zum anderen hat sie
auch negative Konsequenzen für die stoffliche Zusammensetzung
der Knolle: niedrige Temperaturen führen bei Kartoffelknollen zu
einer Umwandlung von Stärke in wasserlösliche Zucker. Dieser als
cold sweetening bezeichnete Effekt wird als eine Adaptation an
Standorte mit Temperaturen unter dem Gefrierpunkt diskutiert, da
wäßrige Lösungen mit steigender Konzentration an gelösten Stoffen
eine zunehmende Gefrierpunktserniedrigung aufweisen. Der Abbau
von Stärke in den Knollen zu reduzierenden Zuckern führt zu einer
Erhöhung der Konzentration gelöster Stoffe und senkt insofern die
Temperatur, bei der es zur Bildung von Eiskristallen in den Zellen
kommt. Die Qualität der Kartoffelknolle als Nahrungsmittel wird
jedoch durch das cold sweetening erheblich herabgesetzt, da die
gesteigerte Konzentration an reduzierenden Zuckern die Konsistenz
der Knollen verändert, beispielsweise kommt es beim Fritieren zu
einer unerwünschten Braunfärbung des Gewebes infolge einer
Maillard-Reaktion.
Überraschend wurde gefunden, daß nach Einführung der auf dem
Plasmid pKS-CSa lokalisierten DNA in das Genom einer
Kartoffelpflanze die Metabolisierung der Stärke in den
Speichergeweben inhibiert und dadurch das Auskeimen der
Kartoffelknollen unterbunden wird. Dies führt zu einer verbesserten
Lagerungsfähigkeit der Knollen, so daß diese für lange Zeit bei
Raumtemperatur gelagert werden können.
Bereits vor dem Auskeimen findet auch in der ruhenden
Kartoffelknolle eine Metabolisierung des Speicherstoffes Stärke
statt. Diese ist zwar im Vergleich zu der während der Keimung
stattfindenden Metabolisierung relativ gering, kann aber dennoch
zu erheblichen Verlusten an Stärke bei langer Lagerung der
Kartoffelknollen führen.
Durch Inhibierung der Respiration in den Kollen, können diese
Lagerungsverluste verringert werden.
Durch Modifikation der in Ausführungsbeispiel 3 beschriebenen
Durchführung kann auch eine Steigerung der Citrat-
Synthaseaktivität in den Geweben einer transformierten Pflanze
erreicht werden. Hierzu wird eine für Citrat-Synthase kodierende
DNA-Sequenz in sense Orientierung an einen Promotor fusioniert,
d. h. das 3′-Ende des Promotors wird mit dem 5′-Ende der
kodierenden DNA-Sequenz verknüpft. Dies führt zur Expression
einer für Citrat-Synthase kodierenden mRNA und folglich zu einer
verstärkten Synthese dieses Enzyms. Die Steigerung der Citrat-
Synthaseaktivität in den Zellen führt zu verstärkter Blüten- und
damit Fruchtbildung. Ein derartiger Effekt ist wünschenswert bei
Kulturpflanzen wie z. B. Tomate, Paprika, oder Baumwolle und bei
verschiedenen Zierpflanzen.
Durch Kombination der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen mit
exogen regulierbaren Steuerelementen, z. B. temperaturinduzierten
Promotoren, besteht auch die Möglichkeit der zeitlich
determinierten Blühinduktion oder Blühinhibierung, je nachdem ob
die DNA-Sequenz in sense- oder antisense-Orientierung an den
Promotor fusioniert ist.
So sind unter anderem Promotoren für eine spezifische Expression
in Blütenanlagen (Huÿser et al. (1992) EMBO J. 11: 1239-1249) oder
in photosynthetisch aktiven Geweben bekannt.
Zur Verhinderung des Auskeimens von Kartoffelknollen, sowie der
Lagerverluste durch Metabolisierung der Stärke sind solche
Promotoren sinnvoll, die eine Aktivierung der Transkription in den
Speicherorganen sicherstellen. Durch Kombination mit exogen
regulierbaren Steuerelementen, beispielsweise wundinduzierbaren
oder temperaturregulierten Promotoren, kann auch das Problem
der vegetativen Vermehrung bei Kartoffelpflanzen, deren Knollen
bei Inhibierung der Citrat-Synthase nicht auskeimen, gelöst werden.
Bei der Zuckerrübe kann in analoger Weise durch Verwendung
eines rübenspezifischen Promotors die Respiration reduziert und
dadurch ein Ertragsverlust durch Zuckerabbau in den Rüben
vermindert werden.
Die erfindungsgemäße DNA-Sequenzen können auch in Plasmide
eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine
Sequenzveränderung durch Insertion, Deletion oder Rekombination
von DNA-Sequenzen in prokaryontischen oder eukaryontischen
Systemen erlauben.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können ferner dazu genutzt
werden, um nach Standardverfahren aus dem Genom von Pflanzen
verschiedener Spezies ähnliche Sequenzen zu isolieren, die ebenfalls
für eine Citrat-Synthase kodieren. Mit diesen Sequenzen können
wiederum Konstruktionen zur Transformation von Pflanzen oder
Mikroorganismen hergestellt werden.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen
stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung,
die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion
transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige
Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw.
Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden
Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das
erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E.coli-Zellen
verwendet. Transformierte E.coli-Zellen werden in einem geeigneten
Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid
wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung
der gewonnen Plasmid-DNA werden im allgemeinen
Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch
molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation
kann die Plasmid DNA gespalten und mit anderen DNA-Sequenzen
verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen
oder anderen Plasmiden kloniert werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen
eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken
umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter
Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium
rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten,
die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von
DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen
werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten
Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-
Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig
transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die
Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle
können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für
die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid
verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch
die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als
Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.
Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die
einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar
entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären
Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von
Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch
homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der
Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für
den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre
Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines
Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium
tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren
können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie
enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linke r oder
Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion
eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien
transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet.
163: 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein
Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für
den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche
T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte
Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen
verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von
Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP
120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System
Offsetdrukkerÿ Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V;
Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 und An et al. (1985) EMBO
J. 4: 277-287 beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-
Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder
Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten
Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber
auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen)
können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika
oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann,
wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen
Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA
untersucht werden.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle
integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den
Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie
enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den
transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid
oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin,
Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuelle
gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen
gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der
üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986) Plant Cell
Reports 5: 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal
angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte
Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die
daraus entstehenden hybriden Individuen haben die
entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um
sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten
und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um
sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere
Eigenarten erhalten geblieben sind.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung hergestellten und
verwendeten Plasmide wurden bei der als internationale
Hinterlegungsstelle anerkannten Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik
Deutschland, entsprechend den Anforderungen des Budapester
Vertrages für die internationale Anerkennung der Hinterlegung von
Mikroorganismen zum Zwecke der Patentierung hinterlegt.
Am 28. 12. 1993 wurden bei der Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen (DSM) folgende Plasmide hinterlegt
(Hinterlegungsnummer):
Plasmid pPCS (DSM 8879)
Plasmid pKS-CSa (DSM 8880)
Plasmid pKS-CSa (DSM 8880)
Verwendete Abkürzungen | |
BSA | |
Rinderserumalbumin | |
EDTA | (Ethylendinitrilo)tetraessigsäure |
50×Denhardt-Lösung | 5 g Ficoll (Typ 400, Pharmacia) |
5 g Polyvinylpyrrolidon | |
5 g Rinderserumalbumin (Fraktion V, Sigma) | |
ad 500 ml mit H₂O | |
FADH₂ | Flavin-Adenin-Dinucleotid, reduziert |
MOPS | 3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure |
NADH | β-Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid, reduziert |
PMSF | Phenylmethylsulfonylfluorid |
SCMo-Virus | "subterranean clover mottle virus" |
SDS | Natriumdodecylsulfat |
20x SSC | 175,3 g NaCl, 88,2 g Natriumcitrat |
ad 1000 ml mit H₂O, pH 7.0 mit 10 N NaOH | |
TobR-Virus | "tobacco ringspot virus" |
Trizin | N-Tris(hydroxymethyl)-Methylglycin |
Fig. 1 zeigt das Plasmid pPCS
Die fein gezogene Linie entspricht der Sequenz von pBlueskript KS. Die starke Linie repräsentiert die cDNA- Insertion.
Restriktionsschnittstellen der Insertion sind angegeben.
Die fein gezogene Linie entspricht der Sequenz von pBlueskript KS. Die starke Linie repräsentiert die cDNA- Insertion.
Restriktionsschnittstellen der Insertion sind angegeben.
Fig. 2 zeigt das Plasmid pKS-CSa
Aufbau des Plasmids:
A = Fragment A: CaMV 35S-Promotor, nt 6909-7437 (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294)
B = Fragment B: Citrat-Synthase-cDNA aus Kartoffel,
BamHI/SalI-Fragment, ca. 1900 bp
Orientierung: anti-sense
C = Fragment C: nt 11748-11939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3: 835-846).
Aufbau des Plasmids:
A = Fragment A: CaMV 35S-Promotor, nt 6909-7437 (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294)
B = Fragment B: Citrat-Synthase-cDNA aus Kartoffel,
BamHI/SalI-Fragment, ca. 1900 bp
Orientierung: anti-sense
C = Fragment C: nt 11748-11939 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J. 3: 835-846).
Fig. 3 zeigt das Ergebnis eines Northern-Blot Experiments
Zur Analyse wurden jeweils 2 µg poly(A⁺)-mRNA aus verschiedenen transgenen Kartoffelpflanzen (Spur 4-8) und drei nicht-transformierten Kartoffelpflanzen (Spur 1-3) verwendet.
Spuren 1, 2 und 3: Wildtyp Solanum tuberosum cv. D´sir´e
Spur 4: transgene Kartoffellinie T6
Spur 5: transgene Kartoffellinie T21
Spur 6: transgene Kartoffellinie T29
Spur 7: transgene Kartoffellinie T50
Spur 8: transgene Kartoffellinie T55.
Zur Hybridisierung wurde die radioaktiv markierte cDNA der Citrat-Synthase aus Kartoffeln verwendet.
Zur Analyse wurden jeweils 2 µg poly(A⁺)-mRNA aus verschiedenen transgenen Kartoffelpflanzen (Spur 4-8) und drei nicht-transformierten Kartoffelpflanzen (Spur 1-3) verwendet.
Spuren 1, 2 und 3: Wildtyp Solanum tuberosum cv. D´sir´e
Spur 4: transgene Kartoffellinie T6
Spur 5: transgene Kartoffellinie T21
Spur 6: transgene Kartoffellinie T29
Spur 7: transgene Kartoffellinie T50
Spur 8: transgene Kartoffellinie T55.
Zur Hybridisierung wurde die radioaktiv markierte cDNA der Citrat-Synthase aus Kartoffeln verwendet.
Fig. 4 zeigt das Ergebnis der Bestimmung der Citrat-
Synthaseaktivität aus Blättern, Knollen und Mitochondrien aus
Knollen von Wildtyp-Pflanzen im Vergleich mit Pflanzen der
transgenen Kartoffellinien T6, T29, T50 und T55.
Fig. 5 zeigt transgene Kartoffelpflanzen der Linien T6 (Nr. 3 und 4)
und T29 (Nr. 5 und 6) im Vergleich mit Wildtyp-Pflanzen (Nr.
1 und 2). Die Pflanzen wurden im Gewächshaus bei 60%
Luftfeuchtigkeit, 10°C bis 15°C unter einem 14h/10h
(Licht/Dunkel) Lichtrhythmus kultiviert.
Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrundeliegenden
Ausführungsbeispiele werden die wichtigsten eingesetzten
Verfahren im folgenden erläutert.
Zur Klonierung in E.coli wurde der Vektor pBlueskriptKS
(Stratagene) verwendet.
Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in
den binären Vektor pBinAR kloniert.
Für den pBlueskriptKS-Vektor und für die pBinAR-Konstrukte
wurde der E.coli-Stamm DH5α (Bethesda Research Laboratories,
Gaithersburgh, USA) verwendet. Für die in vivo excision wurde der
E.coli-Stamm XLI-Blue verwendet.
Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanzen wurde mit
Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes C58C1 durchgeführt
(Rocha-Sosa et al. (1989) EMBO J. 8: 23-29).
Der Transfer der DNA erfolgte durch direkte Transformation nach
der Methode von Höfgen & Willmitzer (1988, Nucleic Acids Res.
16: 9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde
nach der Methode von Birnboim & Doly (1979, Nucleic Acids Res.
7: 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung
gelelektrophoretisch analysiert.
Zehn kleine mit dem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-
Sterilkultur (Solanum tuberosum L.cv. Desiree) wurden in 10 ml
MS-Medium (Murashige & Skoog (1962) Physiol. Plant. 15: 473) mit
2% Saccharose gelegt, welches 50 µl einer unter Selektion
gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt.
Nach 3-5 minütigem, leichtem Schütteln erfolgte eine weitere
Inkubation für 2 Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter zur
Kallusinduktion auf MS-Medium mit 1.6% Glukose, 5 mg/l
Naphthylessigsäure, 0.2 mg/l Benzylaminopurin, 250 mg/l Claforan,
50 mg/l Kanamycin, und 0.80.% Bacto Agar gelegt. Nach einwöchiger
Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurden die Blätter zur
Sproßinduktion auf MS-Medium mit 1.6% Glukose, 1.4 mg/l
Zeatinribose, 20 µg/l Naphthylessigsäure, 20 µg/l Giberellinsäure,
250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin, und 0.80.% Bacto Agar
gelegt.
Für die Bestimmung der Citrat-Synthaseaktivität wurden
Rohextrakte aus Knollen, Blättern und Blüten hergestellt sowie
Mitochondrien aus Kartoffelknollen isoliert. Für die Herstellung von
Rohextrakten wurde das jeweilige Material in flüssigem Stickstoff
gefroren, in Extraktionspuffer (Neuhaus und Stitt (1990) Planta
182: 445-454) homogenisiert, zentrifugiert und der Überstand
anschließend für den Aktivitätstest verwendet. Für die Isolierung
von Mitochondrien aus Kartoffelknollen wurden 100-200 g frisch
geerntete Knollen geschält und in 100 ml "Grinding buffer" (0.4 M
Mannitol, 1 mM EDTA, 25 mM MOPS, 0.1% BSA, 10 mM β-
Mercaptoethanol, 0.05 mM PMSF, pH 7.8) homogenisiert. Das
Homogenat wurde durch 4 Lagen Baumwoll-Gaze filtriert und für 4
min bei 3500 g zentrifugiert. Der Überstand wurde durch 2 Lagen
"Miracloth" (Calbiochem) gefiltert und nochmals für 30 min bei
18000 g zentrifugiert. Das Pellet wurde mit einer weichen Bürste in
2 ml Resuspensionspuffer (0.4 M Mannitol, 20 mM Trizin, 2 mM
EDTA, pH 7.2) resuspendiert. Nach zweifacher Homogenisierung in
einem "Potter"-Homogenisator wurde der Extrakt auf einen
diskontinuierlichen Percoll-Gradient geschichtet und 1 h bei 72000
g zentrifugiert. Mitochondrien wurden aus der 28%/45%-Interphase
entnommen, gewaschen und zweimal für 15 min bei 14500 g in
"Washing buffer" (0.4 M Mannitol, 5 mM MOPS, 0.1% BSA, 0.2 mM
PMSF, pH 7.5) zentrifugiert. Die Mitochondrien wurden anschließend
in 100 µl Resuspensionspuffer aufgenommen. Für die Bestimmung
der Citrat-Synthaseaktivität wurden 5 µl der
Mitochondriensuspension in 100 u¹ Extraktionspuffer (Neuhaus und
Stitt (1990) Planta 182: 445-454) aufgenommen.
Die Citrat-Synthaseaktivität wurde spektraiphotometrisch bei 412
nm und 30°C nach der Methode von Srere (1967, Methods in
Enzymology 13: 3-22) bestimmt.
RNA wurde aus gefrorenem Pflanzenmaterial isoliert wie
beschrieben in Logemann et al. (1987, Anal. Biochem. 163: 21-26).
Die RNA wurde denaturiert in 40% Formamid. Anschließend wurde
die RNA gelelektrophoretisch auf Formaldehyd/Agarosegelen
aufgetrennt und nach dem Geilauf auf Nylonmembran (Hybond N;
Amersham, UK) geblottet. Die Hybridisierung gegen eine radioaktiv
markierte DNA-Probe erfolgte nach Standardmethoden.
Solanum tuberosum-Pflanzen wurden im Gewächshaus bei 60%
Luftfeuchtigkeit, 10 bis 15°C und einem 14h/10h (Licht/Dunkel)
Lichtrhythmus gehalten.
Für die Identifizierung einer cDNA aus Kartoffel, die für Citrat-
Synthase kodiert, wurde zunächst ein DNA-Fragment der bereits
bekannten cDNA von Citrat-Synthase aus Arabidopsis thaliana
(Unger et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13: 411-418) amplifiziert.
Hierfür wurde aus grünem Pflanzengewebe von Arabidopsis
thaliana-Pflanzen Gesamt-RNA extrahiert und aus dieser poly(A⁺)
mRNA präpariert. Diese wurde anschließend für die Herstellung von
cDNA verwendet. Aus dieser cDNA-Präparation wurde mit Hilfe der
Oligodesoxynukleotide
5′-AAGTGGATCCATGGTGTTTTTCCGCAGCGTAT-3′ und
5′-CATAGGATCCTTAAGCAGATGAAGCTTTCTTA-3′,
5′-CATAGGATCCTTAAGCAGATGAAGCTTTCTTA-3′,
die komplementär zum 5′- bzw. 3′-Ende der kodierenden Region
der cDNA der Citrat-Synthase aus Arabidopsis thaliana (Unger et al.
(1989) Plant Mol. Biol. 13: 411-418) sind, durch eine "Polymerase
Chain Reaction" (PCR) ein 1438 bp langes DNA-Fragment isoliert, das
für die Citrat-Synthase aus Arabidopsis thaliana kodiert. Die
verwendeten Oligonukleotide führen zusätzlich an beiden Enden des
amplifizierten DNA-Fragmentes BamHI-Schnittstellen ein. Das aus
der PCR-Reaktion resultierende DNA-Fragment wurde mit BamHI
verdaut und in das mit BamHI geschnittene Plasmid pUC9.2 ligiert.
Die cDNA-Insertion dieses Plasmids wurde später als heterologe
Probe für die Identifizierung einer für Citrat-Synthase kodierenden
cDNA aus Kartoffel verwendet.
Für die Herstellung einer cDNA-Bibliothek wurde aus Blättern von
Kartoffelpflanzen poly(A⁺)-mRNA isoliert. Ausgehend von der
poly(A⁺)-mRNA wurde cDNA hergestellt, die mit EcoRI/NotI-linkern
versehen wurde, und mit der eine cDNA-Bibliothek in dem Vektor
Lambda ZAP II (Stratagene) angelegt wurde (Koßmann et al. (1992)
Planta 188: 7-12). 250000 Plaques dieser cDNA-Bibliothek wurden
mit Hilfe der heterologen Probe aus Arabidopsis thaliana auf DNA-
Sequenzen hin untersucht, die homolog zu dieser sind. Dazu wurden
die Plaques auf Nitrozellulose-Filter übertragen und durch NaOH-
Behandlung denaturiert. Die Filter wurden anschließend
neutralisiert, und die DNA auf den Filtern durch Hitzebehandlung
fixiert. Die Filter wurden in 25% Formamid, 0.5% BSA, 1% SDS, 5xSSC,
5x Denhardt-Lösung, 40 mM Natriumphosphat-Puffer pH 7.2 und
100 µg/ml Lachssperma-DNA prähybridisiert für 2 Stunden bei
42°C. Anschließend wurden die Filter in 25% Formamid, 0.5% BSA,
1% SDS, 5xSSC, 5x Denhardt-Lösung, 40 mM Natriumphosphat-
Puffer pH 7.2 und 100 µg/ml Lachssperma-DNA nach Zugabe der
P ³²-markierten, für Citrat-Synthase aus Arabidopsis thaliana
kodierenden cDNA über Nacht bei 42°C hybridisiert. Die Filter
wurden für 30 min in 5xSSC, 0.5% SDS bei 42°C und für 20 min in
3xSSC, 0.5% SDS bei 42°C gewaschen.
Phagenklone der cDNA-Bibliothek, die mit der verwendeten cDNA
aus Arabidopsis thaliana hybridisierten, wurden unter Anwendung
von Standardverfahren weiter gereinigt. Mit Hilfe der in vivo
excision-Methode wurden von positiven Phagenklonen E.coli-Klone
gewonnen, die ein doppelsträngiges pBlueskript-Plasmid mit der
jeweiligen cDNA-Insertion in der EcoRI-Schnittstelle des poly
linkers enthalten. Nach Überprüfung der Größe und des
Restriktionsmusters der Insertionen wurde ein geeigneter Klon
einer Sequenzanalyse unterzogen.
Aus einem entsprechend Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen E.coli-
Klon wurde das Plasmid pPCS (Fig. 1) isoliert und seine cDNA-
Insertion durch Standardverfahren mittels der Didesoxymethode
(Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467)
bestimmt. Die Insertion ist 1891 bp lang. Die Nukleotidsequenz (Seq.
ID No. 1) ist oben angegeben.
Aus dem Plasmid pPCS wurde durch BamHI/SalI-Verdau ein ca. 1.9
kb langes DNA-Fragment isoliert, das die oben angegebene Sequenz
(Seq. ID No. 1) aufweist und die kodierende Region für Citrat-
Synthase aus Kartoffeln enthält. Dieses DNA-Fragment wurde in den
mit BamHI/SalI geschnittenen Vektor pBinAR (Höfgen und
Willmitzer (1990) Plant Sci. 66: 221-230) kloniert. Der Vektor
pBinAR ist ein Derivat des binären Vektors Bin 19 (Bevan (1984)
Nucleic Acids Res. 12: 8711-8721).
Das resultierende Plasmid wurde pKS-CSa genannt und ist in Fig. 2
dargestellt.
Durch die Insertion des cDNA-Fragmentes entsteht eine
Expressionskassette, die folgendermaßen aus den Fragmenten A, B
und C aufgebaut ist (Fig. 2):
Das Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des
Cauliflower-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die
Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al. (1980) Cell
21: 285-294).
Das Fragment B umfaßt die proteinkodierende Region der Citrat-
Synthase aus Kartoffeln. Diese wurde wie oben beschrieben als
BamHI/SalI-Fragment aus pPCS isoliert und in anti-sense
Orientierung an den Promotor in pBinAR fusioniert.
Fragment C (192 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des
Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al. (1984)
EMBO J. 3: 835-846).
Die Größe des Plasmids pKS-CSa beträgt ca. 12.9 kb.
Der Vektor pKS-CSa wurde mittels Agrobacterium tumefaciens
vermittelter Transformation in Kartoffeln transferiert. Intakte
Pflanzen wurden aus den transformierten Zellen regeneriert.
Als Ergebnis der Transformation zeigten transgene Kartoffelpflanzen
in verschiedenem Ausmaß eine Verringerung der für die Citrat-
Synthase kodierenden mRNA (siehe Fig. 3). Es wurden 2 µg
poly(A⁺)-mRNA in einem Northern-Blot Experiment mit der Sonde
für Citrat-Synthase aus Kartoffeln hybridisiert. Das in Wildtyp-
Pflanzen auftretende, für Citrat-Synthase kodierende Transkript
(Spuren 1 bis 3) ist kürzer als das Transkript der anti-sense-
Expressionskassette (siehe beispielsweise Spur 6), wodurch sich
erkennen läßt, daß es in den verschiedenen transgenen Pflanzen zu
einer unterschiedlich starken Reduktion der endogenen Transkripte
gekommen ist.
Transgene Kartoffelpflanzen, die eine Verringerung der für die
Citrat-Synthase kodierenden mRNA aufwiesen, wurden im Hinblick
auf die Citrat-Synthaseaktivität in verschiedenen Geweben
untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen an Blättern,
Knollen und aus Knollen isolierten Mitochondrien sind in Fig. 4
dargestellt.
Die Verringerung der Citrat-Synthaseaktivität hat in den transgenen
Pflanzen einen erheblichen Effekt auf die Blütenbildung, dessen
Ausprägung vom Ausmaß der Inhibierung der Citrat-
Synthaseaktivität abhängt.
Transformierte Kartoffelpflanzen, bei denen die Citrat-
Synthaseaktivität stark verringert ist (vergleiche Fig. 4), sind in
ihrer Blütenbildung stark bis vollkommen inhibiert (siehe Fig. 5).
Pflanzen bei denen die Citrat-Synthaseaktivität nur mäßig
verringert ist, zeigen eine verspätete Blütenbildung und setzen
weniger Blüten an oder bilden nur Blütenknospen, die sich nicht zu
funktionsfähigen Blüten weiterentwickeln.
Claims (28)
1. Verfahren zur Inhibierung der Blütenbildung in Pflanzen, dadurch
gekennzeichnet, daß die Expression der Citrat-Synthase gehemmt
wird.
2. Verfahren zur Inhibierung der Blütenbildung in Pflanzen gemäß
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression der Citrat-
Synthase durch den Einsatz von anti-sense-DNA gehemmt wird.
3. Verfahren zur Inhibierung der Blütenbildung in Pflanzen, dadurch
gekennzeichnet, daß
- a) in das Genom einer Pflanzenzelle DNA stabil integriert wird, die komplementär zu einem in der Zelle vorhandenen Citrat-Synthasegen ist,
- b) diese DNA durch Kombination mit geeigneten, die Transkription steuernden Elementen konstitutiv oder induziert exprimiert wird, c) die Expression endogener Citratsynthase-Gene aufgrund eines anti sense-Effektes gehemmt wird und
- d) aus den transgenen Zellen Pflanzen regeneriert werden.
4. Verfahren zur Verbesserung der Speicherkapazität von
Nutzpflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) in das Genom einer Pflanzenzelle DNA stabil integriert wird, die komplementär zu einem in der Zelle vorhandenen Citrat-Synthasegen ist,
- b) diese DNA durch Kombination mit geeigneten, die Transkription steuernden Elementen konstitutiv oder induziert exprimiert wird,
- c) die Expression der Citratsynthase aufgrund eines anti-sense- Effektes gehemmt wird und
- d) aus den transgenen Zellen Pflanzen regeneriert werden.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 ,
worin die verwendete anti-sense-DNA in sense Orientierung eine
Nukleotidsequenz umfaßt, die für ein Protein mit der folgenden
Sequenz
oder eines Teiles davon kodiert, wobei die kodierende Sequenz lang
genug ist, um die Expression eines endogenen Citrat-Synthasegens zu
inhibieren.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, worin
die DNA in sense Orientierung die folgende Nukleotidsequenz (Seq ID
No. 1)
oder einen Teil davon umfaßt oder Derivate davon, die durch
Insertion, Deletion oder Substitution von dieser Sequenz abgeleitet
sind.
7. Verfahren zur Induktion der Blütenbildung in Pflanzen, dadurch
gekennzeichnet, daß
- a) in das Genom einer Pflanzenzelle DNA stabil integriert wird, die homologen oder heterologen Ursprungs ist und die für ein Protein mit Citrat-Synthase-Aktivität kodiert,
- b) diese DNA durch Kombination mit geeigneten, die Transkription steuernden Elementen konstitutiv oder induziert exprimiert wird,
- c) es aufgrund dieser Expression zu einer Steigerung der Citrat- Synthasektivität in den transgenen Zellen kommt und
- d) aus den transgenen Zellen Pflanzen regeneriert werden.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, worin die für eine Citrat-Synthase-
Aktivität kodierende DNA-Sequenz eine Nukleotidsequenz umfaßt, die
für ein Protein mit der folgenden Sequenz:
kodiert.
9. Verfahren gemäß Anspruch 7, in dem die für eine Citrat-Synthase-
Aktivität kodierende DNA-Sequenz die folgende Nukleotidsequenz
(Seq ID No.1)
oder einen Teil davon umfaßt, wobei der Teil lang genug ist, um für ein
Protein zu kodieren, das Citrat-Synthase-Aktivität aufweist.
10. DNA-Sequenzen aus einer Pflanze der Familie der Solanaceae, die
die kodierende Region für eine Citrat-Synthase (EC-Nr. 4.1.3.7.)
enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß die in der Nukleotidabfolge
enthaltene Information bei Integration in ein pflanzliches Genom die
Bildung von Ribonukleinsäure erlaubt und über diese
Ribonukleinsäure eine endogene Citrat-Synthaseaktivität unterdrückt
werden kann.
11. DNA-Sequenzen aus Pflanzen der Spezies Solanum tuberosum, die
die kodierende Region für eine Citrat-Synthase (EC-Nr. 4.1.3.7.)
enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß die in der Nukleotidabfolge
enthaltene Information bei Integration in ein pflanzliches Genom die
Bildung von Ribonukleinsäure erlaubt und über diese
Ribonukleinsäure eine endogene Citrat-Synthaseaktivität unterdrückt
werden kann.
12. DNA-Sequenzen aus einer Pflanze der Familie der Solanaceae, die
die kodierende Region für eine Citrat-Synthase (EC-Nr. 4.1.3.7.)
enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß durch die in der
Nukleotidabfolge enthaltene Information die Citratsynthaseaktivität
in Pflanzenzellen erhöht werden kann.
13. DNA-Sequenzen aus Pflanzen der Spezies Solanum tuberosum, die
die kodierende Region für eine Citrat-Synthase (EC-Nr. 4.1.3.7.)
enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß durch die in der
Nukleotidabfolge enthaltene Information die Citratsynthaseaktivität
in Pflanzenzellen erhöht werden kann.
14. Eine DNA-Sequenz gemäß den Ansprüchen 10 bis 13, dadurch
gekennzeichnet, daß diese Sequenz folgende Nukleotidabfolge (Seq. ID No.
1) hat:
15. Ein Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es DNA-Sequenzen gemäß
einem oder mehreren der Ansprüchen 10 bis 14 enthält.
16. Plasmid pPCS, das unter der DSM-Nr. 8879 hinterlegt wurde.
17. Plasmid pKS-CSa, das unter der DSM-Nr. 8880 hinterlegt wurde.
18. Die Verwendung der Plasmide gemäß einem oder mehreren der
Ansprüche 15 bis 17 oder Derivate oder Teile davon zur Transformation
pro- und eukaryontischer Zellen.
19. Bakterien, enthaltend DNA-Sequenzen gemäß einem oder mehreren
der Ansprüche 10 bis 14.
20. Bakterien enthaltend Plasmide gemäß einem oder mehreren der
Ansprüche 15 bis 17.
21. Transgene Pflanzen, enthaltend DNA-Sequenzen gemäß einem oder
mehreren der Ansprüche 10 bis 14 als Bestandteil rekombinanter DNA.
22. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 21 dadurch gekennzeichnet, daß
ihre Citrat-Synthaseaktivität durch Anwesenheit einer DNA-Sequenz
gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 10 bis 14, die Bestandteil
einer rekombinanten DNA ist, verändert ist.
23. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 21 oder 22, dadurch
gekennzeichnet, daß es eine Nutzpflanze ist.
24. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 21 oder 22, dadurch
gekennzeichnet, daß es eine Kartoffel ist.
25. Verwendung von DNA-Sequenzen aus Pflanzen, die für eine Citrat-
Synthase (EC-Nr. 4.1.3.7.) kodieren, zur Inhibierung der Blütenbildung in
Pflanzen.
26. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß einem oder mehreren der
Ansprüche 10 bis 14 in Kombination mit Steuerelementen für eine
Expression in pro- und eukaryontischen Zellen.
27. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß einem oder mehreren der
Ansprüche 10 bis 14 zur Expression einer nicht translatierbaren mRNA,
die die Synthese einer endogenen Citrat-Synthase in den Zellen
verhindert.
28. Verwendung der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 14 zur Isolierung
ähnlicher Sequenzen aus dem Genom von Pflanzen.
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