DE102005007311B4

DE102005007311B4 - Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen mit verminderter Ruheperiode

Info

Publication number: DE102005007311B4
Application number: DE102005007311A
Authority: DE
Inventors: Hiroaki Kawasaki Kisaka; Tetsuya Kawasaki Miwa
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2004-02-17
Filing date: 2005-02-17
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2025-02-18
Also published as: DE102005007311A1; RU2298034C2; RU2005104390A; PL372909A1; FR2866348A1; US20050183168A1; JP2005229823A

Abstract

Verfahren zur Erzeugung einer Pflanze mit einer verkürzten Ruheperiode im Vergleich zu der von natürlich auftretenden Pflanzen derselben Art durch Erhöhung eines intrazellulären 2-OG-Gehalts in der Pflanze, umfassend den Schritt der Überexpression eines intrazellulären GDH-Gens in der Pflanze.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen mit verminderter Ruheperiode und insbesondere Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen mit verminderter Ruheperiode und erhöhtem Ertrag.

Hintergrund der Erfindung

Die Ruheperiode bezeichnet einen Zustand, in dem die lebende Pflanze nicht keimen wird, selbst wenn Umgebungsbedingungen wie Feuchtigkeit, Temperatur, usw. für die Sprossung oder Keimbildung von Samen günstig sind. Die Ruheperiode ist bei Samen, Zwiebeln, Laub abwerfenden Fruchtbäumen oder ähnlichen üblich. Die Ruheperiode wird als wichtige Funktion zum Schutz einer Pflanze vor unterlegenen Umweltbedingungen und zum Erhalt ihrer Samen angesehen. In der modernen Landwirtschaft sind die Kulturbedingungen jedoch mit der Verbreitung von Gewächshauskultivierung oder Multikultivierungen verbessert und so kann diese Ruheperiode die Kultivierung deutlich behindern. Daher wurden Arten mit kurzer Ruheperiode oder keiner Ruheperiode vieler Pflanzen aktiv kultiviert und so konnten ausgezeichnete Ergebnisse erhalten werden.

Weiterhin wurde ein Verfahren zum Abbruch der Pflanzenruheperiode durch künstliche Behandlung entwickelt. Es wird angenommen, dass die Ruheperiode im wesentlichen durch Anhäufung von Keimungsinhibitoren, wie z.B. Abscisinsäure ausgelöst wird. Um aus der Ruheperiode zu erwachen, wird angenommen, dass eine Abnahme des Keimbildungsinhibitors oder eine Zunahme von Gibberellin, das eine Keimbildungsinhibitor-antagonistische Wirkung ausübt, notwendig ist. Daher wird angenommen, dass die Wirkungen des Abbruchs der Ruheperiode bei Gibberellinbehandlungen an Pflanzen auftreten.

Tatsächlich zeigte Gibberellin eine induzierende Wirkung auf die Keimbildung für ruhende Samen von Hafer, Kopfsalat usw. und die ruhenden Triebe von Kartoffel, Pfirsich, Kamelien usw. (Tomokazu Koshiba und Yuji Kamiya, "Science of new Plant hormone", Kodansha Ltd., 2002). Es wurde außerdem anerkannt, dass es eine deutliche Wirkung zur Verbesserung der Keimbildung von Samen von Reis, der Weizenfamilie, Ramie, Erdnüssen, Bromus catharticus, Bromus inermis Leyss., japanischem Rettich, Brassicaarten, Kopfsalat, Aubergine, der Leberpilz (beefsteak plant), Gloxinia, Kalanchoe, Primula, Nigella damascenae, usw. und auch bei Erdbeeren, Aralia cordata Thunberg, usw. aufweist (Vegetable horticulture great dictionary, Yokendo, 1977). Obwohl die Beziehung zwischen Gibberellin und der Keimbildung nicht klar ist, werden die Zwiebel, Frühlingszwiebel, Spinat, Blumenzwiebeln usw. ebenfalls als repräsentative Pflanzen mit einer Ruheperiode angesehen.

Die Kartoffel ist ebenfalls eine Pflanze mit einer Ruheperiode und die Knospenbildung der Kartoffel kann ungefähr 3 Monate nach einer Ernte nicht beobachtet werden.

Wie oben beschrieben wurde jedoch berichtet, dass die Ruheperiode durch eine Gibberellinbehandlung abgekürzt werden kann (Tokushima Test and Research Report of Agriculture, Band 36, Seiten 7–17, 2000) und die Kartoffel wird als geeignetes Material für eine Überprüfung der Beziehung zwischen Ruheperiodenregulatoren und endogenen Gibberellingehalten angesehen.

Die Kartoffel wurde auf ungefähr 20 Million ha (Hektar) kultiviert und ihr Durchschnittsertrag beträgt 1,48 Tonnen pro 10 a (Ar) und ihr Gesamtertrag ungefähr dreihundert Millionen Tonnen. Der größte bepflanzte Bereich liegt in Rußland, gefolgt von China und Polen und der Gesamtertrag dieser Bereiche liegt ebenfalls in dieser Größenordnung. Der bepflanzte japanische Bereich für Kartoffeln liegt bei ungefähr 130.000 ha und der Ertrag bei ungefähr 4 Million Tonnen. Ihr Verbrauch teilt sich auf ungefähr 44 % für Stärkerohmaterialien, 21 % für rohe Nahrungsmittel und 13 für verarbeitete Nahrungsmittel. Da jedoch die Importliberalisierung für Mais oder Weizen nun effektiv wird, werden Importmaterialien mit niedrigen Kosten für Stärke verfügbar. Um diese schwere Preiskonkurrenz zu gewinnen ist es daher notwendig, ein Produktionssystem mit hoher Qualität und hoher Quantität in gleichzeitiger Weise durch weitere Verbesserung der Kartoffelkultivierung sicherzustellen. Insbesondere wird es als nötig betrachtet, den durchschnittlichen Stärkewert von 13 % auf 18 % zu erhöhen und den durchschnittlichen Produktionsertrag pro 10 Ar von 4 auf 7 Tonnen zu erhöhen und weiterhin Produktionskosten auf die Hälfte durch Vermehrung zu reduzieren.

Der Stärkewert in einem anfänglichen Zustand der Knollenverdickung nach der Knollenbildung beträgt ungefähr 0,8 % und danach steigt dieser Wert mit der Knollenverdickung an. Um daher den Stärkewert in der Knolle zu erhöhen ist es wichtig, eine ausreichende Zeit für die Verdickung der Knolle bereitzustellen. Da der Stärkewert außerdem schnell abnimmt, wenn die Erdtemperatur ansteigt, ist eine Erdtemperatur (10 cm unterhalb der Erde) von 17 bis 22°C eine optimale Temperatur für eine Knollen-Verdickungsperiode. Hierfür ist es wünschenswert, die Kultivierungszeit so einzustellen, dass die Temperatur zur Blütezeit, die die Knollenbildung initiiert, ungefähr 18°C beträgt und insbesondere wird empfohlen, dass eine Auspflanzung im Frühling 7 bis 10 Tage vor Erreichen der Lufttemperatur von 10°C durchgeführt wird und dass eine Pflanzung im Herbst 10 Tage vor Erreichen der Durchschnittstemperatur von 23°C durchgeführt wird.

Andererseits ist für den Knollenertrag vorzugsweise eine ausreichende Knollen-Verdickungsperiode zu arrangieren und der Ertrag der Kartoffel steigt um ungefähr 60 bis 70 kg pro Tag pro 10 Ar während der Verdickungsperiode an und es ist wünschenswert, so früh wie möglich im Hinblick auf die optimale Temperatur für den Stärkewert auf dem Farmfeld zu pflanzen.

Im allgemeinen variiert zusätzlich die Zeit von Knollen bis zu Knospensprossen (Knospungsperiode) und Variationen von 15 Tagen sind nicht ungewöhnlich. Im Vergleich mit dem Ertrag von früher mit Knospen versehenen Stümpfen nimmt im allgemeinen der Ertrag von später knospenden Stümpfen ab, da es nicht genügend Zeit für eine Knollenverdickung gibt. Wenn die Knospenbildung um 15 Tage verzögert ist, wird geschätzt, dass der Ertrag pro Pflanze um bis zu 24 % abnimmt. Daher wird die Variation der Knospungsperiode als signifikanter Faktor für die Abnahme des Ertrags angesehen. Daher sind schnelle und einheitliche Knospenbildung aus Knollen, d.h. geringe Wachstumsvariationen, ein essenzieller Faktor zur Erhöhung des Ertrags (Potato encyclopedia, Minoru Yoshida, Rural Culture Association, 1988).

Es wird angenommen, dass Gibberellin auf zwei Wegen synthetisiert wird: Einer ist der Mevalonsäureweg, wobei Gibberellin von einer von Essigsäure abgeleiteten Mevalonsäure über Isopentenyldiphosphat synthetisiert wird und der andere ist der Nicht-Mevalonsäureweg, wobei Gibberellinsäure durch Isopentenyldiphosphat synthetisiert wird, erzeugt aus einer glucoseabgeleiteten Brenztraubensäure und Glyceraldehyd-3-phosphat. Isopentenyldiphosphat wird zu einem tetracyclischen Kohlenwasserstoff Ent-Kauren über Geranyldiphosphat, Geranylgeranyldiphosphat und Ent-Copalyldiphosphat umgewandelt. Dann wird ent-Kauren drei aufeinanderfolgenden Oxidationen zur Erzeugung von Ent-Kaurenonsäure unterzogen und die Ent-Kaurenonsäure wird drei aufeinanderfolgenden Oxidationen zur Synthese von GA12 unterzogen. Die Biosynthese, folgend auf die GA12-Synthese wird durch eine Dioxygenase katalysiert, die 2-Oxoglutarat als co-Substrat verwendet. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt existieren 100 oder mehr Abwandlungen von freien Gibberellinen, jedoch sind aktive Gibberelline mit einer physiologischen Aktivität nur ein Teil von diesen (GA1, GA3, GA4, usw.).

Zum Zwecke der Untersuchung der physiologischen Wirkung von Gibberellin wurde versucht, Gene in eine Pflanze einzuführen, die an der Gibberellinsynthese beteiligt sind. Huang et al. erzeugten einen Transformanten durch Einführung des 20-Oxidasegens, isoliert aus Arabidopsis in Arabidopsis in Sinnrichtung, worin das Gen überexprimiert wurde. Es wurde berichtet, dass dieser Transformant einen erhöhten Gehalt an GA1, GA9 und GA20 zeigt, eine vorgezogene Blütezeit und eine verminderte Ruheperiode der Samen im Vergleich mit Nicht-Transformanten, es wurde jedoch auch berichtet, dass es eine bemerkenswerte morphologische Abnormalität bei einer Pflanze gab, worin eine Verlängerung der Hypocotylen und Stängel beobachtet wurde (Plant Physiology, 118: 773–781, 1998). Außerdem isolierten Carrera et al. ein Gen, kodierend GA20-Oxidase (StGA20ox1) aus Kartoffeln und führten es in Kartoffeln in Sinnrichtung und in anti-Sinnrichtung ein. Es wurde berichtet, dass, wenn es in Sinnrichtung eingeführt und überexprimiert wurde, die Länge der Internodien anstieg und die Knospungszeit der Knolle vorgezogen war (Plant Journal, 22: 247–256, 2000). Bei einem Transformanten, worin das Gen, kodierend GA20-Oxidase, in anti-Sinnrichtung eingeführt worden war, war jedoch die Ruheperiode reduziert und die Zahl und das Gewicht der Knollen war deutlich reduziert und so wurde keine Erhöhung des Ertrags erhalten. Da weiterhin kein Unterschied zwischen der Knospungszeit von Kartoffelknollen, worin ein Gen, kodierend GA20-Oxidase, in Antisinnrichtung eingeführt worden war und der Knospungszeit von Knollen der Nicht-Transformanten beobachtet wurde, schlugen die Autoren vor, dass es keine Korrelation zwischen GA20-Oxidase und Ruheperiode gab.

Andererseits wurde unabhängig von der oben beschriebenen Studie eine transgene Pflanze mit einem eingeführten Glutamatdehydrogenase (GDH) -Gen erzeugt und ein von E. coli abstammendes NADP-abhängiges GDH-Gen (gdhA) wurde in Tabak und Mais zum Zweck einer Verleihung einer Phosphonoglycin-Herbizidresistenz eingeführt. Basierend auf diesen Studien wurde berichtet, dass das Trockengewicht, der Gesamtaminosäuregehalt und der wasserlösliche Kohlenhydratgehalt signifikant anstiegen (Lightfoot et al., Canada, CA2180786, 1996). Ähnlich berichteten Tian et al. (China, CN00109779. 2), dass Tabakpflanzen, bei denen ein von Neurospora abgeleitetes NADP-abhängiges GDH-Gen eingeführt wurde im Vergleich mit Tabakpflanzen, in die das Gen nicht eingeführt worden war, gute Wachstumsergebnisse zeigten. Weiterhin wurde berichtet, dass ein von Aspergillus nidulans abgeleitetes NADP-abhängiges GDH-Gen in Tomatenpflanzen eingeführt wurde und dadurch ein freier Aminosäuregehalt in der Frucht erhöht wurde (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 2001-238556, Kisaka et al.) und dasselbe Gen wurde in Kartoffeln eingeführt und erhöhte dadurch deren Gewicht und Zahl der Knollen (JP2000-404322). Keiner dieser Berichte beschreibt jedoch eine Veränderung des Gibberellingehalts und eine Untersuchung im Hinblick auf die Ruheperiode wurde bei diesen Berichten nicht durchgeführt.

Zusammenfassung der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Erzeugung von Pflanzen mit einer verminderten Ruheperiode.

Es ist weiterhin noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen mit einer verminderten Ruheperiode und einer einheitlichen Knospungs- oder Keim-Zeitabstimmung bereitzustellen.

Zusätzlich ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen mit einer verminderten Ruheperiode und einer einheitlichen Knospungs- oder Keim-Zeitabstimmung und dementsprechend einem erhöhten Ertrag bereitzustellen.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bereits festgestellt, dass der intrazelluläre 2-OG-Gehalt durch Überexpression einer Glutamatdehydrogenase (hiernach als GDH abgekürzt) -Gens in Pflanzenzellen (Kisaka et al., japanische Patentanmeldung Nr. 2003-198559) erhöht ist. GDH katalysiert die reversible Reaktion des Einbaus von Ammoniak in 2-OG, um Glutaminsäure zu erzeugen und umgekehrt Ammoniak aus Glutaminsäure zur Erzeugung von 2-OG freizusetzen. Im allgemeinen wird jedoch angenommen, dass GDH Glutaminsäure zu 2-OG und Ammoniak abbaut anstelle eines Einbaus von Ammoniak in 2-OG zur Erzeugung von Glutaminsäure in den Zellen, da GDH einen höheren Km-Wert für Ammoniak aufweist und im Ergebnis der 2-OG-Gehalt erhöht ist.

Andererseits haben die gegenwärtigen Erfinder angenommen, dass die Ruheperiode durch Erhöhung der endogenen Gibberellinaktivität in einer Pflanze vermindert werden kann, was zu einer vorgezogenen Keimzeit führt, wodurch ein Stamm erhalten wird, der eine Wachstumseinheitlichkeit aufweist, und dass dadurch der Ertrag erhöht werden kann. Insbesondere haben die gegenwärtigen Erfinder festgestellt, dass, da die Biosynthese folgend auf die GA12-Synthese durch eine Dioxygenase katalysiert wird, die 2-Oxoglutarsäure (2-OG) als co-Substrat verwendet, 2-OG stabil durch Überexpression eines Glutamatdehydrogenase (GDH) -Gens der Pflanze in überschüssiger Weise zur Verfügung gestellt wird und die Gibberellinaktivität in Knollen erhöht werden kann und dass im Ergebnis tatsächlich Stämme erhalten werden können, die eine verminderte Ruheperiode, eine vorgezogene Knospungs- oder Keim-Zeitabstimmung und eine einheitliche Knospung- oder Keim-Zeitabstimmung aufweisen und dass daher Stämme mit einer Wachstumseinheitlichkeit erhalten werden können. Die gegenwärtigen Erfinder haben auch festgestellt, dass der Ertrag erhöht war.

Anders ausgedrückt stellt die gegenwärtige Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung einer Pflanze mit einem erhöhten intrazellulären 2-OG-Gehalt und einer verminderten Ruheperiode im Vergleich mit derjenigen von natürlich auftretenden Pflanzen derselben Art bereit und ein Verfahren zur Erzeugung einer Pflanze mit einer verminderten Ruheperiode im Vergleich mit der von natürlich auftretenden Pflanzen derselben Art durch Erhöhung des intrazellulären 2-OG-Gehalts in der Pflanze, umfassend den Schritt der Überexpression eines intrazellulären GDH-Gens in der Pflanze.

Zusätzlich stellt die gegenwärtige Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung einer Pflanze wie oben mit einem erhöhten intrazellulären 2-OG-Gehalt, einer verminderten Ruheperiode im Vergleich zu der von natürlich auftretenden Pflanzen derselben Art und einer einheitlichen Knospungs- oder Keim-Zeitabstimmung bereit und ein Verfahren zur Erzeugung einer Pflanze mit einer verminderten Ruhrperiode im Vergleich zu der von natürlich auftretenden Pflanzen derselben Art und einer einheitlichen Knospungs- oder Keimzeit durch Erhöhung des intrazellulären 2-OG-Gehalts in der Pflanze.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung einer Pflanze wie oben mit einer verminderten Ruheperiode im Vergleich mit der von natürlich auftretenden Pflanzen derselben Art durch Überexpression eines intrazellulären GDH-Gens bereit und ein Verfahren zur Erzeugung einer Pflanze mit einer verminderten Ruheperiode im Vergleich mit der von natürlich auftretenden Pflanzen derselben Art durch Überexpression des intrazellulären GDH-Gens in der Pflanze.

Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung einer Pflanze wie oben mit einer verminderten Ruheperiode im Vergleich mit der von natürlich auftretenden Pflanzen derselben Art und einer einheitlichen Knospungs- und/oder Keimzeit durch Überexpression eines intrazellulären GDH-Gens bereit und ein Verfahren zur Erzeugung einer Pflanze mit einer verminderten Ruheperiode im Vergleich mit der von natürlich auftretenden Pflanzen derselben Art und einer einheitlichen Knospungs- und/oder Keimzeit durch Überexpression des intrazellulären GDH-Gens in der Pflanze bereit. Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugten Pflanzen haben eine verminderte Ruheperiode und eine einheitliche Knospungs- und/oder Keim-Zeitabstimmung und im Ergebnis weisen sie eine Wachstumseinheitlichkeit und so einen erhöhten Ertrag auf.

Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine durch das obige Verfahren erzeugte Pflanze bereit, in die ein Nukleinsäurekonstrukt eingeführt wurde, das die Expression des GDH-Gens erhöhen kann und das das GDH-Gen in den Zellen überexprimieren kann, wobei die Pflanze eine verminderte Ruheperiode im Vergleich mit der von natürlich auftretenden Pflanzen derselben Art aufweist. Zusätzlich betrifft die gegenwärtige Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung einer Pflanze mit einer verminderten Ruheperiode im Vergleich mit der von natürlich auftretenden Pflanzen derselben Art durch Einführung eines Nukleinsäurekonstrukts in eine Pflanze, das die Expression des GDH-Gens zur Überexpression des GDH-Gens in den Pflanzenzellen erhöhen kann.

Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung das oben beschriebene Verfahren bereit, worin ein Nukleinsäurekonstrukt ein Nukleinsäuremolekül enthält, kodierend das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, wie beschrieben in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung das oben beschriebene Verfahren oder die Pflanze, worin das Nukleinsäurekonstrukt ein Nukleinsäurekonstrukt enthält, das mit dem Nukleinsäuremolekül mit der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 beschriebenen Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann und wobei das Nukleinsäurekonstrukt ein Polypeptid mit GDH-Aktivität kodiert.

Spezifisch stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung der Pflanze bereit, worin die durch das Verfahren erzeugte Pflanze die Kartoffel ist.

Die Pflanzenruheperiode begrenzt nicht nur die Kultivierungszeit, sondern ist auch ein Hindernis bei der Bestimmung von Wachstum und Ertrag der Pflanze. Daher können gemäß der vorliegenden Erfindung durch Verminderung der Pflanzenruheperiode ohne Auslösung signifikanter Störungen Begrenzungen im Hinblick auf die Kultivierungszeit entfernt werden und sie ermöglicht das Vorziehen der Knospungs- oder Keimzeit, was zu einer einheitlichen Knospung oder Keimung führt. Daher kann die vorliegende Erfindung ein einheitliches Wachstum der Pflanze bereitstellen und dementsprechend kann sie eine einfache Kultivierung und hohen Ertrag, Wachstum und Qualität bereitstellen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 ist eine schematische Illustration des konstruierten Plasmidvektors.
Nos-Pro: Nopalinsynthasepromotor
NPTII: Neomycinphosphotransferase
Nos-Ter: Nopalinsynthaseterminator
35S-Pro: Blumenkohl-Mosaikvirus 35S-Promotor
Mtd-AN-GDH: Von Aspergillus nidulans abgeleitete Glutamatdehydrogenase (GDH) mit einem Transitpeptid für Mitochondrien
HPT: Hygromycinphosphotransferase
H: HindIII, B: BamHI, X: XbaI, Sp: SpeI, E: EcoRI,
LB: linke Grenze, RB: rechte Grenze

2 zeigt die Ergebnisse einer PCR für eine transgene Kartoffel unter Verwendung eines An-GDH-genspezifischen Primers (A), NPTII-genspezifischen Primers (B). Spur 1: 100 bp Marker, Spur 2: nicht-transgene Kartoffel, Spur 3: transgene Kartoffel Mtd 1, Spur 4: transgene Kartoffel Mtd 2, Spur 5: transgene Kartoffel Mtd 3, Spur 6: transgene Kartoffel Mtd 5 und Spur 7: transgene Kartoffel Mtd B.

3 zeigt die Ergebnisse eines Northern Blots für transgene Kartoffeln. Eine Gesamtmenge von 10 μg RNA, extrahiert aus Knollen, wurde einer Elektrophorese unterzogen und mit Ethidiumbromid gefärbt. Die gesamte Länge eines An-GDH-Gens wird für die Sonde verwendet. Spur 1: nicht-transgene Kartoffel, Spur 2: transgene Kartoffel Mtd 1, Spur 3: transgene Kartoffel Mtd 2, Spur 4: transgene Kartoffel Mtd 3, Spur 5: transgene Kartoffel Mtd 5 und Spur 6: transgene Kartoffel Mtd B.

4 zeigt den 2-Oxoglutarat (2-OG) -gehalt der GDH-transgenen Kartoffel (n = 3). Kontrolle: nicht-transgene Kartoffel und Mtd8: transgene Kartoffel.

5 zeigt die Assay-Ergebnisse für Gibberellin einer GDH-transgenen Kartoffelknolle. Cont: Probenlösung von der nicht-transgenen Kartoffelknolle, Mtd8: Probenlösung von der nicht-transgenen Kartoffelknolle, Mtd8 + Dami: Probenlösung von der transgenen Kartoffelknolle + Daminozidlösung. Nach 0-M: Knollen direkt nach Ernte, nach 2-M: Knollen 2 Monate nach Ernte und nach 3-M: Knollen 3 Monate nach Ernte.

6 zeigt die Ergebnisse eines Knospungstests für GDH-transgene Kartoffelknollen. (A) Lichtbehandlung: für 3 Tage bei 24°C in einem Gewächshaus und dann transplantiert auf Vermiculit; (B) Nicht-Behandlung: Transplantieren auf Vermiculit ohne Lichtbehandlung.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Wie oben beschrieben, betrifft die vorliegende Erfindung eine durch das obige Verfahren erzeugte Pflanze (einschließlich ihrer Nachkommen) mit einer verminderten Ruheperiode im Vergleich mit der von natürlich auftretenden Pflanzen derselben Art durch Überexpression eines GDH-Gens in den Pflanzenzellen und ein Verfahren zur Erzeugung der Pflanze.

Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung eine durch das obige Verfahren erzeugte Pflanze (einschließlich ihrer Nachkommen) bereit, die in der Lage ist, ein Glutamatdehydrogenase (GDH) -gen in den Pflanzenzellen zu überexprimieren, mit einer verminderten Ruheperiode im Vergleich mit der von natürlich auftretenden Pflanzen derselben Art und mit einer einheitlichen Knospungs- und/oder Keimzeit und auch ein Verfahren zur Erzeugung einer Pflanze mit einer verminderten Ruheperiode im Vergleich zu der von natürlich auftretenden Pflanzen derselben Art und mit einer einheitlichen Knospungs- und/oder Keimzeit durch Überexpression eines GDH-Gens in den Pflanzenzellen.

In der vorliegenden Beschreibung bezeichnet "natürlich auftretende Pflanze derselben Art" eine Pflanze, die zu derselben Art gehört, wie die durch die gegenwärtige Erfindung erzeugte und die in der Natur beobachtet wird und von der nicht bestätigt wurde, dass sie künstlich manipuliert oder als Ergebnis einer künstlichen Manipulation erzeugt wurde.

Spezifischer kann gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Pflanze erhalten werden, die ein GDH-Gen überexprimieren kann und die eine verminderte Ruheperiode aufweist im Vergleich zu derjenigen von natürlich auftretenden Pflanzen derselben Art, indem ein Gen in die Pflanze eingeführt wird, das die Expression des GDH-Gens vermehren kann.

In einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung wird GDH durch Einführung eines Nukleinsäurekonstrukts, enthaltend GDH in eine Pflanze in der resultierenden transformierten Pflanze exprimiert zur Erhöhung des 2-OG-Gehalts und dann wird die Gibberellinaktivität angehoben. Im Ergebnis kann eine Pflanze erhalten werden, die eine verminderte Ruheperiode und einheitliche Knospungs- oder Keimungszeit aufweist. GDH katalysiert die Reaktion der oxidativen Deaminierung von Glutaminsäure zur Erzeugung von Ammoniak wie auch die Umkehrreaktion der Erzeugung von Glutaminsäure durch Kondensation von 2-OG und Ammoniak. Es wird jedoch allgemein angenommen, dass GDH den Abbau der Glutaminsäure katalysiert, d.h. die Reaktion, die 2-OG und Ammoniak in vivo erzeugt und zwar vorzugsweise, da der Km-Wert für Ammoniak hoch ist. Im allgemeinen kann eine überschüssige Menge an intrazellulärem Gibberellin oder der schnelle Anstieg des Niveaus von intrazellulärem Gibberellin einen schädlichen Einfluss auf Wachstum oder Ertrag haben. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird Gibberellin jedoch nicht extrazellulär bereitgestellt, sondern statt dessen wird das endogene Gibberellinniveau über den Anstieg des 2-OG-Niveaus aufgrund der Überexpression des GDH-Gens angehoben. Daher würde sich die Aktivität des endogenen Gibberillins gemäß der vorliegenden Erfindung langsam durch Anstieg von 2-OG erhöhen, was zu einer Verminderung der Ruheperiode und einer Synchronisierung von Knospungs- oder Keimumgszeiten ohne die Auslösung signifikanter schädlicher Wirkungen, wie z.B. morphologische Abnormalitäten führen würde. Typischerweise werden Ernten simultan für alle unter denselben Bedingungen für eine bestimmte Zeit kultivierten Pflanzen geerntet, was zu einer Verzögerung und Diversität von Knospungs- oder Keimungszeiten führt, was direkt zu einem niedrigen Ertrag bei der Ernte führen kann. Daher kann gemäß der vorliegenden Erfindung typischerweise eine weitere stabile Verbesserung des Ertrags erreicht werden.

Um den Pflanzen 2-OG-Gehalt in der Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung anzuheben und im Ergebnis die Gibberellinaktivität anzuheben, ist das Verfahren nicht nur auf die Einführung des GDH-Gens gerichtet, sondern es kann auch ein Gen eines Enzyms, das sich von GDH unterscheidet, verwendet werden, das 2-OG aus Glutaminsäure erzeugen kann. In einer Pflanze, in die ein solches Gen eingeführt wurde, wird der 2-OG-Gehalt ansteigen und im Ergebnis wird die Gibberellinaktivität angehoben. Zum Beispiel können diese Enzyme Aspartataminotransferase oder Alaninaminotransferase oder ähnliche beinhalten.

Obwohl die Quelle der Enzyme, die den 2-OG-Gehalt anheben, z.B. GDH, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, nicht besonders begrenzt ist, könnte ein Enzym von der Gattung Aspergillus, z.B. GDH von der Gattung Aspergillus, vorzuziehen sein. Besonders bevorzugt ist das Enzym GDH von Aspergillus nidulans oder Aspergillus awamorii. Zusätzlich kann ein modifiziertes Enzym oder sein Gen mit einer Deletion von ein oder mehr Aminosäuren, einer Substitution und Insertion, z.B. modifiziertes GDH und ein modifiziertes GDH-Gen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange das modifizierte Enzym die oben beschriebene Enzymaktivität, z.B. GDH-Aktivität, aufweist.

Um ein oder mehr Gene dieser Gene überzuexprimieren, kann die Expression der endogenen Gene der Pflanze anstelle einer direkten Einführung eines Nukleinsäurekonstrukts, das diese Gene exprimiert, erhöht werden. Zum Beispiel beinhalten solche Verfahren die Einführung eines cis-wirkenden Nukleinsäurekonstrukts, das die endogene Genexpression erhöht, einschließlich einem starken Promotor und/oder Enhancer und die Einführung eines trans-wirkenden Faktors, der die Expression dieser Gene erhöht.

Weiterhin ist die Lokalisierung von GDH in einer intrazellulären Organelle der Pflanzenzelle nicht auf das Zytoplasma begrenzt, sondern es ist möglich, GDH zu verwenden, lokalisiert in Mitochondrien, Chlorophyll oder Peroxysomen usw. Daher kann auch eine GDH mit einem Signal- oder Transitpeptid, das an das N-terminale oder C-terminale Ende angehaftet ist, um das Enzym in diese intrazellulären Organellen zu transportieren, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Diese Gene oder die cDNA können einfach von dem Fachmann gemäß den veröffentlichten SEQ ID-Nummern erzeugt werden. Zum Beispiel ist die cDNA-Nukleotidsequenz des GDH-Gens von Aspergillus nidulans in GenBank als Hinterlegungsnummer X16121 veröffentlicht. Die Nukleotidsequenz (cDNA-Sequenz) von dem von Aspergillus nidulans abgeleiteten GDH-Gens ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt und die Aminosäuresequenz von GDH in SEQ ID NO: 2. Auf der Grundlage dieser Sequenzen kann die GDH-cDNA einfach durch Synthese eines PCR-Primers, der ein DNA-Fragment amplifizieren kann, einschließlich eines Teils, kodierend die Proteinsequenz und Durchführung von RT-PCR unter Verwendung der aus Aspergillus nidulans-Kultur isolierten RNA als Matrize erhalten werden. Aspergillus nidulans kann erhalten werden, einschließlich denjenigen, die als ATCC10074 oder ATCC11267 oder ähnliche in der American Type Culture Collection registriert sind. Zusätzlich ist die cDNA-Sequenz von Aspergillus awamorii GDH-cDNA auch in GenBank als Hinterlegungsnummer Y15784 veröffentlicht. Aspergillus awamorii ist bei der American Type Culture Collection als ATCC10548 oder ATCC11358 oder ähnliche registriert und GDH-cDNA kann durch das oben beschriebene Verfahren unter Verwendung der erhaltenen Stämme erhalten werden. Die Nukleotidsequenz (cDNA-Sequenz) von dem GDH-Gen, das von Aspergillus awamorii abgeleitet ist, wird als SEQ ID NO: 3 bezeichnet und die GDH-Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 4 dargestellt.

In der vorliegenden Erfindung kann ein Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend Nukleinsäuremoleküle, die ein Polypeptid einer in SEQ ID NO: 2 oder 4 beschriebenen Aminosäuresequenz kodieren, verwendet werden. Es ist weiterhin möglich, das Nukleinsäurekonstrukt, einschließlich Nukleinsäuremolekülen zu verwenden, die eine Homologie von mindestens 70 % oder mehr, vorzugsweise 80 % oder mehr, noch bevorzugter 90 % oder mehr zu SEQ ID NO: 1 oder 3 aufweisen, wobei das Nukleinsäurekonstrukt, kodierend das Polypeptid, eine GDH-Aktivität zeigt. Diese Homologie kann unter Verwendung von dem Fachmann wohlbekannten Programmen, z.B. FASTA, mit Standardparametern berechnet werden. Zum Beispiel werden Programme wie FASTA usw. durch den Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan, National Institute of Genetics (DDBJ/CIB)
(http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html) bereitgestellt (z.B. kann es mit einer Bewertung von: 100 und einer Ausrichtung: 100 verwendet werden). Ein anderer Algorithmus und ein Programm zur Berechnung der Homologie zwischen zwei Sequenzen oder mehr ist dem Fachmann wohlbekannt zusammen mit ihren Standardparametern. Diese Nukleinsäuremoleküle können als Nukleinsäuremolekül verstanden werden, das mit diesen Sequenzen unter "stringenten Bedingungen" hybridisieren kann, insbesondere mit den Sequenzen, wie dargestellt in SEQ ID NO: 1 oder 3. Die hier erwähnte "stringente Bedingung" bezeichnet die Bedingung, unter der sogenannte spezifische Hydride gebildet und nicht-spezifische Hybride nicht gebildet werden. Es ist schwierig, diesen Zustand deutlich numerisch auszudrücken, jedoch kann er als der Zustand definiert werden, bei dem DNA-Moleküle mit einer Homologie von 70 % oder mehr vorzugsweise hybridisieren und andere DNAs mit einer Homologie von 70 % oder weniger nicht signifikant hybridisieren. Spezifischer kann er als der Zustand definiert werden, bei dem die Hybridisierung unter Waschbedingungen auftritt, die zu den normalen Waschbedingungen einer Southern-Hybridisierung von 50°C, 2 × SSC und 0,1 % SDS, vorzugsweise 1 × SSC und 0,1 % SDS und noch bevorzugter 0,1 × SSC und 0,1 % SDS korrespondieren. Außerdem werden äquivalente Bedingungen dem Fachmann bekannt sein (_z.B.

Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994). Obwohl ein Gen, das unter diesen Bedingungen hybridisieren kann, ein Stoppkodon (Stoppkodons) in dem Gen enthalten kann oder eine Mutation in seinem Aktivitätszentrum enthalten kann, was zu einem Aktivitätsverlust führt, könnte ein solches Gen einfach entfernt werden, indem die Enzymaktivität nach Verbindung mit einem kommerziell erhältlichen Expressionsvektor bestimmt wurde.

SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 weisen eine Homologie von 66 %, wie berechnet durch Genetyx, Version 3.2 auf. Ähnlich wurde für SEQ ID NO: 2 und 4 eine Homologie von 87 % gezeigt.

Die GDH-Aktivität kann z.B. durch das Verfahren von Ameziane et al. (Plant and Soil, 221: 47–57, 2000) gemessen werden. Spezifischer gesagt werden Pflanzengewebe, z.B. Blätter, mit flüssigem Stickstoff cryokonserviert, unter Verwendung eines Mörsers gemahlen und mit einem Extraktionspuffer {200 mM Tris (pH 8,0), 14 mM β-Mercaptoethanol, 10 mM L-Cystein-HCl und 0,5 mM PMSF} von 5 Volumen der Gewebeprobe pro Gewicht vermischt. Die resultierende Mischung wird in ein Zentrifugenröhrchen übertragen, 30 Minuten mit 12.000 Upm bei 4°C zentrifugiert und der Überstand ultrafiltriert (Millipore, ultrafreie 0,5 Filtereinheit, Biomax-10) und der Rest wird mehrmals mit dem Extraktionspuffer gewaschen. Die resultierende extrahierte Enzymlösung wird zu der Lösung zugefügt, die 100 mM Tris (pH 8,5), 20 mM 2-Oxoglutarsäure, 10 mM CaCl₂, 0,2 mM NADH und 200 mM NH₄Cl enthält. Dann kann die GDH-Aktivität durch Messung der Abnahme der Absorption bei 340 nm bestimmt werden. Die Proteinkonzentration in der extrahierten Rohenzymlösung kann durch ein wohlbekanntes Verfahren gemessen werden, wie z.B. durch das Bradford-Verfahren unter Verwendung von beispielsweise bovinem Serumalbumin (BSA) als Standard.

Weiterhin ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zur Anhebung der Gibberellinaktivität durch Erhöhung eines 2-OG-Gehalts nicht auf die Einführung eines GDH-Gens begrenzt. Eine Pflanze mit einer hohen Gibberellinaktivität aufgrund des Anstiegs des 2-OG-Gehalts kann ebenfalls durch Einführung eines Enzyms erzeugt werden, das 2-OG aus Glutaminsäure erzeugt und das sich von GDH unterscheiden kann. Beispiele für diese Enzyme beinhalten Aspartataminotransferase oder Alaninaminotransferase oder ähnliche.

Das Nukleinsäurekonstrukt, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann durch dem Fachmann wohlbekannte Verfahren hergestellt werden. Molekularbiologische Verfahren einschließlich einer Isolierung und Bestimmung einer Nukleinsäurekonstruktsequenz können in Publikationen nachgelesen werden, wie z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning-Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Alternativ kann ein Gen-Amplifizierungsverfahren, wie z.B. eine PCR, zur Erzeugung des Nukleinsäurekonstrukts, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, nötig sein. Diese Verfahren werden auch in Veröffentlichungen erklärt, wie z.B. F.M. Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.(1994)).

Das Nukleinsäurekonstrukt, das GDH oder die oben beschriebenen Enzyme kodiert, kann allgemein einen geeigneten Protomotor für Pflanzenzellen enthalten, z.B. einen Promotor für das Nopalinsynthasegen, den 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV35S) oder geeignete Terminatoren, wie z.B. einen Terminator für das Nopalinsynthasegen und andere benötigte oder günstige Sequenzen zur Expression, wie z.B. einen Enhancer und ein Markergen für das Screening von Transformanten, wie z.B. ein Arzneimittel-Resistenzgen einschließlich einem Kanamycin-Resistenzgen, dem G418-Resistenzgen und dem Hygromycin-Resistenzgen.

Der in einem solchen Nukleinsäurekonstrukt verwendete Promotor kann ein konstitutiver Promotor, ein gewebsspezifischer Promotor oder ein Wachstumsstufenspezifischer Promotor sein, der abhängig von dem verwendeten Promotor gemäß dem Wirt, dem benötigten Expressionsniveau, dem Expressions-Zielorgan oder der Wachstumsstufe gewählt werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können starke Promotoren, die nicht für Gewebe oder Wachstumsstufen spezifisch sind, verwendet werden, einschließlich z.B. dem CaMV35S-Promotor. Gewebespezifische Promotoren beinhalten z.B. den Phaseolingen-Promotor oder den Patatingen-Promotor oder ähnliche. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Nukleinsäurekonstrukt verwendet, worin das GDH-Gen durch einen starken konstitutiven Promotor, wie z.B. den CaMV35S-Promotor angetrieben wird.

Ein Gentransferverfahren der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders begrenzt und es ist möglich, ein geeignetes Gentransferverfahren für Pflanzenzellen oder Pflanzen, abhängig vom Wirt zu verwenden, die dem Fachmann bekannt sind. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird z.B. ein Gentransferverfahren unter Verwendung von Agrobacterium verwendet. Bei einem solchen Transformationssystem ist es vorzuziehen, einen binären Vektor zu verwenden. Im Fall der Verwendung von Agrobacterium beinhaltet das bei der Transformation verwendete Nukleinsäurekonstrukt weiterhin einen T-DNA-Bereich, der die einzuführende DNA-Sequenz flankiert. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die eingeführte Sequenz zwischen den linken und rechten T-DNA-Randsequenzen inseriert. Ein geeigneter Entwurf und eine Konstruktion eines solchen Transformationsvektors, basierend auf T-DNA, ist dem Fachmann wohlbekannt. Außerdem sind die Bedingungen für die Transfektion einer Pflanze mit einem Agrobacterium, das ein solches Nukleinsäurekonstrukt beherbergt, dem Fachmann wohlbekannt.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können auch andere Gentransferverfahren verwendet werden. Beispiele für Gentransferverfahren beinhalten ein Verfahren zur Einführung einer DNA in einen Protoplasten unter Verwendung von Polyethylenglykol oder Calcium, Protoplasten-Transformationsverfahren durch Elektroporation, ein Verfahren unter Verwendung einer Teilchenpistole (particle gun) und ähnliche.

Die Pflanzenzellen und ähnliche, die wie oben beschrieben manipuliert wurden, können für die Transformation selektiert werden. Diese Selektion kann z.B. basierend auf der Expression eines Markergens, das in dem für die Transformation verwendeten Nukleinsäurekonstrukt vorliegt, durchgeführt werden. Wenn ein Markergen z.B. ein Arzneimittelresistenzgen ist, können sie durch Kultivierung oder Anzüchtung von Pflanzenzellen in einem Kulturmedium, das Antibiotika oder Herbizide oder ähnliches in moderaten Konzentrationen beinhaltet, selektiert werden. Alternativ können Transformanten, wenn ein Markergen ein (3-Glucuronidasegen oder Luciferasegen oder ähnliches ist, durch Screening über die Aktivität des Markergens selektiert werden. Wenn diese identifizierten Transformanten andere sind als der Pflanzenkörper, wie z.B. Protoplasten, Calli, Explantate oder ähnliches, kann aus ihnen eine gesamte Pflanze regeneriert werden. Für diese Regeneration kann jedes dem Fachmann bekannte Verfahren abhängig von den zu verwendenden Wirtspflanzen verwendet werden.

Die so erhaltene Pflanze kann durch ein übliches Verfahren kultiviert werden, d.h. unter denselben Bedingungen wie für Nicht-Transformanten und um die transgenen Pflanzen, enthaltend ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung zu identifizieren, können verschiedene molekularbiologische Verfahren zusätzlich zu der auf dem oben beschriebenen Markergen basierenden Selektion verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Southern-Hybridisierung oder PCR verwendet werden, um die Gegenwart oder Abwesenheit eines rekombinanten DNA-Insertionsfragments und seine Struktur nachzuweisen. Es ist möglich, eine Northern-Hybridisierung oder RT-PCR oder ähnliches zu verwenden, um das RNA-Transkript von einer eingeführten Nukleinsäurekonstrukt-DNA nachzuweisen oder zu messen.

Die Expression des eingeführten Gens des erhaltenen Transformanten kann dann durch Bestimmung der Proteinmenge, der mRNA-Menge oder der Enzymaktivität z.B. des GDH-Proteins bewertet werden. Die Proteinmenge kann z.B. durch das Western-Blot-Verfahren oder ähnliche und die mRNA-Menge kann z.B. durch das Northern-Blot-Verfahren oder quantitative RT-PCR-Verfahren bewertet werden. Zusätzlich kann die oben beschriebene enzymatische Aktivität der Pflanzenextrakte durch ein gewöhnliches Verfahren gemessen werden. Die GDH-Aktivität kann z.B. durch das Verfahren von Ameziane et al. (Ameziane R., Bernhard K., und Lightfood D., Plant and Soil, 221: 47–57, 2000) gemessen werden.

Dementsprechend kann der 2-OG-Gehalt weiter für die transformierte Pflanze bewertet werden, worin die Expression des eingeführten Gens, z.B. die GDH-Genexpression, bestätigt wurde. Der 2-OG-Gehalt kann z.B. durch ein enzymatisches Verfahren gemessen werden, wobei die gesamte oder ein Teil der transformierten Pflanze gemahlen und eine extrahierte Lösung hergestellt wird. Die Herstellung eines Pflanzenextrakts und Quantifizierung von 2-OG können durch das Verfahren von Usuda (Usuda H., Plant Physiol, 78: 859–864, 1985) durchgeführt werden. Spezifischer gesagt können Proben von einer Pflanze durch ein geeignetes Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können 20 μl einer extrahierten Probe zu 475 μl einer Reaktionslösung {0,1 M Tris-HCl (pH 8,5), 1,0 mM CaCl₂, 0,2 mM NADPH und 0,2 M NH₄Cl} zugefügt werden, die Absorption der resultierenden Lösung kann bei 340 nm gemessen werden, dann können 5 μl (10 Einheiten) GDH der Lösung zugefügt werden und die resultierende Lösung läßt man 10 Minuten bei 37°C regieren. Danach kann die Absorption wiederum bei 340 nm gemessen werden. Der 2-OG-Gehalt kann aus dem Unterschied zwischen der nach Zugabe der Enzymlösung gemessenen Absorption und der vor Zugabe der Enzymlösung gemessenen Absorption berechnet werden. Unter gewöhnlichen Kultivierungsbedingungen wird der 2-OG-Gehalt als angestiegen betrachtet, wenn der 2-OG-Gehalt der gemahlenen Teile von oberhalb der Erde (Blatt, Stengel, beide zusammen, Blütenorgan oder ein Teil der Frucht) oder eines unter der Erde gelegenen Teils (Wurzel oder Knolle) um das 1,2fache oder mehr im Vergleich mit dem der Ursprungslinie derselben Art, die für die Geneinführung verwendet wurde (nicht-transformierte Pflanze) ansteigt.

Zwei Fälle werden für Gibberellin-Quantifizierung angenommen. Einer ist der Fall, bei dem die Gibberellinart für die Analyse vorher bestimmt wird. In diesem Fall wird nach Durchführung der notwendigen Reinigung eine Instrumentalanalyse, wie z.B. ein GC/MS-Verfahren durchgeführt. Das andere ist der Fall, wo die Art (die Arten) und der Gehalt des Gibberellins (der Gibberelline), die in der Probe enthalten sind, nicht bekannt sind. In diesem Fall kann nach Reinigung und/oder Fraktionierung der Probe ein Bioassay (biologischer Assay) gemäß dem Verfahren von z.B. Chen et al. durchgeführt werden. Für einen Bioassay wurde im wesentlichen ein Tropfverfahren unter Verwendung einer Zwergmutante von Reis, die empfindlich auf Gibberellin reagiert, Tanginbozu, verwendet. Kurz gefasst werden mit Hüllen versehene nicht polierte Reissamen oberflächensterilisiert, indem sie mit 70 % Ethanol 1 Minute und 2 % Natriumhypochlorit für 15 Minuten behandelt werden, gefolgt von einem Waschen mit sterilisiertem Wasser und sie werden in sterilisiertes Wasser eingetaucht und 2 Tage bei 30°C inkubiert. Dann werden die gekeimten Samen wieder auf dieselbe Weise sterilisiert, auf einem Agarmedium (0,6 % Agar) ausgesät und 5 Tage unter Tageslicht für 16 Stunden bei 25°C inkubiert. Nur die gekeimten Sämlinge, die ein einheitliches Wachstum zeigen, werden selektiert und 2 μl der Probenlösung wird zwischen das 1. Blatt und das Coleoptil getropft. Nach Kultivierung für zusätzliche 5 Tage unter denselben Bedingungen kann der Gibberellingehalt durch Messung der Länge der zweiten Blatthülle bestimmt werden. Eine Gibberellin-Quantifizierung kann entweder durch Instrumentalanalyse oder den Bioassay durchgeführt werden. Wenn der aktive Gibberellingehalt im Vergleich mit den Kontrollen angestiegen ist, wie bestimmt durch Instrumentalanalyse, oder wenn die Internodiumlänge im Vergleich mit den Kontrollen statistisch signifikant unterstützt wurde (z.B. signifikantes Niveau von 5 %), wie bestimmt durch den Bioassay, kann es möglich sein zu bestimmen, dass die Gibberellinaktivität erhöht ist.

Nachdem dementsprechend die transgene Pflanze, die eine verminderte Ruheperiode aufgrund des Anstiegs an endogenem 2-OG-Gehalt und Gibberellinaktivität im Vergleich mit nicht-transformierten Pflanzen als Kontrollen aufweist, definiert wurde, können die Eigenschaften getestet werden, im Hinblick darauf, ob sie genetisch stabil sind oder nicht. Um dies zu tun, können die Pflanzen unter konventionellen Bedingungen zum Erhalt ihrer Samen gezüchtet und kultiviert werden oder, um Knollen zu erhalten, z.B. im Fall der Kartoffel, und die Weitergabe der Eigenschaften an ihre Nachkommen kann analysiert werden. Die Gegenwart oder Abwesenheit des eingeführten Nukleinsäurekonstrukts, seine Lokalisierung, Expression und ähnliches in der Nachkommenschaft kann ebenfalls durch ein ähnliches Verfahren wie für die Primärgeneration der Transformanten (T1-Generation) analysiert werden.

Obwohl transgene Pflanzen hemizygot oder homozygot im Hinblick auf die Sequenz von dem in ein Genom eingeführtes Nukleinsäurekonstrukt sein können, ist es möglich, sowohl Hemizygote als auch Homozygote in den Nachkommenschaften durch Kreuzung, falls nötig, zu erzeugen. Die von dem Nukleinsäurekonstrukt abgeleitete Sequenz, die in das Genom integriert ist, wird gemäß Mendel in der Nachkommenschaft aufgeteilt. Um daher Nachkommenpflanzen und -saat zu erhalten, die einen stabilen Charakter aufweisen wird es bevorzugt, homozygote Pflanzen zu verwenden.

Bei den meisten Transformanten ist zusätzlich ein Fremdgen nur an einem Locus inseriert, es ist jedoch nicht selten, dass die Transformanten Multikopietransformanten sind, bei denen das Fremdgen in eine Vielzahl von Genloci inseriert wurde. Damit das eingeführte Gen stabil ist usw. sind Einzelkopietransformanten in der vorliegenden Erfindung vorzuziehen.

Dementsprechend werden die so erhaltenen transgenen Pflanzen im Hinblick auf die Ruheperiode bewertet. Die Verminderung der Ruheperiode kann durch Vergleich der Pflanzen-Ruheperiode von jeder der Pflanzenlinien der vorliegenden Erfindung mit der Ruheperiode der Standard-Pflanzenart bewertet werden oder durch Vergleich der Pflanzen-Ruheperiode von jeder der Pflanzenlinien, erzeugt durch die vorliegende Erfindung mit den Ruheperioden der Standardpflanze, wobei die Bewertung unter Verwendung eines signifikanten Niveaus von 5 % durchgeführt werden kann. Im allgemeinen ist diese "Standard-Pflanzenart" die "natürlich auftretende Pflanze derselben Art", wie vorher beschrieben.

Im Fall von transgenen Kartoffeln z.B. werden sie nach der Ernte bei Raumtemperatur (15 bis 25°C) oder niedriger Temperatur (4 bis 8°C) für ungefähr 3 Monate unter konventionellen Bedingungen gelagert und dann werden die Saatkartoffeln in Kulturerde ausgepflanzt. Dann wird das Verhältnis von gekeimten Saatkartoffeln mit demjenigen der nicht-transgenen Kartoffeln verglichen (z.B. die für die Einführung eines genetischen Konstrukts gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Quellpflanze, einschließlich der natürlich auftretenden Pflanze derselben Art), um die Abnahme der Ruheperiode zu bewerten. Die tatsächlichen Tage, die für die Knospung (das Sprossen) benötigt werden, würden variieren, abhängig von Lagerungszuständen, Varietät, Kultivierungsbedingungen und ähnlichen, aber wenn z.B. die transgene Pflanze und die nicht-transgene Pflanze, die von May Queen abstammt, bei Raumtemperatur gelagert werden, zeigen 70 % oder mehr der Kartoffeln der vorliegenden Erfindung oder der durch die vorliegende Erfindung erzeugten Kartoffeln eine Abnahme der Periode, die für die Auslösung der Keimung benötigt wird, um 1 bis 8 Wochen. Daher, kurz gefasst im Fall der Kartoffel, wenn die für die Auslösung der Keimung benötigte Periode für 70 % oder mehr der Kartoffeln unter den oben beschriebenen Bedingungen um 1 bis 8 Wochen vermindert ist im Vergleich mit der von natürlich auftretenden Kartoffeln derselben Art, kann dies als eine Abnahme der Ruheperiode angesehen werden.

Da die transgenen Pflanzen ein frühes Knospungs- oder Keimzeitmuster aufwiesen sowie ein synchronisiertes Knospen und Keimen im Vergleich mit der nicht-transformierten Pflanze ist es daher möglich, Wachstum oder Ertrag deutlich zu verbessern. Weiterhin können Saatmaterialien von der so erzeugten transgenen Pflanze erhalten werden. Die Aussaat kann einfach durch dasselbe Verfahren wie für die nicht-transgene Pflanze derselben Art erzeugt werden. Wenn notwendig, kann die Aussaat durch dem Fachmann bekannte konventionelle Verfahren konserviert, sterilisiert, von Insekten befreit werden und ähnliches.

Zusätzlich zu der Einführung eines spezifischen Nukleinsäureprodukts kann die Ruheperiode durch Erhöhung des intrazellulären Pflanzen-2-OG-Gehalts durch Mutagenese durch Bestrahlung, Ultraviolettbestrahlung und/oder Mutagene (z.B. Alkylierungsmittel, wie z.B. Ethylenimin oder Ethylmethansulfonat) verändert werden, optional gefolgt von einer Selektion. Insbesondere kann unabhängig von der Einführung eines Nukleinsäurekonstrukts die Pflanzen-Ruheperiode durch Anstieg des intrazellulären 2-OG-Gehalts durch Verstärkung der Expression des GDH-Gens, der Aspartat-Aminotransferase und der Alanin-Aminotransferase verkürzt werden. Das allgemeine Mutageneseverfahren und Reagenzien in Bezug auf dieses Verfahren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind dem Fachmann wohlbekannt. Die Bewertung für das Kultivierungsverfahren, den 2-OG-Gehalt, die Menge der Expression von jedem oben beschriebenen Gen und/oder die reduzierte Ruheperiode der Pflanze, die so erzeugt wurde, kann gemäß Verfahren und auf eine Weise durchgeführt werden, die ähnlich sind wie die für die transgenen Pflanzen beschriebenen.

Wie aus der obigen Beschreibung verstanden wird, kann gemäß der vorliegenden Erfindung die Ruheperiode der Pflanze mit einer Ruheperiode im allgemeinen im Vergleich zu der nicht-transformierten Pflanze verkürzt werden, z.B. der natürlich auftretenden Pflanzen derselben Art. Die gegenwärtige Erfindung kann auf eine Pflanze angewandt werden, für die Gibberellin bei dem Abbruch der Ruheperiode effektiv ist. Solche Pflanzen beinhalten Hafer, Kopfsalat, Kartoffel, Pfirsich, Kamelien, Reis, Gerste, Ramie, Erdnuss, Bromus catharticus, Bromus inermis Leyss., japanischen Rettich, Brassica, Aubergine, Leberpilz, Gloxinia, Kalanchoe, Primula, Nigella damascena, Erdbeere, Aralia cordata Thunberg, jedoch sind sie nicht auf diese Arten begrenzt. Ein besonders bevorzugtes Beispiel einer Pflanze mit einer verkürzten Ruheperiode gemäß der vorliegenden Erfindung und einer Pflanze, die durch die vorliegende Erfindung erzeugt wird, ist die Kartoffel.

Die vorliegende Erfindung wird spezifisch und im Detail durch die folgenden Ausführungsformen beschrieben, unter Bezugnahme auf das Produktionsverfahren einer Pflanze mit einem erhöhten 2-OG-Gehalt, insbesondere einer Pflanze, manipuliert für eine Überexpression des GDH-Gens, eine Messung des 2-OG-Gehalts, einen Gibberellinassay, einen Knospungstest und einen Ertragstest.

Die Konzentrationsangaben „M und mM" beziehen sich auf Mol/l und mMol/l.
Beispiel 1
Isolierung des NADP-abhängigen GDH-Gens aus Aspergillus nidulans (A. nidulans) und Konstruktion eines Ti-Plasmidvektors
(1) Isolierung des NADP-abhängigen GDH-Gens aus Aspergillus nidulans (An-GDH)
A. nidulans wurde auf ein Kartoffel-Dextrose-Agarmedium inokuliert, über Nacht bei 30°C kultiviert und die resultierenden Kolonien wurden weiter in einem Dextrose-Flüssigmedium 2 Tage kultiviert. Die gesamte RNA wurde von diesen proliferierten Bakterien erhalten.
Die mRNA wurde von der Gesamt-RNA unter Verwendung des Poly (A) Quick mRNA Isolation Kit (Stratagene Co.) gereinigt und dann wurde eine Erststrang-cDNA unter Verwendung des Firststrand cDNA Synthis Kit (Amersham Bioscience Co.) synthetisiert. Die PCR-Reaktion wurde mit der synthetisierten Erststrang-cDNA als Matrize durchgeführt. Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung des PCR-Systems 2400, hergestellt von PerkinElmer wie folgt durchgeführt: 94°C - 3 min; 94°C - 45 sek, 59°C - 30 sek, 72°C - 90 sek und 35 Zyklen; 72°C - 10 min. Die verwendeten Primer waren
5'-TCT AGA ATG TCT AAC CTT CCC GTT GAG-3' (SEQ ID NO: 5) und
5'-GAG CTC TCA CCA CCA GTC ACC CTG GTC-3' (SEQ ID NO: 6). Im Ergebnis wurde eine Bande von ungefähr 1,4 kbp angetroffen, die mit der erwarteten Größe des beabsichtigten Gens übereinstimmte. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden unter Verwendung des TA-Cloning-Kits (Invitrogen Co.) kloniert. Die Nukleotidsequenz des erhaltenen Klons wurde unter Verwendung eines Sequencers (377A von ABI Co.) bestimmt. Die Nukleotidsequenz wurde in SEQ ID NO: 1 dargestellt und die Aminosäuresequenz des kodierten Proteins wurde in SEQ ID NO: 2 dargestellt.
Diese Sequenz stimmte mit der bekannten Nukleotidsequenz des NADP-abhängigen GDH-Gens von A. nidulans überein, das als An-GDH bezeichnet wurde.
(2) Konstruktion des Ti-Plasmidvektors
Dann wurde mit den erhaltenen Genen eine Nukleotidsequenz verbunden, kodierend das Transitpeptid für Mitochondrien. Das Nukleotidfragment, kodierend das Transitpeptid für Mitochondrien, wurde erhalten, indem eine PCR unter Verwendung der 5'-Seite des NAD-abhängigen GDH-Gens von Tomaten als Matrize verwendet wurde. Die für die PCR-Reaktion verwendeten Primer waren
5'-CTG CAG ATG AAT GCT TTA GCA GCA AC-3'(SEQ ID NO: 7) und
5'-TCT AGA TAA ACC AAG AAG CCT AGC TG-3'(SEQ ID NO: 8). Die Verbindung eines An-GDH-Gens und einer Nukleotidsequenz, kodierend das Transitpeptid für Mitochondrien, wurde durch PCR mit dem An-GDH-Gen und einem Transitpeptidgen als Matrizen durchgeführt. Die vier in der PCR-Reaktion verwendeten Primer waren
5'-TCT AGA ATG AAT GCT TTA GCA GCA AC-3'(SEQ ID NO: 9),
5'-GGG AAG GTT TAG ACA TTA AAC CAA GAA GCC T-3'(SEQ ID NO: 10),
5'-AGG CTT CTT GGT TTA ATG TCT AAC CTT CCC-3'(SEQ ID NO: 11)
und 5'-GAG CTC TTA CGC CTC CCA TCC TCG AA-3'(SEQ ID NO: 12).
Zu dem erhaltenen GDH-Gen wurde die Transitpeptidsequenz für Mitochondrien zugefügt, was als Mtd-An-GDH bezeichnet wurde.
Das Mtd-An-GDH-Gen wurde in pIG121-Hm eingebaut, durch Ersatz des GUS-Teils von pIG121-Hm, einem Vektor, Ti-Plasmid für eine Agrobacterium-vermittelte Transformation (1). Das erhaltene Ti-Plasmid wurde in Agrobacterium tumefaciens EHA101 eingeführt, das für die Kartoffeltransformation verwendet werden sollte.
Beispiel 2
Erzeugung einer transgenen Kartoffel
Die Transformation der Kartoffel (May Queen) wurde durch das Verfahren von Gordon et al. (Plant Cell Reports, 12: 324–327, 1993) durchgeführt. Steril induzierte Mikroknollen wurden zur Bildung von Knollenscheiben geschnitten und die Stücke wurden auf ein MS-Agar-Medium platziert, beinhaltend 2 mg/l Zeatin und 0,1 mg/l Indolessigsäure. Die Stücke wurden für 24 Stunden bei 25°C kultiviert, wobei die Tageslichtstunden bei 16 Stunden gehalten wurden. YEP-Medium (10 g/l Bactotrypton, 10 g/l Hefeextrakt und 1 g/l Glukose), enthaltend 50 mg/l Kanamycin und 50 mg/l Hygromycin wurden mit dem Agrobacterium, enthaltend die konstruierten Nukleinsäuremoleküle, inokuliert und über Nacht unter Schütteln bei 28°C kultiviert. Die Agrobacterium-Suspension wurde zu den Knollenscheiben zugefügt und 24 Stunden zur Auslösung der Infektion kultiviert. In 10 Minuten wurde die überflüssige Agrobacterium-Suspension durch Verwendung von sterilisiertem Filterpapier entfernt, in eine Petri-Schale übertragen, die das oben beschriebene Medium enthielt und 24 Stunden unter derselben Bedingung kultiviert. Dann wurden die Knollenscheiben in MS-Agar-Medium transplantiert, enthaltend 50 mg/l Kanamycin, 300 mg/l Cefotaximhydrochlorid, 2 mg/l Zeatin und 0,1 mg/l Indolessigsäure, um die Transformanten zu selektieren. Der regenerierte Schössling wurde weiter in das oben beschriebenen Medium transferiert und seine Resistenz wurde bestätigt. Der Schössling, der eine anscheinende Kanamycin-Resistenz zeigte, wurde in ein MS-Agar- Wurzelbildungsmedium transplantiert, enthaltend 50 mg/l Kanamycin und 300 mg/l Cefotaxim-Hydrochlorid, um eine Wurzeldifferenzierung zu induzieren. Die Stengelspitze wurde mindestens dreimal von der redifferenzierten Wurzelpflanze geschnitten und auf ein Regenerations-Selektionsmedium transplantiert, um die Kanamycin-Resistenz zu bestätigen, um dadurch Chimären auszuschließen. Eine Gesamtheit von 5 Individuen, wie so erhalten, wurden in der Erde zum Erhalt von Knollen akklimatisiert.
Beispiel 3
Bestätigung des eingeführten Gens
DNA wurde aus 5 selektierten individuellen Linien mit einer Kanamycinresistenz und nicht-infizierten Pflanzen extrahiert. Die DNA wurde durch das Verfahren von Honda et al. (Honda und Hirai, Jpn. J Breed 40: 339–348, 1990) extrahiert. Die PCR-Analyse wurde mit der extrahierten DNA als Matrize durchgeführt, für An-GDH-Gen spezifische Primer,
5'-TCT AGA ATG TCT AAC CTT CCC GTT GAG-3'(SEQ ID NO: 5) und
5'-GAG CTC TCA CCA CCA GTC ACC CTG GTC-3'(SEQ ID NO: 6), und
Primer zur Vervielfältigung des NPTII-Gens in einem Vektor
5'-CCC CTC GGT ATC CAA TTA GAG-3'(SEQ ID NO: 13) und
5'-CGG GGG GTG GGC GAA GAA CTC CAG-3'(SEQ ID NO: 14). Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung des PCR-Systems 2400, hergestellt von PerkinElmer Co. wie folgt durchgeführt: 94°C - 3 min; 94°C - 45 sek, 55°C - 30 sek, 72°C - 90 sek, 35 Zyklen; 72°C - 10 min. Das PCR-Produkt wurde einer Elektrophorese auf einem 1 % Agarosegel unterzogen und dann mit Ethidiumbromid gefärbt, um die Gegenwart oder Abwesenheit des Amplifikationsprodukts und dessen Größe zu überprüfen. Im Ergebnis wurden spezifische Banden für das An-GDH-Gen (ungefähr 1,5 kbp) und das NPTII-Gen (ungefähr 1,1 kbp) in den gewählten transgenen Kartoffeln beobachtet (2) und diese Banden wurden bei den nicht-infizierten Pflanzen nicht beobachtet. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass die T-DNA- Region, einschließlich dem An-GDH-Gen, in die transformierten Kartoffeln eingeführt worden war.
Beispiel 4
Bestätigung der Expression des eingeführten Gens (Northern-Blot-Analyse)
Die Expression des eingeführten Gens wurde durch Durchführung einer Northern-Blot-Analyse unter Verwendung von transgenen Kartoffeln bestätigt, bei denen die Einführung des An-GDH-Gens bestätigt worden war.
RNA wurde aus den Knollen transformierter Kartoffeln durch ein SDS-Phenol-Verfahren extrahiert. Die extrahierte RNA wurde einer Elektrophorese auf einem 1,2%igem Agarosegel, enthaltend 18 % Formaldehyd unterworfen und dann mit Ethidiumbromid gefärbt. Nach einem Blotten auf eine Nylonmembran (HybondN+) wurde mit UV fixiert und eine Hybridisierung wurde mit einer Sonde durchgeführt, die das Gesamtlängen-An-GDH-Gen enthielt. Ein DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II und PCR DIG Probe Synthesis Kit, hergestellt von Roche Diagnostics K.K., wurden für den Northern-Blot und die Sondenpräparation verwendet.
Im Ergebnis wurde eine An-GDH-Gen-spezifische Bande für die Knollen der transgenen Kartoffeln bestätigt (3). Die Expression des eingeführten Gens wurde in den Blattgeweben und Knollen der transgenen Kartoffeln dargestellt. Diese An-GDH-spezifische Bande wurde bei nicht-transformierten Kartoffeln nicht beobachtet.
Beispiel 5
Expression des eingeführten Gens (NADP-GDH-Aktivität)
Die NADP-GDH-Aktivität wurde für eine Bestätigung der Expression des eingeführten Gens unter Verwendung transformierter Kartoffeln, worin die Einführung des An-GDH-Gens bestätigt worden war, bestimmt.
Die Aktivitätsmessung wurde durch das Verfahren von Ameziane et al. (Plant and Soil, 221: 47–57, 2000) durchgeführt. Blattgewebe (ungefähr 0,2 g) der transgenen Kartoffeln wurden mit flüssigem Stickstoff eingefroren und dann in einem Mörser zerkleinert. Ein Extraktpuffer {200 mM Tris (pH 8,0), 14 mM β-Mercaptoethanol, 10 mM L-Cystein-HCl und 0,5 mM PMSF} von 5 Volumen der Gewebeprobe wurde hinzugefügt. Die erhaltene Suspension wurde in ein Zentrifugenröhrchen übertragen und bei 12.000 Upm für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde ultrafiltriert (Millipore, ultrafrei 0,5 Filtereinheit, Biomax-10) und dreimal mit dem Extraktpuffer gewaschen, um das Sediment auf dem Filter zu gewinnen und eine rohe Enzymlösung herzustellen.
Die Aktivität wurde durch Zugabe der vorher extrahierten Rohenzymlösung zu einer Reaktionslösung gemessen, enthaltend 100 mM Tris (pH 8,5), 20 mM 2-Oxoglutarat, 10 mM CaCl₂, 0,2 mM NADH und 200 mM NH₄Cl und die Absorption wurde bei 340 nm gemessen. Die Proteinkonzentration der extrahierten Rohenzymlösung wurde durch ein Bradford-Verfahren mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standardprotein gemessen.
Im Ergebnis wurde eine 20- bis 50fach höhere Aktivität in der Probe von den transgenen Kartoffeln im Vergleich mit der von nicht-transgenen Kartoffeln beobachtet (Tabelle 1). Diese Aktivität wird als die Aktivität betrachtet, die auf die Expression des eingeführten An-GDH-Gens zurückzuführen ist, da es wenig NADP-GDH-Aktivität in der Probe der nicht-transformierten Kartoffeln gab.
Tabelle 1 NADP-GDH-Aktivität bei transgenen und nicht-transgenen Kartoffel
Beispiel 6
Bestimmung des 2-Oxoglutarat (2-OG) -Gehalts von Kartoffeln eingeführtem GDH-Gen
Der 2-OG-Gehalt in den Blattgeweben von transgenen Kartoffeln (Mtd 8) wurde bestimmt. Die Kartoffeln wurden 1 Monat in einer Mischerde von 500 g Power Soil und 500 g Vermiculit zum Erhalt gesunder gewachsener Pflanzen kultiviert und das Blattgewebe wurde als Testmaterial verwendet. Die Extraktion wurde durch das Verfahren von Agarei et al. (Plant Science, 162: 257–265, 2002) durchgeführt. Nachdem das Blattgewebe (ungefähr 0,1 g) mit flüssigem Stickstoff zerkleinert worden war, wurden 200 μl 3 % HCO₄ dazugefügt und es wurde gut gemischt. Nach einer Zentrifugation für 10 Minuten bei 12.000 Upm wurde der Überstand in ein anderes Röhrchen übertragen. Zu dem verbleibenden Sediment wurden 200 μl 3%ige HCO₄ zugefügt und es wurde gut gemischt. Nach Zentrifugation für 10 Minuten bei 12.000 Upm wurde der Überstand in das erste Röhrchen übertragen. Dann wurden 50 μl bis 70 μl 5 M K₂CO₃ dem gewonnenen Überstand zur Neutralisierung der Lösung zugefügt. Nach einer Bestätigung, dass der pH der Lösung neutral war, wobei Litmuspapier verwendet wurde, wurde steriles Wasser der Lösung zugefügt, um das Volumen auf 600 μl einzustellen und die resultierende Lösung wurde als Testprobe verwendet. Die Bestimmung des 2-OG-Gehalts wurde gemäß dem modifizierten Verfahren von Usuda et al. (vorher zitierte Referenz) durchgeführt. Die extrahierte Probe von 20 μl wurde zu 475 μl der Reaktionslösung zugefügt {0,1 M Tris-HCl (pH 8,5), 1,0 mM CaCl₂, 0,2 mM NADPH und 0,2 M NH₄Cl}. Nachdem die Absorption bei 340 nm gemessen worden war, wurden 5 μl (10 Einheiten) Glutamatdehydrogenase (GDH) zugefügt und die resultierende Lösung wurde weiter 10 Minuten bei 37°C umgesetzt. Die Absorption bei 340 nm wurde wiederum gemessen und der 2-OG-Gehalt wurde unter Verwendung des Unterschieds zwischen dem Absorptionswert berechnet, gemessen, nachdem die Enzymlösung zugefügt worden war und demjenigen, der gemessen wurde, bevor die Enzymlösung zugefügt worden war.
Im Ergebnis war der 2-OG-Gehalt in den transformierten Kartoffeln um das 1,7fache im Vergleich von dem von nicht-transformierten Kartoffeln angehoben (4).
Beispiel 7
Gibberellin-Bioassay für Kartoffelknollen mit darin eingeführtem GDH-Gen
Eine Zwergmutante von Reis, Tanginbozu, wurde in dem Assay verwendet. Das Assay-Verfahren basierte auf dem Verfahren von Chen et al. (Plant Cell and Environment, 24: 469–476, 2001). Von Hüllen befreite nicht-polierte Reissamen wurden mit 70 % Ethanol 1 Minute und 2 % Natriumhypochlorit 15 Minuten oberflächensterilisiert, gefolgt von einem Waschen mit sterilisiertem Wasser für dreimal und dann in sterilisiertem Wasser eingetaucht und 2 Tage bei 30°C inkubiert. Keimende Sämlinge wurden wiederum auf ähnliche Weise, wie oben beschrieben, sterilisiert. Nachdem 0,6 % Agarplatten zu destilliertem Wasser zugefügt und durch einen Autoklaven sterilisiert wurden, wurden die keimenden Sämlinge in Teströhrchen mit einem Durchmesser von 3 cm platziert, die jeweils mit Agarmedium von 25 ml gefüllt waren. Dieses wurde 5 Tage bei 25°C kultiviert, während die Tageslichtstunden 16 Stunden betrugen. Die keimenden Sämlinge, die nur einheitliche Sämlinge aufwiesen, wurden selektiert und 2 μl Testlösung wurde zwischen das erste Blatt und den Coleoptil getropft. Nach einer Kultivierung für 5 Tage unter denselben Bedingungen wurde die Länge der zweiten Blatthülle gemessen.
Für den Assay wurden Knollen, gelagert bei –80°C, direkt nach der Ernte, Knollen von 2 Monaten nach der Ernte und Knollen von 3 Monaten nach der Ernte verwendet. Die geernteten Knollen wurden im Raum gelagert. Alle Knollen wurden unter Verwendung von flüssigem Stickstoff zerkleinert und durch Zugabe von 80 % Aceton mit einem 3fachen Volumen des frischen Gewichts extrahiert. Nachdem Unreinheiten durch Zentrifugation entfernt worden waren, wurde der Überstand gefriergetrocknet. 20 % Aceton wurden der gefriergetrockneten Probe zugefügt, um ein Frischgewicht von 100 μl/g zu erhalten. Um die Spezifität von Gibberellin zu überprüfen, wurden 1 mg/l Daminozid, ein Gibberellinantagonist, verwendet. Die folgenden 3 Gruppen wurden hergestellt: eine Gruppe einer Testlösung von transgenen Kartoffelknollen, eine Gruppe einer Testlösung von nicht-transgenen Kartoffelknollen und eine Gruppe, worin dieselbe Menge Daminozid der Testlösung der transgenen Kartoffelknollen zugefügt worden war.
Im Ergebnis wurde bestätigt, dass im Fall eines Tropfens der Testlösung, extrahiert aus den transgenen Kartoffelknollen, die Verlängerungslänge der zweiten Blatthülle im Vergleich mit derjenigen erhöht war, die aus nicht-transgenen Kartoffelknollen extrahiert wurde. Dies legte nahe, dass der Gehalt an aktivem Gibberellin in der Testlösung von den transgenen Kartoffelknollen erhöht war im Vergleich mit dem von den nicht-transgenen Kartoffelknollen. Da die Wirkung der Verlängerungsunterstützung auf die zweite Blatthülle durch Zugabe von Daminozid inhibiert wurde, wurde die Verlängerung der zweiten Blatthülle außerdem als Gibberellin-spezifische Wirkung angesehen (5). Da die Verlängerungsunterstützung der zweiten Blatthüllenlänge erhöht zu sein schien, wenn die Zeitspanne der Knollenlagerung anstieg, wurde angenommen, dass die Ruheperiode durch graduellen Anstieg der Gibberellinaktivität in den Knollen während der Langzeitlagerung unterbrochen werden könnte.
Beispiel 8
Studie im Hinblick auf die Knospung transformierter Kartoffel
Die Knospung von transgenen Kartoffelknollen und nicht-transgenen Kartoffelknollen 3 Monate nach der Ernte wurde untersucht. Im Mai knospende Knollen wurden für transgene Kartoffeln (40 von 42 Knollen) beobachtet, jedoch wurden keine knospenden Knollen für nicht-transgene Kartoffeln beobachtet (0 von 30 Knollen). Weiterhin wurde, nachdem eine Lichtbehandlungs-Knospenbehandlung für 10 transgene Kartoffelknollen und 10 nicht-transgene Kartoffelknollen bei Raumtemperatur, 25°C für 3 Tage, durchgeführt wurde, eine Gruppe in eine Erde transplantiert, die nur aus Vermiculit bestand und die andere Gruppe mit derselben Zahl von Knollen wurde wie sie war gehalten. Dann wurde die Zahl der Knospen bestimmt. Die transplantierten Knollen wurden in einem Gewächshaus mit einem geschlossen System kultiviert, gehalten bei 24°C während des Tages und bei 18°C während der Nacht und die Zahl von Knollen mit Knospensprossung oberhalb der Erde wurde jede Woche gemessen.
Im Ergebnis wurde eine Knospung für transgene Kartoffelknollen 2 Wochen nach Transplantation beobachtet und alle Knollen zeigten Knospen 3 Wochen nach einer Transplantation für die transgenen Kartoffelknollen. Demgegenüber wurde bei den nicht-transgenen Kartoffeln eine Knospung in der 4. Woche beobachtet, jedoch wurde die Knospung nicht von allen Knollen beobachtet und zwar selbst nach der 7. Woche (6). Aus diesen Ergebnissen wurde bestätigt, dass die Knospungszeit der transgenen Kartoffelknollen vorgerückt war und dass die Knospe sehr einheitlich auftrat.
Beispiel 9
Studie des Ertrags der transformierten Kartoffeln
Der Ertrag wurde unter Verwendung der Knollen von transgenen Kartoffeln und nicht-transgenen Kartoffeln untersucht. Power Soil (Kureha Chemical Industry Co.) mit 0,3 kg und Vermiculit mit 1 kg wurden zu einem Nr. 7 Topf zugefügt und eine Knolle wurde in jeden Topf platziert. In der Studie wurden 8 Knollen transgener Kartoffeln und 8 Knollen nicht-transgener Kartoffeln kultiviert und das Frischgewicht des Teils oberhalb der Erde, die Zahl der Knollen und das Knollengewicht wurden gemessen. Während der Kultivierung wurde die Zahl der Stengel auf 1 pro Knolle normalisiert und es wurde nur Wasser ohne zusätzlichen Dünger gegeben.
Im Ergebnis stieg das Gewicht des Teils oberhalb der Erde, das Knollengewicht und die Anzahl der Knollen der transgenen Kartoffeln um das 1,13fache, 1,35fache bzw. 1,24fache im Vergleich mit denjenigen von nicht-transgenen Kartoffeln (Tabelle 2).
Tabelle 2 Studie im Hinblick auf den Ertrag der transformierten Kartoffeln, enthaltend das eingeführte GDH-Gen
Literaturliste

1. Canada, CA2180786
2. China, CN00109779.2
3. Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 2001-238556
4. Tomokazu Koshiba und Yuji Kamiya, "Science of new plant hormone", Kodansha Ltd., 2002
5. Vegetable horticulture great dictionary, Yokendo, 1977
6. Tokushima Test und Research Report of Agriculture, Band 36, Seiten 7–17 (2000)
7. Minoru Yoshida, Potato encyclopedia, Rural Culture Association, 1988
8. Plant Physiology, Band 118, Seiten 773–781 (1998)
9. Plant Journal, Band 22, Seiten 247–256 (2000)

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur Erzeugung einer Pflanze mit einer verkürzten Ruheperiode im Vergleich zu der von natürlich auftretenden Pflanzen derselben Art durch Erhöhung eines intrazellulären 2-OG-Gehalts in der Pflanze, umfassend den Schritt der Überexpression eines intrazellulären GDH-Gens in der Pflanze.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren weiterhin eine Pflanze mit einheitlicher Knospungs- oder Keimungs-Zeit erzeugt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Schritt der Überexpression des intrazellulären GDH-Gens in der Pflanze durch Einführung eines Nukleinsäurekonstrukts in die Pflanze durchgeführt wird, das die Expression des GDH-Gens erhöhen kann.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Schritt der Überexpression des intrazellulären GDH-Gens in der Pflanze durch Einführung eines Nukleinsäurekonstrukts in die Pflanze durchgeführt wird, das das GDH-Gen exprimieren kann.
Verfahren gemäß Anspruch 3 oder 4, wobei das Nukleinsäurekonstrukt ein Nukleinsäuremolekül umfasst, kodierend das Polypeptid mit der in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 beschriebenen Aminosäuresequenz.
Verfahren gemäß Anspruch 3 oder 4, wobei das Nukleinsäurekonstrukt mit einem Nukleinsäuremolekül mit der in SEQ ID NO: 1 oder 3 beschriebenen Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert, wobei das Nukleinsäuremolekül ein Polypeptid mit GDH-Aktivität kodiert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Pflanze gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Hafer, Kopfsalat, Kartoffel, Pfirsich, Kamelien, Reis, Weizen, Ramie, Erdnuss, Bromus catharticus, Bromus inermis Leyss., japanischem Rettich, Brassica, Aubergine, Leberpilz, Gloxinia, Kalanchoe, Primula, Nigella damascena, Erdbeere, Aralia cordata Thunberg, Zwiebel, Frühlingszwiebel, Spinat und Blumenzwiebeln.