JPH02186925A - 新規な除草剤耐性植物 - Google Patents

新規な除草剤耐性植物

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JPH02186925A
JPH02186925A JP1247888A JP24788889A JPH02186925A JP H02186925 A JPH02186925 A JP H02186925A JP 1247888 A JP1247888 A JP 1247888A JP 24788889 A JP24788889 A JP 24788889A JP H02186925 A JPH02186925 A JP H02186925A
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ahas
dna
cells
gene
plant
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JP1247888A
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Alice Montoya
アリス　モントヤ
George Jen
ジョージ　シェン
Christian Harms
クリスチャン　ハームス
Gleta Carswell
グレタ　カースウエル
Susan Armour
スーザン　アーマー
Sandra Volrath
サンドラ　ボルラス
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Novartis AG
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Ciba Geigy AG
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕 本発明は高められたレベルのアセトヒドロキシ酸シンタ
ーゼ（ＡＨＡＳ）酵素により耐性が引き起こされる除草
性のＡＨＡＳ阻害剤に耐性である植物細胞および植物、
この耐性植物細胞の調製に有用な組換えＤＮＡ、並びに
選択および組換えＤＮＡでの形質転換による前記植物細
胞の調製方法に関する。 〔従来の技術〕 アセトヒドロキシ酸シンターゼ（Ａ　ＨＡ　Ｓ　。 Ｅ、　Ｃ，４，１，３，ｌ　８、アセトラクテートシン
ターゼともいう）は、分岐鎖アミノ酸すなわちバリン、
ロイシンおよびイソロイシンの生合成において中心的な
働きをする酵素である。ＡＨＡＳは２分子のピルベート
の縮合を触媒してアセトラクテートとし、そしてまたピ
ルベートとケトブチレートとの縮合を触媒してアセトヒ
ドロキシブチレートとする。触媒活性にはフラビンアデ
ニンジヌクレオチド、チアミンピロホスフェートおよび
二価のカチオンが必要である。腸内細菌では形成される
アミノ酸によりフィードバック阻害が異なる３種のアイ
ソザイムが同定されている。植物ＡＨＡＳもまた３種も
しくはそれ以上のアイソザイムからなり得ることがいく
つかの実験の証拠が示唆している。スルホニル尿素除草
剤、イミダゾリノン除草剤およびトリアゾロピリミジン
除草剤がＡＨＡＳの阻害を経由して作用するという観察
は、この酵素にかなりの興味を引き起こした。 スルホニル尿素除草剤およびイミダゾリノン除草剤に対
する耐性がいくつかの腸内細菌および酵母では変更され
たＡＨＡＳに起因するという発見は、その方向に探究を
集中させた。例えば米国特許第４７６１３７３号には、
植物細胞培養物の選択により得られたそして別の除草量
のイミダゾリノンＡＨＡＳ阻害剤に耐性であるトウモロ
コシ植物が記載されている。この耐性は変更されたアセ
トヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）により植物に付
与される。酵母における変更されたＡＨＡＳに関する広
範囲の経験から推論すると、欧州特許出願第２５７９９
３号は、遺伝子レベルでの核酸の変化およびそれに伴う
酵素レベルでのアミノ酸の変化が通常の濃度のスルホニ
ル尿素除草剤に耐性であるＡＨＡＳを導く、種々のＡ）
ｌΔＳコード遺伝子のヌクレオチド配列を開示し、そし
てこれら遺伝子の７種のサブシーケンス（ｓｕｂ−ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ）を記載している。この特許出願はまた変
更されたＡＨＡＳ遺伝子をタバコ内に遺伝子操作により
導入する方法を開示している。 〔発明が解決しようとする課題〕 変更されたＡＨＡＳを選択する試みまたは遺伝子操作に
より変更されたＡＨＡＳを導入する試みはこれまでいく
つかの成功を導いたけれども、この試みが遺伝可能にス
ルホニル尿素耐性およびその他の所望の性質を有する有
用作物を導くか否かは依然として未解決である。結局は
Ａ）ＩＡＳ酵素の変更がまた分岐鎖アミノ酸を導く生合
成経路を変更し、そしてそれ故に予期しないおよび不所
望の性質を有する植物となるであろうことが予想され得
る。それ故に本発明の目的は、正常な野生型植物ＡＨＡ
Ｓの操作、例えば野生型ＡＨＡＳ遺伝子の過剰発現また
は増幅に基づいて除草性のＡＨＡＳ阻害剤に対する耐性
を植物に与える方法および手段を記載することである。 抗生物質の標的酵素の過剰発現の機構は耐性菌において
研究され、そして全ての種類の微生物およびホ乳類細胞
に関して広範囲にわたり記載されている。植物内におけ
る酵素の短期間の過剰発現の報告もまた利用可能である
。国際特許出願Ｗ　Ｏ８６１０２０９７号は耐性が高め
られたレベルの野生型グルタミンシンテターゼにより引
き起こされる除草性のグルタミンシンテターゼ阻害剤に
耐性である植物細胞を開示している。しかしながら、グ
ルタミン生合成経路と分岐鎖アミノ酸合成経路との固有
の相違のために、過剰発現の概念は植物内の除草性ＡＨ
ＡＳ阻害剤に対する耐性または許容性を付与するために
適用され得るかどうかの指標がない。さらに、除草剤感
受性のタバコ植物細胞内への野生型タバコＡＨＡＳ遺伝
子の導入が、これらの細胞に対してスルホニル尿素除草
剤耐性を与えることに失敗した欧州特許出願第２５７９
９３号に記載された実験の結果は、除草性のＡＨＡＳ阻
害剤への原理的な過剰発現の一般的な適用を妨害する。 〔課題を解決するための手段〕 本発明は除草性のアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨ
ＡＳ）阻害剤、例えばスルホニル尿素、イミダリノンま
たはトリアゾロピリミジン除草剤に耐性である植物細胞
に関し、この耐性は高められたレベルのＡ　ＨＡ　Ｓ酵
素により引き起こされる。本発明の植物細胞は選択操作
または遺伝子操作により得ることができる。本発明はさ
らに前記植物細胞を含有する植物、種子およびその他の
ムカゴ、前記植物細胞の調製に有用な組換えＤＮＡ、前
記植物細胞、種子およびその他のムカゴの調製方法並び
に本発明の植物からなる農園において雑草を防除する方
法に関する。 １こ　　　　ｔ＋！Ｈ 配列ｌは”Ｍ１３マイナス２０′１プライマー５　’Ｇ
ＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３　’を用いてｐｃ
ＩＢ１２５３の２．１　ｋｂｐ　Ｉ！１ｎｄＩＩＩＥｃ
ｏＲＩ断片から得られたＤＮＡ配列Ｃ１５ｑｂ−２０、
Ｓｅｑを示す。 配列２は配列Ｃ１５ｑｂ　−２０，Ｓｅｑから推定され
るＤＮＡ二本鎖配列（Ｃ１５ｑｂ　−２０，Ｓｅｑは上
の鎖である）およびこのＣｌ５ｑｂ　−２０，Ｓｅｑ配
列に相補的な鎖の一つの読み枠から推定されるアミノ酸
配列を示す。このアミノ酸配列から形成されるポリペプ
チドは右から左にそして下から上に読まれるべきである
。 配列３は配列２において示されたＣｌ５ｑｂ　−２０、
Ｓｅｑから推定されるポリペプチド（中央の配列）、ア
ミノ酸２６７位ないし４１１位のタバコ５ｕＲＢＡＨＡ
Ｓ酵素の配列（上段の配列）およびアミノ酸２７３位な
いし４１７位のアラビドプシスＡＴ−ＩＡＳ酵素の配列
（下段の配列）の類似性の比較を示す。ＶＡＸコンピュ
ーター（マサチューセッツ州ボストン、ＤＥＣ）を操作
してザ・ユニバーシティ・オブ・ライスコンシン・ジエ
ネティクス・コンピュータ・グループのＧＡＰプログラ
ムにより配列された。トウモロコシポリペプチドとタバ
コの配列とアラビドプシスの配列との間には、それらが
それらの配列中で同じ位置に同一のアミノ酸を有する場
合に垂線が引かれている。 配列４はアラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子のヌクレオチド
１１６６位ないし１１８２位から作られたプライマーを
用いてｐｃＩＢ１２５５から得られたＤＮＡ配列Ｃ３ｓ
ａ１６ｓｅｑ、　Ｄａｔを示す。 １位はアラビドプシスＡＨＡＳコード配列のイニシェー
ク−ＡＴＧの八である。ブライマー配列は５　’ＴＡＡ
ＧＡＴＴＧＴＴＣＡＴＡＴＴＧ３′である。 配列５は配列Ｃ３ｓａ１６ｓｅｑ、　Ｄａｔから推定さ
れるＤＮＡ二本鎖配列（Ｃ３ｓａ１６ｓｅｑ、Ｄａｔは
上の鎖である）およびこのＣ３ｓａ１６ｓｅｑ、　Ｄａ
ｔ配列の一つの読み枠から推定されるアミノ酸配列を示
す。このアミノ酸配列から形成されるポリペプチドは左
から右にそして上から下に読まれるべきである。 配列６は配列５において示されたｃ３ｓａ＋６ｓｅｑ。 Ｄａｔから推定されるポリペプチド（中央の配列）、ア
ミノ酸４１２位ないし５３５位のタバコ５ｕＲＢ　Ａ　
Ｉ−Ｉ　Ａ　Ｓ酵素の配列（上段の配列）およびアミノ
酸４１８位ないし５４１位のアラビドプシスＡＨＡＳ酵
素の配列（下段の配列）の類似性の比較を示す。ＶＡＸ
コンピューター（マサチューセッツ、ボストン、ＤＥＣ
）を操作してザ・ユニバーシティ・オブ・ライスコンシ
ン・ジエネティクス・コンピュータ・グループのＧＡＰ
プログラムにより配列された。トウモロコシポリペプチ
ドとタバコおよびアラビドプシスの配列との間には、そ
れらがそれらの配列中で同じ位置に同一のアミノ酸を有
する場合に垂線が引かれている。 配列７は完全なトウモロコシＣＩ　ＡＩ（ＡＳ遺伝子と
フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）ＤＮＡとのＤＮＡ配
列を示す。トウモロコシＣＩ　ＡＲＡＳの推定されるア
ミノ酸はＤＮＡ配列の下に記載されている。 配列８は完全なトウモロコシＣ３ＡＨＡＳ遺伝子とフラ
ンキングＤＮＡとのＤＮＡ配列を示す。トウモロコシＣ
３ＡＩ（ＡＳの推定されるアミノ酸はＤＮＡ配列の下に
記載されている。 配列９はタバコＰＲ−１ａ遺伝子のＸｈｏ１部位とＢｇ
１１１部位の間の２ｋｂ対断片のゲノムＤＮＡ配列を示
す。ヌクレオチド９０３近傍の矢印は転写開始部位を示
し、そして２０７と３１３に記された垂直な矢印は２つ
の独立したｃ　ＤＮＡクローンの末端を示す。この遺伝
子のコード部分によりコード化されるポリペプチド配列
もまた開示されている。 ル　　−・コレ　シ １シゴソ電１託 寄託番号　名称（寄託臼） ５３４８７　　アグロバクテリウム・チュメファシエン
スＡ２８１（１９８６年５月１４日）４０３２６　　ゼ
ア・メイズ懸濁培養物（１９８？年５月２０日） ６７４２０　　ｐＥ１６／８−ｃ４プラスミドを有する
大腸菌１１Ｂ１０１（１９８７年５月２９日）６７６２
８　　ｐＴＪＳ７５−Ｋｍを有する大腸菌１１ＢＩＯＩ
（１９８８年２月１２日） ４０４２６　　プラスミドｐＢＳ−ＰＲ１０１３Ｃ１＆
（１９８８年２月１２日） ４０５２９　　　プラスミドＤＮＡ　ｐｃＩＢ１２５３
（１９８８年１２月２９日） ４０５３０　　ファージラムダＤＮＡ　ＤＣＩ８１２０
０（１９８８年１２月２９日） ４０５３１　　ラムダファージＬＣＩＢ　１２００（１
９８８年１２月２９日） ４０５３２　　プラスミドＤＮＡ　ｐｃ＋ｂ　１２５５
（１９８８年１２月２９日） ４０５３３　　ファージラムダ口ＮＡ　Ｄｔ、ＩＢ　１
２０２（１９８８年１２月２９日） ４０５３４　　ラムダファージＬＣＩＢ　１２０２（１
９８８年１２月２９日） 葱を口組区 本発明は、高められたレベルのアセトヒドロキシ酸シン
ターゼ（ＡＨＡＳ）酵素により耐性が引き起こされる除
草性のＡＨＡＳ阻害剤に耐性である植物細胞に関する。 ［耐性Ｊとは前記植物細胞が通常量のＡＨＡＳ酵素を有
する同−属および品種の相当する植物細胞の少な（とも
９５％、例えば９９％、９９．９％もしくはそれ以上を
死滅させるには十分である前記除草性ＡＨＡＳ阻害剤の
濃度で生き残ることを意味する。高められたレベルのＡ
ＨＡＳ酵素は、通常レベルのＡＨＡＳ酵素を有する同−
属および品種の相当する植物細胞内のＡＨＡＳ酵素の平
均レベルより実質的に高いレベル、例えば２倍またはそ
れ以上高いレベル、例えば１０倍高いレベルである。 本発明の植物細胞内の高められたＡ　ＨＡ　Ｓレベルは
、同−属および品種の相当する正常な、すなわち野生型
の細胞内に存在するのと同じＡＲＡ　Ｓ酵素の高められ
たレベルに起因してもよいが、しかし別の品種もしくは
別の属の野生型の細胞から誘導されるＡ　ＨＡ　Ｓ酵素
の高められた量に起因しても、または適当な化学物質も
しくは高エネルギー照射での突然変異によるか、もしく
は化学合成による天然の酵素から誘導される突然変′Ａ
ＡＨＡＳ酵素の高められた量に起因してもよい。天然も
しくは突然変異酵素の供給源はあらゆる植物であってよ
いが、しかし微生物例えばバクテリアおよび酵母であっ
てもよい。野生型細胞からのＡ　Ｉ−Ｉ　Ａ　Ｓ酵素は
以下の除草性ＡＨＡＳ阻害剤に通常感受性であるが、し
かし該除草剤に対して変動する程度の耐性を示してもよ
い。 高められたレベルのＡＨＡＳ酵素を示す本発明の植物細
胞は選択方法または遺伝子操作により得ることができる
。好ましい選択方法は、以下により詳細に記載するよう
な全体の植物体に再生され得るあらゆる種類の細胞培養
物、例えば単一細胞、植物細胞培養物、胚形成性植物組
繊細胞培養物、プロトプラスト培養物、カルス培養物等
に関して用いられる方法である。選択方法はまた全体の
植物体または種子に適用可能であるが、しかしこれらは
効果がない。好ましい選択方法は突然変異操作に好都合
である処理、例えば突然変異性化学物質例えばＮ−エチ
ルＮ−ニトロソ−尿素（ＮＥＵ）、Ｎ−メチル−Ｎ′−
二トローＮ−二トロソーグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチ
ルメタン−スルホネート（ＥＭＳ）またはアジ化ナトリ
ウム（ＮａＮｓ）との処理、または高エネルギー照射例
えば短波長紫外線（ＵＶ）　、ガンマ線またはＸ線での
処理を行った細胞に適用されてもよい。しかしながら、
突然変異の自然の頻度は、次いで本発明の方法で選択さ
れ得る所望の性質を有する植物細胞を調製するには通常
十分である。 選択操作により得られる本発明の植物細胞における高め
られたレベルのＡ　ＨＡ　Ｓ酵素は異なる原因、例えば
相当する内因性ＡＨＡＳ遺伝子の多重コピーまたは相当
するＡＨＡＳ遺伝子内のＡＨＡＳコード配列の多重発生
、すなわち遺伝子増幅、または内因性ＡＨＡＳ遺伝子の
非コード調節配列における突然変異の結果としての内因
性ＡＨＡＳコード配列の高められた発現、すなわち過剰
発現に起因してもよい。 種々の異なる試みが、高められたレベルのＡＨＡＳ酵素
を得るために、遺伝子操作技術と共に使用され得る。遺
伝子操作技術が上に詳細に記載したような選択操作によ
り得ることができる結果をもたらすために使用され得る
。例えば、内因性ＡＨＡＳ遺伝子の多重コピーが導入さ
れ、そして本発明の植物細胞のゲノム内に安定に組み込
まれてもよいし、またＡＨＡＳ遺伝子が構築され、そし
て内因性ＡＨＡＳコード配列の多重コピーが内因性プロ
モーターの制御下、正しい読み枠内にあるゲノム内に導
入されてもよい。 さらに、内因性ＡＨＡＳ遺伝子は、内因性ＡＩ］Ａｓコ
ード配列の発現を増やすために塩基配列を導入し、置換
し、または切除することにより非コード調節領域におい
て操作されてもよいし、また内因性ＡＨＡＳコード配列
は高レベルの発現を呈することが知られている異なる内
因性プロモーターの制御下におかれてもよい。　遺伝子
操作技術はまた、外因性ＡＨＡＳ遺伝子、外因性ＡＨＡ
Ｓコード配列および／または外因性プロモーターおよび
エンハンサ−を導入することにより高められたレベルの
ＡＨＡＳ酵素を有する植物細胞を調製するために本発明
に従って使用され得る。前記外因性ＡＨＡＳ遺伝子は野
生型ＡＨＡＳの性質を実質的に有する異なる品種または
属のＡＨＡＳをコードしてもよい。そのような外因性Ａ
ＨＡＳ遺伝子の例は除草性ＡＨＡＳ阻害剤に感受性であ
る植物からの遺伝子である。これにもかかわらず感受性
Ａ　Ｉ（Ａ　Ｓをコードする外因性遺伝子を含有する植
物細胞は、異なる環境で遺伝子の高められた発現のため
に除草性ＡＨＡＳ阻害剤に耐性であってもよい。 本発明のその他の面において、植物細胞は前記Ａ　Ｉ−
１ΔＳの高められた発現を呈するプロモーターに操作可
能に連結された前記植物細胞内で機能的であるＡＨＡＳ
をコードするＤＮＡ配列からなる安定に組入れられたキ
メラＤＮＡ構築物を含有する。使用すべき異なる外因性
プロモーターの性質は以下により詳細に記載されるであ
ろう。操作可能に連結されたΔＨΔＳコード配列は別の
品種または属の内因性ＡＩ（ΔＳコード配列またはＡＨ
ＡＳコード配列、特に除草性ＡＨＡＳ阻害剤に感受性で
ある植物細胞から誘導される野生型コード配列であって
よい。このようなＤＮＡ構築物はその他のコード配列、
例えば移送ペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ
）のコード配列であってよく、このペプチドはＡＨＡＳ
酵素が発生および作用の通常の部位、例えば葉緑体また
はミトコンドリア内に移送されるような様式で本発明の
植物細胞により処理される融合タンパク質を導く。 本発明の植物細胞は単子葉または双子葉植物の細胞であ
ってよい。あらゆる植物が考慮されるが、特に経済価値
のある栽培植物、例えばヒトまたは動物の栄養のために
生長させた植物、有用な二次代謝物質の内容物のために
生長させた植物、繊維の内容物のために生長させた植物
、樹木、観賞価値のある植物等である。例えば、トウモ
ロコシ（メイズ）、小麦、大麦、イネ、モロコシ、サト
ウキビ、テンサイ、ダイス、プラッシカ組匡鏡ｋＣ１ヒ
マワリ、ニンジン、タバコ、レタス、キュウリ、トマト
、ジャガイモ、ワタ、アラビドプシスＭ１肛包旺ｈ）　
、ロリウム几ｌＵ１ｍｌ−、フェストゥカー１競■は）
　、ダクチリス剛に江且口、またはポプラであるが、こ
れらは本発明の範囲をなんら限定するものものではない
。 特に本発明は、高められたレベルの除草性ＡＨＡＳ酵素
により除草性ＡＨＡＳ阻害剤に対する耐性が引き起こさ
れ、そして該ＡＨＡＳが野生型ＡＨＡＳの特性を実質的
に有する植物細胞に関する。好ましくは前記ＡＨＡＳは
以下に記載する除草性ＡＨＡＳ阻害剤に感受性である植
物細胞から誘導される。 前記高められたレベルのＡＨＡＳ酵素が、除草性ＡＨＡ
Ｓ阻害剤に感受性であるその他の同様な天然に生じる植
物細胞内のＡ　ＨＡ　Ｓ酵素のレベルに比べ少な（とも
２倍、特に少なくとも１０倍高い植物細胞が好ましい。 前記高められたレベルのＡＨＡＳ酵素が内因性ＡＨＡＳ
コード配列の高められた発現に起因する、例えば内因性
ＡＨＡＳ遺伝子の非コード配列内での突然変異により引
き起こされるか、または内因性ＡＨＡＳ遺伝子の多重コ
ピーに起因する植物細胞がさらに好ましい。 本発明のもう一つの好ましい面において、植物細胞は外
因性ＡＨＡＳ遺伝子に起因して、好ましくは野生型ＡＨ
ＡＳの特性を実質的に有するＡＨＡＳをコードする外因
性ＡＨＡＳ遺伝子に起因して、例えば除草性ＡＨＡＳ阻
害剤に感受性である植物細胞から誘導された外因性ＡＨ
ＡＳ遺伝子に起因して高められたレベルのＡＨＡＳ酵素
を示す。特にこのような好ましい植物細胞は、前記ＡＨ
ＡＳの高められた発現を呈するプロモーターに操作可能
に連結した前記植物細胞内で機能的であるＡＨＡＳをコ
ードするＤＮＡ配列からなるキメラＤＮＡ構築物、また
は前記植物細胞内で機能的であるＡＨＡＳをコードする
ＤＮＡ配列と移送ペプチドをコードするＤＮＡ配列とか
らなるキメラＤＮＡ構築物を安定に組入れており、そし
てこれらのコード配列は前記ＡＨＡＳの高められた発現
を提供するプロモーターに操作可能に連結されている。 好ましいプロモーターは化学的に調節可能なプロモータ
ーである。 好ましい植物細胞はトウモロコシ（メイズ）、小麦、大
麦、イネ、モロコシ、サトウキビ、テンサイ、ダイス、
プラッシカ、ヒマワリ、ニンジン、タバコ、レタス、キ
ュウリ、トマト、ジャガイモ、ワタ、アラビドプシス、
ロリウム、フェストゥが、ダクチリス、またはポプラ細
胞であり、特にトウモロコシ、小麦、ダイスお上びタバ
コ細胞である。 ト 除草性Ａ　ＨＡ　Ｓ阻害剤は当該分野で公知である。特
にそれらはスルホニル尿素除草剤、イミダゾリノン除草
剤またはトリアゾロピリミジン除草剤の類に属する。 スルホニル尿素除草剤は例えばオルト置換されたＮ−ア
リールスルホニル−Ｎ′−ピリミジニル〜またはトリア
ジニル−尿素およびそれらの誘導体であり、例えば２−
クロロ−Ｎ−［（４−メトキシ−６−メチル−１，３，
５−トリアジン−２−イル）−アミノカルボニル］−ベ
ンゼンスルホンアミド（クロルスルフロン）、２−メト
キシカルボニル−Ｎ−［（４，６−シメチルビリミジン
ー２−イル）−アミノカルボニル〕−ベンゼンスルホン
アミド（スルホメツロンメチル）、２−メトキシカルボ
ニル−Ｎ−〔（４−クロロ−６−メドキシビリミジンー
２−イル）−アミノカルボニル〕−ベンゼンスルホンア
ミド、メチル−２−ｆＮ−Ｃ（４，６ジメトキシ−ピリ
ミジン−２−イル）−アミノカルボニル〕−アミノスル
ホニルメチル）−ベンゾエート、２−（２−クロロエト
キシ）−Ｎ−〔（４−メトキシ−６−メチル−１，３，
５−トリアジン−２−イル）−アミノカルボニル〕ベン
ゼンスルホンアミド（トリアスルフロン）、２−メトキ
シカルボニル−Ｎ−〔４−メトキシ−６−メチル−１，
３，５−トリアジン−２−イル）−アミノカルボニル〕
−３−チオフェンスルホンアミド（チアメツロンメチル
）、２−メトキシカルボニル−Ｎ−１［４，６−ビス−
（ジフルオロメトキシ）−ピリミジン−２−イル〕−ア
ミノカルボニル）−ベンゼンスルホンアミド、または２
−（２−メトキシエトキシ）−Ｎ−（４，６−（ジメト
キンーｌ、３゜５−トリアジン−２−イル）−アミノカ
ルボニル〕−ベンゼンスルホンアミドである。好ましい
スルホニル尿素除草剤はＮ−ｏ−メトキシまたはエトキ
シカルボニルフェニルスルホニル−Ｎ′−（ジフルオロ
メトキシ置換ピリミジニル）−尿素、例えば５Ｕ８７２
と呼ばれる２メトキシカルボニル−Ｎ−ｆ［：４．６−
ビス−（ジフルオロメトキシ）−ピリミジン−２−イル
〕−アミノカルボニル）−ベンゼンスルホンアミド、お
よびＮ−ｏ−（２−メトキシ−または２−エトキシ−ニ
ドキシ）−フェニルスルホニル−Ｎ′−（メチルおよび
／またはメトキシ置換トリアジニル）−尿素、例えば５
Ｕ４６４と呼ばれる２−（２−メトキシエトキシ）−Ｎ
［（４，６−シメトキシー１．３．５−トリアジン−２
−イル）−アミノカルボニル〕−ベンゼンスルホンアミ
ドである。 イミダゾリノン除草剤は、例えば２−（２イミゾリニル
）−ピリジンまたは−キノリンおよびそれらの誘導体で
あり、例えば２−（５イソプロピル−５−メチル−４−
オキソ−２−イミダゾリニル）−ニコチン酸（イマザビ
ル）、２−（５−イソプロピル−５−メチル−４−オキ
ソ−２−イミダゾリニル）−３−キノリンカルボン酸（
イマザキン）、または５−エチル２−（５−イソプロピ
ル−５−メチル−４−オキソ−２−イミダゾリニル）−
ニコチン酸（イマダザリン）、およびそれらの酸付加塩
である。 トリアゾロピリミジン除草剤は、例えばＮ（２，６−ジ
クロロフェニル）−５，７−シメチルー１２．４−１リ
アゾロ［１，５−ａ）ピリミジン−２−スルホンアミド
またはＮ−（２−メチル−６−二トロフエニル）−５，
７ジメチルー１．２．４−１−リアゾロ〔１，５ａ〕−
ピリミジン−２−スルホンアミドである。 スルホニル尿素除草剤、特にＮ−ｏ−メトキシ−または
エトキンカルボニルフェニルスルホニル−Ｎ’−（ジフ
ルオロメトキシ置換ピリミジニル）−尿素除草剤例えば
５Ｕ８７２、Ｎ−ｏ−（２−メトキシ−または２−エト
キシ−エトキシ）−フェニルスルホニル−Ｎ’−（メチ
ルおよび／またはメトキシ置換トリアジニル）尿素除草
剤例えば５Ｕ４６４、またはＮ−。 （２−クロロエトキシ）−フェニルスルホニル−Ｎ′−
（メチルおよび／またはメトキシ置換トリアジニル）−
尿素除草剤例えばトリアスルフロンに耐性である植物細
胞が好ましい。 イミダゾリノン除草剤またはトリアゾロピリミジン除草
剤に耐性である植物細胞も同様に好ましい。 の　のム　ゴ 本発明はさらに、除草性アセトヒドロキシ酸シンターゼ
（ＡＨＡＳ）阻害剤に耐性である植物、種子およびその
他のムカゴ（ｐｒｏｐ五ｇｏｌｅ）に関する。特に本発
明は、前記耐性が前記植物細胞内において高められたレ
ベルのＡ　ＨＡ　Ｓ酵素により引き起こされる除草性Ａ
ＨＡＳ阻害剤に対して耐性である植物細胞を含何する植
物、種子およびその他のムカゴに関する。 植物はあらゆる種類の組織されたおよび分化した植物の
形態を意味し、小植物体、実生、植物胚および類似の形
態、また植物の部分、例えば葉、根、茎、花、花芽、果
実等を包含する。 ムカゴは、植物を増殖させるために使用し得る生殖およ
び栄養植物器官または組織からなり、例えば種子、塊茎
、茎または根切片、芽などである。ムカゴはまた、試験
管内で増殖させ得る並びにそれから試験管内培養および
マイクロプロパゲーション法により再生させ得るあらゆ
る細胞または組織を意味すると理解すべきである。 本発明の植物、種子およびその他のムカゴは上記したよ
うな除草性Ａｍ−ＩＡＳ阻害剤に耐性である植物細胞を
含有する。植物、種子およびその他のムカゴは完全に上
記の耐性植物細胞から構成されてもよいし、また該植物
、種子およびその他のムカゴに同時にまたはそれ以外で
除草性ＡＨＡＳ阻害剤に対する耐性を付与するには十分
な限られた数の耐性植物細胞から構成されてもよい。植
物、種子およびその他のムカゴが高度に分化され、そし
て異なる性質および特性を有する植物細胞からなるので
、全体の植物、種子およびその他のムカゴに除草剤耐性
を付与するためにこれらの全ての細胞が除草性ＡＨＡＳ
阻害剤に耐性であることは決して要求されない。 本発明の植物は単子葉または双子葉植物であってよい。 あらゆる植物が考慮されるが、特に経済価値のある栽培
植物、例えばヒトまたは動物の栄養のために生長させた
植物、有用な二次代謝物質の内容物のために生長させた
植物、繊維の内容物のために生長させた植物、樹木、観
賞価値のある植物等である。例えば、トウモロコシ（ノ
イズ）、小麦、大麦、イネ、モロコシ、サトウキビ、テ
ンサイ、ダイズ、プラッシカ、ヒマワリ、ニンジン、タ
バコ、レタス、キュウリ、トマト、ジャガイモ、ワタ、
アラビドプシス、ロリウム、フェストゥカ、ダクチリス
、またはポプラであるが、これらは本発明の範囲をなん
ら限定するものものではない。 本発明の好ましい植物、種子およびその他のムカゴは、
上記したような好ましい植物細胞を含有するものである
。 特に本発明は、高められたレベルのＡＨＡＳ酵素により
除草性ＡＨＡＳ阻害剤に対する耐性が引き起こされ、そ
して該ＡＨＡＳが野生型ＡＨＡＳの特性を有する植物細
胞を含有する植物、種子およびその他のムカゴに関し、
該ＡＨＡ　Ｓは例えば上記の除草性ＡＴ−１ΔＳ阻害剤
に感受性である植物細胞から誘導される。前記植物細胞
内の前記高められたレベルのＡＨＡＳ酵素は、少なくと
も２倍、特に少なくとも１０倍であることが好ましい。 前記高められたレベルのＡＨＡＳ酵素が内因性ＡＨＡＳ
コード配列の高められた発現に起因する、内因性ＡＨＡ
Ｓ遺伝子の多重コピーに起因する、または外因性ＡＨＡ
Ｓ遺伝子好ましくは野生型Ａ　ＨＡ　Ｓの特性を実質的
に有するＡＨＡＳをコードする外因性ＡＨＡＳｉｌ伝子
に起因する植物細胞を含有する植物、種子およびその他
のムカゴがさらに好ましい。 特にこのような好ましい植物、種子およびその他のムカ
ゴは、前記ＡＨＡＳの高められた発現を提供するプロモ
ーターに操作可能に連結した、前記植物細胞内で機能的
であるＡＨＡＳをコードするＤＮＡ配列からなるキメラ
ＤＮＡ構築物、または前記植物細胞内で機能的であるＡ
　ＨＡ　ＳをコードするＤＮＡ配列と移送ペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列とからなるキメラＤＮＡ構築物であ
って、該移送ペプチドコード配列は前記ＡＨＡＳの高め
られた発現を提供するプロモーターに操作可能に連結さ
れているキメラＤＮＡ構築物を安定に組み入れた植物細
胞を含有する。 好ましいプロモーターは化学的に調節可能なプロモータ
ーである。 Ｄ寸虹Ｎ湖じｕｌ− 本発明はさらに、遺伝子操作による上記植物細胞の調製
にを用な組換えＤＮＡに関する。特に本発明は、プロモ
ーターに操作可能に連結された野生型ＡＨＡＳをコード
するＤＮＡ配列からなり、該プロモーターは前記野生型
遺伝子内のＡＨＡＳに連結されたプロモーターとは異な
るキメラＤＮＡ構築物に関する。 組換えＤＮＡは天然に生じる遺伝子もしくはゲノムまた
は下記のキメラＤＮＡ構築物のＤＮ八から切り出され、
自然の環境から単離され、適当なりローニングベクター
内に導入され、そして宿主内で増幅されたＤＮＡである
。単離の技術、適当なりローニングベクターおよび宿主
は以下にさらに詳細に記載するであろう。 キメラＤＮＡ構築物はこの結合において天然には生じな
い異なるＤＮＡ断片からなるＤＮＡ配列である。キメラ
ＤＮＡ構築物内に結合されるＤＮＡ断片は同一種または
異なる種に由来してもよい。例えば、ＡＨＡＳをコード
するＤＮＡ断片はＡＨＡＳコード配列の高められた発現
を提供する同一種の別の遺伝子からのプロモーターを表
現するＤＮＡ断片に操作可能に連結されてもよい。しか
しながら好ましくは、ＡＨＡＳをコードするＤＮＡ断片
は、別の種例えば別の植物種、菌類、酵母もしくは植物
ウィルスからのプロモーターまたは合成されたプロモー
ターを含有するＤＮＡ断片に操作可能に連結されている
。合成されたプロモーターは、新たにヌクレオチドから
化学的に合成されたプロモーターまたはあらゆる有機体
に結合された形では存在しない合成または天然のプロモ
ーターからのヌクレオチド配列を２種またはそれ以上を
結合することにより一緒にスプライシングしたハイブリ
ッドプロモーターのいずれかである。プロモーターはキ
メラＤＮＡ構築物で形質転換される植物細胞内で機能的
でなければならない。 同一種または異種から誘導されたプロモーターは、野生
型ＡＨＡＳ遺伝子プロモーターの場合のように分岐鎖ア
ミノ酸により負に制御される代わりに、分岐鎖アミノ酸
生合成の回路により提示されるもの以外の内部または外
部の要因により、Δ１−Ｉ　Ａ　Ｓの一定の発現を提示
し得るか、または制御され得、特に特に正に制御され得
る。 プロモーター制御の外部要因は、例えば光、熱、または
化学物質、例えば無機塩例えば塩化物、亜硝酸塩、硝酸
塩またはアンモニウム塩特に亜硝酸塩ナトリウムまたは
亜硝酸塩アンモニウム、重金属、または有機化合物例え
ば有機酸特にサリチル酸、アセチルサリチル酸、安息香
酸、ナフトエ酸、フェニル−またはナフタレン−酢酸、
ベンゾチアジアゾールカルボン酸またはその他の芳香族
およびヘテロ芳香族酸、またはポリアクリル酸、および
上記酸の誘導体、特に塩例えばアルカリ金属、アルカリ
土類金属またはアンモニウム塩、およびエステル例えば
低級アルキルエステル例えばメチルおよびエチルエステ
ルである。 キメラＤＮＡ構築物に包含されるべきプロモーターの例
はカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）１９ｓま
たは３５Ｓプロモーターおよびダブルプロモーター、ツ
バリンシンターゼプロモーター、病原関連（ＰＲ）タン
パク質プロモーター、リブロースビスホスホネートカル
ボキシラーゼ（ｓ　ｓ　ｕＲＵＢ　Ｉ　５ＣＯ）プロモ
ーターの小サブユニット等である。 本発明のキメラＤＮＡ構築物はプロモーターの多重コピ
ーおよび／またはＤＮＡコード配列の多重コピーを含有
してもよい。さらに該構築物はマーカーのコード配列お
よびその他のペプチド例えばシグナルまたは移送ペプチ
ドのコード配列を包含してもよい。 有用なマーカーは抗生物質または薬剤耐性、例えばハイ
グロマイシン、カナマイシン、Ｇ４１８、ゲンタマイシ
ン、リンコマイシン、メトトレキセート、グリホセート
等に対する耐性を付与するペプチドである。これらのマ
ーカーは形質転換されていない細胞から本発明のキメラ
ＤＮＡ構築物で形質転換された細胞を選択するために使
用できる。その他の有用なマーカーは肉眼で見ることが
できる反応、例えば色反応により容易に検出できるペプ
チド性酵素、例えばルシフェラーゼ、β−１，３−グル
クロニダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼである。 シグナルまたは移送ペプチドは所望の作用部位に移送さ
せる能力を有する本発明のキメラＤＮＡ構築物の発現で
形成されるＡＨＡＳを提供する。本発明の移送ペプチド
に対する例は葉緑体移送ペプチドまたはミトコンドリア
移送ペプチドである。 本発明のキメラＤＮＡ構築物内のＡＨＡＳコード配列は
、植物例えばタバコ、トウモロコシ（メイズ）またはア
ラビドプシスから、または微生物例えば大腸菌もしくは
酵母から誘導され得る。そのようなＤＮＡ配列は上記の
除草性へ〇　Ａ　Ｓ阻害剤に耐性であるかまたは感受性
であるＡ　ＨＡ　Ｓをコードし得る。しかしながら、好
ましくは、該ＤＮＡ配列は感受性野生型ＡＨＡＳをコー
ドする。移送ペプチドのコード配列を含有するキメラＤ
ＮＡ構築物において、これらの配列は植物例えばタバコ
、トウモロコシまたはアラビドプシスから通常誘導され
る。好ましくは、移送ペプチドおよびＡＨＡＳコード配
列は同一植物から誘導される。 本発明の好ましいキメラＤＮＡ構築物において、プロモ
ーターは植物細胞内で機能的である。 特に、そのようなキメラＤＮＡ構築物は野生型ＡＨＡＳ
をコードするＤＮＡ配列とプロモロターに操作可能に連
結された移送ペプチドをコードするＤＮＡ配列とからな
り、該プロモーターは野生型遺伝子内のＡＨＡＳに連結
されたプロモーターとは異なるが、しかし植物細胞内で
機能的である。 プロモーター例えば病原関連（ＰＲ）タンパク質プロモ
ーターが例えば熱、光または化学物質により調節可能で
あるキメラＤＮＡ構築物が特に好ましい。カリフラワー
モザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５３プロモーターを含
むキメラＤＮＡ構築物がさらに好ましい。 好ましいキメラＤＮＡ構築物はまた、上記の除草性ＡＨ
ＡＳ阻害剤に感受性であるタバコまたはアラビドプシス
から誘導された野生型ＡＨＡＳのコード配列を含む構築
物である。同様に、トウモロコシ（メイズ）から誘導さ
れた野生型ＡＨＡＳのコード配列を含む構築物が好まし
い。 野生型Ａ　ＨＡ　ＳをコードするＤＮＡ配列と葉緑体移
送ペプチドをコードするＤＮＡ配列とからなるキメラＤ
ＮＡ構築物、例えば前記ＤＮＡ配列が除草性のＡＨＡＳ
阻害剤に感受性であるタバコまたはトウモロコシ（メイ
ズ）から誘導された構築物、および選択可能なマーカー
をコードする例えばハイグロマイシン耐性をコードする
ＤＮＡ配列を含むキメラＤＮＡ構築物が最も好ましい。 もう一つの実施態様において、本発明は野生型Ａ　ｌ−
Ｉ　Ａ　Ｓコード配列の多重コピー、例えば野生型Ａ　
ＨＡ　Ｓ遺伝子の多重コピーを含む組換えＤＮＡに関す
る。ＡＨＡＳコード配列は微生物例えば大腸菌もしくは
酵母から、または植物例えば上記のあらゆる植物例えば
アラビドプシス、タバコもしくはトウモロコシ（メイズ
）から誘導され得る。組換えＤＮＡは除草性ＡＨＡＳ阻
害剤に感受性であるＡＨＡＳを、または本発明の除草性
ＡＨＡＳ阻害剤に対しである程度の耐性を示す野生型Δ
ＨＡ　Ｓをコードし得る。 本発明の組換えＤＮＡ、例えば野生型遺伝子の多重コピ
ーを含む組換えＤＮＡまたは上記のキメラＤＮＡ構築物
を含む組換えＤＮＡは、クローニングベクター例えばプ
ラスミド、ファージＤＮＡ、コスミド、または宿主細胞
内で復製可能なその他のＤＮＡの形態であってよい。そ
のようなりローニングベクターは通常、コード配列およ
び予測できる様式のその他のＤＮＡコード化情報を扱う
ために決められた部位でベクターを切断することを可能
にする制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を単独
でまたは少数含有する。本発明の一つの面において、組
換えＤＮＡは植物細胞の形質転換のためのベクターであ
り、これは微生物例えば大腸菌および／またはアグロバ
クテリウム内で機能的な複製開始点を含んでいてもいな
（でもよい。組換えＤＮＡはまた植物の選択可能なマー
カー、例えばカナマイシン、ハイグロマイシン、Ｇ４１
Ｂ、ゲンタマイシン、リンコマイシンまたはメトトレキ
セート耐性のコード配列を含何してもよい。 多重コピーまたは野生型ＡＨＡＳコード配列、例えば除
草性ＡＨＡＳ阻害剤に感受性であるタバコまたはトウモ
ロコシ（メイズ）から誘導された遺伝子等を含む組換え
ＤＮＡが好ましい。 植物の選択可能なマーカー、例えばハイグロマイシン耐
性をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡがさらに
好ましい。 所望により微生物例えば大腸菌および／またはアグロバ
クテリウム内で機能的な複製開始点を含む、植物細胞の
形質転換のためのベクターである上記のキメラＤＮＡ構
築物からなる組換えＤＮＡが特に好ましい。 本発明はトウモロコシ、ゼア・メイズくｋＬｍｌＬ￥）
からの野生ｆｆ１ＡＨＡＳをコードするＤＮＡ配列を含
む組換えＤＮＡにさらに関する。 植物に除草性のアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ΔＨＡ
　Ｓ　）阻害剤に対する耐性を与えることができるキメ
ラＤＮＡ構築物の製造方法もまた本発明により包含され
、以下の段階：ｔａ）天然の供給源またはゲノムもしく
はｃＤＮＡライブラリーから野生型ＡＨＡＳをコードす
る第一のＤＮＡ成分配列を単離し、 ｔｂ）段階（ａｌの該ＤＮＡ成分配列を、野生型遺伝子
内の前記ＡＨＡＳに連結されたプロモーターとは異なる
がしかし植物内で機能的であるプロモーターに、それら
を同時にまたは引き続いて連結することにより操作可能
に連結する、ことからなる。 本発明はさらに、植物に除草性のアセトヒドロキシ酸シ
ンターゼ（ＡＨＡＳ）阻害剤に対する耐性を与えること
ができるキメラＤＮＡ構築物の製造方法にも関し、これ
は以下の段階：ｔａ）天然の供給源またはゲノムもしく
はｃＤＮΔＤＮＡラリーから野生型ＡＨＡＳをコードす
る第一のＤＮＡ成分配列を単離し、 （ｂｌ移送ペプチドをコードする第二のＤＮＡ成分配列
を単離し、 ｆｃ）段階＋ａｌおよび＋ｂ＋の成分配列を連結し、（
ｄｉ段階（Ｃ１の生成ＤＮＡ成分配列を、野生型遺伝子
内の前記ＡＨＡＳに連結されたプロモーターとは異なる
がしかし植物内で機能的であるプロモーターに、それら
を同時にまたは引き続いて連結することにより操作可能
に連結する、ことからなる。 の　　　　　　　　　　　　　の 本発明のその他の面は、 ＋ａｌ野生型植物細胞を増加する量の除草性ＡＨＡＳ阻
害剤の存在下で培養し、 ｔｂ）段階（ａ）からの生き残りの植物細胞を前記除草
性ＡＨＡＳ阻害剤の存在下で継代培養し、ｆｃ１段階ｆ
ｂｌで得られた植物細胞を、野生ｆｆ１ＡＨＡＳ特性を
実質的に有するＡＨＡＳの存在およびＡＨＡＳ酵素の高
められたレベルに対して分析し、そして ＋ｄ１段階１ｃＩに記載した所望の特性を有する植物細
胞を選択し、そして培養する、 ことからなる上記の植物細胞の調製方法である。 細胞は懸濁培養液または固体培地中で培養され得る。培
養培地は当該分野で公知の培地であり、そして塩、緩衝
剤、ビタミン、糖、および所望によりその他の成長調節
化合物例えばホルモン、または付加的な栄養物例えばア
ミノ酸を通常含有する。好ましい培地は実施例に記載し
たものであり、例えばＴ、　Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ等、Ｐ
ｈｙｓｉｏｌＰｌａｎｔ、１５：４７３−４９７（１（
１６２）、に、Ｎ、Ｋａｏ　　等、Ｐｌａｎｔａ１２６
：１０５−１１０＜１０７５＞およびＣ−Ｃ，Ｃｈｕ等
、５ｃｉｅｎｔｉａ　５ｉｎｌｃａ　１８：６５９（１
９７５）に記載されているものである。 例えば懸濁培養のためには、２５−５０−の培地には１
００−のエルレンマイヤーフラスコが、または５０−１
００−の培地には２５〇−のフラスコが使用される。フ
ラスコには１−１０日間前生長させた細胞培養液１−２
５ｍ／が接種される。細胞は暗所または明所のいずれか
で、好ましくはオービタルシェーカー上５５０−２０Ｏ
ｒｐ　　（動程２−５ｃｍ）で、２０−３０℃で培養さ
れる。一部の試料を新鮮な培地に接種することにより、
または５０と９５％の間の細胞懸濁液をデカンテーシヨ
ンもしくはピペットで除去し次いで新鮮培地を再び満た
し所望の容量の懸濁液とすることにより、細胞は３−１
Ｏ日間隔（通常７日）で継代培養される。 培養条件は特定の植物の属および種に対しておのおの適
用されなければならない。例えば、トウモロコシ（メイ
ズ）の胚形成性組織培養物の製造方法は、当該分野で公
知であり、そして適当に使用され得る。しかしながら、
異なるトウモロコシの遺伝子型はそれらの培養応答およ
びそれらの特定の培養要件において広範囲に相違するこ
とが見出された。それ故に、各々のトウモロコシの遺伝
子型に対して有効な培養条件を決定することが必要であ
る。このことは優良トウモロコンの遺伝子型、例えば優
良トウモロコシ近交系の場合に特に真実である。 例えば、胚形成性カルスは、約１．５−２．５　ｏｈｍ
の長さの胚を含む受粉的ｔｏ−ｔａ日後の自家受粉され
た植物から穂軸を収穫し、穀粒から胚を除去しそしてそ
れらを胚軸を下方に向けて固化された培養培地上に置く
ことにより、トウモロコシ杯盤組織から調製される。植
物を生長させる農地または温室のいずれかが使用される
。 培地は胚形成性カルスの誘導に適した当該分野で公知の
ものの一つであってよく、例えばＭＳ（Ｔ、　Ｍｕｒａ
ｓｈｌｇｅ等、同上；　Ｒ，Ｕ、　５ｃｈｅｎｋ等、　
Ｃａｎａｄ、　Ｊ。 Ｂｏｌａｔ＋ｙ　５０：１９９−２０４．１９７２　）
　、ＫＭ　（Ｋ、Ｎ、にａ。 等、同上）　、Ｎ　６　（Ｃ−Ｃ，Ｃｂｕ等：Ｐｒｏｃ
ｅｅｊｉｎｇｓ　ｏｆＳｙｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｐｌａ
ｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、ｐｐ、４３−５
０゜５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、１
９７８）　、　Ｄ（Ｄｕｎｃｕｎ等。 Ｐｌａｎｔａ　１６５：３２２−３３２．１９８５）ま
たは当該分野で公知のその他のもの、またはそれらを改
良したものが使用できる。培地はオーキシン型の生長調
節剤を１種またはそれ以上含有するが、それらは例えば
２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、３．
６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸（ジカムバ）、４
−アミノ−３゜５．６−１リクロロー２−ピリジンカル
ボン酸（ビクロラム）、ｐ−クロロフェノキシ酢酸（ｐ
ＣＰＡ）、２，４．５−トリクロロフェノキシ酢酸（２
，４，５−Ｔ）、３−アミノ−２５−ジクロロ安息香酸
（クロラムベン）または２−メチル−４−クロロフェノ
キシ酢酸（ＭＣＰＡ）であり、濃度は胚形成性カルスを
誘導するのに適当な濃度で、例えば０．Ｏｌないし１０
Ｈ／　ｌ、好ましくは約２ｍｇ／ｌである。好ましい生
長調節剤は使用される遺伝子型に依存する。優良近交系
２１１Ｄ、８Ｎ８１０．２７１７．５Ｎ９８４　　［フ
ァンク・シーズ・インターナショナル（Ｆｕｎｋ　５ｅ
ｅｄｓ　Ｉｎｔｅｒｎａ目ｏｎａｌ）　　ノースカロラ
イナ州グリーンズボロー〕に対して好ましい生長調節剤
は２．４−Ｄである。優良近交系２７３　Ｙ（Ｆｕｎｋ
　５ｅｅｄｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に対して
好ましい生長調節剤はｐＣＰＡである。優良近交系２７
４に対して好ましい生長調節剤はジカムバである。培地
は適当なゲル化剤、例えばノープル・アガー、デイフコ
・バクト・アガー、デイフコ精製アガー、フィトアガー
または登録商標ゲルライトで固化される。培地の炭水化
物濃度は遺伝子型の要求に応じて２ないし１２％の範囲
であり得る。好ましい炭水化物はショ糖である。還元窒
素と酸化窒素の量と比率は使用される遺伝子型に応じて
変更され得る。大量および少量の塩、ＦｅＥＤＴＡおよ
びビタミンに加えて、培地はその他の促進補足剤、例と
してアミノ酸例えば胚形成性カルスの形成を促進するた
めのカサミノ酸（１００−２００ｍｇ／ｌ）またはプロ
リン（１０−１５０１！ｌ閘）を含有してもよい。各々
の補足剤および変更は培養される各遺伝子型に要求され
るように使用される。 トウモロコシの懸濁培養液の調製のために、ゼア・ノイ
ズ植物、例えば優良近交系Ｆｕｎｋ２７１　？　（Ｆｕ
ｎｃ　５ｅｅｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の自家
受粉植物の胚を含有する未熟実が殺菌され、そしてカル
ス形成には当該分野で公知の適当な開始培地上で平板培
養される。カルスは、特徴的な形態により同定される所
望のタイプのカルス、すなわち液体培地内に移して小さ
い個々の細胞集合体に分離される非粘着性で球状でそし
て非常に砕けやすいタイプのカルスの誘導形成を行う異
なるタイプの培地上で継代培養されてもよい。そのよう
なカルスは延長された期間、通常３力月またはそれ以上
例えば６力月間継代培養される。懸濁液中で好ましくは
室温、例えば２６℃で、暗所内回転（、んとう機または
類似の装置上での継代培養後、これらの培養物だけが多
数の膨張した細胞を示さないままである。好ましい組織
は通常のタイプの細胞集合体より特徴的により平滑な表
面を有しそして１週間より少ない倍加時間である増殖速
度を有する密集した細胞質分割細胞集合体からなる。最
良の形態を示す細胞を継代培養のために常に選択するこ
とにより系は維持される。そのような好ましいゼア・メ
イズ懸濁培養物は上記のようにアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションに寄託されている。 その他の培養条件は当該分野では公知であり、そして適
当に使用され得る。 別の致死濃度の除草性ＡＨＡＳ阻害剤に耐性である細胞
を得るために、細胞は感受性の野生型細胞のほとんどの
増殖を阻害するには十分な阻害剤の存在下で培養される
。 通常培養された細胞は新鮮な培養培地で希釈されて、細
胞ブレーティングに適当な細胞濃度とされる。希釈に使
用される培養培地は阻害剤を所望の濃度で含有してもよ
い。ブレーティングのために小容量の培地中の細胞が適
当な濃度で阻害剤を含有する固化培養培地の表面上に均
等に拡散される。適当な阻害剤濃度は服量反応曲線から
決定され、そして感受性野生型細胞のＩＣ，。（５０％
阻害濃度）に比べ少なくとも２倍高い。 選択培地上に分散された細胞を含有する培養プレートは
適当な増殖条件、例えば１８−３２℃好ましくは２５−
２８℃、暗所中または細胞コロニーが形成されるまで明
所中のいずれかで培養される。細胞コロニーが現れたら
、所望濃度で阻害剤を含有する新鮮な液体または固化培
地に移す。 前生長させた懸濁培養細胞はまず最初に固化培地の表面
上で小容量の液体培地中に懸濁されてもよい。はぼ等容
量の温かい液体アガーまたはアガロース培地（１，２−
１，６％アガーまたはアガロース）またはその他の適当
な固化剤例えば登録商標ゲルライトを約３８−４４℃（
ゲル化剤の同化温度に応じて）で溶解した状態に保ち、
これを添加し、そしてこのプレートをゆっくりとしかし
すぐに回転させて培地表面上に均一に細胞を分散させ、
そして培地が固化する前に細胞とアガー培地を混合する
。 また、細胞は選択培地の表面に分散させる前に溶解した
アガー培地と混合される。培地は所望濃度で阻害剤を含
有してもよい。この方法は細胞が選択培地の表面上の固
化培地の薄層に積層されそして固定化される利点を有す
る。この方法は１Ｏｒｓのベトリ皿当たり全容量２０−
３０−内に細胞を留めるのに比べ、細胞のより良好な通
気を可能とする。 さらにまた、除草剤耐性細胞は液体選択培地中で選択さ
れてもよい。予め培養された細胞は所望濃度の除草性Ａ
ＨＡＳ阻害剤を含有する液体培地内に適当な細胞密度で
接種される。細胞は増殖速度に応じて適゛当な時期に、
２日ないし６週間、好ましくは７−１Ｏ日の後に所望濃
度の阻害剤を含有する新鮮培地を用いて継代培養される
。 液体もしくは固体培地または細胞懸濁液を調製するため
に用いられるあらゆる培地は除草性ΔＨＡ　Ｓ阻害剤を
所望濃度、すなわち服量反応曲線から決定される濃度、
例えば２０　ｐｌ）ｂ、　５０　ｐｐｂ、　　ｔｏｏ　
ｐｐｂ、　５００　ｐｐｂ、　　１０００　ｐｐｂ等で
含有してもよい。 除草性ＡＨＡＳ阻害剤は上記除草剤のいずれでもよく、
例えばスルホニル尿素除草剤、イミダゾリノン除草剤ま
たはトリアゾロピリミジン除草剤、特に上記スルホニル
尿素の一つ、例えば５Ｕ８７２．５Ｕ４６４またはトリ
アスルフロンであってよい。 使用される除草剤濃度に応じて、細胞生長は阻害剤の不
在の場合に比べ相当に遅くなるであろう。 高められたレベルのＡ　ＨＡ　Ｓ阻害剤除草剤に耐性を
有する細胞培養体を得るために、除草剤の存在下でプレ
ートされた細胞または生長させた懸濁液から発生した細
胞コロニーを段階的に、例えば徐々に１度が高くなる除
草剤、例えばスルホニル尿素除草剤、特に上記スルホニ
ル尿素の一つ、例えば５Ｕ８７２．５Ｕ４６４またはト
リアスルフロンに移す。各段階での除草剤濃度の増加は
２ないし５倍であってよい。細胞を次いで、それらを次
のより高い濃度の除草剤に移す前に、ある高められた除
草剤濃度で１−１０回継代培養で生長させる。細胞コロ
ニーをさらに高濃度の除草剤に移す操作は、非常に高い
除草剤濃度で十分に増殖する細胞が得られるように、１
−１０回繰り返される。 さらに、広い範囲の耐性を有する除草剤耐性細胞は２．
３またはそれ以上の異なる除草剤での選択により得られ
うる。異なる除草剤は混合物として使用され得る。しか
しながら、細胞を単一の除草剤を含有する培地中でまず
増殖させ、次いで第２の除草剤を含有する培地に移す、
例えば上記濃度でＳＵ４６４を含有する培地中で最初に
、次に上記濃度で５Ｕ８７２を含有する培地中で行うこ
とが好ましい。特に、細胞を一除草剤の存在下で増殖さ
せ、段階的な方法で徐々に増加する濃度の同一除草剤を
含有する培地に移し、次に低い濃度の別の除草剤を含有
する培地に移し、そして最後に徐々に増加する濃度のこ
の第２の除草剤の存在下で増殖させる。次の除草剤濃度
および／または次のタイプの除草剤に移す前に細胞は１
−１Ｏ回継代培養されてもよい。 特定の方法は除草性ＡＨＡＳ阻害剤に耐性のトウモロコ
シ（メイズ）細胞培養物を選択するために用いられる。 いずれかの方法が使用されるトウモロコシの遺伝子型の
培養特性および特定の要求に応じて使用される。好まし
くは、優良トウモロコシ生殖質の近来系が使用されるが
、しかし操作はトウモロコシ変種または雑種に対して同
等に適用可能である。培地および培養条件は培養された
近交の各々のトウモロコシに対して決定され、そしてそ
の遺伝子型の特定の培養要求に従って使用される。培地
および培養条件の適当な例は上記のものである。 例えば選択は胚形成性カルスで行われてもよい。この操
作は例えば優良近来系８Ｎ８１０゜２７１７．５Ｎ９８
４および６Ｎ６１５　（ＦｕｎｋＳｅｅｄｓ　Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ）で行われる。選択の出発材料とし
て■型または■型のいずれかの形態の胚形成性カルスを
使用する。■型および■型の形態の胚形成性カルスは当
該分野で公知である（Ｃ，Ｅ、　Ｇｒｅｅｎ等著：に、
Ｄｏｗｎｅｙ等編Ａｄｖａｎｃｅ　Ｉｎｇｅｎｅ　ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙの中のＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｇｅｎｅ
Ｈｃｓ　。 ｆ　ｐｌａｎｔｓ　ａｎｄ　ａｎｉｍａｌｓ、Ｍｉａｍ
　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ２０：１４７−１
５７．八ｃａｄｅａ＋ｌｃ　Ｐｒｅｓｓ、　　ニューヨ
ーク。 １．９８３）。胚形成性カルスは上記の未熟接合胚から
開始されるか、またはその他の適当な外植片、例えば原
基の房（ｔａｓｓｅｌ　ｐｒｉｍｏｒｄｌａ）または葉
の基部組織から開始され、そして増殖させて選択に十分
な量のカルスを生成する。 選択のために、胚形成性カルスは適当量の生長調節剤、
例えばオーキシン型生長調節剤例えば２．４−Ｄおよび
適当濃度の除草性ＡＨＡＳ阻害剤を含有するカルス維持
培地に移される。 カルス維持培地の組成は使用されるトウモロコシ遺伝子
型の特定の生長要求に従って選択される。選択に有用な
阻害剤濃度は、種々の量の阻害剤を含有する培地上で胚
形成性カルスを培養し、そして生長応答を測定すること
により決定される。有用な阻害剤濃度は上記の除草性Ａ
ＨＡＳ阻害剤例えば除草性スルホニル尿素例えば５Ｕ８
７２　５Ｕ４６４またはトリアスルフロンの１と１００
　ｐｐｂの間である。好ましい阻害剤は５Ｕ８７２であ
る。有用な阻害剤濃度は胚形成性カルスの生長を７０−
９０％に阻害する濃度である。多（の培養物の速度を越
える速度で生長するカルスを同一組成の新鮮培地に移す
。 所望の胚形成性の形態を有する培養物だけが継代培養さ
れる。 １週間または２週間毎に阻害剤を含有する新鮮培地上で
１回ないし数回培養物を継代培養し、これにより最も速
く生長する培養物だけを継代培養する。カルスをより高
い１度の除草剤を含有する培地に移す前に、ある量の除
草剤を含有する培地上でこのカルスを１回または数回継
代培養のために生長させてもよい。除草剤の濃度は移し
変える毎に２ないし３の因数で徐々に増加する。培養物
をこの除草剤濃度で十分に生長させたら、それらを次の
より高い濃度に再び移す。より高い選択レベルへのこの
段階的移し変えは、所望レベルの耐性が得られるまで数
回繰り返される。十分なカルスが生成されたら、それを
以下に記載の胚成熟および植物再生に適当な培地に移す
。 再生可能な懸濁培養物を形成するトウモロコシ遺伝子型
を有する胚形成性トウモロコシ懸濁培養物を用いて選択
を行うこともできる。この操作は例えば優良近来系２７
１７および５Ｎ９８４　（Ｆｕｎｋ　５ｅｅｄｓ　Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に使用される。 胚形成性懸濁培養物は実施例に記載したように作成され
、そしてそれらは週毎の新鮮培地への継代培養により維
持される。この培地は所望の砕けやすい胚形成性培養物
の形態を維持するために適当な生長調節成分を含有する
。好ましい培地は１−１００■／１２，４−Ｄを含有す
るかまたは生長調節剤として上記のような関連化合物を
含有する液体培地に基づいたＭＳまたはＮ６である。 選択のために適当量の除草性ＡＨＡＳ阻害剤が培地に添
加される。適当な除草剤濃度は種々の量の除草剤が補足
された培地中で細胞を培養し、そして培養物の生長応答
を測定することにより決定される。適当な除草剤濃度は
培養物の生長を少なくとも５０％に減少させる濃度であ
る。この操作に従って、０．１ないし＋　００　ｐｐｂ
の上記除草性Ａ　ＨＡ　Ｓ阻害剤、例えば除草性スルホ
ニル尿素例えば５Ｕ８７２が選択のために使用される。 胚形成性懸濁培養物に使用される適当な除草剤濃度は、
異なる培養タイプが阻害剤に対する感受性において異な
っていてもよいように、同一トウモロコシ遺伝子型の胚
形成性カルスで使用される濃度と異なっていてもよい。 培養物を阻害性除草剤を含有する培地中で１回ないし数
回継代培養のために生長させる。培養物が除草剤の存在
下で十分に生長することが明らかになったら、それらを
より高濃度の除草剤を含有する培地に移す。この濃度は
前に使用された濃度の通常２倍ないし３倍である。より
高い除草剤濃度で十分に生長する培養物を、このより高
い除草剤濃度の除草剤の存在下で１回ないし数回継代培
養し、そして次いで次のより高いレベルの除草剤に移す
。培養物がこの除情剤濃度で十分に生長しているとき、
それらを次のより高い濃度に移す。より高い選択レベル
へのこの段階的移し変えは、所望のレベルの耐性が得ら
れるまで数回繰り返される。十分な細胞塊が形成された
ら、以下に記載の胚成熟および植物再生に適当な固化培
地上にブレーティングする。 選択方法の有効性を評価するために、異なる濃度の除草
剤での細胞の生長の服量反応曲線が決定される。除草剤
感受性の野生型の懸濁培養細胞と除草剤耐性選択細胞を
適当なフラスコ内に含有された所望の除草剤濃度の液体
培地の適当量内に接種するが、この特番フラスコに同量
の細胞が接種されるように注意する。各フラスコは等し
い容量の培地を含有する。除草剤温度当たり数本の同様
のフラスコに接種する。除草剤１度はゼロ（＝対照）か
ら耐性細胞がさらに生長しない濃度まで選択される。通
常除草剤濃度は数百倍で使用される。広範囲の濃度を橋
わたしするために、対数尺度、例えばＯ，Ｉ　−０，３
１，０−３，０−１０−３０−１００−３００−１００
０−３０００−１００００ｐｐｂが使用される。接種さ
れた細胞の種々の試料はまた接種の時間に採取され、フ
ラスコ当たりの接種された細胞の塊を決定する。細胞を
次に温度および光が調製された条件で数日間生長のため
に培養する。細胞を集め、そして細胞の新鮮な塊の重量
を測定する。細胞の生長を測定し、そして予め決められ
た時間例えば１０日間の細胞の新鮮な塊の増加量として
表し、そして除草剤の不在下で生長させた細胞の塊に対
する百分率として表す。ＩＣｓ。値、細胞生長が対照の
生長の５０％である除草剤濃度は除草剤濃度に対する相
対的な細胞塊のプロットされたデータのグラフから決定
される。 投与量依存生長はまた異なる濃度の除草剤を含有する固
化培養培地に移された除草剤耐性細胞培養物から誘導さ
れたカルス片を用いて測定されてもよい。相対的な生長
は適当な培養期間、例えば２−６週間後にカルス片のｆ
ｆ１ｆｆｌを測定しそして除草剤なしの培地中で生長し
た対照培養物と比較することにより決定される。 細胞懸濁培養物を用いる方法がより正確なので好ましい
。 細胞が類似のまたは完全に異なる除草剤に交差耐性を示
す範囲を決定するために、服量反応曲線が各々の選択さ
れた増加する濃度の除草剤中で細胞を生長させることに
より得られる。細胞の相対的生長およびＩＣ＆。値は比
較のための各除草剤に対して決定される。再び交差耐性
がカルス培養物に関して決定されてもよいが、しかし細
胞懸濁培養物を用いる方法がその正確さのために好まし
い。 細胞培養物の除草剤耐性の表現型が長（維持されるかど
うかを決定するために、細胞は除草剤含有培地から除草
剤非含有培地に移される。 細胞は１週間ないし数ケ月例えば３−１８ケ月の期間除
草剤の不在下、適当な間隔で通常の継代培養、例えば懸
濁培養を７−１Ｏ日間またはカルス培養を３−６週間行
って生長させる。ある与えられた時点で、既知の量の細
胞を除草剤含有培地に戻し、そして適当な期間例えば１
０日（懸濁培養）または４週間（カルス培養）培養する
。相対的な生長を上記のように決定する。 この操作は異なる期間、例えば３ないし１８ケ月除草性
Ａ　Ｉ−Ｉ　Ａ　Ｓ阻害剤の不在下で生長させた培養物
で繰り返す。 鼠仇Ω丘ｉ耘表 本発明はさらに、あらゆる種類の植物材料が組換えＤＮ
Ａで形質転換されるＬ記のような植物細胞の調製方法に
関する。 植物材料のアグロバクテリウム］ｌ創ｂ」工１ＵＳ）感
染により、プロトプラスト内への直接遺伝子移送により
、マイクロ発射砲撃（ｓａｉｅｒｏｐｒ。 ｊｅｃｔｉｌｅ　ｂｏｍｂａｒｄａ＋ｅｎｔ）により植
物細胞の形質転換により、またはＤＮＡの注入により、
植物は形質転換される。これらの方法は当該分野で公知
であり、そして適宜適用される。 例えば、単離された植物プロトプラストは、Ｌ、Ｍａｒ
ｔｏｎによりＣｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｓｏ
ｍａｔｉｃ　ＣｅＩｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｐｌ
ａｎｔｓ、Ｖｏｌ、１：５１４−５２１（＋９８４）に
記載されたような外来ＤＮＡ配列を含有するアゲロバク
チリアと共培養されてもよい。トラ゛ンスジエニック細
胞コロニーおよびカルスは選択され、そしてトランスジ
ェニック植物が当該分野で公知の以下の確立された操作
で得られる。 適当な操作が使用される植物種に応じて選択され得る。 また、所望の外因性ＤＮＡは以下の刊行物に記載の方法
に従ってプロトプラスト内に導入されてもよい：　Ｊ、
　Ｐａｓｘｋｏｗｓｋｉ等、ＥＭＢＯＪ、３：２７１７
（１９８４）　；英国特許出願ＧＢ　２１５９１７３；
欧州特許出願ＥＰ　１２９６６８；　Ｒ，Ｄ、５ｈｌｌ
ｉｌｏ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３：１０９
９（１９８５）　；　１．　Ｐｏｔｒｙｋｕｓ等、　Ｍ
ｏ　１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅ　１．　ｔ。 ９：　１８３（１９８５）。 穀物および草類のプロトプラスト内への直接遺伝子移入
のために、以下の参考文献に記載の方法が使用され得る
：　Ｉｌ、　Ｌ６ｒｘ等、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ
。 １９９：１７８（＋り８５）・Ｍ、Ｅ、Ｆｒｏｍｍ等、
Ｎａｔｕｒｅ　３１９ニア１９（＋０８６）；英国特許
出願Ｇｅｌ　２１４０８２２．および１．　ＮｅＨｒｕ
ｔｉｕ等、Ｐｌａｎｔ　　Ｍｏ１．Ｂｌｏｌ、８：３６
３（］！’＋８７）　　。 外因性ＤＮＡは、例えば裸の線状、環状または超らせん
ＤＮＡ、　リポソーム内に内包されたＤＮＡ、スフェロ
プラスト内のＤＮＡ、その他の植物プロトプラスト内の
ＤＮＡ、塩と複合［。 たＤＮＡ等のあらゆる形態でプロトプラストに添加され
てもよい。 植物細胞内に外来ＤＮＡ配列を導入するもう一つの方法
は、加速装置による植物細胞内に強制的に送られる粒子
ｌ＼の前記ＤＮＡの付着からなる（Ｔ、　Ｍ、に１ｅｉ
ｎ等、同上；Ｄ、　Ｅ、　ＭｃＣａｂｅ等、Ｂｉｏｊｅ
ｃｈｎｏｌｏｇＶ　６：９２３−９２６．１９８８）。 あらゆる植物組織または植物器官がこの方法の標的とし
て使用され得、胚、頂芽およびその他の分裂組織、芽、
試験管内および生体内の体細胞および生殖組織を包含す
るがこれに限定されない。トランスジェニック細胞およ
びカルスは当該分野で公知の以下の確立された方法で選
択される。標的とされた組織は、当該分野で公知の以下
の確立された方法で、不定胚を形成するか、または苗条
を再生するように誘導されて、トランスジェニック植物
が得られる。適当な方法が使用された植物種に応じて選
択され得る。 ＤＮＡの植物細胞内への移送はまた、米国特許第４７４
３５４８号およびＴ、　Ｊ、　Ｒｅ１ｅｈ等、Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４：１００１−１００４（１９
８６）　：Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｂａｔ、　６４；１２５９
−１２６７（１９８６）に記載されたような単離された
プロトプラスト、培養細胞および組織内への注入により
、モしてＡ、Ｄｅ　Ｌａ　Ｐｅｎａ等、　Ｎａｔｕｒｅ
　３２５：２７４２７８（１９８７）、　Ａ、　Ｃ，Ｇ
ｒａｖｅｓ等、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏ＋。 ７：４３−５０（１９８６）、　Ｇ、　ＩＪ、　Ｓ、　
Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ　Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ等、Ｎ
ａｔｕｒｅ　３１１ニア６３−７６４（１９８４）、に
ｒｉｍｓｌｅｙ等。 Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１８５（１９８８
）およびＧｒｉｍｓｌｅｙ等。 Ｎａｔｕｒｅ　３２５：１７？（１９８？）により記載
されたような実生および植物の分裂組織内への注入によ
り行われる。トランスジェニック植物およびそれからの
後代は当該分野で公知な慣用方法により得られる。 再生された植物は組み入れられた外来ＤＮＡに関してキ
メラであってよい。外来ＤＮＡを含有する細胞が小胞子
または大胞子のいずれかに生長したならば、組み込まれ
た外来ＤＮＡは有性の後代に伝達されるであろう。外来
ＤＮＡを含有する細胞が植物の体細胞であるならば、生
体内すなわち芽または茎挿し木、または試験管内すなわ
ち当該分野で公知の以下の確立された方法のいずれかで
植物増殖の慣用方法により非キメラのトランスジェニッ
ク植物が作成される。 そのような操作は使用された植物種に応じて選択され得
る。 特に、タバコ葉ディスクが以下の方法でアグロバクテリ
ウムで形質転換され得る：タバコ内に形質転換されるべ
き所望の遺伝子を含有するアグロバクテリウム・チュメ
ファシエンス島肛ｂａｃ　ｅ　’　　　　ｆａｃ’ｅ　
　）の異なる遺伝子型を当該分野で公知のアグロバクテ
リウム最小培地上で生長させる。５−７閣の葉ディスク
を試験管内で培養されたタバコから無菌的にくり抜き、
そしてＲ，Ｈａｒｓｈ等、５ｃｉｅｎｃｅ　２２７：１
２２９−１２３１＜１９８５）に実質的に記載されたよ
うに、バクテリア懸濁液内に数分間浸漬する。葉ディス
クを次に、アグロバクテリウムを殺すための適当な抗生
物質例えばカルベニシリン、カナマイシン、ハイグロマ
イシン、バンコマイシン、メツオキシンもしくはその他
または上記の抗生物質の組合せを含有する苗条誘導性培
地上の口紙に移す。葉ディスクをさらに、除草量のＡＨ
八へ阻害剤、例えばスルホニル尿素除草剤例えばトリア
スルフロン、５Ｌ１４６４またはＳＵ８７２をさらに含
有する液体または好ましくは固体の苗条誘導性生長培地
に移す。除草性ＡＨＡＳ阻害剤の濃度は上記の服１反応
曲線により決定されるような有効な範囲、例えば１０と
ｔ　ｏ　ｏ　ｐｐｂＯ間の５Ｕ８７２である。抗生物質
の濃度は全てのアグロバクテリウムを実質的に殺すよう
に選択され、例えばカルベニシリン、バンコマイシンま
たはメツオキシンに対してはｌｏｏと５０００■／１の
間であり、好ましくは約５００■／ｌであり、カナマイ
シンに対しては１０と１０００■／１の間であり、好ま
しくは約１００■／ｌであり、そしてハイグロマイシン
に対しては５と１００■／１の間であり、好ましくは約
２０■／１である。 また、トランスジェニックカルスは除草性へ〇　Ａ　Ｓ
阻害剤以外の選択剤を用いて選択される。 この方法における選択剤の選択は、形質転換において使
用されたアグロバクテリウム内に含有されたベクター構
築物内の耐性遺伝子により命令される。例えば、ベクタ
ー構築物がカナマイシン耐性遺伝子を含む場合には、所
望のトランスジェニックカルスおよび苗条は約５０と２
゜θ■／ｌの間のカナマイシンを含有する培地を用いて
選択される。ベクター構築物が１１イグロマイシン耐性
遺伝子を含む場合には、約２０と１００■／ｌの間のハ
イグロマイシンを含有する培地が用いられる。除草性Ａ
）ＩＡＳ阻害剤に対する耐性の発現は上記選択剤により
予め選択された組織上で後に試験される。 上記選択培地のいずれかの上で培養組織から生じる苗条
は小植物発育を誘導する培地に移される。好ましくはこ
の培地はまた、除草性ΔＨＡｓ阻害剤を上記有効濃度で
、例えば約１００１１ｐｂの５Ｕ８７２を、そして所望
する場合にはアグロバクテリウムを殺す上記抗生物質を
好ましくは上記の１度で含有する。小植物発育は少なく
とも３週間続けられる。小植物は分化して、発育しそし
て根づくことが可能である種々の挿し木を与え得る。根
づいた小植物を次に土−バーミキュレート混合物に移植
し、そして温室に移動し、そして全体の植物に生長させ
る。 所望の遺伝子は当該分野で公知の方法により形質転換の
ために使用されるアグロバクテリウム内に誘導される。 例えば適当なシャトルベクターは大腸菌Ｓ　Ｍ　１７　
（Ｒ，５ｌａｏｎ等、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ。 １ｏｇｙ　１ニア４−７５．１９８３）からアグロバク
テリウム・チュメファシエンス株に交配により移送され
てもよい。また、ベクターがアグロバクテリウム・チュ
メファシエンス内に交配により形質転換されてもよい。 また、ベクターはアグロバクテリウム・チュメファシエ
ンス株内にＭ、Ｈｏ１ｓｔｅｒ等、同上の方法により形
質転換されてもよい。 適当なアグロバクテリウム・チュメファシェンス株は例
えばプラスミドのカナマイシンマーカーがＴｎ７のスペ
クチノマイシン／ストレプトマイシン部分で置換された
ＥＨＡＩＯＩ株の誘導体（Ｅ、　ｆｌｏｏｄ等、　Ｊ、
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６８：１２９１−１３０１
゜１９８６）である。 トウモロコシ（メイズ）の形質転換のためには以下の方
法が好ましい：トウモロコシプロトプラストを細胞懸濁
培養物、例えば上記の懸濁培養物から調製する。この懸
濁培養物を細胞壁を消化する適当な酵素混合物内でイン
キュベートする。そのような酵素混合物は当該分野で公
知である。消化は酵素の型および量に応じて、例えば数
時間ゆっくり揺れるテーブル上、約３０℃で行われる。 調製は好ましくはプロトプラスト放出を倒立顕微鏡でモ
ニターする。プロトプラストを、好ましくは適当な孔径
のふるい、例えば１００μｍおよび／または５０μｍメ
ツシュのふるいを通しての口過により集め、洗浄し、そ
して塩溶液好ましくは塩化カリウム、マグネシウムおよ
びカルシウムの緩衝化溶液中で条件を整え、そして最後
に形質転換のための緩衝化マグネラム塩溶液中に懸濁す
る。 エレクトロポレーションによるトウモロコシプロトプラ
ストの形質転換は、数分間例えば５分間約４５℃の熱シ
ョックにプロトプラストを晒し、次に氷で室温まで冷却
することにより行われ得る。熱シヨツク処理は好ましい
が必須ではない。所望のＡＨＡＳ遺伝子構築物および所
望の場合にキャリアーＤＮＡ例えば子ウシ胸腺ＤＮＡを
含有する線状化プラスミドはプロトプラスト懸濁液に添
加される。マグネシウム塩および場合によってはその他
の添加剤、例えば糖または糖アルコール例えばマンニト
ールを含有する１０と４０％の間の濃度および２０００
とｔｏｏｏｏの間の分子量を有する水性ポリエチレング
リコール溶液がプロトプラストに添加される。この混合
物は十分にしか（、ゆっくりと混合され、そして数分間
例えば１０分間インキュベートされる。しかしながら、
ポリエチレングリコール溶液とのインキュベーションは
エレクトロポレーションの前には省略されてもよい。 試料をエレクトロボレーターのチャンバー内に移し、そ
して該試料に数秒間隔で２ないし５回、例えば１０また
は３秒間隔で３回、＋０００と２８００Ｖｃｍ’の間の
初期電圧、および約１０μｓｅｃの指数関数的減衰時間
でパルスを与える。 場合によってはプロトプラストはエレクトロポレーショ
ンの後に室温以下例えば約１６℃に冷却されてもよい。 プロトプラストを次に通常の培地例えば全ての必須ミネ
ラル塩、ビタミン、有機酸、糖、糖アルコール、ヌクレ
オチドおよびアミノ酸、場合により少量の生長調節剤例
えば２．４−ジクロロフェノキシ酢酸を含有する固化完
全培地中で培養してもよい。プロトプラストは、例えば
各々場合によって糖例えばグルコースを含有するカリウ
ム、カルシウムおよびマグネシウム塩の緩衝化溶液また
はナトリウム、カリウムおよびカルシウム塩の緩衝化溶
液で、前もって洗浄してもよい。好ましい方法において
、例えば上記の胚形成性トウモロコシ懸濁培養物から、
またはブラックメキシカンスイートコーン懸濁培養物か
ら調製されたナース培養物の表面のフィルター上でプロ
トプラストは培養される。すでにこの段階で選択を行う
ために、あらゆるプロトプラスト培養培地は、除草量の
ＡＨＡＳ阻害剤、例えば上記のようなスルホニル尿素除
草剤特に５Ｕ８７２を含有してもよい。 ポリエチレングリクールの存在下でのトウモロコシプロ
トプラストの形質転換は別の方法によってもよい。プロ
トプラストは約４５℃で数分間例えば５分間熱ショック
処理され、次に氷で室温まで冷却される。熱シヨツク処
理は必須ではなく、省略されてもよい。所望の遺伝子構
築物および場合によりキャリアーＤＮＡ例えば子ウシ胸
腺ＤＮＡを含有する線状化プラスミドはプロトプラスト
懸濁液に添加される。２０００と１００００の間、好ま
しくは約６０００の分子量を有するポリエチレングリコ
ールおよびカルシウム塩例えば硝酸カルシウムを約０．
１Ｍの濃度で、そして場合によってはその他の添加剤例
えば糖または糖アルコール例えばマンニトールを含有す
るｐ　Ｈが８と９の間のわずかにアルカリ性の水溶液が
プロトプラストに添加され、１２と２５％の間、好まし
くは約２０％のポリエチレン濃度を得る。この混合物は
断続的にゆっくり揺らしながら１０ないし６０分間、好
ましくは１０分間インキュベートされ、次に塩溶液例え
ばカリウムおよびカルシラ１１塩を含をする溶液、好ま
しくはナトリウム、カリウムおよびカルシウム塩並びに
糖例えばグルコースを含有する溶液を用いて、例えば２
ないし３分間隔で一部分を添加し１０倍まで例えば５倍
まで段階的に希釈される。プロトプラストは次に通常の
培地、例えば全ての必須ミネラル塩、ビタミン、有機酸
、糖、糖アルコール、ヌクレオチドおよびアミノ酸、場
合により少量の生長調節剤例えば２．４−ジクロロフェ
ノキシ酢酸を含有する固化完全培地中で培養してもよい
。 エレクトロポレーシヨンまたはポリエチレングリフール
処理を行った形質転換されたプロトプラストは上記の完
全培地中で好ましくは暗所中はぼ室温、例えば約２６℃
で培養される。１４日以内にコロニーはプロトプラスト
から生じる。これらのコロニーは上記完全培地または当
該分野で公知のその他のカルス維持培地中で延長された
期間例えば数週間継代培養される。好ましくは継代培養
のための培地は、所望のＡ）（ＡＳ遺伝子構築物を含有
するトランスジェニック細胞を選択するための除草量の
Ａ　ＨＡ　Ｓ阻害剤を含有する。例えば、この培地は上
記の銀量反応曲線法で決定されるような除草量のスルホ
ニル尿素除草剤を含有する。典型的には、該培地は５０
と５００　ｐｐｂの間、例えばｔ　ｏ　ａ　ｐＨｂの除
草剤ＳＵ８　？　２を含有する。該培地はまた、形質転
換において使用されるＤＮＡ構築物がそれに対する耐性
マーカーを含有する抗生物質、例えばハイグロマイシン
を含有してもよい。形質転換された細胞がハイグロマイ
シン耐性遺伝子を含有すると期待されるならば、この抗
生物質はカルス継代培養のための培地に対して２０と２
００■／１の間、好ましくは約５０■／１の濃度で添加
される。 口　　　　−八　゛ 除草剤耐性である非再生性細胞培養細胞から植物を得る
ために、プロトプラスト融合および体細胞ハイブリダイ
ゼーションの方法が用いられる。除草剤耐性の非再生性
細胞培養物は１つの融合親として作用する。第２の融合
親は同一植物種の再生性組織または再生性細胞培養物か
ら単離されたプロトプラストである。 使用される下記の酵素およびそれらの濃度に応じてプロ
トプラストが得られるまで例えばｌ−５時間室温で、セ
ルロース分解性およびペクチン分解性酵素、例えばそれ
ぞれ登録商標でセルラーゼ・オノヅカＲＩＯまたはＲ３
，マセロザイム、ペクトリアーゼ、ロザイム、ペクチナ
ーゼ、マセラーゼ、ドリセラーゼ等からなる浸透圧的に
緩衝化された酵素溶液内で細胞をインキュベートするこ
とにより、プロトプラストが除草剤耐性培養細胞から単
離される。プロトプラスト−酵素混合物は適当なフィル
ター例えば５０μｍまたは１００μｍステンレス鋼スク
リーンを通して注水される。口液内のプロトプラストは
、繰り返される遠心分離または適当な濃度のショ糖もし
くは登録商標パーコールへの浮上、そして次に溶液内に
再懸濁することにより酵素を含まないように洗浄される
。 一般に、プロトプラストは、試験管内で生長さぜた葉組
織、胚軸もしくは子葉組織または普通に土で生長させた
野生型植物から、適当な浸透圧的に緩衝化された酵素溶
液中で組織片をインキュベートすることにより単離され
る。除草剤耐性細胞培養物からの、および野生型の葉か
らのプロトプラストをほぼ同数個で混合する。 融合を誘導するために、分子１１５００と６０００の間
の水性ポリエチレングリコールの２０５０％溶液等量を
混合されたプロトプラスト懸濁液に添加する。５−３０
分のインキュベージクン後、適当な希釈剤を１５−６０
分かけて添加する。適当な希釈剤はカルシウム塩例えば
塩化カルシウムまたは硝酸カルシウム、および所望によ
り糖または糖アルコール例えばマンニトールを含有する
水溶液である。また、プロトプラストは電気パルスを、
Ｕ、　Ｚ　１ｍｍｅｒｍａｎｎ等、ＰｌａｎＬａ　１５
１：２６，１９８１に記載されたように適用することに
より融合されてもよい。得られた融合産物は当該分野で
公知の通常のプロトプラスト培養培地、例えば塩、ビタ
ミン、糖または糖アルコールを含有する培地中で培養さ
れる。プロトプラストは液体培地中または固化培地中、
暗所または弱い光の下、はぽ室温またはそれよりわずか
に高いかもしくは低い温度で培養されてもよい。 プロトプラストの融合に続いてハイブリッド細胞コロニ
ーを得るために選択系が使用される・除草１のＡＨ八へ
阻害剤の添加は感受性融合親から誘導された全ての野生
型細胞すなわち葉、胚軸または子葉プロトプラストを殺
すであろう。除草剤耐性細胞親から誘導された除草剤耐
性細胞すなわち耐性細胞培養プロトプラストは、これら
の条件下で生長するであろう。除草剤耐性細胞培養プロ
トプラストと除草剤感受性プロトプラストとの融合によ
り形成されたｌ＼イブリッド細胞はまた、除草剤耐性の
優性のために生長することができるであろう。培養培地
が苗条形成を刺激する生長調節剤を含有する時、その他
の選択が得られる。除草剤耐性細胞培養細胞のプロトプ
ラストから誘導された細胞は、それらを非再生性にする
固有の欠陥のためにｍ条を形成しないであろう。しかし
ながら、非再生性細胞培養物と再生性の葉、胚軸または
子葉プロトプラストとからなるハイブリッド細胞は、再
生性が一般に優性形質としてふるまうので苗条誘導条件
下でｗ条を形成することができるであろう。１段階毎に
に行われるか、または同時に行われる２選択段階の組合
せは、除草剤耐性である再生されたハイブリッド植物を
得ることを可能にする。 特に、通常２−４週間後に小さい細胞コロニーが培養さ
れたプロトプラスト融合混合物から形成されたとき、細
胞を洗浄し、そして感受性野生型融合親の細胞の生長を
阻害するには十分である除草量のＡＨＡＳ阻害剤例えば
スルホニル尿素除草剤、好ましくは上記のスルホニル尿
素の一つ、例えば５Ｕ８７２．５ＴＪ４６４またはトリ
アスルフロンを含有する選択培地に移す。 野生型感受性細胞の生長を阻害するのに十分である除草
剤の量は上記のように決定される。例えば１Ｏ１３０ま
たはｌ　００　ｐｐｂの５Ｕ８７２が使用される。細胞
を１回ないし数回の継代培養のために選択培地中で成長
させる。この除草剤含有培地中で生長する細胞を、引き
続いて適当な培地中で成長させ、苗条および植物再生を
促進する。このような再生培地は当該分野で公知であり
、使用された植物種に応じて選択されてもよい。再生培
地はまた、ｌＯないし１００ｐ（ｌｂの除草性ＡＨＡＳ
阻害剤例えば上記のスルホニル尿素の１つ、例えば５Ｕ
８７２を含有してもよい。細胞は緑の苗条が形成される
まで通常３−６週間インキュベートされる。 好ましい１段階選択法において、プロトプラスト融合混
合物から誘導された細胞コロニーは除草剤の不在下約４
−６週間培養される。次にコロニーを、苗条形成誘導に
は適当であり、そして除草量のスルホニル尿素除草剤、
例えば感受性野生型細胞の生長を阻害するには十分な５
Ｕ８７２を含有する固化培養培地の表面にブレーティン
グする。コロニーを緑の苗条が形成されるまでこの培地
中で生長させる。 その他の変形において、上記の融合の後に得られた混合
プロトプラスト懸濁物は、アガーまたはアガロース含有
プロトプラスト培養培地内に載せることにより培養され
る。通常２−４週間後小さい細胞コロニーがブレーティ
ングされた細胞から生じた時、アガロース培地を数個の
部分に分割する。そのうちの１つを、コロニ形成の範囲
（平板効率）を決定するための対照として作用する約１
Ｏ−５０Ｊの液体培養培地に移す。その他の部分は、除
草量のスルホニル尿素除草剤、イミダゾリノン除草剤ま
たはトリアゾロピリミジン除草剤、好ましくは感受性野
生型細胞の生長を阻害するには十分なＩＯないし１００
　ｐｐｂの５Ｕ８７２を含有する等容量の液体培養培地
に移す。これらの培養物はゆっくり揺動させながらシェ
ーカー上で暗所中または明所中のいずれかで、突出細胞
コロニー（ｐｒｏｍｉｎｅｎＬ　ｃｅｌｌ　ｃｏｌｏｎ
ｙ）が形成されるまで培養される。液体培地は適当な間
隔、通常１週間で交換される。除草剤の存在下で生長す
ることができる突出コロニーを次に固体培地部分から切
り出し、そして除草量の阻害剤を含有する新鮮な固化培
地に移す。次に生長するカルスの一部を苗条および小植
物再生を促進するのに適当な培地に移し、そして明所中
でインキュベートする。 そのような再生培地は当該分野で公知であり、そして使
用した植物種に応じて選択され得る。 緑の苗条が形成されそして十分に発育したら（丈１−３
ａｎ）、それらを生長、苗条伸長および根つきをさらに
促進する新鮮培地に移す適当な培地は当該分野で公知で
ある。小植物が十分に発育したら、それらを適当な棒内
の堆肥混合物に移し、上申で生長するように順化させる
。 培地は除草量のＡＨＡＳ阻害剤、例えば１０ないしｌ　
ＯＯｐｐｂの上記スルホニル尿素除草剤の１つ、例えば
トリアスルフロン、５Ｕ４６４または５Ｕ８７２を含有
してもよい。植物またはそれらの一部は後記するような
方法に従ってそれらの除草剤耐性特性が分析される。 開放または調節受粉の標皐法を用いて後代は得られる。 不定胚を成熟させそして発芽させることにより、土に移
されて生長して成熟する小植物とすることにより、植物
は胚形成性トウモロコンカルス培養物から再生される。 胚成熟は胚形成性カルスを上記オーキシン型生長調節剤
を低下させた濃度例えば０．０！ないし０．５■／１で
含有するかまたは全熱含有しない新鮮培養培地に移すこ
とにより促進される。少量、０，０１ないし２０■／ｌ
の範囲のサイトキニン例えば６−フルフリルアミノプリ
ン（カイネチン）、トランス−ゼアチン、ゼアチンリボ
シド、イソペンチルアデニン（２−ｉ１’）または６−
ベンジルアミノプリン（６−ＢＡＰ）が苗条生長を促進
するための培地に包含されてもよい。再生を促進するた
めに使用される培地は、変更された例えば低下させた量
の塩、ビタミンまたは炭水化物源を含有し得る。さらに
培地は選択のために使用された少量の例えば０．１−３
０ｐｐｂの除草性ＡＨＡＳ阻害剤を含有してもよい。再
生に最適な条件は使用されたトウモロコシ遺伝子型に依
存するであろう。根形成を促進するために小さな小植物
は、少量の例えば０．０１ないし１■／ａの弱いオーキ
シン、例えばα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）　、インド
ール−３−酢酸（ＩＡＡ）またはインドール−３−酪酸
（１，８Ａ）を含有する培地に移されてもよい。 一旦根が十分に発育したら、小植物を適当な体内の混合
物に移し、そして温室内に移す。順化を促進するために
、小植物は何日か湿度を保つために透明なプラスチック
カップで覆われそして日光を遮られてもよい。小植物は
また、順化のために噴霧ベンチで何時間か培養されても
よい。−見上中に確立されたら、植物を成熟まで実質的
に通常のトウモロコシ植物のように生長させる。花芽形
成時、植物は手で受粉されるが、好ましくは自家受粉で
ある。種子は当該分野で公知のように集められ、そして
貯蔵される。 懸濁培養物を用いた選択操作で得られた細胞塊は、胚形
成性トウモロコシカルスに対して上記の方法または当該
分野で公知のその他の方法で再生される。細胞を胚成熟
に適当である固化培養培地上にブレーティングし、そし
て次に上記のように処理する。 植物再生のその他の方法は当該分野で公知である。それ
らは特定の植物種に採用されそして適宜使用される。 ｍＭＵ−耐１！Ｈ１医 植物内または該植物から誘導された組織内の除草性ＡＨ
ＡＳ阻害剤に対する耐性の範囲を決定するために、以下
の試験が使用され得る：本発明に係る望ましいＡ　ＨＡ
　Ｓ遺伝子を含有するトランスジェニック、突然変異ま
たは体細胞ハイブリッド植物から組織片が移植され、そ
して細胞増殖を促進するのに適当な培地に置かれる。使
用される培地は、細胞懸濁物またはカルス培養物を作成
するための液体またはゲル培地であってよい。そのよう
な培地は当該分野で公知であり、使用された植物種に応
じて選択され得る。得られた細胞培養物は適当な細胞塊
が得られるまで上記のように継代培養される。これらの
細胞は上記のように除草剤耐性に対して試験される。 さらに、除草性ＡＨＡＳ阻害剤はこの分野で使用される
方法と同様に植物に直接施用されてもよい。発芽前の施
用において、適当な濃度の阻害剤溶液が、その中に試験
植物の種子が蒔かれている基質に施用される。発芽後の
施用において、植物を温室、ファイトトロンまたは農地
内の種子平和、鉢または土中で生長させる。適当な濃度
の阻害剤溶液が噴霧され苗条を覆う。 水和剤がよりよい接触のために通常包含される。 規定された容量の阻害剤溶液が使用されるか、または植
物にはしたたり落ちるまで噴霧される。 土中への発芽後の施用において、植物が基質中で確立さ
れた後、既知容量の適当濃度の阻害剤溶液が土に施用さ
れる。阻害剤からの損傷は、測定の標準法、例えば非発
芽植物の数を測定するか、または損傷された葉の領域も
しくは死んだ植物の数を決定することにより行われる。 注意深く調節された条件下比較的小さい尺度で種子の試
料が阻害剤耐性が評価される必要がある場合、種子ブレ
ーティング法が適当である。 この方法はまた阻害剤耐性植物の後代において形質の遺
伝的分離を試験するために有用である。 種子は標準法により殺菌され、そして次に適当濃度の阻
害剤を含有する固化発芽培地上にブレーティングされる
。種子発芽および阻害剤損傷、例えば漂白または死は、
適当な期間通常２−６週間の後に評価される。 その他の有用な方法は実生ポーチ試験（ｓｅｅｄｌｉｎ
ｇ　ｐｏｕｃｈ　ｔｅｓｔ）である。この方法は、耐性
のレベル（収量反応曲線）、特定の除草剤耐性系からの
種子のその他の除草性ＡＨＡＳ阻害剤に対する交差耐性
、および阻害剤耐性植物の後代において阻害剤耐性の分
離を決定するために、種子例えばトウモロコシの種子の
阻害剤耐性を試験するために適当である。種子は発芽紙
の上に置かれ、その紙は所望濃度の除草性ＡＨＡＳ阻害
剤例えば上記スルホニル尿素除草剤の１つ、例えば５Ｕ
８７２を含有する塩溶液で湿らせである。第２の紙は表
面に使用され、そして２枚の紙は巻かれて芯を形成し、
発芽溶液中に置かれ、そしてほぼ室温で、暗所もしくは
弱い光の中、高い相対湿度で５ないし３０日間培養され
る。発芽溶液は細菌の混入を防ぐために殺菌剤を含有し
てもよい。操作は無菌条件下で行われてもよい。除草剤
耐性の量を決定するために実生の根および苗条の丈を測
定する。 ＡＪＬ八妄へｌ＆性！ｎ丸定 除草剤なしでの、または除草量のＡＩ−Ｊ　ＡＳ阻害剤
の存在下でのＡＨＡＳ比活性の決定は、除草剤耐性細胞
が当該分野では公知である変更されたＡ　ＨＡ　Ｓ酵素
を含有するかどうか、またはこれらの細胞が高められた
量の野生型酵素もしくは野生型ＡＨＡＳ酵素特性を実質
的に有するＡＨＡＳ酵素を発現するかどうかを判断する
ために使用される。 Ａ　）Ｉ　Ａ　Ｓ活性をアッセイするための適当な条件
は当該分野で公知である。正確な結果を得るために改良
されたプロトコルが使用され、そして実施例に詳説した
。特にこのプロトコルは、酵素活性を安定化するグリセ
ロール、フラビンアデニンジヌクレオチドおよびマグネ
シラシム塩の使用を包含する。その他の安定化作用はチ
アミンピロホスフェートにより与えられる。好ましくは
、プロテアーゼ阻害剤例えばフェニルメチルスルホニル
フルオリドは組織抽出および精製の間に包含され酵素の
安定性を確実にする。 直線性の活性は３０℃で２．５時間までのアッセイ条件
下でみられる。Ａ　ＨＡ　Ｓ活性は凍結および０℃以下
での貯蔵に不安定であることがわかったが、しかし５℃
で４日までは安定である。 しかしながら、植物組織または細胞は液体窒素で凍結さ
れ、−８０℃またはそれ以下で貯蔵され、そしてＡ　Ｉ
−Ｉ　Ａ　Ｓ活性の損失なしに再び解凍され得る。 当該分野で記載されたように、植物ΔＨΔＳ酵素は、凍
結に対する異なる感受性、除草剤による阻害に対する感
受性の異なるパターン、およびアミノ酸バリン、ロイシ
ンおよびイソロイシンによる異なるフィードバック阻害
を示す多種のアイソザイムからなるように考えられる。 Ａ　ＨＡ　Ｓ酵素アッセイは、上で詳説した選択操作の
に続いて、そして実施例において以下のことを証明する
。すなわち、その他の除草量のΔＩＩΔＳ阻害剤に耐性
であり、相当する野生型細胞と比較した場合高められた
レベルのＡ　ＨＡＳ酵素を含ａするが、しかし除−５剤
による阻害および上記アミノ酸によるフィードバック阻
害に関して野生型Ａ　ＨＡ　Ｓ酵素に匹敵するＡ　Ｉ−
Ｉ　ＡＳ酵素を含有する植物細胞が見出され得ることで
ある。増加する１の好ましいＡ　ＨＡ　Ｓ阻害剤５Ｕ４
６４を用いる選択により調製された除草剤耐性タバコ細
胞系２１種のなかで、５種の細胞系が相当する野生型細
胞におけるよりも少なくとも２倍高いＡ　ＨＡ　Ｓ活性
を示したが、しかし野生型細胞と同様に阻害に対して感
受性であるＡＩＩＡＳを打していた。同様に、増加する
川の好ましいＡＩ（へＳ阻害剤５Ｕ８７２を用いる選択
により調製された除草剤耐性タバコ細胞系１０８種のな
かで、２２種の細胞系が相当する野生型細胞におけるよ
りも少なくとも２倍高いＡ　Ｉ−Ｉ　Ａ　Ｓ活性を示し
たが、しかし野生型細胞と同様に阻害に対して感受性で
あるΔＨＡ　Ｓを何していた。 ユ途 本発明により考えられ得る特定の用途は農園における雑
草を防除する方法である。上記のような本発明の植物は
そのような農園において使用され、そして該農園におけ
る全ての植物は植物防除量の除草性ＡＨＡＳ阻害剤と接
触される。 本発明の植物は、それらが除草性へ〇　Ａ　Ｓ阻害剤に
対して耐性であるから生き残るであろうが、しかし雑草
植物は死滅するであろう。 前記農園への除草性Ａ　ＨＡ　Ｓ阻害剤の施用の適当な
態様は当該分野でよく知られており、状況例えば本発明
の作物のタイプ、前記農園内に一般的に見られる雑草の
タイプ、除草性ＡＨＡＳ阻害剤の使用法および環境条件
例えば土壌タイプ、予期される天候等に応じて選択され
る。 施用の基本的な態様は、発芽前施用すなわちその中に本
発明の植物の種子が蒔かれた土壌への除草性Ａ　ＨＡ　
Ｓ阻害剤の施用、および発芽後施用すなわち本発明の植
物がある期間生長した後に全ての植物または土壌への施
用である。使用すべき除草性ＡＮＡ、Ｓ阻害剤の濃度お
よび臣は、環境への影響を最低限にするかまたは皆無で
あるように過剰になることを避け、農園における雑草を
防除できるように選択される。 本発明の好ましい面において、作物はその中の除草性Ａ
　ＩＩ　Ａ　Ｓ阻害剤に対する耐性が化学調節剤により
調節可能であるものが使用される。 農園内の全ての植物は、雑草防除量の除草性ＡＨＡＳ阻
害剤と同時にまたは引き続いて前記化学調節剤と接触さ
れる。再び当業者は上記施用の適当な態様、および適当
１度および量の化学調節剤および除草性Δｌ−１ΔＳ阻
害剤を施用するであろう。 本発明の植物細胞および植物のその他の用途も考えられ
る。例えば」１記のような除草性Ａ　ＨΔＳ阻害剤に対
する耐性は本発明の植物から誘導された体細胞ハイブリ
ッド植物およびトランスジェニック植物の選択のために
使用されてもよい。除草性ＡＨＡＳ阻害剤に対する耐性
がＡ！ＩΔＳ遺伝子を含有する組換えＤ　Ｎ　Ａにより
植物細胞に与えられる場合には、この特性は所望の遺伝
子型を示す植物細胞を選択する方法において使用されて
もよい。所望の遺伝子型を含む植物細胞のあらゆる混合
物は除草性ＡＨＡＳ阻害剤の存在下で培養され、そして
生き残る細胞が単離される。特に、上記のような好まし
い組換えＤＮＡおよび／またはキメラＤＮＡ構築物のい
ずれもＡ　ＨＡ　Ｓ阻害剤除草剤に耐性を付与する選択
可能なマーカーとして使用されてもよい。さらに、本発
明の植物細胞内の高められたレベルのＡＨＡＳ酵素はこ
れらの細胞を酵素のｔＩｉ離、精製および詳細な特徴づ
けのための慣用の供給源とする。本発明の植物細胞はま
た、新規でさらに選択性のＡＨＡＳ阻害剤除草剤を検出
するためのスクリーニング法において好都合に使用され
得る。 〔実施例、発明の効果〕 本実施例で使用された標準的な組換えＤＮＡおよび分子
クローニング技術は、Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ。 Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈおよびＪ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＩｌａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　１ｆａｒｂｏｒ、ＮＹ＜１０８２）およびＴ、　Ｊ
、　Ｓｉ　１ｈａｖｙ、　Ｍ、　Ｌ、　Ｂｅｒｍａｎお
よびＬｌ、Ｅｎｑｕｉｓｔ、［ｉｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
　Ｗｉｔｂ　Ｇｅｎｅ　Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、
Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉ＋ｉｇ　１ｌａｒｂｏｒ、ＮＹ（ｉ
ｆ）８４）に記載されている。 賂語： 　Ｔ　Ｐ ＢＳΔ ＭＳ ２．１−Ｄ アデノシン三リン酸 ウシ血清アルブミン ブラックメキシカンスイートコーン ２．４−ジクロロフェノキシ酢酸 ジチオトレイトール ジメチルスルホキンド エチレンジアミン四酢酸 フラビンアデニンジヌクレオチド 新鮮重量 キロ塩基対 ２−モルホリノエタンスルホン酸 分子量 充填細胞容ｈ
【 リン酸緩衝液 ポリエチレングリコール フェニルメチルスルホニルフルオリト ドデンル硫酸ナトリウム チアミンピロリン酸 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンＤ　′ｌ”　
Ｔ ＭＳＯ ＥＤＴΔ ＦΔＤ Ｗ ｂｐ ＥＳ Ｗ ＣＶ ＢＳ Ｐ［シＧ ＭＳ　Ｆ ＤＳ ＰＰ ｒｉｓ ＭＬＪｊｌｉＬ： 工」」１１液 １０ｍＭ　）リス−ｔｌｃ１．　ｐＨｓ、　ｏ、　１ｍ
Ｍ　ＵＤＴ八丁へ口支ｆｌｕ旨１夜 １００ｍＭ　　ｆ・リス−１１ｃＩ、　ｐＨ８，０，１
０ｄ　ＥＣＴ八、　１％（Ｖ／ｖ）ＮＰ−４０（ジグ？
−ケミカルズ（Ｓｌｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）〕 −１１」」１１肢 ８９ａ＋Ｍ　トリスホウ酸塩、８９−ホウ酸、２ｍＭ　
ＥＤＴＡハ　ブＩ　　ゼーシ　ン ２５％Ｖ／Ｖホルムアミド〔超特級、ベセスダ・リサー
チ・ラボラトリ−（ＢｅｔｈｅＳｄａ　Ｒｅ５ＱｒＣｈ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）メリーランド州ガイザースバ
ーグ］５ｘＳＤＳ　　（Ｂ　Ｄ　Ｈケミカルズ社（ＢＤ
）ｌ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＬＴＤ、　）英国プール１
．５にデンハルッ溶液、　２００　ｕ　ｇ／ｍｌ切断お
よび変性サケ精子ＤＮＡ（シグマ・ケミカルズ） ！ノ二及Ｊ溶痰 ０．０２％Ｆｉｃｏｔｌ　（タイプ４００．シダ？−ケ
ミカルズ、ミズーリ州セントルイス）、０．０２％ポリ
ビニルピロリドン（ＰＶＰ３６０．　　シグマ・ケミカ
ルズ。 ミズーリ州セントルイス）、０．０２％ＢＳＡ　　（画
分■、シグマ・ケミカルズ） １−Ω ０、１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０１５Ｍクエン酸ナトリウ
ム、　ｐＨ７、０、Ｌｊｆｌｌ　： 、ＭＩＬ この培地はＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（”Ｍ
Ｓ”、　Ｔ、　Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ等、　Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ、　Ｐｌａｎｋ、　１５：４７３−４９７．１９６２
）の大量塩、小量塩およびＦｅ−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ
＃５００−１１１７．４．３Ｈ／ｌ）、１００ｍｇ／ｌ
　　ミオイノシトール、ｌａｇ／ｌニコチン酸、ｔ＋ｕ
／Ｉピリドキシン−ＩＩｃＩ、１０■／１チアミン−１
１０１，２−３Ｈ／ｌシヨ糖、０．４ｍｇ／ｌ　２，４
ジクロロフエノキシ酢酸、および０．０４ｍｇ／　ｌカ
イネチン、ｐｌｌ５．８からなる。この培地はオートク
レーブにより殺菌される。 １バユ左左ス玉並 ＭＳ多量塩および少量塩およびＦｅ−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂ
ｅＯ＃５ＱＯ−１１１７：４．３Ｈ／ｌ）、ＭＳビタミ
ン、１００ｍｇ／ｌミオイノシトール、２０ｇ／ｌ０Ｈ
／ｌシヨ糖／ｉ　ａナフタレン酢酸、および０．３ａ＋
ｇ／　ｌ　カイネチンからなる。 バコプロ　ブース ＭＳ多量塩および少量塩、ＭＳビタミン、１００ｍｇ／
　１　　ミオイノシトール、２％ショ糖、０．４５Ｍマ
ンニトール、２吐／ｌ　ｐ−クロローフエキシ酢酸、お
よび０．５ｍｇ／　ｌ　カイネチン、ｐＨ５，８からな
る。 Ｍ」計重】− この培地はＭＳ多量塩および少量塩（にＣＢｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌｓ）、６−ベンジルアデニン（１ｍｇ／ｌ）　
、ａナフタレン酢酸（ｏ、＋ｍｇ／ｌ）　、ミオイノシ
トール（１００ｍｇ／ｌ）　、ニコチン酸（１＋ａｇ／
ｌ）　、ピリドキシ／（ｊｍｇ／Ｉン、チアミン−１１
ＣＩ　（ＩＯＨ／　Ｉ　）、およびショ糖（３０ｒ／ｌ
）からなる。オートクレーブの前にｐｌｌは５．８に調
整される。この培地は通常０．８％アガーまたは０２４
％ゲルライトで固化されて用いられる。 旦Ｍ笠 この培地はＭＳ多量塩および少量塩、およびＦｅ−ＥＤ
ＴＡ（Ｇｉｂｃｏ＃５００−１１１７；４．３Ｈ／ｌ）
、Ｂ５ビタミン（０，Ｌ、　Ｃａｍｂｏｒｇ等、Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔｓａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
５０：１５１−１５８．１９６８）、１００ｍｇ／ｌ　
　ミオイノシトールおよび３０ｒ／ｌ　シタ糖、ｐＨ５
，８からなる。この培地は通常０．８％アガーまたは０
．２４％ゲルライトで固化されて用いられる。 ｉＭ この培地はに、Ｎ、にａｏ等、Ｐｌａｎｔａ　１２６＋
１０５−１１０（１９７５）に記載されたようなマクロ
成分、ミクロ成分およびＦｃ−ＩＥＤＴＡ　、並びに以
下の有機化合物からなる：ビオチン（０，０，１ｍｇ／
Ｉ）、ピリドキシンＩＩｃＩ（ｌ　ｍｇ／ｌ）　、チア
ミン−ｔｌｃｌ（ｌｏｍｇ／ｌ）　、−１−コチンアミ
ド＜　ｆ　ｍｇ／Ｉン、ニコチン酸（０，ｆｍｇ／ｌ）
、葉酸（０，４ｍｇ／ｌ）　、Ｄ−パントテン酸カルシ
ウム（ｌ　ｍｇ／ｌ）　、１）−７ミ／安息香酸（０，
０２ｍｇ／ｌ）、塩化コリン（ｌ　ｍｇ／Ｉ）　、リボ
フラビン（０゜２Ｈ／ｌ）　、ビタミンＢ１２（０，０
２ａｆｆ／ｌ）、グリシン（０，１ｍｇ／Ｉ）　、シタ
糖（０，２５ｒ／ｌ）　、グルツース（６８，４Ｈ／ｌ
）　、マンニトール（０，２５ｒ／ｌ）　、ソルビトー
ル（０，２５ｒ／ｌ）　、セｏビオ−７、＜０．２５ｒ
／ｌ）　、フルクトース（０，２５ｒ／ｌ）　、マン／
−ス（０，２５ｒ／ｌ）、ラムノース（ｏ、２５ｒ／ｌ
）　、リボース（０，２５ｒ／ｌ）、キシロース（０，
２５ｒ／ｌ）　、ミオイノシトール（０，１Ｈ／ｌ）、
クエン酸（４０ｍｇ／ｌ）、７’？ル酸（４０ａ＋ｉｒ
／　ｌ　）、リンゴ酸ｃ４ｏｍｇ／ｌ）、ピルビン酸ナ
トリウム（２０１１１ｇ／Ｉ）、アデニン（０，１ｍｇ
／ｌ）　、グアニン（０，０３ａ＋ｇ／ｌ）、チアミン
（０，０３ｍｇ／　ｌ　）、ウラシル（０，０３ｍｇ／
　Ｉ　）、ヒボキサンチン（０，０３ｍｇ／　ｌ　）、
シトシン（０，０３ｍｇ／ｌ）、グルタミン（５，６ｇ
＋ｇ／ｌ）　、アラニン（０，６１ｇ／ｌ）、グルタミ
ン酸（０，ｋｇ／ｌ）　、システィン（０゜２ｍｇ／Ｉ
）　、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、ヒス
チジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン
、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、
トリプトファン、チロシンおよびバリン（各０．１ｍｇ
／ｌ）。溶液は口過滅菌される。最終ｐＨは５．８であ
る。 注意：マクロ成分は１０倍の濃厚貯蔵溶液として、ミク
ロ成分は１０００倍の濃厚貯蔵溶液として作られる。ク
エン酸、フマル酸およびリンゴ酸並びにピルビン酸ナト
リウムはＮ　Ｈ，ＯＨでｐＨ６，５に調整された１００
倍の１厚貯蔵溶液として調製される。アデニン、グアニ
ン、チミジン、ウラシル、ヒボキサンチンおよびシトシ
ンはＮ　Ｈ、ＯＨでｐ　Ｈ６，５に調整された１０００
倍の濃厚貯蔵溶液として調製される。アミノ酸は１０倍
の貯蔵溶Ｊ＆（ＮＨｌＯ［Ｉでｐ１１６．５）を用いて
、与えられた最終濃度とする。 ビタミン貯蔵溶液は通常１００倍濃厚に調製される。 Ｋ工 この培地はＣ−Ｃ，Ｃｈｕ等、５ｃｉｅｎｔｉａ　５ｉ
ｎｉｃａ　１８：６５９（１９７５）に記載されたよう
なマクロ成分、ミクロ成分およびＦｅ−ＥＤＴＡ　、並
びに以下の有機化合物からなる：ピリドキシンーＩＩｃ
　ｌ　（０，５ｍｇ／　ｌ　）、チアミン−ＩＩｃＩ（
０，１ｍｇ／ｌ）　、ニコチン酸（０，５ｍｇ／ｌ）、
グリシン（２，０ｍｇ／ｌ）およびショ糖（３０，０ｇ
／ｌ）。溶液はオートクレーブされる。最終ｐ　Ｈは５
．６である。この培地は通常０．２４％ゲルライトで固
化されて使用される。 注意：マクロ成分は１０倍の濃厚貯蔵溶液として、ミク
ロ成分は１０００倍の濃厚貯蔵溶液として作られる。ビ
タミン貯蔵溶液は通常１００倍濃厚に調製される。 次１卆ロー：　バコ　　　　　　の ニコチアナ・タバカム侍」虹ｕｎ　Ｌｌ１皿）　。 系Ｓ３の懸濁培養細胞を液体培養培地ＭＸＩ中で生長さ
せる。培地ＭＸＩを２５４含有する１００−のエルレン
マイヤーフラスコを７日間前生長させた細胞培養物１０
−とともにインキュベートする。細胞は２５℃暗所中、
オービタルシェーカー上１０１００ｒｐ動程２ｃｍ）で
培養される。細胞は、一部の試料を新鮮培地中に接種し
、デカンテーションまたはピペットで約９０％の細胞懸
濁物を除去し、新鮮培地を補充して所望容量の懸濁物と
することにより、７目間隔で継代培養する。典型的には
、新鮮重量で５８ｇの細胞塊が細胞２５０−３５０■の
接種から１０日以内の生長で生成される。 細胞を実施例１のように前生長させる。沈澱または５０
０Ｘｇでの短時間の遠心分離により細胞を集め、そして
使用された培養培地を除去する。次に細胞を新鮮培養培
地で希釈し細胞ブレーティングに適当な細胞密度、ｄあ
たり約１００００コロニーを形成する単位を得る。ブレ
ーティングのために小容量の培地（約ＩＪ）中の細胞は
、所望濃度の阻害剤を含有する固化培養培地（ＭＸＩ、
０．８％アガー）の表面に均一に分散させる。培地約２
０２０−３Ｏが１０ｃｍのベトリ皿あたり使用される。 適当な阻害剤濃度は態量反応曲線は（実施例５）から決
定され、そして感受性野生型細胞のＩＣ，、より少なく
とも２倍高い。 選択培地上に分散させた細胞を含有する培養プレートは
、細胞コロニーが形成されるまで暗所中２５−２８°Ｃ
でインキュベートされる。現れる細胞コロニーは所望濃
度で阻害剤を含有する新鮮培地に移される。 上記方法の好ましい変形において、培養細胞の前生長懸
濁物はまず最初に、固化培地表面の小容量の液体培地中
に分散される。約４０℃で溶液のままである等容量の温
かい液体アガー培地（１，２−１，８％アガー）を添加
し、そして培地が固化する前にプレートをゆっくりしか
し即座に揺らし培地表面上に均一に細胞を分散させそし
て細胞とアガー培地を混合する。 また、選択培地の表面に分散させる前に、細胞を溶液の
アガー培地と混合してもよい。この方法は細胞が選択培
地の表面の固化培地の薄層内に留まり、そして固定化さ
れる利点を有する。 全容ｆｆ１２０−３０Ｆｎｌ内に細胞を留めることと比
較して細胞のよりよい通気を可能とする。 以下の除草性Ａ　ＨＡ　Ｓ阻害剤は２０ｐｐｂ、５０　
ｐｐｂ、　　１００　ｐｐｂ、　５００　ｐｐｂおよび
１００ｏ　ｌ１ｌ）ｂの濃度で使用される：　ＳＯ２７
２および５Ｕ４Ｂ４゜ 実施例１のようにして培養した細胞を、所望濃度の除草
性ＡＨＡＳ阻害剤を含有する液体培地ＭＸＩ内に適当な
細胞密度で接種する。細胞を実施例１のようにインキュ
ベートシそして生長させる。除草剤を所望濃度で含有す
る新鮮培地を用いて７−１Ｏ日の間隔で細胞を継代培養
する。 使用した除草剤濃度に応じて細胞生長は除草剤の不在下
よりも遅いかもしれない。 以下の除草剤ＡＩＩＡＳ阻害剤は２０ｐｐｂ、５０　ｐ
ｐｂ、　　１００　ｐｐｂ、　５００　ｐｐｂおよび１
００ｏ　１ｌｌｌｌｂの濃度で使用される：　ＳＯ２７
２および５Ｕ４６４゜ 高められたレベルのＡＨＡＳ酵素を有する細胞培養物ま
たはカルスを得るために、懸濁培養物またはカルスを多
段階法で徐々に高まる１度の除草性Ａ　Ｉ−Ｉ　Ａ　Ｓ
阻害剤に移す。特に以下の段階が実施される： 懸濁培養物を形成するために実施例２において選択に使
用されたように、実施例２のブレーティングされた細胞
から現れる細胞コロニーを同一濃度のＡＨＡＳ阻害剤を
含有する液体ＭＸ１培地に移す。また、実施例３におい
て選択に使用されたように、実施例３の選択された細胞
轡濁培養物を同一濃度のＡＨＡＳ阻害剤を含有する液体
ＭＸＩ培地中で継代培養してもよい。 培養物を１週間毎に１−１Ｏ回継代培養し、そしてその
次のより高い濃度で除ｃｌ！剤を含有するＭＸＩ培地中
で継代培養する。このより高い濃度の除草剤を含ｆ「す
る培地中で細胞をＩＯ回継代培養を行う。細胞をその次
のより高い濃度で除草剤を含有するＭＸＩ培地に移す。 この操作を繰り返すことにより、細胞は段階的に、５０
ｐｐｂから１００　ｐｐｂのＳＯ４０４、次いで１００
　ｐｐｂの５Ｕ８７２へ、そして引き続いて５００　ｐ
ｐｂ、、１０００　ｐｐｂ、そして５０００　ｐｐｂの
５Ｕ８７２へ動かされる。 また、実施例２の選択されたカルス片は所望濃度に除草
剤を補足した固化ＭＸＩ培地に移されてもよい。より高
い除草剤濃度への移動は、固化培地を使用することを除
いて前のパラグラフに示された方法に従う。 、実１１例玉：　　　　　　　　に　　番　　　　　の
眼位反応曲線を得るために異なる濃度の除草剤での細胞
の生長が決定される。除草性Ａ　ＨＡＳ阻害剤感受性の
野生型タバコ細胞Ｓ３と除草剤耐性の選択されたまたは
トランスジェニック細胞との懸濁培養細胞を実施例１の
ように液体培地中、高い細胞密度で２−４日前生長させ
る。 細胞を洗浄して使用した培地を除き、そして除草剤なし
の新鮮培地を添加して所望の細胞密度（懸濁液ｌ−あた
り約１５０■ＦＷ細胞）を得る。約２５０−３００１！
ＩｇＦＷ細胞を含有する細胞懸濁液２．５−の試料を、
１００−のエルレンマイヤーフラスコ内に入った所望除
草剤濃度の液体培地約３０−内に接種する。各フラスコ
に同量の細胞を接種するように注意が払われる。 各フラスコは等容量の培地を含有する。１種の除草剤濃
度あたり３−６個の同様のフラスコに接種される。除草
剤濃度はゼロ（一対照）、０゜ｌ　ｐｐｂ、　０．３　
ｐｐｂ、　　ｌ　　ｐｐｂ、　３　ｐｐｂ、　　１０　
ｐｐｂ１３０　　ｐｐｂ、　　１００　　ｐｐｂ、３０
０　　ｐｐｂ、　　１０００ｐｐｂ、　３０００　ｐｐ
ｂ、およびｌ　（１０００ｐｐｂから選択される。接種
された細胞の種々の試料は接種の時間に採取され、フラ
スコあたりの接種された細胞の量を決定する。 細胞を次に２８℃で暗所中ｌＯ日間調節された条件下生
長のためにインキュベートする。各フラスコの内容物を
真空吸引装置の配置された口紙上に注ぎ、全ての液体を
除去しそして多数の適度に乾燥した新鮮細胞を得ること
により、細胞を集める。細胞の新鮮な塊の重量を測定す
る。試料の乾燥重量は乾燥後に測定してもよい。 細胞の生長を決定し、そして１０日間で得た細胞として
表され、そして次式：〔（除草剤生長細胞の最終的量）
−（接種ｆｆ１））ｘｌｏｏ÷〔（除草剤なしで生長し
た細胞の最終的量）（接種量）〕に従う除草剤不在下で
生長した細胞に対する百分率として表される。ＩＣ，、
値はプロットされたデータのグラフ（除草剤濃度に対す
る相対的な細胞量）から決定される。ＩＣ６゜は、細胞
生長が対照の生長（除草剤なしで生長した細胞）の５０
％である除草剤濃度を意味する。 この方法の変形において、除草剤耐性細胞培養物から誘
導された種々のカルス片は実施例２および４のように、
異なる濃度で除草剤を含有する固化カルス培養培地に移
される。相対的生長は、カルス片の重量を測定し、そし
て除草剤なしの培地で生長した対照培養物と比較するこ
とにより、２−６週の培養期間の後に決定される。 しかしながら、懸濁法がより精度が高いために好ましい
。 尖鬼拠１：交差美ぼけＤ久夾定 細胞が類似体またはその他の除草剤に耐性を示す範囲を
決定するために、選択された除草剤の増加する濃度中で
細胞を生長させることにより実施例５が繰り返される。 細胞の相対的生長およびそれらのＩＣｓ。値は比較のた
めに各除草剤に対して決定される。 ＩＬヶＬＬ：　　　　　　　　　　　　の　　　　のＢ
９こ 細胞培養物の除草剤耐性表現型が経時的に維持されるか
どうかを決定するために、細胞を除草剤合釘培地から除
疹剤なしの培地に移す。実施例１のように、除草剤の不
在下で３力月間、適当な間隔で通常の継代培養（懸濁培
養に対しては７−１Ｏ日間隔、カルス培養に対しては３
６週間間隔）を行いながら、細胞を生長させる。次いで
既知量の細胞を除草剤含有培地に戻し、そして１０日間
（懸濁培養）または４週間（カルス培養）培養する。相
対的生長を実施例５のように決定する。 ！ＩＪｕ！ＬＬ：タバコプロ　プラス　の　　お勧 り草勧耐１ｆでふ３韓４組竹、細胞培養細胞から植物を
得るために、プロトプラスト融合および体細胞ハイブリ
ダイゼーションの方法が使用される。除草剤耐性非再生
性細胞培養物はひとつの融合親として作用する。第２の
融合親は同一植物種の再生性組織または再生性細胞培養
物から屯離されたプロトプラスト ０、５Ｍマンニトール中の１％マセロザイムおよび１％
セルラーセＲＩＯ、１　０ｍＭＣ　ａ　Ｃ　ｌ　２、お
よび５ｍＭＭＥＳ，ｐＨ５．８からなる浸透圧的に緩衝
化された酵素溶液中で細胞をインキュベートすることに
よりプロトプラストが除草剤耐性培養細胞からｒｌｉ離
される，、プロトプラスト酵素混合物は１００μｍステ
ンレス鋼スクリーンを通して注水される。口液中のプロ
トプラストはショ糖（０．５Ｍ）上での繰り返し浮動法
または遠心分離法、そして次に０．５Ｍマンニトール、
ｌ　ＯｃＭＣａＣ　Ｉｔ　、および５ｍＭＭＥＳ，ｐＨ
　５．　８からなる洗浄液内に再懸濁することにより酵
素を含まないように洗浄される。ブ［１ドブラストは血
球計測器で計測され、そして約０．　５×ｌＯｌ′／Ｉ
７＋／の畜度に希釈される。 ｂ）　バコ　　　　゛のプロ　ブース 実施例８ａの酵素溶液中で葉片をインキュベートするこ
とにより試験管内で生長したタバコ植物の葉組織からプ
ロトプラストを単離する。 プロトプラストを洗浄し、計測し、そして実施例８ａの
ように再懸濁する。 Ｃ）プロ　ブース　　Ａ 精製の後、実施例８ａおよび８ｂからのプロトプラス！
・を同数混合する。融合を誘導するために、約１００μ
ｌの混合プロトプラスト懸濁液をガラスカバースリップ
上に置き、そして等量の４０％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ、分子量４０００）を添加する。１
０分間のインキュベーションの後、洗浄溶液（０゜４Ｍ
？ンニトール、５０ｍＭＣａＣＩｔ　、ｐＨ８）を３０
分間かけて５分間隔で１００μβずつ添加する。プロト
プラスト融合混合物を次に洗浄溶液で洗浄しＰＥＧを除
去し、そして最後にプロトプラスト培養培地中に再懸濁
する。 ｄ）ブ旦上１１久１展養Ｓ− プロトプラストを１−あたり０．４−ＩＸＩＯ’の密度
に希釈し、そして暗所巾約２８℃で液体プロトプラスト
培養培地の薄層中で培養する。 約２週間後、細胞コロニーがプロトプラストから再形成
されたら、浸透圧が低下された液体培養培地（０，２Ｍ
マンニトール）を添加する。コロニーは早く生長するの
で、培養物はさらに液体ＭＸＩ培養培地で希釈される。 また、段階Ｃのプロトプラストは、Ｒ，Ｄ、５ｔｌｌ目
Ｏ等、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　２：２
４４−２４７（１９８３）に記載されたように最終密度
１−あたり０．４−１　Ｘ　１０’に１．２％溶解アガ
ロースまたは１．４％アガーを含有する温かいプロトプ
ラスト培地等容量で希釈される。混合物を６ｃｍのベト
リ皿内に約２１１１の厚さに注ぎ、混合のためにゆっく
り回転させ、そしてゲル化させる。留められたプロトプ
ラストは、小さいコロニーが形成されるまで、暗所巾約
２８℃で培養される。 災皿桝工：　　　　　ハ　ブｌ”コロニーのハ　ブ■　
　　バコ 立札生 除草剤耐性ハイブリッド植物の選択は１段階または２段
階選択方法のいずれかで行われる。 ａ）２段落五広： 第１段階において、除草剤耐性の選択が行われる。培養
２−４週間後実施例８の培養プロトプラスト融合混合物
から形成された細胞および小さい細胞コロニーを洗浄し
、そして実施例８ｂの感受性タバコプロトプラストから
誘導された感受性野生型細胞の生長を阻害するには十分
な３０ｐｐｂの５Ｕ８７２を含有する選択培地ＭＸｌに
移す。懸濁した細胞をペトリ皿内に薄層として分散させ
、そして暗所巾約２８℃で約２週間培養する。また、細
胞をより大容量、２０１００ｍｊ中、フラスコ内で揺ら
しながら培養する。 次の段階で、除草剤含有培地ＭＸＩ中で生長する細胞お
よび細胞コロニーを液体ＭＳＢＮ培地で洗浄し、次に固
化ＭＳＢＮ培地上にブレーティングする。ＭＳＢＮ培地
は３０または１０ｏ　１ｌｌ）ｂの３０８７２を含有す
る。別の方法では除草剤は培地に添加されない。培養は
緑の苗条が形成されるまで明所中（寒白色蛍光管からの
約３０００ルクス）約２８℃で３−６週間行われる。 ｂ）１ｍ色η 実施例８のプロトプラスト融合混合物を直径巾なくとも
ｌ　ｍｍの細胞コロニーが形成されるまで約４週間培養
する。コロニーを液体ＭＳＢＮ培地で洗浄し、次に３０
またはｌ　ＯＯｐｐｂの５Ｕ８７２を含有する固化ＭＳ
ＢＮ培地上にブレーティングする。培養は緑の苗条が形
成されるまで明所中（寒白色蛍光管からの約３０００ル
クス）約２８℃で３−６週間行われる。 その他の変法おいて、実施例８ｄにおける固化培地内に
留めた培養プロトプラスト融合混合物が選択のために使
用される。小さい細胞コロニーが培養２−４週間後留め
た細胞から生じたら、アガーまたはアガロース培地をい
くつかの部分に切断する。そのうちの一つをコロニー形
成の範囲（平板効率）を決定するための対照として作用
する約３０ｒｎｌの液体培養培地ＭＸＩに移す。その他
の部分を３０ｐｐｂの５Ｕ８７２を含有する３０−の培
養培地ＭＸＩに移す。これらの培養は突出細胞コロニー
が形成されるまで暗所中ゆっくり揺らしながら行われる
。液体培地は週毎に交換する。５Ｕ８７２の存在下で生
長することができる突出コロニーを固化培地部分から切
り出し、そしてカルスを生長させるための３０または１
００　ｐｐｂの５ｔＪ８７２を含有する新鮮な固化ＭＸ
Ｉに移す。カルス片（約１００−２００■ＦＷ）を次に
３０または１００ｐｐｂの５Ｕ８７２を含有する固化Ｍ
ＳＢＮ培地に移す。培養は緑の苗条が形成されるまで明
所中（寒白色蛍光管からの約３０００ルクス）約２８℃
で３−６週間行われる。 ［１；！１；４．１）１１１．−１）！［１，−［１，
−（：）−ニハ　ブ１　　　バコ　　の十分に発育した
実施例９において形成された緑の苗条（丈１−３ｃｍ）
を０ＭＳ培地に移しさらに生長、苗条伸長および根つき
を促進する。 小植物が十分に発育したら、それらを体内堆肥混合物に
移し、そして土壌での生長に順化させる。　植物または
それらの部分は実施例１１に従ってそれらの除草剤耐性
特性が分析される。 後代は、開放または調節された受粉の標準的方法により
得られる。 ａ）葉ｊう≦（先決： 実施例１０，２３または２４の試験管内で生長した小植
物からまたは土中で生長した植物から４−１Ｏ■の葉デ
ィスクを、前選択量（例え！ｉ’セロ（＝対照）、ｌ　
Ｏｐｐｂ、１ｏｏｐｐｂ、１０００ｐｐｂ、またＧ；ｋ
ｌ　ｏ　ｏ　ｏ　ｏ　ｐｐｂ）　ノ試験すべき除草性Ａ
ＨＡＳ阻害剤を含有するＭＳ　ＢＮ培地上に載せる。明
所中での３−６週間の生長後、培養組織片は阻害剤の存
在下での緑の苗条を形成する能力が評価される。同様に
、茎、葉柄、根、子葉および胚軸からの部分が使用され
る。 ｂ）細ｌ団トｌ法： 組織片を実施例１０．２３または２４の植物から移植し
、ＭＸＩ培地内に載せる。カルスを形成した後、液体ま
たは固化培地ＭＸＩを用いて３−６週間継代培養する。 これらの細胞は実施例５および６の方法に従って試験さ
れる。 Ｃ）の ｌ）発芽前の施用：選択された濃度の阻害剤溶液が、そ
の中に試験植物の種子が蒔かれている基質に施用される
。 ２）発芽後の施用：植物を温室、ファイトトロンまたは
農地内の種子手箱、鉢または土中で生長させる。予め選
択された濃度の阻害剤溶液が噴霧され苗条を覆う。水和
剤がよりよい接触のために包含される。規定された容量
の阻害剤溶液が使用されるか、または植物にしたたり落
ちるまで噴霧される。 ３）土中への発芽後の施用：植物が基質中で確立された
後、既知容量の予め選択された濃度の阻害剤溶液が土に
施用される。 阻害剤からのｔｊｌ傷は、測定の標阜法である非発芽植
物の数を測定するか、または損傷された葉の領域もしく
は死んだ植物の数を決定することにより行われる。 ｄ）　−ブレーナ　ン　　： この方法は阻害剤耐性植物の後代において形質の遺伝的
分離を試験するための好ましいものである。種子は標準
法により殺菌され、そ１．て次に予め選択された濃度の
阻害剤を含有する固化０ＭＳ培養培地上にブレーティン
グされる。 種子発芽、漂白または死は、２−６週間の後に評価され
る。 ｅ）実生エニ±試且土 この方法は、耐性のレベル（服は反応曲線）、交差耐性
、および阻害剤耐性植物の後代において阻害剤耐性の分
離を決定するために、トウモロコシの種子の阻害剤耐性
を試験するのに適当である。 種子は発芽紙（２５Ｘ３８ｃｍ）の上に、上から約２．
５ＣＩ１１そして２．５ａｍｌｌｆｌＬで１０列置かれ
る。 その紙は所望濃度の除草性へ〇　Ａ　Ｓ阻害剤を含有す
るｌ　ｍＭ　Ｃａ（ＳＯｔ）ｚの溶液で湿らせである。 第２の紙は上に使用され、そして２枚の紙は巻かれて芯
を形成し、前記種子は抜芯の上から約２、５　ｃｍであ
る。少なくとも２つの同じ芯が試験すべき種子ロットあ
たり繰り返される。対照とするために除草性Ａ　ＨＡ　
Ｓ阻害剤を含有しない発芽溶液で少なくとも２つのロー
ルが準備される。紙ロールは発芽溶液１．５１を含有す
る４１プラスチツク容器内に垂直に設置される。登録商
標カプタン殺菌剤〔ドラボン・ケミカルス（Ｄｒａｇｏ
ｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、　バージニア州ロアノーく
〕２２５ｇを発芽培地に添加して細菌の混入を減らす。 プラスチックの袋を前記容器の」二にかぶせ湿度を保つ
。該容器を２８℃で弱い光（１６／８時間の照光周期）
の下、相対湿度８５％で７日間インキュベートする。実
生の根および苗条の長さをａｌｌｌ定する。 ズ」１例」−ｉ：　ウモロコシ ルスの 通交系１’　ｕ　ｎ　ｋ　２７１７　（Ｆｕｎｋ　５ｅ
ｅｄｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の受粉１２−１
４日後の自家受粉トウモロコシ植物から実を集める。皮
を除去し、そしてより良好な湿潤のために洗剤を数滴添
加した市販のクロロツタスジリーチ２０％溶液内で振と
うすることにより実を約１５分間滅菌する。次に実を滅
菌水で数回すすぐ。その他の全ての段階は滅菌空気流の
フード内で無菌的に行われる。長さ１．５−２．５　ｔ
ｍの胚を穀粒がらスパチュラで除去し、０．２４％ゲル
ライトで固化させた２■／１２．４−ジクロロフェノキ
酢酸（２，４−Ｄ）および３％ショ糖を含有するＭＳ培
養培地上に胚軸を下向きにして載せる。 胚形成性カルスは約２８°Ｃ暗所中での培養２−４週間
以内に胚の胚盤組織上に形成する。カルスを外植片から
除去し、そして２■／１２゜４−Ｄを含有する新鮮な固
化ＭＳ培地に移す。 胚形成性カルスの継代培養は！週間毎に繰り返される。 胚形成性の形態を有するカルス部分のみ継代培養する。 、２Ｕ！ｌＬ伶ｎｕ：　　　　　　ＡＨＡ　　　　”　
　　に　　　　　あ実施例１２の胚形成性カルスを０．
２４％ゲルライトで固化させた２■／ｆ２．４−Ｄ、３
％ショ糖および３０　ｐｐｂｓＵ８７２を含有するＮ６
培地からなるカルス維持培地に移す。培養物は暗所中２
８℃でインキュベートされる。１４日後、生長性カルス
を同一組成の新鮮培地に移す。■型形態の砕けやすい胚
形成性カルスとして知られる所望の胚形成性の形態を有
する培養物のみを継代培養する。１週間毎に２ないし１
０回新鮮培地で継代培養することにより（この場合最も
速（生長する培養物が継代培養される）培養物を増殖さ
せる。速く生長するカルスを次に１００　ｐｐｂｓＵ８
７２含有のカルス維持培地に移す。この除草剤濃度でカ
ルスが十分に生長したら、通常的５ないし１０回の週毎
の継代培養後、カルスを３００　ｐｐｂＳＵ８７２含有
のカルス維持培地に移し、そしてよく生長する培養物が
得られるまで継代培養する。この操作は１０００　ｐｐ
ｂＳＵ８７２含有の培地を用いて繰り返され、そして２
０００および４０００１）ｐｂ金含有培地で再び繰り返
される。 十分なカルスが作成されたとき、実施例１４に記載した
ようにそれを胚成熟および植物再生に適当な再生培地に
移す。使用された各除草剤濃度で生長する胚形成性カル
スを再生培地に移す。 ｂ） トウモロコシ近交系Ｆｕｎｋ２７１７の胚形成性懸濁培
養物を実施例２４に従って確立し、そして２１Ｉ１ｇ／
１２．４−Ｄで継代培養することにより維持する。選択
のために、培養物を２■／１２，４−Ｄおよび１０ｐｐ
ｂＳυ８７２を含有する液体Ｎ６培地に移す。培養物を
シェーカー上１２　Ｏｒｐｍで２８℃暗所中生長させる
。１週間毎に培地を除去しそして新鮮培地を添加する。 培地５０−あたり充填細胞容量約ｌｏ−を維持するため
に、培養液はそれらの生長に従って培養培地で希釈され
る。各継代培養で培養物は検査され、そして所望の砕け
やすい形態を有し速く生長する培養物だけがさらなる継
代培養のために保持される。ｉ　ｏ　Ｉ）Ｉ）ｂの５Ｕ
８７２を含有するＮ６培地内での２ないし１０回の継代
培養の後、培養物は１週間毎の少なくとも２ないし３倍
の生長速度で増加を続ける。培養物を次に２■／ｌの２
．４−Ｄおよび３ｏｐｐｂの５Ｕ８７２を含有するＮ６
培地に移す。生長する培養物を上記のようにこの培地中
でもう２ないし１０回継代培養して繰り返し継代培養す
る。 所望の砕けやすい胚形成性形態を有し速く生長する培養
物をさらなる継代培養のために選択する。速く生長する
培養物を次に２■／１の２゜４−Ｄおよび１００　ｐｐ
ｂの５ＬＩ８７２を含有するＮ６培地に移し、所望の砕
けやすい胚形成性形態を有し生長する培養物を継代培養
する操作を速（生長する培養物が得られるまで２ないし
１０回繰り返す。これらの培養物を次に２■／！の２．
４−Ｄおよび３００１１ｐｂの５Ｕ８７２を含有するＮ
６培地に移す。 上記の除草剤濃度レベルで選択された各胚形成性懸濁培
養物から植物の再生のために、培養物をまず０．２４％
ゲルライトで固化し、２■／ｌの２．４−Ｄおよび場合
により培養物が生長していた１度の５Ｕ８７２を含有す
るＮ６培地上に移し、胚形成性カルスを生成する。再生
のために十分量のカルスが得られるまで胚形成性カルス
を新鮮カルス維持培地上で継代培養する。 所望の胚形成性形態を有する培養物だけを継代培養する
。 新鮮再生培地に移すことにより実施例１３の選択された
胚形成性カルス培養物から植物を再生させる。使用され
る再生培地は、２．　４−Ｄを含有しないＮ６培地から
なるＯＮＢ培地、または０．２５■／１の２．４−Ｄお
よび１０■／ｌのカイネチン（６−フルフリルアミノプ
リン）を含有するＮ６培地からなるＮ６１、または０１
■／１の２．４−Ｄおよび１■／ｌのカイネチンを含有
するＮ６培地からなるＮ６２であり、これらは全て０．
２４％ゲルライトで固化されたものである。培養物を明
所中（白色蛍光灯から１０−１００μアインシユタイン
／ｒｒｒｓｅＣで１日あたり１６時間）２８℃で生長さ
せる。 培養物は２週間毎に新鮮培地上で継代培養される。小植
物を３ないし８週間発育させる。少なくとも２ｃ１１１
の高さの小植物を固着カルスから除去し、そして根促進
培地に移す。異なる根促進培地が使用される。この培地
は通常用のまたは半分に減らされた量の塩、１　ｇ／ｌ
に減らされたンヨ糖およびさらに生長調節化合物を欠く
かもしくは０．１■／ｌのα−ナフタレン酢酸を含有す
るビタミン非含有Ｎ６またはＭＳ培地からなる。−旦根
が十分に発育したら小植物をバーミキュレート、ピート
ボケおよび園芸上からなる鉢混合物に移す。移植のとき
に全ての残りのカルスを切取り、全てのアガーをすすぎ
落とし、そして葉をおよそ半分に刈り取る。小植物は最
初何［１かは湿度を保つために逆さにしたプラスチック
カップで覆い、光をさえぎって温室で生長させる。順化
の後、植物を鉢代えしそして成熟するまで生長させる。 肥料ピータース２０２０−２０が植物が健康に発育する
ことを確実にするために使用される。花芽形成植物を受
粉、好ましくは自家受粉させる。 ５週令のアラピドブンス・タリアナ筐１ｂｌｄ　。 Ｉ！ＪｉｉＬｉｌｉａ　ｌ　ｔ　ａ　ｎ　ａΣ生態型コ
ロンビアから全植物ＤＮＡを以下の操作で単離する：葉
および茎組織４０ｇを液体窒素内に集める。凍結された
組織を水冷された乳鉢と乳棒で細かい粉末にすりつぶす
。粉末を抽出緩衝１（５０ｍＭ）リス＝ＨＣ１、ｐＨ８
，５０ｍＭＥＤ′ｌ”Ａ、５０ｍＭＮａＣ１２％サルコ
シン酸ナトリウム、１００μｇ／＋ＪプロテイナーゼＫ
）２００ｒｎｌに再懸濁する。スラリーを融解させ、混
合しそして５５°Ｃで１時間インキュベートし、次に１
１００００Ｘで１５分間遠心分離する。上清を２容量の
エタノールと混合し、そしてｌｏｏｏｏＸｇで１５分間
遠心分離する。ＤＮＡ含有ペレットをｌＯ倍ＴＥ緩衝液
６４．４−に溶かす。この溶液にＣｓＣ１６２，２ｇと
ｌθ■／−エチジウムプロミド２．９−を添加し、そし
て５５°Ｃの水浴中で５分間加熱し、ＣｓＣｌを溶解さ
せる。ＣｓＣ１溶液を８０００　Ｘｇで４５分間遠心分
離することにより透明化し、ＶＴｉ５０”Ｑｕｉｃｋ−
ｓｅａｌ”遠心管に入れ、そしてベックマンＶＴｉ５０
ロータ中４５０００　ｒｐｍで２０’ＣＩ８時間遠心分
離する。１６ゲージ針を付けたシリンジで管から蛍光Ｄ
ＮＡバンドを取り出し、そして２０倍ＳＳＣで飽和させ
たイソプロパツールで５回抽出してエチジウムプロミド
を除去する。生成した溶液を２容潰の水および０．１容
量の３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐ　１１４．８で希釈し、そ
して２容量のエタノールと混合する。ＤＮＡ繊維をパス
ツールピペットの先端で溶液から巻取り、７０％エタノ
ールですすぎ、風乾し、０．５ｍｇＴＥ緩衝液に溶解し
、そして４°Ｃで貯蔵する。 ｂ）ｌｔｕ　　　　　　　　　の　　　・アラビドプシ
スＤＮＡ２５０μｇを制限酵素Ｘｂａｌ　　４０００単
位で４時間消化する。消化物を０゜８％アガロースゲル
上での電気泳動により分画する。６．５ｋｂｐと４．３
６ｋｂｐの間のＤＮＡ断片（Ｉｌｉｎｄｌ［［消化ラム
ダＤＮＡサイズマーカーに基づいて）をＮＡ−４５ＤＥ
ＡＥ膜〔シュライヒャー・アンド・シューエル（Ｓｃｈ
ｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）、ニューハ
ンプシャー州キーン〕を用いて製造会社の推奨する操作
に従ってゲルから分離する。ＤＮＡをＴＥ緩衝液２０μ
ｌに溶解しそして溶液の濃度をＵｖ分光器で決定する。 Ｃ）−ム　−　ブー１　の Ｘｂａ　ｌ消化およびホスファターゼ処理ラムダＯｎｇ
Ｃ（ｌ　ｏｎｇＣ）アーム調製物をストラタジーン・ク
ローニング・システムズ（Ｓｔｒａｌａｇｅｎｅ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ　５ｙｓｔｅｏ＋ｓ　（カリフォルニア州う
・ジョラ）〕から得る。アラビドプシスＸｂａ　ｌ挿入
ＤＮＡ０．１８ｇを前記１ｏｎｇｃアーム１．　Ｏｕ　
ｇをスタラタジーンにより推奨される方法で連結する。 ギガバック・プラス・キット（ＧｉｇａｐａｃｋＰｌｕ
ｓ　ｋｉｔ）　　（ストラタジーン・クローニング・シ
ステムズ）を用いて製造会社により推奨される方法で連
結反応物２．５μｌをラムダファージの頭部内に充填す
る。このライブラリィの活性は大腸菌株ＶＣ３２５７（
ストラタジーン・クローニング・システムズ）で滴定さ
れる。 ｄ）　　　　　　　　ローブの ｐ　Ｅ　１６　／　８−　ｃ　４プラスミドＤＮＡ（Ｊ
、Ｐｏ１ａｔｎａ、Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　　Ｒｅｓ、Ｃ
ｏａ＋ｍ、４９：５７７−５８４．１９８４．ＡＴＣＣ
に寄託されている。上記参照）５０ｇｇをＥｃｏＲＩで
消化し、そして消化産物を０．８％アガロースゲルで分
析する。酵母ＡＨＡＳ遺伝子のコード配列を含有する２
ｋｂｐ　ＵｃｏＲ１断片をＮＡ−４５ＤＥＡＥ膜を用い
て製造会社の推奨する操作に従ってゲルから分離する。 ２　ｈｂｐ断片への放射標識プローブは、プライムタイ
ムキット（Ｐｒｉｍｅ　Ｔｉｍｅ　Ｋ口）［インターナ
シヨナル・バイオチクノロシーズ社Ｃ１ｎｊｅｒｎａ口
ｏｎａｌ　Ｂｉｏｊｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、
）、　、コネチカット州ニュー・ヘブン］を用いて製造
会社の推奨する方法に従ってランダムプライミング反応
でハイブリダイゼーション反応を行うその日に合成され
る。標識反応は１２５μｌまで一定の率で引き上げられ
、そして断片０．２５μｇおよび３０００Ｃｉ／ｍＭｏ
１α−”Ｐ　　ｄｃＴＰ１２５μＣｉを含有する。酵母
ｔ　ＲＮＡ　５０ｇｇをキャリアーとして反応物に添加
し、そしてＤＮＡを５Ｍ酢酢酸アンユニ１クム１２５μ
！よびエタノール５００μ！で沈澱させる。反応混合物
をドライアイスで凍結させ、融解し、そしてマイクロヒ
ュージ〔ブリンクマン（Ｂｒｉ口ｋｍａｎ）　）中量高
速度で１５分間遠心分離する。ペレットをＴＥ緩衝液２
００μ！内に溶解し、そして放射標識ＤＮＡプローブは
Ｇ５０セフ７デツクスクイツクスピンカラム〔ベーリン
ガー・マンハイム・バイミケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）
、インジアナ州インジアナポリス〕に製造会社により推
奨される方法で流して組み込まれなかったヌクレオチド
をさらに除く。ＤＮＡプローブを沸騰水浴中で５分間熱
することにより変性させ、冷却し、そしてハイブリダイ
ゼーション溶液に添加する。 ｅ）−ム　−　ブー１　のス　寥−ニン２５００００の
組換えファージを大腸菌株ＶＣ３２５７に感染させ、１
５０閣ペトリ皿あたり５００００のファージの密度で５
枚のプレートにブレーティングする。ファージプラーク
の複製膜リフｈ（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ　ｍｅｍｂｒａｎ
ｅ　１ｉｆｔ）はコロニー／プラークスクリーンメンブ
ラング（ＮＥＮ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、
Ｄｕ　Ｐｏｎｔ、ＢｏｓＬｏｎ、ＭＡ）を用いて製造会
社により推奨される方法に従って作成される。膜を洗浄
緩衝液（５倍ＳＳＣ，２％５ＤＳ）中で一晩キインキュ
ベートする。次に膜を４２℃でゆ−）くり揺らしながら
ＬＳハイブリダイゼーシタン緩衝液１５０−内でインキ
ュベートする。 １６時間後、上記のように調製された３２ｐ−標識酵母
ＡＨＡＳ遺伝子プロー１０．２５μｇを含有する新鮮Ｌ
Ｓハイブリダイゼーション緩衝液！５０−に移す。膜を
４２℃で１６時間ゆっくり揺らしながらインキュベート
し、室温で２倍ＳＳＣを用い１回の洗浄あたり１５分間
２回洗浄し、４２℃でＬＳ洗浄緩衝液（２５％ホルムア
ミド、５倍ＳＳＣ，１％５ＤＳ）を用い１回の洗浄あた
り２時間３回洗浄し、そして室温ですすぎ緩衝液（０，
１ＳＳＣ，１％５ＤＳ）を用いて１回の洗浄あたり３０
分間２回洗浄する。 膜をマウントし、そしてクロネックス・ライトニング・
プラス・スクリーンズ（Ｃｒｏｎｅｘ　Ｌｉｇｈｔｅｎ
ｌｎｇ　Ｐｌｕｓ　５ｃｒｅｅｎｓ）　［デュポン（Ｄ
ｕ　Ｐｏｎｔ）　、プラウエア州つイルミントン〕およ
びＸＡＲ−５フイルム〔コダック（にｏｄａｋ）、ニュ
ーヨーク州ロチェスター〕でフルオログラフを行う。両
方の膜リフト上に陽性フィルムシグナルを与えたプレー
トの領域からのプラークを拾い上げ、そして１５０ｍプ
レートあたり約３００プラークの低い密度でブレーティ
ングし、モしてスクリーニング操作を単一のハイプツト
プラークが単離されるまで繰り返す。 ｅｊＬ胤り土工：　　　Ｍ　”　３５　　　　　７ビ゛
プブラーク精製フアージからのファージＤＮＡのミニブ
レツブ（ｍｉｎ　１ｐｒｅｐ）はラムダソルブ・ファー
ジ・アブソルベント・キット（ＬａｍｂｄａＳｏｒｂＰ
ｈａｇｅ　Ａｄｓｏｒｂｅｎｔ　ｋｉｔ）　［プロメガ
（Ｐｒｏｍｃｇａ）、ウィスコンシン州マジソン〕を伴
う操作に従って行われる。ファージＤＮＡを制限酵素Ｘ
ｂａｌで切断し、そして５．５ｔｔｂｐ挿入断片をｐＢ
Ｓ　（−）プサスミド（スタラタジーン・クローニング
・システムズ）のＸｂａ　１部位内にクローン化する。 アラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子を含有するＸｂａ　１断
片とのクローン化断片の同定は、その制限地図およびＤ
ＮＡ配列とＧ、　ｌｌａｕｇ＋＋ｎ等、　Ｍｏ１．　Ｇ
ｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、２１１：２６６−２７１（１９８
８）、およびＢ、　Ｍａｚｕｒ等、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｌ
＋ｙｓｉｏ１．８５＋１１１０−１１１７（１９８７）
によりアラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子に対して記載され
たものとの比較により行われる。このプラスミドはｐｃ
ｌＢ１２０？と表される。 ｐｃＩＢ７１０植物発現ベクター（Ｓ、　Ｒｏｌｈｓｔ
ｅｉｎ等、Ｇｅｎｅ　５３：１５３−１６１．１９８７
）内の７　ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター融合部位をＢａ
ｍｔｌｌからＮｃｏｌへ以下のように変換する：ＣａＭ
Ｖ３５Ｓプロモーターを含む断片内のＮｅｏ　１部位は
、ｐＣＩＢ７１０プラスミドＤＮＡをＮｅｏ　Ｉで切断
し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（クレノーＤＮＡポリメ
ラーゼ）のクレノー断片を突出末端に満たし、そしてプ
ラスミドをＴ４ＤＮΔリガーゼで再環化することにより
破壊される。生成するプラスミドをＢａａｌｌｌで切断
する。突出末端をクレノーＤＮＡポリメラーゼで満たし
、そしてＮｃａｌリンカ−〔ニュー・イングランド・バ
イオラプス（Ｎｅｗ　［ｉｎｇｌａｎｄ　Ｂｌｏｌａｂ
ｓ）、　ニュー　ヨーク州ビバリー〕をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで末端に連結してｐＣｒＢ１２１１を形成する。 ｂ）　　−ビ１プシス　　Ａｓコー゛　　の　ａｐｃＩ
Ｂ１２０？内のアラビドプシスへＨΔＳコード配列ノＸ
ｂａ１部位（７）１．３ｋｂｐ下流は、ｘｂａ［で切断
され、突出末端をクレノーＤＮＡポリメラーゼで満たし
、そしてＮｅｏ　Ｉリンカ−にュー・イングランド・バ
イオラプス）内にＴ　４　ＤＮΔリガーゼで添加するこ
とによりＮｃｏ　１部位に変換される。次にＮｃａｌで
切断してプラスミド配列からＡＨＡＳコード配列を含む
３．３　ｋｂｐ　Ｎｃｏｌ断片を放出する。消化物をＮ
ｃｏｌ切断ｐｃＩＩ３１２１１　ＤＮＡと連結し、そし
て大腸菌株ＪＭＩ０９　（Ｃ，Ｙａｎｉｓｃｈ等、Ｇｅ
ｎｅ　３３：１０３−１１９．１９８５）細胞内に形質
転換される。ミニプレツブプラスミドＤＮＡがアンビン
リン耐性を示すコロニーから調製され、そしてＸｂａｌ
および５ａｃ１１制限エンドヌクレアーゼで消化する。 消化産物をゲル電気泳動により分析し、ｐｃｌＢ１２１
１ｃａＭＶ３５３プロモーター発現部位のΔＨＡ　Ｓコ
ード配列の直接下流の５′末端を融合した組換えプラス
ミドを含むクローンを同定する。このプラスミドはｐｃ
ＩＢ１２１２と表される。 ３５ＳプロモーターＡＨＡＳキメラ遺伝子は、Ｘｂａｌ
およびＫｎｐｌ制限酵素で切断することによりｐｃＩＢ
１２１２から切り出され、Ｘｂａｌおよびにｐｎｌ切断
ｐｃＩｎ２００内に連結される。これにより、アラビド
ブンスＡＨＡＳ遺伝子を駆動させるキメラＣａＭＶ３５
Ｓを含有する二重ベクターｐｃｉ３１２１３が得られる
。 ｄ）　　　　ｌ３２００の　−・ テトラサイタリン遺伝子を切り出すためにｐ１’　Ｊ　
Ｓ　７５　（Ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒおよび１ｌｅｌ
ｉｎｓｋｉ、　Ｊ、　Ｉｔａｃｔｅｒｉｏｌ。１［ｉ４
　：４４ｆ３−４５５，１９８５）をＮａｒｌで消化す
ることによりＴＪＳ７５Ｋａｎをまず創生し、次にＮｐ
ｔ　ｌ遺伝子を介するｐ　Ｕ　Ｃ４Ｋ（Ｊ、Ｍｅｓｓｉ
ｎｇおよびＪ、Ｖｉｅｒｒａ、Ｇｅｎｅ　１９：２５９
−２６８．１９８２）からのＡｃｃｌ断片を挿入する。 ｐｃｌＢ２００は、Ｘｈｏ！リンカ−をｐｃ１８７（左
側および右側Ｔ−ＤＮＡ境界、植物選択性ｎｏｓ／ｎｐ
ｔｎキメラ遺伝子およびｐＵｃポリリンカーを含有する
、ＳＪ、　ＲＯｌｈＳｔｅｉｎ等、　Ｇｅｎｅ　５３：
１５３−１６１．１９８７参照）のＥｃｏＲＶ断片に連
結し、そしてＸｔ＋ｏＨ１！ｌ化断片を５ａｉｌ消化Ｔ
ＪＳ７５Ｋａｎ内にクローニングすることにより次に作
成される。 二重ベクターｐ（ｌＢ１２１３を大腸菌からアグロバク
テリウム・チュメファシェンスヘＤｔｔａ等、　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７
：７３４７−７３５１゜１９８０の三親交雑法により転
移させる。ｐｃ■Ｂ１２１３を取り込む大腸菌株ＨＢ　
ｌ　０１の定常培養物（ｌｉ、　Ｒｅｌｅｉｇｈおよび
Ｇ、　Ｗｉ　１ｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ　８３：９０７０−９０７
４．１９８６）　　（５０ｕ１２）、可動化ヘルパープ
ラスミドｐＲＫ２０１３　（ＡＴＣＣ３７１５９）を取
り込む大腸菌株ＨＢ１０１（５０μｍ）、およびｐｃＩ
Ｂ５４２ヴイルレンスヘルパープラスミドを取り込むア
グロバクテリウム・チュメファシエンス株Ａ１３６　（
１００μりを混合し、そしてＬＢアガーブレー１・上で
２日間３０℃で生長させる。 ｐｃＩＢ５４２およびｐｃＩＢ１２１３を含有するアグ
ロバクテリウム・チュメファシェンスＡ１３８トランス
結合体は、スペクチノマインンおよびカナマインンを両
方とも５０■／！で含有するＭＡＲ最少アガープレート
（Ｍ、　Ｃｂ目
【００等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎｉ１．　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７１　：３６７２−３６
７６、１０７４）上で３回の画線により選択され、精製
される。アグロバクテリウム・チュメファシェンスのこ
の株をＣＧＡＩ４０２と表す。 実ｊＭＬ汁［Ｌ・　　　　タバコＡ　ｌ−Ｉ　Ａ　　　
　　のａ）　バコブロ　プラス　の　　： 実施例１の２日令のタバコ細胞懸濁培養物１００ｒｎｌ
を等容量の２倍強度の酵素溶液と混合する。酵素溶液は
ｌＯｇ／ｌセルラーゼＲ，ＩＯオノズカ（ヤクルト本社
）、２．５ｇ／ｌマセラーゼ〔リゾプス種からのペクチ
ナーゼ、ベーリンガー・ダイアグノスティクス（Ｂｃｈ
ｒｉｎｇｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）カリフォルニ
ア州う・ジョラ〕、１ｇ／ｌペクトリアーゼＹ−２３（
盛進製薬社）、１．４５　ｇ／　ＩＩ　Ｃａ　Ｎ　Ｏｙ
　・４１−１２０．０．５　ｇ　／ｆＭｇｓｏ、・７Ｈ
３０，０，２３ｇ／ｆＮＨ。 １−１．Ｐｏ、　、１．２ｇ＃ＫＮＯｆｆ　、０．３ｇ
／ｌＫＣｌおよび７３ｇ／ＩＤ−マンニトール、ｐＨ５
，７０を含有し、遠心分離されそして０．２μｍフィル
ターを通して口過される。混合物は室温でゆっくり回転
するプラットホームシェーカー（４０ｒｐｍ）上で５時
間インキュベートされる。この消化の間に少量の試料を
顕微鏡試験用に亀り出す。消化はほぼ８０％の細胞が球
状のプロトプラストに変換されるまで続けられる。 フラスコをシェーカーから取り出し、そして細胞／プロ
トプラスト懸濁液を静置する。実質的に細胞およびプロ
トプラストを含まないフラスコ内の培地の上層半分をピ
ペットで吸い上げ捨てる。残りの消化混合物を滅菌５０
ｍ／遠心管に移し、そして臨床用遠心分離器（Ｈｌｌ−
８ＩＩ。 ＩＥＣ）内５００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。 プロトプラストを含むペレットをすすぎ１溶液内に再懸
濁し、臨床用遠心骨１ｉｌ器内１０００ｒｐ易で１０分
間遠心分離する。すすぎＩ溶液はシタ糖（１５４ｇ／ｌ
　、ＭＥＳ　（０，５９ｇ／ｆ）　、ＫＮＯｓ　　（２
５０ｍｇ／　ｌ）　、ＮＨｓＮＯ（２５ｍｇ／ｌ）　、
Ｎａ）ＩｚＰＯａ　・Ｈ２Ｏ（１５ｇ／ｌ）　、ＣａＣ
１２”　２ＨｔＯ（９０■／ｌ）　、Ｍｇ５Ｏ，・７　
Ｈ２Ｏ（２５■／１）、および（ＮＨ４）　−３０４（
１３，４■／ｌ）からなる。遠心管の上層にはプロトプ
ラストバンドがあり、一方破片および無傷の細胞が管の
底に沈澱する。プロトプラスト画分を集め、そしてすす
ぎＩ溶成中での遠心分離を繰り返す。 プロトプラスト画分を遠心管に移し、そして使用まで氷
上で貯蔵する。 ｂ）−ダル弦りひ下−配０卯１旨− 水冷プロトブラスト懸濁液１００−を氷冷ＴＥＮＰ緩衝
液４００−と混合してプロトプラストを溶菌させる。Ｉ
ＥＣ臨床用遠心分離器内２０００ｒｐｍで１０分間の回
転で溶菌物から核を沈澱させる。核ペレットを水冷ＴＥ
ＮＰ５００−に再懸濁し、そして上記のようにさらにも
う一度沈澱させる。各々プロトプラスト懸濁成約１２．
５−からの核ベレットを１０（ｉ％ＴＥ緩衝液２６−に
懸濁し、２０％（ｗ／ｖ）ナトリウムラウロイルサルコ
シン５ｍ／を添加して核を溶菌させ、各々の溶菌物にＣ
ｓＣｌ３２．２ｇおよびｌＯ■／−エチジウムプロミド
（Ｅｔｔ’３ｒ）２゜８９ｒｎｌを添加し、そしてゆっ
くり混合してＣｓＣ１を溶解させることにより８本のＣ
ｓＣｌグラジェント管を準備する。溶解物をポリアロマ
−管（ベックマンＶＴｉ５０，３９−管）内に入れ、そ
してＶＴｉ５０ロータ（ベックマン）内２０℃で１６時
間４５０００　ｒｐｍで回転させる。 １６ゲージの針を備えた３−シリンジを用いてグラジェ
ントからＵＶ蛍光バンドを引き出し、そして集める。Ｖ
Ｔｉ５０内でのＣｓ　Ｃｌ　／　ＥｔＢｒ平衡遠心分離
を繰り返すことによりＤＮＡをさらに精製する。ＵＶ蛍
光バンドをグラジェントから引き出し、そして２０倍Ｓ
ＳＣで飽和させた等量のイソプロパツールでの抽出６回
によりＥｔｎｒを除去する。連続して２容ｒＩｉの蒸留
水、ｏ、ｔｇｍの３．０Ｍ酢酸ナトリウム、ｐｌ−１５
，４、および２容はのエタノールを添加することにより
きれいにしたグラジェント溶液から［３Ｎ八を沈澱させ
る。ＤＮＡ繊維をパスツールピペットに溶液から巻取り
、そして７０％エタノールで洗浄し、次にＴＥ緩衝液３
０Ｆｎｌに溶解し、そしてフェノール：クロロホルム（
１：１）混合物等容量で抽出する。水相を等容量のクロ
ロホルムでさらに抽出し、そしてＯ，］容量の３Ｍ酢酸
ナトリウム、ｐｔ１５．４および２，０容徴のエタノー
ルを添加してＤＮＡを沈澱させる。 ＤＮＡ繊維を巻取り、７０％エタノールで洗浄し、そし
て５分間風乾し、次にＴＥ緩衝液全体で７１ｎｌに溶解
させ、そして使用まで４℃で貯蔵する。 Ｃ）　バコのラム　　゛ツムパン　の　　：タバコＤＮ
Ａを５ａｕ３八エンドヌクレアーゼで部分消化し、そし
てＳＷ４１０−タ（ベックマン）内２００００ｒ四で２
０時間１０−４０ンヨ糖グラジェントを通して沈澱させ
る。グラジェントからの両分をＴＢＥ緩衝液内の０．５
％アガロースゲル上で分析する。１２ないし２２ｋｂｐ
の大きさの範囲内のＤＮＡ断片を含有する両分を集める
。ＤＮＡはｌ／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（＋）　
Ｈ４，８）および２容量のエタノールで沈澱され、そし
てストラタジーンからのＢａｍ１ｌｌ消化され、ホスフ
ァターゼ処理されたＥＭＢＬ３ＤＮＡと連結させる。連
結は、ラムダベクターＤＮＡ１μｇおよび挿入ＤＮＡ０
．ｌｕｇを含有する反応物５μｌを用いてスタラタジー
ンにより推奨される操作および条件に従って行われる。 連結反応物は、ギガバックプラスキット（ストラタジー
ン）を用いて製造会社の指示に従ってラムダファージの
頭部内に充填される。 大腸菌株ＣＥ　Ｓ　２０１　（ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ
、ｖｏｌｕｍｅｌ：ａ　ｐｒａｃｌｌｃａｌ　ａｐｒｏ
ａｃｈ、Ｄ、ｌＪ、Ｇｌｏｖｅｒ編集、ＩＲＬＰｒｅｓ
ｓ、０ｘｆｏｒｄ　ａｎｄ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｄ
Ｃ，ｐ、３３）で滴定されたファージ量は挿入ＤＮＡ　
１８ｇあたりおよそ２ＸＩＯＧファージである。 ｄ）　−ビ′ブシス　　　　コー　　　　”の酵母ＡＨ
ＡＳ遺伝子から放射標識プローブの調製のために実施例
１５に記載した方法および操作に従ってアラビドプシス
Ａ　ＨＡ　Ｓ遺伝子の内部コード配列を含有するＤＮＡ
断片から放射性プローブを調製する。この実験のために
、アラビドプシスへＨΔＳコード領域（Ｇ、　ｌｌａｕ
ｇａｎ等、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２１１
：２６６−２７１．１９８８）内の５ａｃ１１ないしＢ
ｇｌｌｌ制限部位におよぶＤＮＡ断片をｐｃＩＢ１２０
７から単離し、そして放射標識プローブの調製に使用す
る。アラビドプシスＡＨＡ　Ｓ断片０．５μｇを実施例
１５に記載したランダムプライム法でタバコラムダライ
ブラリィのスクリーニングにおいて使用された１μｇあ
たり比活性７Ｘ１０＠ｃｐｍに標識する。 大腸菌株ＣＢ５２０１上に約１００万個のプラークを得
るラムダファージをブレーティングし、そして放射標識
されたプローブでスクリーニングする。ライブラリィス
クリーニングおよび陽性クローンの精製に使用される操
作および条件は実施例１５におけるアラビドプンスＡＨ
ＡＳ遺伝子のラムダクローンを単離するために記載した
ものであるが、使用される１１」ハイブリダイゼーショ
ンおよびハイブリダイゼーション反応物の容量はスクリ
ーニングされる膜リフトの数に比例して調整される。 タバコＳｕＲΔおよび５ｕＲＢ逍伝子（に、　Ｌｅｅ等
、ＥＭＢＯＪ、　７：１２４１−１２４８．１９８８）
に特異的な配列を有するオリゴヌクレオチドをアプライ
ド・バイオシステムズ・モデル３ＢＯＡ　　ＤＮＡシン
セサイザー（カリフォルニア州フォスター・シティ）で
標準プロトコルに従って合成する。 ＳｕＲΔ遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは以下の配列
：　５　’　ＴＴＴＴＴＡＧｃＴＴΔＧＴΔＧＴＧＣＴ
ＣＴＣＡＴＧＴＴＣＴＣＡ３　’である。５ｕＲＢ遺伝
子特異的オリゴヌクレオチドは以下の配列二５しｒ　Ｔ
　ＣＡ　Ｇ　Ｔ　ＴＴ　ＣＧ　Ｔ　ＧＧＣＧＣＴＣＴＣ
ＧＴＣＴｌ”ＣＴＣＡＧＡ３　’である。これらのオリ
ゴヌクレオチドは、Ｍａｎｉａｔｉｓ等（同上、　ｐ、
１２２−１２３　）に記載された方法に従って７−”Ｐ
　　ＡＴＩ’　（３００ＱＣｉ／ｍＭｏ１）の存在下で
１゛４ポリヌクレオチドキナーゼを用い５′ヒドロキシ
末端を放射標識される。オリゴヌクレオチド０．１５ｇ
ｇは、ＡＴＰラベルｌＯＯμＣｉおよびＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ２０単位を含有する反応物５０μｒ内３
７℃で４０分間処理される。放射標識オリゴヌクレオチ
ドは、セファデックスＧ２５クイツクスピンカラム（ベ
ーリンガー・マンハイム）でのゲル排除クロマトグラフ
ィーにより組み込まれなかったΔＴＰから分離され、そ
して１８ｇあたり１１０９ｃｐより大きい比活性を示す
。 １００ｗベトリ皿上での膜リフトは実施例！５に記載し
た方法に従って上記実験から単離された１０個のラムダ
コロニーで作製される。膜をＯＮハイブリダイゼーンヨ
ン緩衝液（ＩＭＮａＣＩ、１％ＳＤＳ、ｔｏ％デキスト
ランスルフェート）５〇−内５５℃でゆっくり揺すりな
がらインキュベートする。−晩のインキュベート後、末
端標識タバコ５ｕＲＡ　　Δ［Ｉ　Ａ　Ｓ遺伝子特異的
オリゴヌクレオチド３０ｎｇおよび切断され熱変性され
たサケ精子Ｄ　Ｎ　Ａ　１．７　ｙＪを膜含有ハイブリ
ダイゼーション反応物に添加する。反応物をゆっくり揺
すりながら５５℃で１晩インキユベートする。膜を室温
で２倍ＳＳＣで３０分間すすぎ、ＯＮ洗浄緩衝液（２倍
ＳＳＣ，１％５ＤＳ）２Ａで５５℃で９０分間洗浄し、
そして室温で２倍ＳＳＣで１５分間すすぐ。 クロネックスライドニングプラススクリーンズ（デュポ
ン）およびＸＡＲ−５フイルム（コダック）でフルオロ
グラフを行う。１日および３日の露出後、Ｓ緩衝液（０
，１倍ＳＳＣ，１％５ＤＳ）内で１５分間煮沸すること
によりそれらのアニールした放射標識プローブから同−
膜が取り去られ、そして上記のハイブリダイゼーション
操作が放射標識タバコ５ｕＲＩ３　　ＡＨＡＳ遺伝子プ
ローブ（上記）を用いて繰り返される。 タバコ５ｕＲＡ　　ＡＨＡＳ遺伝子を含有するラムダク
ローンがＳｕＲΔプローブとの強いハイブリダイゼーシ
ョンシグナルを示すものとして、そしてＳ　ｕ　ＲＢシ
グナルとの弱いかまたは全くシグナルを示さないものと
して同定され、一方５ｕＲＢｉｆｉ伝子を含有するクロ
ーンはその逆を示すものとして同定される。ハイブリダ
イゼーション試験により確認された同定物の証明のため
に、ファージＤＮＡのミニブレツブが実施例１５に記載
された操作を用いて各ラムダクローンから調製され、そ
してＢａｍ１ｌｌ　％口ｃｏＲ１、Ｎｃｏｌ。 ＰｓｔｌおよびＸｈｏ　［制限酵素での消化により分析
される。５ｕＲＡおよび５ｕＲＢクローンはに、　Ｌｅ
ｅ等、ＥＭＢＯＪ、　Ｔ：１２４１−１２４８．１９８
８の発表された配列に基づいたこれらの遺伝子の診断上
の制限断片を含有することが示されている。 ｇ）　バコ Ｒ 実ＪＩＩＬ：　　　ＭＶ３５Ｓ　　　　　バコ上記制限
消化分析によりＳｕＲΔ　Ａ　ＨＡ　Ｓ遺伝子の全体を
含有することがわかったＳｕＲΔラムダクローンのミニ
ブレツブＤＮＡをＸｈｏｌで切断し、そしてＡＨＡＳ遺
伝子を含有する６゜５ｋｂｐ　Ｘｈｏｌ断片をプラスミ
ドベクターｐＢｓ（−）（スタラタジーン）のＸｈｏ　
１部位内にクローン化する。同様に、上記制限消化分析
によりＳ　ｕ　ＲＢ　　ΔＨＡ　Ｓ遺伝子の全体を含有
することがわかったＳ　ｕ　ＲＢラムダクローンのミニ
ブレツブＤＮＡをＢａｍｔｌｌおよびＰｓｔｌ制限酵素
で切断し、そして６．２ｋｂｐ　Ｂａｍ１ｌｌ　−Ｐｓ
Ｌｌ断片をｐＢＳ（−）プラスミドのＢａｍＨＩ　／Ｐ
ｓｔ１部位内に部位−ン化する。これらのクローンの正
確さは期待される制限断片の存在を示す診断上の制限消
化物により証明されている。野生型タバコ５ｕＲＡおよ
び５ｕＲＢ　　ＡＨＡＳＩｊ！Ｉ伝子を含有するｐＢＳ
（−）プラスミドはそれぞれｐｃＩＢ１２０９およびｐ
ｃＩＢ１２１０と表される。 タバコＳ　ｕ　ＲＡ　　Ａ　）ＩΔＳ遺伝子のコート配
列に隣接する５ｓｐｌおよびＳｔｕ［部位がｐｃＩＢ７
１０のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターへの転写融合物を構
纂するために使用される。５ｓｐｌ部位は５ｕＲＡコ一
ド配列のイニンエーターＡ　′ｒＧコドンの７５ｂｐ５
’上流に位置し、そしてＳｔｕ１部位はＳｕＲΔコード
配列の゛ｒＧＡ終止コドンの３０ｂｐ３’下流に位置す
る（Ｋ、１．ｅｃ等、［ｉＭＨＯＪ。 ７：１２４１−１２４８．１９８８　）　、　ｐＣＩ　
Ｂ　ｌ　２０　！ＪをＳｓｐ！およびＳｌｕ！で切断し
、そしてＩｌａｍ旧　リンカ−（ＮＥＢ）をＴ４ＤＮΔ
リガーゼで断片の末端をに付着させる。リンカ−を含む
断片をＢａｍ１ｌｌで消化し、そしてＢａｍ１ｌ！消化
ｐＣＩＢ７１０で連結する。連結反応産物を大腸菌株Ｊ
Ｍ１０９内に形質転換させる。プラスミドＤＮＡのミニ
ブレツブをカナマイシン耐性形質転換体から調製し、そ
して２．１ｋｂｐＳｕＲＡ　　ＡｌｌΔＳ遺伝子挿入物
を含有するクローンを同定するためにＢａｍ１ｌｌで消
化する。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによる正しい転写
を可能にする配向にＳ　ｕ　ＲＡ遺伝子を含有するクロ
ーンを同定するために、これらのクローンのＤＮＡをさ
らにＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの少し５′上流を切断
するｘｂａｌで消化し、そして挿入ＤＮＡ内で非対照的
に切断するＮｅｏ　ｌで消化する。そのようなプラスミ
ドはｐＣＩＢ１２１４と表される。 このプラスミドをＸｂａｌおよびＫｐｎｌ制限酵素で消
化し、そしてキメラ遺伝子を含有するＸｌ＋ａｌ／Ｋｐ
ｎｌ断片をＸｂａｌおよびにｐｎ１７ｔ’ｌ化ｐ　Ｃｌ
　１３２００内に連結する。連結反応物は大腸菌株Ｈ［
３１０１内に形質転換され、そしてミニプレツブプラス
ミドＤＮＡはカナマイシン耐性形質転換体から調製され
る。キメラ遺伝子挿入物を含有するｐｃＩＢ２００を有
するコロニーを同定するためにミニプレツブＤＮＡを診
断制限酵素で消化する。Ｉつのそのようなプラスミドは
ｐＣＩＢ１２１５と表される。このプラスミドを実施例
１６に記載した方法に従ってアグロバクテリウム・チュ
メファンエンスに移送する。ｐ　ＣＩ　Ｂ５４２および
ｐＣｌ［３１２１５を取り込んでいる相当するアグロバ
クテリウム・チュメファンエンスはＣＧＡ　ｌ　４０３
株と表される。 トウモロコシＤＮＡをゼア・メイズ近交系ｒｒｕ　ｎ　
ｋ　２７１　？　（Ｆｕｎｋ　５ｅｅｄｓ　１ｎｌｅｒ
ｎａＬｉｏｎａｌ）から以下の方法に従って単離する：
黄色くなったトウモロコシ実生１００ｇを液体窒素中で
凍結させ、そして冷却した乳鉢と乳棒を用いて細かい粉
末につりつぶす。できた粉末を冷却抽出緩衝液（５０１
ＴＩＭトリスー１ｉｃ　ｌ　、　　ｐ　Ｌ１８．０．　
５０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，０，５０ｍＭＮａＣ１，２
％ナトリウムＮ−ラウ［ｌイルサルコンン（シグマ・ケ
ミカルズ、ミズーリ州セントルイス）、４００ｕｇ／−
エチジウムプロミド）２００−と混合し、そして氷上で
１５分間か（はんする。生成溶液を４℃でＧＳＡロータ
〔ソルノ＼ル／デュポン（Ｓｏｒｖａｌ／ＤｕＰｏｎｃ
）、プラウエア州つイルミントン〕内１００００　ｒｐ
ｍで３０分間２回遠心分離するこ々により透明にする。 生成−Ｌ７ｎは以下の組成（７）Ｃ３ＣＩ／エチジウム
プロミド溶液を調製するために使用される：上清３２．
２ｍＮ、ＣｓＣ１３１、Ｉ　３　ｇおよび１０■／−エ
チジウムブロミ１’　２．　Ｄ　Ｊ、、生成溶液を５５
°Ｃに加熱してＣｓＣ１を完全に溶解させる。加熱後、
溶液をＶＴｉ５０ポリアロマ−管内に入れ、そしてＶ　
′ｌ’　ｉ　５０ロータ内（ベックマン）　４５０００
　ｒｐｍで２０°Ｃ１８時間遠心分離する。 ＤＮＡバンドを紫外線蛍光によるＣｓＣｌグラジェント
内に同□定し、そ（、て１６ケージの針を備えた３−シ
リンジを用いて遠心管から集める。ＤＮＡ含有画分を集
め、そしてさらにＶＴＩ５０ロータ内でのＣｓＣ１／エ
チジウムプロミド平衡遠心分離により精製する。生成Ｖ
る紫外線蛍光バンドを管から引き出す。２０倍ＳＳＣで
飽和させた等量のイソプロピルアルコールを用いて６回
の抽出によりエチジウムプロミドを除去する。２容量の
蒸留水、０１容ｆｌｔの３０Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５
，４，２容量の無水エタノールを連続的に添加すること
によりこの透明溶液からＤＮＡを沈澱させる。Ｉ）　Ｎ
　Ａをパスツールピペットを用いて生成溶液から巻取り
、７０９にエタノールで洗浄し、ＴＥ緩衝液３０Ｊに溶
解し、そして専容爪のフェノール　クロロホルム（１：
　ｌ）で抽出する。生成する水相をさらに、等容量のク
ロロホルムを用いて抽出し、そして３．０　Ｍ酢酸ナト
リウム、ｐＨ５，４、および２容量の無水エタノールを
添加することによりＤＮＡを沈澱させる。ＤＮＡを生成
溶液から巻取り、７０％エタノールで洗浄し、５分間風
乾し、ＴＥ緩衝液ｌＯ−に溶解し、そして使用まで４℃
で貯蔵する。 ｂ）　ウモロコシの　ノムラ　ブラリ　のトウモロコシ
ＤＮＡのゲノＩ、ライブラリィは上記のように調製され
たトウモロコシＤＮＡ３００μｇを用いてストラタジー
ン・カンパニ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、Ｃ＾）により供給さ
れる。ゲノムライブラリィの調製物はラムダダッシュベ
クター（ストラタジーン）内にある。ライブラリィは、
トウモロコシＤＮＡの５ａｕ３Ａ部分消化から誘導され
る【５ないし３ｏｋｂｐ挿入物から構渠される少な（と
もｌＸｌ０’−プライマリイ組換えファージを含む。挿
入物はラムダダッシュのＢａｍｔ１１部位内にクローン
化される。ファージ収量は大腸菌株ＣＥＳ２０１上で滴
定される（ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｄ、　Ｍ、　Ｇ
ｌｏｖｅｒ編集、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ　
ａｎｄＷａｓ旧ｎ１ｒｌｏｎ　　ＤＣ，ｐ、３３）。 実施例１５のアラビドブンスＡＩＩＡＳ遺伝子の内部コ
ード配列を含むＤＮＡ断片から放射性プローブを調製す
る。ｐＣＩＢ１２０７ブラスミトＤＮ八５０μｇを５ａ
ｃｌｌ　および１１＋１でン肖化し、そして消化産物を
０．８％アガロースゲル上での電気永動により分析する
。アラビドプシスＡＩ（Ａ　Ｓコード領域（Ｇ、　ｌｌ
ａｕｇａｎ等、　Ｍｏ１．　ＧｅｎＧｅｎｅｔ、　２１
１：２６６−２７１．１９８８）内の５ａｃｌｌ　ない
しＢｇｌｌｌ制限部位におよぶ１．７ｋｂＤＮＡ断片を
ＮＡ４５ＤＥＡＥメンプラン〔シュライヒャー・アンド
−ン１エル社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈ
ｕｅｌｌ　Ｉｎｃｌ、ニューハンプシャー州クレーン〕
を用いて製造会社により推奨される方法に従ってゲルが
ら単離する。放射標識プローブは、アラビトプンスＡ　
Ｉ（Ａ　Ｓ断片０．３μｇで始めるランダムブライミン
グにより、そしてプライムタイムキット（インタナショ
ナル・バイオテクオ［Ｊジー社。 コネチカット州二ニーへブン）を用いて該キットに添付
された製造会社の方法に従ってハイブリダイゼーション
のその日に合成される。標識反応は１２５μｌまで一定
の率で引き上げられ、そして断片０．３　μｇおよび３
０００Ｃｉ／ｍＭｏ１ａ−”Ｐ　　ｄｃＴＰ１２５μｃ
ｉを含イｒする。標識反応の終了時に、キャリヤー酵母
ｔＲＮＡ５０μｇを反応物に添加し、そしてＤＮＡを５
Ｍ酢酸アンモニウム１２５μ！およびエタノール５００
μｌで沈澱させる。反応混合物をトライアイス内で凍結
させ、融解し、そしてマイクロフユージ（ベックマン）
内設高速度で１５分間遠心分離する。ペレットをＴＥ緩
衝液２００μｌに溶解し、そして組み込まれなかったヌ
クレオチドを放射標識ＤＮＡプローブから６５０セフア
デツクスクイノクスピンノｌラム（ベーリンガー・マン
ハイム・ハイオケミカルズ　インジアナ州インンアナポ
リス）クロマトグラフィーにより製造会社の推奨する方
法に従って除去する。生成する放射標識プローブの比活
性は投入ＤＮＡ１μｇあたりｌ　Ｘ　Ｉ　Ｏ”　（：１
ｌｌＱｌに等しいかまたはそれより高い。ＤＮＡプロー
ブを沸騰水浴内で５分間加熱することにより変性させ、
氷で冷却し、そしてハイブリダイゼーション溶液に添加
する。 （１）−ム　−　ブラ１　のスフ１−二゛トウモロコシ
ライブラリィの８０００００個の組換えファージを大腸
菌株ＣＥＳ２０１上にブレーティングする。１５０ｍｍ
ベトリ皿あたり５００００個のファージの密度で１６枚
のプレートにスタラタノーンにより推奨される方法に従
ってブレーティングする。ファーソブラークの複製膜リ
フトはコロニー／プラークスクリーンメ／ブランズ（Ｎ
ＥＮリサーチ・プロダクツ、デュポンマサチューセッツ
州ボストン）を用いて製造会社により推奨される方法に
従って作成される。 膜を洗浄緩衝液（５倍ＳＳＣ，２％５ＤＳ）中で一晩キ
インキユヘートする。次に膜を４２°Ｃでゆっ（り揺ら
しなからＬＳハイブリダイゼーション緩衝液４００Ｊ内
でインキュベ−１・する（以Ｆ参照）。 １６時間のインキュベーション後、上記のように調製さ
れた３２ｐ−標識アラヒトブシスＡ１１ＡＳ遺伝子プロ
ーブ０３μｇを含有する新鮮ＬＳハイブリダイゼーショ
ン緩衝液４００−に移す。膜を４２°Ｃで１６時間ゆっ
くり揺らしながらインキュベートシ、室温で２倍ＳＳＣ
を用い１回の洗浄あたり１５分間２回洗浄し、４２℃で
ＬＳ洗浄緩衝液（２５にホルムアミド、５倍ＳＳＣ，Ｉ
９イ５ＤＳ）を用い１回の洗浄あたり２時間３回洗浄し
、そして室温ですすぎ緩衝液（０，１倍ＳＳＣ，１％５
ＤＳ）を用いて１回の洗浄あたり３０分間２回洗浄する
。膜をマウントし、そしてクロネックスライトニングプ
ラススクリーンズ（デュポン、プラウエア州つイルミン
トン）およびＸＡＲ−５フイルム（コダック、ニューヨ
ーク州ロチェスター）でフルオログラフを行う。両方の
膜リフト上に陽性フィルムシグナルを与えたプレートの
領域からのプラークをさらに研究するために拾い上げる
。これらは１５０ｍｍプレートあたり３００ないし５０
０プラークの低い密度で再ブレーティングし、そしてス
クリーニング操作を単一のハイブリッドプラークが単離
されるまでさらに２回繰り返す。３つの独立に誘導され
た組換えファージは単一プラーク段階まで精製される。 これらのうち２つ、ＬＣＩＢ１２００およびＬＣＩＢ１
２０２は、それらが再ブレーティングで均一でありそし
て同一なハイブリッドプラークを与えることにおいて安
定である。第３の７７−ジＬＣ＋８１２０１は再ブレー
ティングで大きいおよび小さい両方のサイズのプラーク
を生じる。アラビドプシスＡ）（ΔＳプローブとのハイ
ブリダイゼーションは、小さいＬＣＩＢ１２０１プラー
クのみが均一な配列を含有し大きいプラークは含まない
ことを示す。ＬＣＩＢ１２０１ファージは明らかに不安
定であり、そして大きいプラークを形成しモして欠失Ａ
ＨＡＳ均一配列を有する誘導体を自然に生じる。ＬＣＩ
Ｂ１２００およびＬＣＩＢ１２０２は、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションに寄託されている（上
記参照）。 プラーク精製ファージからのＬＣＩＢ１２００およびＬ
ＣＩＢ１２０２ファージＤＮＡのミニプレツブはラムダ
ソルブ・ファージ・アブソルベント・キット（プロメガ
、ウィスコンシン州マジソン）を伴う操作に従って行わ
れる。ＤＣＩＢ１２００と表されるＬＣＩＢ１２００フ
ァージＤＮＡを制限酵素Ｘｂａｌで消化する。消化断片
をブルースクリプトＳＫ＋プラスミド（ストラタジーン
・クローニング・システムズ）のＸｂａ１部位内にクロ
ーン化する。４．　Ｏｋｂｐ　Ｘｂａｌ断片の挿入物を
含有するクローンは、５ａｃｌｌ　−８ｇｌ１１アラビ
ドプシスＡ　ＨＡ　Ｓ断片を用いるハイブリダイゼーシ
ョンにより同定される。このクローンはトウモロコシＡ
ＨＡＳ遺伝子配列を含む。生成するプラスミドは＄）Ｃ
ＩＢ１２５３と表される。 ＤＣＩＢ１２０２と表されるＬＣＩ８１２０２ファージ
ＤＮＡを制限酵素εｃｏＲＩで消化する。 消化断片をブルースクリプトＳＫ＋プラスミドのＥｃｏ
Ｒ１部位内にクローン化する。？、　５　ｋｂｐ　Ｅｃ
ｏＲ１断片挿入物を含有するクローンは、５ａｃｌｌ−
ＢｇｌｌｌアラビドプシスＡＨＡＳ断片を用いるハイブ
リダイゼーションにより同定される。このクローンはト
ウモロコシＡ）（ＡＳ遺伝子配列を含む。生成するプラ
スミドはｐＣＩＢ１２５５と表される。Ｔ）ＣＩＢ１２
５３およびｐｃｔＢ１２５５のプラスミドＤＮＡを種々
の制限酵素で消化し、アガロースゲル上での電気泳動後
に分析し、そして制限地図をこれらの挿入ＤＮＡに対し
て推論する。ｐｃＩＢ１２５３およびｐ（ｌＢ１２５５
内のＤＮＡ挿入物のこれらの制限地図をそれぞれ第１図
および第２図に示す。 ｐｃＩＢ１２５３およびｐｃＩＢ１２５５内のＤＮＡ挿
入物のＤＮＡ配列はジデオキシ配列決定法（Ｍ、）Ｉａ
ｔｔｏｎ！およびＹ、　５ａｋａｋｉ、　Ａｎａｌ、　
Ｂｉｏｃｈｅ鶴、　１５２：２３２−２３８．１９８６
＞で決定される。 ｌ）叶゛　　　５ ｐＣＩＢ１２５３からの２．１　ｋｂｐ　ＨｉｎｄｌＩ
［−１ＥｃｏＲ［断片をブルースクリプトＳＫ＋プラス
ミド（ストラタジーン）内にクローン化する。生成する
プラスミドＤＮＡのクローン化された挿入物をｒＭ１３
マイナス２０」プライマー：５　’　ＧＴＡＡＡＡＣＧ
ＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３　　’を用いて配列決定する。生
成する部分配列、Ｃｌ５Ｑｂ−２０，ＳｅＱは配列ｌで
示される。 Ｃ１５ｑｂ−２０，ＳｅＱに相補的な配列の１つの読み
枠からの推定されるアミノ酸配列は配列２で示される。 このアミノ酸配列とアラビドプシスおよびタバコＢ　　
ＡＨＡＳ遺伝子との配列（Ｂ、　Ｍａｘｕｒ等、Ｐｌａ
ｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、８５：１１１０−１１１７．１
９８７およびに、　Ｌｅｅ等、εＭＨＯＪ、　７：１２
４１−１２４８．１９８８）　との比較は配列３に示さ
れる。比較はこの読み枠がアラビドプシスとタバコＢ　
　ＡＨＡＳポリペプチドとの間の特定領域に８９％の相
同性を有することを示す。そのような実質的な相同性は
、ｐｃＩＢ１２５３内のＤＮＡ挿入物がトウモロコシＡ
ＨＡＳ遺伝子の一部または全てを含む表示である。完全
なトウモコシＣＩＡＲＡＳ遺伝子配列およびそのフラン
キング配列はその他のジデオキシ配列決定法により得ら
れ、そして配列７に示される。 ２）　ローン ｐｃＩＢ１２５５ＤＮＡは以下のプライマー：　５　”
ＴΔＡＧＡＴＴＧＴＴＣＡＴＡＴＴＧ３′を用いて配列
決定される。これはアラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子のヌ
クレオチド１１６６ないし１１８２位の配列である。第
１位はアラビドプシスＡＨＡＳコード配列のイニシェー
ク−ＡＴＧの八である。ｐｃＩＢ１２５５のＤＮＡ挿入
物の生成する部分配列、Ｃ３ｓａ１６ｓ６ｑ、Ｄａｔは
配列４で示される。Ｃ３ｓａ１６ｓｅｑ、Ｄａｔの１つ
の可能な読み枠からの推定されるアミノ酸配列は配列５
で示される。 このアミノ酸配列とアラビドプシスおよびタバコＢ　　
ＡＨＡＳ遺伝子の配列との比較は配列６に示される。比
較はこの読み枠がアラビドプシスとタバコＢ　　ＡＨＡ
Ｓポリペプチドとの間の特定領域に８１％の相同性を有
することを示す。 そのような実質的な相同性は、ｐｃＩＢ１２５弓内のＤ
ＮＡ挿入物が第２の異なるトウモロコシＡＨＡＳ遺伝子
の一部または全てを含む表示である。完全なトウモコシ
ＣＩＡＨＡＳ遺伝子配列およびその配置配列はその他の
ジデオキシ配列決定法により得られ、そして配列８に示
される。 ａ）転ｆｆΣ上 ＤＣＩＢ１２００およびＤＣＩＢ＋２０２内のトウモロ
コシＡ　ＨＡ　Ｓ遺伝子の転写開始部位を以下の実施例
に記載した方法に従ってプライマー伸長により地図作成
する。制限部位はｐＣＩＢ１２５３およびｐｃＩＢ１２
５５の上流（５′方向）で、そして各Ａ　）ｉ　Ａ　Ｓ
遺伝子の転写開始部位の１Ｏｂｐ以内に導入される。こ
れはムターゲンキット（Ｍｕｌａ−Ｇｅｎｅ　ｋｉｔ）
［バイオラド（８１０−ＲＡＤ）、カリフォルニルア州
すッチモンド１を用い製造会社の指示に従って試験管内
での突然変異誘発により行われる。 トウモロコシＡ　ＨＡ　Ｓ遺伝子は、新たに創生された
部位および２つの遺伝子の終止コドンの下流に位置する
部位で切断する制限酵素により改変された１）ＣＩＢ１
２５３およびｐＣＩＢ１２５５から切り出される。切り
出された遺伝子断片の末端は適当なリンカ−の付着で改
変され、そして前記トウモロコシＡ　ＨＡ　Ｓ遺伝子は
実施例１８の操作に従ってｐ（ｌＢ７１０内のＣａＭＶ
３５Ｓプロモーターカセットに融合される。 ＤＣＩ　Ｂ　１２００およびＤＣＩ８１２０２のトウモ
ロコシＡ　ＨＡ　Ｓ遺伝子を含有するＣａＭＶ発現ベク
ターはそれぞれｐｃＩＢ１２５ＢおよびｐｃＩ３１２５
８と表される。 遺伝子融合物の外側を切断する制限酵素でのｌ肖化１こ
より、ＣａＭＶ　３５　Ｓ／　トウモロコンＡＨＡＳ遺
伝子融合物をｐＣＩＢ１２５６およびｐ（ｌＢ１２５８
から切り出す。放出されたキメラ遺伝子断片の末端を適
当なリンカ−で改変され、そして該断片は同一制限酵素
で同様に改変されたｐｃＩＢ２００のＸｂａ１部位内に
クローン化される。連結反応物は大腸菌株１−Ｉ　Ｂ　
１０１内に形質転換されそしてカナマイシン耐性バクテ
リアが選択される。ミニプレツブプラスミドＤＮＡがカ
ナマイシン耐性形質転換体から調製され、そして制限酵
素消化物を用いて分析して、所望のキメラＣａＭＶ／）
ウモロコシＡ　ＨＡ　Ｓ遺伝子融合物を含むＩ）Ｃ，ｌ
Ｂ２００プラスミドを同定する。ｐｃＩＢ１２５６およ
びｐｃＩＢ１２５８からのＣａ　Ｍ　Ｖ　／　トウモロ
コシＡ　Ｉ−Ｉ　ＡＳ遺伝子融合物を含む二重ベクター
は、それぞれｐＣＩＢ１２５９およびｐｃＩ８１２６１
と表される。 大腸菌から実施例１６に記載した方法に従ってヴイルレ
ンスーヘルパープラスミドｐｃ’５５４２を生じるアグ
ロバクテリウム・チュメファシエンスＡ１３６株へｐｃ
Ｉ８１２５９およびｐＣＩＢ１２６１を移入するために
三親交雑が使用される。ｐｃＩＢ５４２およびｐｃＩＢ
１２５９を組み入れたアグロバクテリウム・チュメファ
ンエンスＡ１３６株は株ＣＧＡ１４５０と表され、そし
てｐｃＩ８５４２およびｐｃｉ８１２６１を組み入れた
株は株ＣＧへ１４５２と表される。 ニコチアナ・タバカムのｆａ　３５　ｇを液体窒素で凍
結させ、そして乳鉢と乳棒で細かい粉末にすりつぶすこ
とにより組織から核を単離する。 この粉末を粉末化緩衝液（０，３Ｍシヨ糖、５０ｍＭト
リス、ｐＨ８，５ｍＭ塩化マグネシウム、５ｆｆＩＭナ
トリウムビスルファイト、０．５％ＮＰ４０）２５０−
に添加し、そして１０分間氷上でかくはんする。この混
合物を６層のチーズクロスを通して口過し、そして液体
を遠心管に移しそして７００Ｘｇで１０分間遠心分離を
行う。 ペレットを粉末化緩衝液内に再懸濁しそして再び遠心分
離を行う。ベレットを粉末化緩衝液内に再び再懸濁しそ
して再び遠心分離を行う。ベレットを再び粉末化緩衝液
内に再懸濁し、そしてこの懸濁液を１０ｍＭｈリス、ｐ
ｌ（８，１，５ｍ１ｉｌ塩化マグネンウム、１４０ｍＭ
塩化ナトリウム、２４％ショ糖、１％Ｎｌ”４０を含有
する冷ショ糖クツション２〇−上に載せる。これらの管
は１７０００Ｘｇで１０分間遠心分離される。この段階
でペレットはほとんどの核およびデンプン粒を含有する
。高分子ｆｆｉ　Ｉ）　Ｎ　Ａはｕａｎｔａｔ　ｉｓ、
　Ｔ、等。 同上に実質的に従って核から単離される。ＤＮＡをＭｂ
ｏ　＋で部分消化し、そしてＥＭＢＬ３クロニングベク
ターのｎａｍｔ１１部位内に連結する。 約３０００００個のプラークが標識されたＰＲ−１ｂｃ
ＤＮＡプローブでスクリーニングされる。 ５０の陽性クローンが単離され、そして特徴づけられる
。陽性プラークは精製されそして制限分析により特徴づ
けられる。これらのクローンは制限地図作成により８つ
の明らかな群に分類される。クローンの１つはｔｏｂｃ
ｈｒＰＲ１０１３と同定される。ｔｏｂｃｈｒＰＲ１０
１３の部分制限地図は第１図に示される。ＤＮＡの単離
およびＤＮＡ操作は実質的にはＭａｎｉａｌｉｓＴｌ等
、同上に記載されている。 ｂ）　Ｂ−ＰＲＩＯ１３Ｃ１の ｔｏｂｃｈｒＰＲｌｏ　１３からのＣ１ａｌ断片はブル
ースクリプトプラスミド（ストラタノーン・クローニン
グ・システムズ）内にサブクローン化され、ｐＢＳ−Ｉ
’ＲＩ　Ｏｌ　３Ｃｌ　ａを生成する。ｐＢＳ−ＰＲｌ
　０１３Ｃｌ　ａからの２ｋｂ　Ｘｈｏｌ　−Ｂｇｌｌ
ｌ断片を配列決定し、そして９１３ないし１７１１位（
配列９）がＰｆｉｎｔＺｎｅｒ、　Ｕ、Ｍ等、Ｍｏ１．
　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｌ、　、　２１１　：２（１０−
２０５（１！Ｊ８８）により単離されたＰＲ−１ａに対
するｃＤＮΔＤＮＡンの配列に完全に一致することが見
出された。クローニング操作の間のタバコＤＮＡの可能
な再配列はゲノムＤＮへの予測された制限断片を分析す
ることにより除外される。ｐＢＳ−ＰＲ１０１３Ｃ１ａ
の配列情報および制限地図に基づいて、ゲノムタバコＤ
ＮＡのｌ１ｃｏＲＩ、１１ｉｎｄｌｌ、　Ｘｈｏｌ＋　
Ｂｇｌｌｌ、または１１１ｎ旧１！＋Ｐｓｌｌのいずれ
かでの消化は、ＰＲ−１ａ遺伝子を含むそれぞれ３．２
ｋｂ、　６．７ｋｂ、　２．　Ｏｋｂまたは６．４ｋｂ
の断片を生じるであろう。この予測を確かめるために、
タバコ染色体ＤＮＡ３μｇを適当な酵素で消化し、そし
て０．７％アガロースゲルで電気泳動を行う。ＤＮＡを
ナイロン膜に移し、そしてＰＲ−１ａ遺伝子の標識され
たｘｈｏｌ　−Ｈ５ｌＥ１１制限断片で探索する。対照
としてｐＢｓ−ＰＲＩＯ１３Ｃ１ａＤＮ八を消化しそし
て同一ゲルで電気泳動を行う。予測されたようにＥｃｏ
旧、Ｉｆ　ｉ　ｎ　ｄ　Ｉ［１、Ｘｈｏｌ＋〇ｇｌｌｌ
、および旧ｎｄｌ［→−Ｐｓｔｌ消化物は、対照バンド
と共に移動する期待される分子爪のハンドを作る。それ
故に、ｔｏｂｃｈｒＰＲ１ｏ１３クローン内に含まれる
ＤＮＡはタバコゲノム内のＤＮＡの隣接片を表ず。 ｃ）　Ｂ　−ＲＯ３の Δ　ｔｏｂｃｈｒＰＲ１０１３からブルークリプトプラ
スミドの唯一のＥｃｏＲｌ　部位内にＰＲ１ａ遺伝子を
含有する３、　６　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片をサブクロー
ニングすることによりプラスミドｐＢＳ−ＰＲ１，０１
３Ｅｃｏは構築される。プルスクリプトプラスミド（カ
タログ番号２１２０３）はスタラタジーン・クローニン
グ・システムズ（カリフォルニア州う・ジョラ）から入
手できる。ｐＢＳ−ＰＲＩＯ１３Ｅｃｏの構造は制限地
図作成とＤＮＡ配列決定の両方により確認される。 Ｂ、また、ｐＢＳ−ＰＲＩＯ１３Ｃ１ａをＥｃｏＲｌで
消化し、そしてＰＲ−１ａ遺伝子を含有する３、６ｋｂ
断片を単離する。ブルースクリプトをＥｃｏＲＩで消化
し、予め単離された３、　６　ｋｂ　ＥｃｏＲ１断片と
混合し、そして連結する。 ｄ）　−ＲＯ３ｃΔの 太 プラスミドｐＢｓ−ＰＲ１０１３ＥｃｏをＰｓ目で消化
し、そしてＤＮＡ断片を２．５％低ゲル化温度のアガロ
ースゲルで分離する。ブルースクリプトベクターおよび
タバコＤＮＡの３．０ｋｂ断片を含有する大断片を正確
に切り出し、そして６５℃に加熱してアガロースを出解
させる。 ２μｌを水１５μ！に添加し、そしてＤＮＡをアカロー
ス内で連結させる。−晩のインキュベート後、ＤＮＡを
含有するアガロースを次に６５°Ｃで１０分間インキュ
ベートすることにより融解させ、そして次に実質的に上
記のようにアガロースから形質転換させる。６つの推定
上の陽性構築物の各々からのバクテリアの培養物の一部
を１００μｇ／−のアンピシリンを含有するＬＢ培地（
Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊ、１１．、ｌＥｘｐｅｒｉｍｅｎｌｓ
　ｉｎ　Ｍｅｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７２）　５−内に接種
し、この培養を３７℃で一晩インキ、ベートする。臨床
用遠心分離器内最高速度で１０分間遠心分離することに
より細胞を集める。上清を除去し、そして細胞を５０−
グルコース、２５ｍＭトリス、ｐ　Ｈ７，５、ｌＯｍＭ
ＥＤＴＡからなる溶ｎ　ｌ　ＯＯｕ　ｌ内に再懸濁し、
そしてその懸濁液を１．５ｍ！エッペントルフ遠心管に
移す。新たに調製した１０■／ｄリゾチーム溶液２５μ
ｌを添加し、そして懸濁液を氷上に１０分間放置する。 ０．２Ｎ水酸化すトリウムおよび１％ドデンル硫酸ナト
リウムを次にｒｆ＋加し、そして懸ｐＡ液を混合し、そ
して氷上に２分間放置する。２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４，８）２００μｌを添加し、そして溶液を１５分間放
置する。生成溶液をエッペンドルフ遠心分離器内最高速
度で１０分間遠心分離を行う。上清を新たな遠心管に移
し、そしてフェノール／クロロホルム（１・１）４００
μｌで抽出する。水相を新たな遠心管に移し、そしてク
ロロホルム４００μ！で抽出する。この抽出物からの水
相を新たな遠心管に移し、そして２容量のエタノールの
添加によりＤＮＡを沈澱させ、−２０℃で３０分間貯蔵
する。沈澱ＤＮＡをエッペンドルフ遠心分離器内最高速
度で１５分間遠心分離を行って集める。エタノールを除
去しそしてベレットを８０％エタノールで洗浄する。エ
タノールを再び除去し、そしてベレットを風乾にさせる
。ＤＮＡをＴＥ緩衝液１００μ！内に再懸濁する。構築
物をｐｓｔｔで消化して変更する。親プラスミドＩ）Ｂ
Ｓ−ＰＲＩ０１３Ｅｃｏからは６ｋｂおよび約６５０ｋ
ｂのバンドが得られ、それより小さいものが新しい構築
物では欠けている。これらのプラスミドの一つはプラス
ミドｐＢＳ−ＰＲＩ　０１３ＥｃｏΔＰ’ｓｔとして選
択される。このサブクローンの構造は配列分析により確
認されている。 ｐＢＳ−ＰＲ１０１３Ｅｃｏの予備的な制限地図が確立
されている。Ｘｈｏｌ制限部位はＰＳｔ１部位の約１２
００ｋｂ上流に位置している。プラスミドｐＢＳ−ＰＲ
Ｉ　Ｏｌ　３ＥｃｏΔＰｓｔをｘｈＯＩで消化してそし
て断片を０，９％低ゲル化温度のアガロースゲルで分離
する。２つの断片が３゜９ｋｂおよび１．７ｋｂの大き
さで視覚化される。３゜９ｋｂ断片を含有するバンドを
ゲルから注意深く切り出しそして実質的に上記のように
アガロース内に連結する。アガロースを融解しそして上
記のように活性大腸菌株ＨＢＩＯＩ内でＤＮＡを形質転
換させる。上記のように細胞をＬＢａｍｐプレート上に
ブレーティングし、そしてイ゛−ンキュベー卜する。１
つの推定上のコロニをＬＢ−ａｍｐ培地内に接種し、そ
して実質的に上記のようにＤＮＡを単離する。この新し
いサブクローンｐＢＳ−ＰＲＩＯｌ　３ＥｃｏΔＰｓｔ
ΔＸｈｏの構造は制限分析およびＤＮＡ配列決定により
確認されている。 【）　　　　２７　の； プラスミドｐｃＩＢｌｏ１．３（カタログ番号６０２４
、１　’）をクロネテック・ラプス（Ｃ１ｏｎｅＬｅｃ
ｈ　Ｌａｂｓ）　（カリフォルニア州パロ・アルド）か
ら入手される。このプラスミドをまず最初にＢａｍ１１
１で次に５ａｌｌで消化する。プラスミドｐＢＳ−ＰＲ
ＩＯ１３ＥｃｏΔＰｓｔΔＸｈｏをＰｓｔｌで消化する
。次式。 ５　’−ＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣΔ−３１の配列を有す
るＰｓｔｌ／Ｂａｍ１ｌｌ　アダプターをアプライド・
バイオシステムズ・シンセサイザーを使用し、Ｂ−シア
ノエチルホスホルアミデート化学を用いて合成し、そし
て逆相ＨＰＣＬにより精製し、そしてＰｓｔｌ消化ｐＢ
Ｓ−ＰＲＩＯＩ３ＥｃｏΔＰｓｔΔＸｈｏに連結する。 生成する材料を最初にＢａｍ１ｌｌで次にＸｈｏｌで消
化する。 Ｂａｍ１ｌｌ　／Ｘｂｏｌ断片を単離し、消化されたｐ
ｃＩ８１０１、３に連結し、そして形質転換する。ｐＣ
ＩＢ２７０の推定上のクローンを単離し、そして制限お
よびＤＮＡ配列分析により確認する。 ・ラプス、　（Ｂｅｔｔ＋ｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅｒｃｂ　
Ｌａｂｓ、）　（メリーランド州ガイザースブルグ）か
ら人手してもよい。どちらかのベクターを最初にＡｓｐ
７１８で次にＰｓｔｌで消化する。０，７％ＴＡＥ低温
ゲル低温ゲル化アガロ−重上泳動によるポリリンカー片
の除去後、生成ベクターＲＦを混合し、そしてアガロー
ス内で上で調製した１、Ｉｋｂ断片と連結する。ＤＮＡ
を形質転換し、推定上の陽性プラークを単離し、そして
それらの構造をＲＦ　　ＤＮＡの分析により確認する。 プラスミドｐＢＳ−ＰＲＩ　Ｏ１３ＥｃｏΔＰｓｔΔＸ
ｈｏをＰｓｔｌおよびＡｓｐ７１８でｌ角化する。 １、　ｌｋｂ　Ａｓｐ７１８　／Ｐｓｔｌ断片を１％Ｔ
ＡＥ低温ゲル化アガロースゲル上での電気泳動の後に単
離する。コーリーファージＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３
ｍｐ１９の複製体（ＲＦ）をＭｅａｓｌｎｇ、　Ｊ。 Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙａｏｌ、　１０１．２０（１９８
３）に従って調製する。 また、これらのベクターはベセスダ・リサーチ単鎖Ｍ１
３ｍｐ１８−ＰＲ１０１３ＥｃｏΔＰｓｔΔＸｈｏファ
ージＤＮＡをＭｅｓｓｉｎｇ、同上に従って単離する。 次式： ％式％ の配列のｔｓｂｐオリゴヌクレオチドプライマーを上記
のように合成する。プライマーをＴ４ボリヌクレオチド
キナーゼ（Ｍａｎｌａｔｉｓ、Ｔ、等、同上ｐ、　１２
５）で非標識ＡＴＰを用いてホスホリル化する。３７℃
で６０分間のインキュベーションの後反応物を６８６Ｃ
まで１５分間加熱し、そして次に氷上に置く。このブラ
イマーおよびＭＩ３−４０７オワードシークエンシング
ブライマー（二ニー・イングランド・バイオラプス＃１
２１２）を単鎖Ｍ１３ｍｐ１８−ＰＲ１０１３ＥｃｏΔ
ＰｓｔΔＸｈｏＤＮＡに、ｌ：ｌ：１のモル比で混合後
、６８℃で１０分間加熱後ゆっくり冷却することにより
アニールする。アニルされた混合物を氷上に置き、そし
て１０倍伸長緩衝液（２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７，５
，６ｍＭＭｇＣ１２，１ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭ　　ｄ
ＡＴＰ。 １ｍＭ　　ｄＣＴＰ、１ｍＭ　　ｄＧＴＰ、１ｍＭ　　
ｄＴＴＰ）ｌ／１０容量を添加する。ＤＮＡポリメラー
セＩ大断片（クレノー断片、ニュー・イングランド・バ
イオラプス＄２１０）ｔｏ小単位よびＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（ＮＥＢ＃２０２）０゜１単位を添加し、そして反応
を１５℃で１４時時間待させる。その際に各々の酵素を
付加的に追加し、そして混合物が活性ＪＭＩ　Ｏｌ大腸
菌を形質転換するために使用される前に反応をさらに２
時間２５℃で行う。 突然変異したファージを同定するためにプラークをシー
ンスクリーンプラス（デュポン）にもち上げ、そして製
造会社の推奨に従って操作する。０．９ＭＮａＣ１を含
有する製造会社のハイブリダイゼーション溶液中、フィ
ルターを４時間プレハイブリダイゼーションし、そして
４２℃で一晩ハイプリダイゼーションする。このフィル
ターを次に引き続いて０．９Ｍの濃度のＮａＣｔで洗浄
し、そして各段階で５℃毎に洗浄１度が増加するオート
ラジオグラフィーにより追跡する。ハイブリダイゼーシ
ョンにより突然変異したことが同定されたプラークを塩
基変換の確認のために配列決定する。 複製体のそのような候補の１つ（Ｍ１３ｍｐ１８−ＰＲ
１０１３ＥｃｏΔＰｓｔΔＸｈ。 Ｎｅｏ）を単離し、そしてＰｓｔｌおよびＢｓｔＥＩＩ
で消化し、Ｍ１３ｍｐ１８−ＰＲＩＯ１３Ｅｃ。 ΔＰｓｔΔＸ　ｈ　ｏ内の相当する非突然変異３９４ｂ
ｐの断片を置換するために使用される３９４ｂｐの断片
を生成する。これにより、９３０位でＮｃｏ１部位を有
しＰＲ−１ａ遺伝子のコード配列２１７ｂｐが次に続＜
ｐｃＩＢ２６Ｂが調製される。このプラスミドの構造は
配列分析により確認されている。 ｌ）　バコ　Ｒ−Δプロモーター　セ　　の註 Δ、ｐＢｓ−ＧＵＳ１．２の構築 ｐＢＳ−ＧＵＳｌ、２はｐＲＡＪ　２６５（Ｊｅ［ｅｒ
ｓｏｎ、　Ｒ，へ１等、ＥＭＢＯＪ、　６．３０９１−
３９０７（１９Ｂ？）およびＧＵＳ　Ｕｓｅｒ　Ｍａｎ
ｕａｌ、Ｃ１ｏｎｅｊｅｃｈ　Ｌａｂｓ、　Ｐａ１ｏ　
Ａｌｔｏ、　Ｃａ、　）からの３９１ｂＤの５ａｌｌ／
５ｎａｂｌ断片、ｐＢ　Ｉ　２２１　（Ｊｅｆｆｅｒｓ
ｏｎ、Ｒ，Ａ、等、ＥＭＢＯＪ、同上）からの１７０７
ｂｐの５ｎａｂｌ／ＥｃｏＲＩ断片、および５ａｌｌと
ＥｃｏＲＩで消化したｐＢｓの３部分の連結により創生
される。形質転換体を単離し、そして制限消化およびＤ
ＮＡ配列決定により分析する。１つの確認されたクロー
ンをｐＢＳＧ　Ｕ　Ｓ　＋、、　２と命名する。 Ｂ、ｌ見り艶ハｙｉ４Ｌ １．０％低ゲル化温度のアガロースＴＡＥゲル上でのＸ
ｈｏ　ＩおよびＮｅｏ　Ｉ消化ｐｃＩＢ２６８の電気泳
動後９３０ｂｐの断片を単離する。この断片を次にＸｈ
ｏｌとＮｃａｌで消化したｐＢＳ−Ｇｕｓｔ。 ２内に連結する。形質転換体を単離し、そして制限消化
およびＤＮＡ配列決定により分析する。 １つの陽性プラスミドを選択し、そしてｐｃｉ８２６９
と命名する。 ＰＲ−ＩＡプロモーターがバクテリアβ−グルクロニダ
ーゼ遺伝子の発現を制御するプラスミドｐｃＩＢ２６９
の構築は、参照により本明細書に編入する審査中の米国
特許出願第１６５６６７号に記載されている。ＰＲ−Ｉ
Ａ制御ＡＨＡＳ遺伝子を構築するために、実施例１５に
記載された野生型アラビドプシスＡ　ＨＡ　Ｓ遺伝子を
含有するｐｃＩＢ１２０７をＮｃｏｌとＸｂａｌで消化
し、そしてＮｃｏｌおよびＸｂａ　ｌ消化ｐｃＩＢ２６
９プラスミドと連結する。連結反応物は大腸菌株ＪＭ１
０９内に形質転換される。ミニプレツブプラスミドＤＮ
Ａがアンピシリン耐性形質転換体から調製され、そして
最初の２．０ｋｂｐ断片の代わりに３．３ｋｂｐ断片を
含むｐＣＸＢ２６９を同定するためにＮｅｏ　ＩとＸｂ
ａｌで消化される。 １つのそのようなプラスミドをｐｃＩ８１２１６と表す
。 にｐｎｌとＸｂａｌで消化される。１つのそのようなプ
ラスミドをｐｃｌＢ１２１７と表す。このプラスミドは
大腸菌株ＨＢＩＯＩから三親交雑によりｐｃＩＢ５４２
ヴイルレンスヘルパーブラスミドを含むアグロバクテリ
ウム・チュメファシエンス株Ａ１３６に実施例１６に記
載した方法に従って形質転換される。ｐＣＩＢ５４２お
よびｐｃＩＢ１２１７を含むアグロバクテリウム・チュ
メファンエンス株Ａ１３６の１つの弔離体は株ＣＧＡ　
ｌ　４０４と表される。 キメラＰＲ−ＩＡ／ＡＨＡＳ遺伝子をにｐｎｌおよびＸ
ｂａｌでの消化によりｐｃＩＢ１２１６から切り出し、
そしてにｐｎｌおよびＸｂａｌ消化ｐｃＩＢ２００に連
結する。連結反応物は大腸菌株ＨＢ１０１内に形質転換
される。ミニプレツブプラスミドＤＮＡがアンピシリン
耐性形質転換体から調製され、そしてＰＲ−１ａ／ＡＨ
ＡＳ遺伝子断片を含むｐｃＩＢ２００を同定するために
ｔｏｏｇ／−力ルベニンリン含有のＴＢブロス（ＢＲＬ
フォーカス）内で株を生長させることによりＤＨ５ａ（
ＵＲＬ）内でプラスミドｐＣＩＢ１２１０　（実施例１
７）を増殖させる。 １）、　３．　Ｃｌｅｗｅｌおよびり、Ｒ，１ｌｅｌｉ
ｎｓｋｉ、Ｊ、Ｂａｃｊｅｒｉｏｌｌｌｏ：６６８−６
７２（１９７２＞のトリトン」二澄み法により、３倍容
量の試薬および１０％トリトンＸ−ｔＯＯではな（２％
トリトンＸ−１００を使用する変更を行ってプラスミド
ＤＮＡを単離する１、ベックマンし８８０超遠心分離機
で垂直ロータ内６５０００ｒｐｍで４時間または４５０
０Ｏｒｐｍで１４時間の遠心分離により形成されるエチ
ジウムプロミドを含有する塩化セシウムグラジェント上
のバンド形成の後にプラスミドを集める。 ２０倍ＳＳＣで平衡化したイソプロピルアルコールで繰
り返し抽出することによりエチジウムプロミドを除去し
、モしてｌ容量の１１０１１Ｉトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８
，０、およびＯ１８容量のイソプロパツールの添加によ
りＤＮＡを沈澱させる。 このｐＣＩＢｌ　２１０ＤＮＡ２ｍｇを５ｐｅｌで完全
に消化し、′ｒΔＥ緩衝液中の低ゲル化温度アガロース
（ＵＲＬ）の０．７％ゲルで１ボルト／ｃｍでの電気泳
動により次に分離される約４００ｏｂｐと５１９５ｂｐ
の２つの断片を得る。４　ｋｂｐのバンドをゲルから切
断し、６５℃で５分間融解し、等容量の水で希釈し、そ
してさらに１０分間３７℃に維持する。フェノールでの
２回連続の抽出、次いで０．１容量の３Ｍ酢酢酸上トリ
１クムよび２容量の９５％エタノールの添加によりＤＮ
Ａをアガロースから分離する。 単離した断片を次に１■／ｒｎｌの濃度の１０ｍＭトリ
ス−ＨＣ１ｐＨ７，０に溶解させる。１０倍連結塩（０
，６６Ｍ１−リス−〇Ｃｌ　、　　Ｉ）　Ｈ７，５，０
，６６Ｍ　　ＭｇＣｌ□　　０．１Ｍ　　ＤＴＴ、０．
６６ｍＭΔＴＰ）０．１容量および”ｒ４　Ｄ　ＮΔリ
ガーゼｌ単位を添加し、そして反応物を１５°Ｃで１時
間インキュベートする。反応混合物を凍結させ、そして
ＤＮＡ０．５μｇを含Ｒする試料を０゜７％ＴＢアガロ
ースゲルで電気泳動し起こった連結の範囲を決定する。 この結果に応じて、反応をリガーゼまたは５ｐｅｌの添
加の後に続け、混合物中の大部分の断片が１２ないし１
６ｋｂｐの範囲となるまでさらに追跡する。等容量の５
Ｍ酢酸アンモニウムおよび２容量のエタノールの添加に
よりＤＮＡを次に沈澱させる。沈澱したＤＮＡを７０％
エタノールで洗浄し、そして風乾する。 ＤＮＡを滅菌緩衝液中に溶解し、そして下記のようなト
ウモロコシプロトプラストを形質転換するために使用す
る。 異なる遺伝子型のアグロバクテリウム・チュメファシエ
ンスをマンニトールおよびグルタメート塩培地を加えた
ＡＢ最少培地（Ｗａｔｓｏｎ、　Ｂ、等。 Ｊ、　（Ｉａｃｔｅｒｉｏｌ、　１２３．２５５（１９
７５））上で４８時間２８℃で生長させる。バクテリア
を沈澱させ、２倍希釈したＭＳＢＮ培地中に再懸濁し、
そして２５°Ｃで３時間放置する。使用前にバクテリア
懸濁液はＭＳＢＮまたはグルタメート塩で希釈され０．
１と０．２のあいだの最適密度（ＯＤ）とする。試験管
内で栽培されたニコチアナ・タバカムの園芸品種Ｘａｎ
ｔｈｉ、Ｈａｖａｎａ３８、ＳＲＩおよびＣｏｋｅｒ１
７６植物から無菌的に５−７　ｍｍの葉ディスクを切り
出し、そしてＲ，１ｌｏｒｓｃｈ等、５ｃｉｅｎｃｅ　
２２７：１２２９−１２３１（１９８５）に従ってバク
テリア懸濁液Ａ液内に浸漬し、そしてその中に６ないし
１０分間保つ。対照ディスクを浸漬し、そして同じ時間
グルタメート塩培地内で培養する。葉ディスクを口紙上
に吸い過剰なバクテリアを除去し、モしてＭ、ＳＢＮ培
地に移す。葉ディスクを次にＭＳＢＮ培地上の口紙に移
す。覆いをしたプレートを２５−２８℃で４８時間イン
キュベートする。葉ディスクを次に５００■／ｌカルベ
ニシリンおよび２００■／！バンコマイシンを含有する
液体ＭＳ１３Ｎ培地中に浸漬し、そして形質転換された
細胞を選択するための１００■／１カナマイシン、５０
０■／１カルベニシリンおよび２００■／１２バンコマ
イシンを含有する固化（０，８％アガー）ＭＳＢＮ培地
上に下側を上にして置く。カナマイシンおよびカルベニ
シリンは培地の残りをオートクレーブした後に口過滅菌
した溶液として添加される。培養プレートを２５−２８
°Ｃで明所中インキュベートする。葉ディスクを同じ組
成の新鮮培地に１週間毎に移す。 ｂ）盪立双へ叔よ坊ゴ宋受ｌヨー ＭＳＢＮ選択培地上の葉ディスクに形成されるｗ条が約
１ｃｍの丈になったとき切り出し、そしてＭ　Ｓ　Ｂ培
地に移す。このＭＳＢ培地はＭＳ多量、および少量塩お
よびＦｅ−ＥＤＴΔ（ギブコ＃５００−１１１７　；４
．３ｇ／ｌ）　、Ｂ５ビタミン（にａｍｂｏｒｇ、Ｏ，
Ｌ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ５ｅｒ
ｃｈ、５０：１５１−１５８．１９１３８）　、１００
ｍｇ／　１ミオイノシ］・−ルおよび３ｏｇ／（ｌショ
等、　　ｐＩ−１５，８からなり、そして１００■／１
カナマイシン、５００■／′１カルベニシリンおよび２
００■／ａバンコマイシンで補足されているｏ　ｉ苗条
が冗なる形質転換細胞から誘導されることを確認するた
めに、苗条を異なる葉ディスクからまたは同じ葉ディス
クの異なる面から切り出す。小植物を根が十分に発育す
るまで発育させる。小植物を分割して根づいた苗条培養
物の復製物を得る。根づいた小植物を土−バーミキュレ
ート混合物に移植し、そして温室に移す。新たに鉢植し
た小植物は湿度を保ち、そししてそれらの硬化を促進す
るために数日間光を遮る。植物を通常の方法に従って栽
培し、そして成熟するまで生長させる。花芽形成時に花
に自家受粉させる。 種子を成熟後に集める。 アグロバクテリウム株ＣＧＡ　１４０２およびＣＧＡＩ
４０３を実施例２３に従う儲ディスク法によりタバコを
形質転換するために使用する。 選択から誘導される形質転換された植物を生長させ成熟
させる。ＭＳＬＩＮ選択培地」二の儲ディスクから形成
されるカルスはカルス生長培地りで維持される。カルス
は、上記のようなＭ　Ｓ　ｒ３Ｎ培地にカルス片を移す
４二とによりトう〉スジエニック植物を再生するために
使用される。）Ｊルスおよびカルスから誘導される懸濁
培養物は実施例１１に記載したような除草剤耐性の発現
を決定するために使用される。カルスおよび１′！濁培
養物はまた、Ｆ記の化学物質誘導の後の除草剤耐性の発
現を決定するためにも使用されろ６゜実】ｌ汁ｌ」−：
ゼ　・メ　ズ 実施例１２に記載したカルスを全部で６力月間継代培養
する。継代培養のために選択したカルスの型は、比較的
非粘着性の球状でそして非常に砕けやすいものであり、
そのためにカルスは液体培地内に置かれて小さい個々の
細胞塊に分かれる。大きく広がった細胞の塊を含む培養
物は保持されない。トウモロコシ優良近交系Ｆｕｎｋ２
７１７の特定のカルスの一部５００■を１２５−プロン
グフラスコ内に２■／１２゜４−Ｄを含有するＮ６培地
３０ｒｎ！中に置く。シレーターシェーカー（１３０ｒ
ｐｍ、動程２．５−）上暗所２６℃で１週間の培養後、
培地を新鮮な培地に交換する。さらに１週間後懸濁液を
再びこの方法で継代培養する。その際に、培養物は検査
され、そして非常に多くの広がった細胞を示さないもの
を保持する。好ましい組織は通常の細胞塊より特徴的に
平滑な表面を有する濃密な細胞質分裂細胞塊からなる。 保持された細胞は少な（とも５０％がこれらの小さい細
胞塊を示す細胞である。これらの懸濁物はまた１週間よ
り短い倍加時間である速い生長速度を有する。この懸濁
培養物は、０．５ＪＰＶＣ（充填細胞容量：ピペット内
に固定された細胞容量）を新鮮培地２５−に移すことに
より継代培養される。この方法での４ないし６週間の継
代培養の後、培養物は１週間毎の継代培養あたり２ない
し３倍に増加する。７５％以上の細胞が望ましい形態で
ある培養物をさらに継代培養して維持する。この系はフ
ラスコ内容物が最良の形態を示すフラスコを継代培養の
ために常に選択することにより維持される。孔径６３０
μｍのステンレス鋼ふるいを通す定期的な口過は培養物
の分散を高めるためにある場合に用いられるが、必ず必
要なものではない。 所望の形態を有するゲア・ノイズ懸濁培養物は、上記の
ようにアメリカン・タイプ・カルチャー・フレクション
（ＡＴＣＣ）寄託されている。 実」１例ｊユｉ：ゼ　　　　の　　　　　゛の実施例２
５において調製された懸濁培養細胞のＰＶＣＩ−１，５
−を４％（ｗ／ｖ）セルラーゼＲ３とＫＭＣ（８，６５
ｇ／１Ｋｃｌ、１６．４７　ｇ　／　Ｉ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ
　ｔ・６Ｈ２０，１２，５ｇ／ｆＣａＣ１，−２Ｈ２０
，５ｇ／　ＩＭＥＳ、　　ｐ　Ｈ５，６）塩溶液内の１
％（ｗ／ｖ）ロジームとからなる口過滅菌された混合物
１Ｏ−１５ｄ中インキユベートする。消化を３０℃でゆ
っくり揺れるテーブル上３〜４時間を行う。調製はプロ
トプラスト放出に対して倒立顕微鏡下で追跡される。放
出されるプロトプラストは次のように集められるニ調製
物を１００８ｍメツシュシーブを通して口過し、つぎに
５０μｍメツシュシーブを通して口過する。プロトプラ
ストを酵素溶液の最初の容量に等しい容量のＫＭＣ塩溶
液でシーブを通して洗浄する。プロトプラスト調製物１
０−を各々使い捨てのプラスチック遠心チューブに入れ
、そして０．６Ｍショ糖溶液（０゜Ｌ％（ｗ／ｖ）ＭＥ
ＳおよびＫＯＨでＩ）　Ｈ５，６に緩衝化）１．５−２
−を下に積層する。このチューブを６６０−１Ｏ０Ｘで
１０分間遠心分離し、そして界面のプロトプラストバン
ドをピペットを用いて集めそして新たなチューブに入れ
る。プロトプラスト調製物を新鮮なＫＭＣ塩溶液１Ｏｒ
Ｒ１内に再懸濁し、そして６６０−１Ｏ０ｘで５分間遠
心分離する。上清を除いて捨て、そして残っている層中
にプロトプラストをゆっくり再懸濁し、そして次に１３
／１４強度のＫＭＣ溶液１０−を徐々に添加する。再び
５分間遠心分離した後、上清を再び除いて、そしてプロ
トプラストを６／７強度のＫＭＣ溶液に再懸濁する。一
部を計測のために採取し、そしてプロトプラストを再び
遠心分離により沈澱させる。 プロトプラストをＫＭ培地または以下の実施例において
記載される形質転換に使用するために要求されるような
０．１％（ｗ／ｖ）ＭＥＳおよび６ｍＭＭ　ｇ　ＣＩ　
２を含有する０、５Ｍマンニトール中に１−あたり１０
’で再懸濁する。 裏鳳桝ｌ工：エレ　　ロ　　−ｒ　′　−ゼ熱ショック
を除いて全ての段階が室温（２２−２８℃）で行われる
。ｏ、　ｉ％（ｗ／ｖ）ＭＥＳおよび６　ｍＭＭ　ｇ　
Ｃｌ　ｔを含有する０、　５　Ｍマンニトール中にある
実施例２６におけるプロトプラストの懸濁物の耐性をダ
イアログ・エレクトロボレーター（ダイア−ログ社、西
ドイツ国デ４０００デュッセルドルフ）のチャンバー内
で測定し、そして３００ｍＭＭｇＣ１２を用いて１−１
．２キロオームに調整する。試料を含有するチューブを
４５℃の水浴中に５分間浸漬することによりプロトプラ
ストに熱ショックを与え、次に水で室温まで冷却する。 実施例２２のＤＮＡまたは実施例１９のＣａＭＶ３５Ｓ
／メイズ八ＨＡ　Ｓ遺伝子構築物を含有する線状化プラ
スミドのＤＮＡ４μｇ１および子ウシ胸腺キャリアーＤ
ＮＡ２０μｇをプロトプラスト懸ｆＡ液の一部０．２５
−に添加する。３０ｍｌＪＭ　ｇ　Ｃｌ　ｔを含有スる
０、　５　Ｍマンニトール内の２４％（Ｗ／■）ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）溶液（ＭＷ８０００）０．
１２５−をプロトプラストに添加する。混合物を十分に
しかしゆっくりと混合し、そして１０分間インキュベー
トする。 試料をエレクトロボレーターのチャンバー内に移し、そ
して試料にｌＯ秒間隔で３回、初期電圧１０００．１２
００．１５００．１８００．２３００または２８００Ｖ
ｃｍ’、および指数関数的減衰時間１０μｓｅｃでパル
スを与える。 プロトプラストを次のように培養する：試料を６国ペト
リ皿内に室温でブレーティングする。 さらに５−１５分後、１．２％（ｗ／ｖ）ジ−プラーク
アガロースおよび１■／１２，４−〇を含有するＫＭ培
地３ｄを添加する。アガロースおよびプロトプラストを
十分に混合し、そして培地をゲル化する。 また、プロトプラストを培地（１，２％（Ｗ／Ｖ）ジ−
プラークアガロース内に０．５■／１２４−Ｄおよび１
００■／１アセチルサリチル酸を含有するＫＭ培地）中
に取り出し、そしてす−スカルチューデュラボアフィル
ター（ＧＶＷＰ０４７００．孔径０．２２μｍ、直径４
７關）上にｌ−あたり０．５Ｘ１０’の密度で載せる。 ＧＡ７プラスチツク容器内の蒸留脱イオン水内でフィル
ターを２０分間オートクレーブし、そしてナースカルチ
ャー上にフィルターを設置する３時間前に上記の液体Ｋ
Ｍ培養培地中しかしゲル化剤なしで前調整する。 ナースカルチャーはブラックメキシカンスイート（ＢＭ
Ｓ）：７−ン懸濁培養物（Ｇｒｅｅｎ、　１ｌｏｒｔ。 Ｓｃｉ、　１２：１３１．１０？７；Ｓｍ１ｔｈ等、Ｐ
ｌａｎｔ　Ｓｃｉ、Ｌｅｔｔ、３６：６７、１９８４）
からまたは実施例２５に記載された胚形成性懸濁物から
調製される。ＢＭＳがナースとして使用される場合、０
．５■／１２．４Ｄおよび１００■／１アセチルサリチ
ル酸（０，１％（ｗ／ｖ）ＭＥＳ、ｐＨ６，０を含有す
る２％（ｗ／ｖ）ＤＭＳＯ中に２ｍｇ／Ｊ）を含有する
滅菌ＫＭ培地が１．２％のアガロース最終濃度を得るた
めに滅菌ジ−プラークアガロースに添加される。アガロ
ースを溶解するためにマイクロ波処理を行った後、培地
を水浴中で４４℃に冷却し、８ＭＳ懸濁液のｐｖｃ　ｉ
−を培地１０ｍ／あたり添加し、そして一部の５−を直
径６０ｍｍのペトリ皿の表面−面に分散させる。培地が
固化したら、上記滅菌デュラボアフィルターを表面に載
せる。マイクロ波処理され、そして４４℃に冷却された
上記培地中のプロトプラス）−０，５Ｊを各フィルター
の表面上にゆっくりとピペットで注ぐ。 胚形成性懸濁物がナースとして使用される場合、Ｎ６培
地はグルコースを用いて約５３０５４０ｍＯｓ／ｋｇＨ
，Ｏに浸透圧を高める。ｐＩＩは６、０に前調整され、
そして培地は０．２μｒｎのフィルターを通して口過滅
菌される。２．４−Ｄおよびアセチルサリチル酸を添加
し、そして操作は前のバラグラフの記載に従つ。 プロトプラストを実施例２６の最後の段階で１２ｍＭＭ
ｇ　Ｃｌ　ｚを含有する０、　５　Ｍ　７ンニトル溶液
内に再懸濁する。４５℃５分間の熱ショックを実施例２
７に記載したように行う。プロトプラストを遠心管中に
管あたり懸濁されたプロトプラスト０．３−で形質転換
のために分注する。次の１０分間に以下のものを添加す
る：実施例１９または２２のＤＮＡおよび０．１ＭＣａ
（ＮＯａ）２および０．４　Ｍマンニトールを含有する
４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ溶液（ＭＷ６０００）をＫＯＨ
でｐｌ（８−９に調整して、２０％ＰＥＧの最終濃度を
得る。一部をときどき揺らしながら３０分間インキュベ
ートし、そして次にプロトプラストをペトリ皿内に載せ
（直径６−の皿あたり最初のプロトプラスト懸濁液０゜
３−）、そして実施例２７に記載したように培養する。 ″ｕｌＬＬ：プロ　プラス　　−　ルスのアガロース内
にプロトプラストを含むプレートを２６℃で暗所中に置
く。１４日以内にコロニーがプロトプラストから生じる
。コロニーを含有するアガロースは、２■７１２．４−
Ｄを含有し０．２４％（Ｗ／Ｖ）ゲルライトで固化した
Ｎ６培地３０ｒＲ１を含有する直径１ＯａＩｌペトリ皿
の表面に移す。この培地を２Ｎ６と表す。カルスをさら
に２６℃で暗所中培養し、そしてカルス片を新鮮な２Ｎ
６培地上で２週間毎に継代培養する。 別法としてｔ　ｏ　ｏ　ｐＦｌｂの５ＬＪ８７２を含有
する２Ｎ６培地が形質転換された細胞を選択するために
使用される。 ３Ｕ庇Ｊ１Ｊ−頭：　　　　　　　　　　セ　　　のア
ッセイすべき材料のｆｆ１ｆｆｉは、細胞懸濁物の冷却
遠心分離により得られるベレットのｆｆＸｎを測定する
か、または液体窒素内に入れそして冷浸して細かい粉末
にしだカルス、葉または根組織の重量を測定するかして
決定される。細胞懸濁ベレットの重機（ｇで）に等しい
、または組織の重ＩＷｋ（ｇで）に等しいかもしくは２
倍の冷却ホモシネ−ジョン緩衝液ｌ容量（−で）を添加
し、そして混合物を１５０００ｐｓｉでフレンチプレス
に細胞を通過させるか、または乳鉢と乳棒で砂といっし
ょに粉砕する。引き続く全ての段階は材料を冷却状態（
４℃）に保つ。細胞を１６０００ｐｓｉで破壊し、細胞
浸出物を水上の容器に集める。細胞の破片を除くために
浸出物を１１０００ｏｒｐで５分間遠心分離する。Ｊ：
。 清の容量を測定１７、そして酵素規格の硫酸アンモニウ
ムを２５％飽和まで（上清１−あたり（ＮＨＩ）２ＳＯ
１１４４■）添加する。混合物を１５分間氷上でかくは
んし、次に１１００００ｒｐで５分間遠心分離する。ベ
レットを捨て、そして上清を硫酸アンモニウムで５０％
飽和に（上ｔｆ！ｌ−あたり（ＮＨ，）２Ｓ０．１５８
１１１ｇ）調整する。１５分間氷上でかくはん後、１１
００００ｒｐで５分間遠心分離することによりベレット
を集める。得られたベレットをカラム緩衝液１−２１ｎ
ｌに溶解させる。抽出物をカラム緩衝液で平衡化したセ
ファデックスＧ５０カラムに通すことにより脱塩する。 試料をカラム緩衝液で溶出させ、カラムに通した試料の
溶液ｌｄに対し試料的２−を集める。 ホモシネ−ジョン緩衝液およびカラム緩衝液はアッセイ
すべきＡ　ＨＡ　Ｓの供給源に応じて選択される： バコ、〜モジ　−シ　゛　は５０ｍＭＮａＨ２ｐｏ、緩
衝液ｐＨ７，０，０，５ｍＭＥＤＴΔｐＨ７、０，０，
５ｍｌＪＭｇ　Ｃｌ　２．１ｍＭピルビン酸ナトリウム
ｐ　Ｈ７，０，１０ｔｉＭ　　ＦＡＤ、１ｍＭＰＭＳＦ
Ｓ　１０％グリセロールからなる。 モロコシ　モジ　−ン　ン　パ　は５０ｍｔｉｌトリス
ｐ　Ｈ７，５，１ｍＭＥＤＴＡｐＨ？、５．５ｍＭＭｇ
ＣＩ２．２０ｍＭピルビン酸ナトリウムｐ　Ｉ７．０．
１０μＭ　　ＦＡＤ、１ｍＭＰＭｓＦ、１ｍＭＤＴＴ、
１ｍＭＴＰＰ、１０％グリセロールからなる。 ／（ニア　　５Ａ緩ＩＩは５０ｍＭＮ　ａ　Ｉ２　Ｐ　
Ｏａ緩衝液ｐＨ７，０，０，１ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍ
ＭＭｇＣ２、ｌ　ＯμＭ　　ＦＡＤ、１ｍＭＰＭＳＦ、
ｌ　０％グリセロールからなる。 ウモロコシ　ラに援チＪＬは５０−トリスｐＨ７，５，
５ｍｌＪＭｇＣ１１，１０ｕＭ　　ＦＡＤ、０゜ｌ　ｍ
Ｍ　Ｅ　Ｄ　′ｌ”Δ、　１ｍＭＰＭｓ　Ｆ、　　１ｍ
ＭＤＴＴ、　　１０％グリセロールからなる。 実施例３０に従って調製された抽出物５−５０μｌを全
容量０．５−の反応混合物（下記参照）内に溶解させる
。混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。６Ｎ
　　ＨｚＳＯ＋　　５０μ！の添加により反応を終了さ
せる。混合物を６０°Ｃで１５分間インキュベートし、
次にａナバトール試薬（２，、５Ｍ　　Ｎ　ａ　ＯＨ中
の５％ａナバトール５００μｌおよび２５μｇ／−クレ
アチン）６２５μａと反応させ、そして６０℃でさらに
１５分間インキュベートする。沈澱が形成されたら、こ
れを回転させて除き、そして５２０ｎｍで吸収を測定す
る。形成されたアセトインの量は、０．４μｇないしｌ
Ｏμｇアセトインを用いて作成した標準曲線から計算さ
れる。 比活性は■タンパク質あたりのｐＫａ　ｔとして表され
る。 ｂ〕二一ザプレー　　　セ　： 試料１−２０μβを全容量０．１５−の反応混合物と共
にエリザプレート内に十分に載せる。 混合物を３７°Ｃで３０分間反応させる。１％クレアチ
ンを含有する２、４Ｍ　　ＨｇＳＯ４５０μｐの添加に
より反応を終了させる。混合物を６０°Ｃで１５分間イ
ンキュベートする。存在するあらゆる沈澱は遠心分離に
より分離される。アッセイ混合物１５０μ！を新しいエ
リザプレートに移し、５　Ｍ　　Ｎ　ａ　ＯＨ中のｌＯ
％ａ−ナバトール１００μｌと処理し、そして６０°Ｃ
でさらに２０分間インキュベートする。５２Ｏｒ＋ｍで
吸収を測定し、比活性はａ）のように表される。 ｃ）ＩＥＬ害皿線上 スルホニル尿素、イミダゾリノンおよびトリアゾロピリ
ミジン除草剤の存在下でＡ　ＨＡ　Ｓ活性を測定するこ
とにより点阻害曲線は作られる。 スルホニル尿素およびトリアゾロピリミジン除草剤は除
草剤の最終濃度がＩｎＭと１１００００ｎの間になるよ
うに反応混合物内に包含される。 イミダゾリノン除草剤はｌｏｎＭと１１０００００ｎの
間の濃度範囲で包含される。イソロイシン、ロイシンお
よびバリンのΔＨ八へ活性の阻害は、アッセイ反応混合
物中での最終濃度がｌ０１２０または３０ｍＭで、各ア
ミノ酸の別々の混入、および全ての可能な組合せでの混
入により決定される。 反応混合物はアッセイされるべきΔＨＡ　Ｓの供給源に
依存するニー久ヨ七Ｕえ応ユ葭１液は２０ｍＭＮａ１１
２ＰＯ＋緩衝液ｐＩ−（７，Ｑ、２０鶴ピルビン酸ナト
リ１クムｐＨ７，０，０，５ｍＭＴＰＰ、５關ＭｇＣＬ
　、ｌ　ＯμＭ　　ＦＡＤからなる。上皇−モロコシ「
　１　′−は５０ＩＩＩＭトリスｐＨ７，５，１０ｄＭ
ｇＣＬ　、ｌ　ＯｕＭ　　ＦＡＤ、１ｍＭＴＰＰ、７０
ｍＭピルビン酸ナトリウムｐＨ７，５からなる。 表土： Ａニレ！比ル括並 耐−性ｌム匙Ｌｕ１ｌ−胞系！−＠ ５ＲＩＯ１１１５８，９ ８０，１４３，２ ２４，９１０００ ２７，６ （表１の脚注） ａ・・・細胞系は実施例３１の概要に従ってアッセイを
行う前にＩｎＯｐｐｂｓＵ　８７２　（Ｓ　３　＋ｌｊ
、Ｊ−びｓ　Ｒ系）　マタ＋１１００　ｐｐｂＳＵ４８
４（Ｓｕ系）を含有するＭＸＩ培地中で２−３日間継代
培養される。 ｂ・・・Ｓ３−およびＳ　３　十二野生型。ｓ３−はア
ッセイの前にあらゆる除草剤なしで継代培養される。 ５Ｒ１０１−１７３＋ＡＩ（へＳ阻害剤耐性株ハｌ　０
０　ｐｐｂＳＵ８７２を用いて実施例２に概要を示した
選択操作により得られる。 ＳＲＩ　０１１　：ＡＨＡＳ阻害剤耐性株は１Ｏ００ｐ
ｐｂＳＵ８７２を用いて実施例２に概要を示した選択操
作により得られる。 ５Ｒ２００１−２０２２：ＡＨＡＳ阻害剤耐性株は実施
例２および実施例４に概要を示した選択操作により、第
１の選択において１００　ｐｐｂＳＵ８７２を用い、そ
して第２の選択においてｌ０００ｐｐｂＳυ８７２を用
いて得られる。 ５Ｕ６−４１　＋ＡＨＡＳ阻害剤耐性株ｉ、ｔｌ　ＯＯ
ｐｐｂＳＵ４６４を用いて実施例３に概要を示した選択
操作により得られる。 Ｃ・・・比活性−ｐＫａ　ｔアセトイン／■タンパク質
。 表１に表された結果は、実施例２．３および４の選択操
作を用いると、高められたレベルのＡ　ＨＡ　Ｓ酵素を
有するが、しかし増加するレベルの除草性スルホニル尿
素５Ｕ８７２および５Ｕ４６４に対するＡＨ八へ感受性
は野生型株Ｓ３内のＡ　ＨＡ　Ｓの感受性に類似するタ
バコ細胞系が見出され得ることを示す。 表（：１シ　　　バコ　　　１の　■ ゛よ　　ミノ　〕　−′バッ 表２に表された結果から、高められた活性を有するがし
かし除草剤に対しての感受性も類似する細胞系における
ＡＨＡＳは、相当する野生型細胞におけるＡ　ＨＡ　Ｓ
酵素のフィードバック阻害に類似するバリン、ロイシン
およびイソロイシンによるフィードバック阻害もまた示
すことがわかる。 ５ｕ４１　　３６０　　　１５　　　１２　　　３２　
　　２１′７１　　８３　　９７（表２の脚注） ａ・・・細胞系は実施例３１の概要に従ってアッセイを
行う前に１００ｐｐｂＳＵ４６４を含有するＭＸｌ培地
中で２−３日間継代培養される。 ｂ・・・５Ｕ６−４１　：　ＡＩＩＡＳ阻害剤耐性株は
Ｉ　ＯＯｐｐｂＳＵ４６４を用いて実施例３に概要を示
した選択操作により得られる。 Ｃ・・比活性−ｐＫａ　ｔアセトイン／■タンパク質。 Δ）Ｉ　Ａ　Ｓ遺伝子またはキメラＡＩＩＡＳ５ｎ伝子
の多重コピーを強力なプロモーターと」１に含有する植
物および植物細胞系が実際に転写レベルでＡ　ＨＡ　Ｓ
遺伝子を過剰に発現するかどうかを決定するために、こ
れらの植物および植物細胞系からのＡＩＩＡＳ・ポリＡ
−ＲＮＡの徴を対照のものと比較するが、この対照はＡ
ＨＡＳ遺伝子またはキメラΔＨＡ　Ｓ遺伝子の余分なコ
ピーを含まない同一または類似の植物または植物細胞で
ある。 ポリΔ・ＲＮ　Ａはアラビドプシス植物、タハコの葉お
よびタバコのカルスから調製される。 各供給源に対して組織２５ｇが、反応容量を使用された
組織の増加分に応じて増加させることを除いてＥ、　Ｂ
ａｃｋ等、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２１
２：２Ｏ−２６（１９８７）に記載された方法に従う調
製に使用される。 細胞系または植物およびそれらの対照からのポリＡ−Ｒ
ＮＡｌμｇをホルムアルデヒドアガロースゲル上で分別
し、そしてＭａｎｉａｔｉｓ等（同上、　９．２０２−
２０３　）により記載された操作に従ってニトロセルロ
ース膜にプロッティングを行う。 これらの実験において、ブロモフェノールブルー染料の
先端が各ゲル長の約３／４下方に達したら、電気泳動を
終了し、そしてゲルをプロッティングのために処理する
。ニトロセルロース膜を２０倍ＳＳＣ中で湿らせ、そし
て４２℃でＬＳハイブリダイゼーション緩衝液中プリハ
イブリダイゼーションを行う。６時間後、実施例１７の
アラビドプシスＡ　ＨＡ　Ｓ　５ｃａｌｌ−Ｂｇｌｌｌ
遺伝子断遺伝子断片的４　Ｘ　１０’ＣｐＩｌを含有す
る新鮮なＬＳハイブリダイゼーション緩衝液中に膜を移
す。これらの試験において、ＬＳ緩衝液は膜１ｃ！１四
方あたり０．２ｍｌの量で使用される。 膜をこのハイブリダイゼーション溶液中４２℃で１６時
間ゆっ（り揺らしながらインキュベートし、２倍ＳＳＣ
を用い１回あたり１５分間２回室温で洗浄し、ＬＳ洗浄
緩衝液（２５％ホルムアミド、５倍ＳＳＣ，１％５ＤＳ
）を用い１回あたり２時間３回４２℃で洗浄し、そして
すすぎ緩衝液（０，１倍ｓｓｃ、ｔ％５ＤＳ）を用い１
回あたり３０分間２回室温で洗浄する。膜をマウントし
そしてクロネックス・ライトニング・プラス・スクリー
ン（デュポン、プラウエア州つィルミントン）およびＸ
ＡＲ−５フイルム（コダック、ニューヨーク州ロチェス
ター）で８時間、１日、３日、および９日フルオログラ
フィーを行う。 プロット上の各々のハイブリッド形成したバンドの活性
は次のように測定される：ＸΔＲ−５フィルムはザイネ
ー・ソフト・レーザー・スキャニング・デンシトメータ
ー・モデルＳＬ５　０　４　−　Ｘ　Ｌ（Ｚｅｉｎｅｈ
　　５ｏｆｔ　　Ｌａ５ｅｒ　　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　　
Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　５Ｌ−５０４
−ＸＬ）　　Ｃバイオメト・インストルメント・インコ
ーホレーテッド（Ｂｔ。 ＩＤｅｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａ
ｔｅｄ）、カリフォルニア州フラートン〕を用いてスキ
ャンされる。各バンドに対して対象のバンドのピーク強
度がＯｌｌと１の間の光学単位（ＯＤ）となるように露
出が選択される。露出を行うとそのバンドの全体のＯＤ
がバンドの強度の総和により測定される。全体のＯＤは
活性を与える露出時間により増幅される。 災施舅」」」　　バコ　　Ｄ　　の　　ン分析すべき細
胞のＤＮＡは実施例１７に記載したように調製される。 Ｄ、ＮＡ２０μｇを制限酵素Ｎｃｏｌ　１００単位で全
体で４時間消化する。 消化ＤＮＡ試料をフェノール／クロロホルムで抽出し、
エタノールで沈澱させ、そしてＴＥ緩衝液中に溶解させ
る。試料濃度をＵ■分光器で決定する。消化ＤＮＡの試
料１０μｇをＴＡＥ（４０ｍＭトリス−アセテート、ｐ
Ｈ８，０，１伍ＭＥＤＴＡ）０．８％アガロースゲル上
で分析する。 検量のためにゲルはＸｈｏ１Ｍ化ｐｃＩＢ１２００（実
施例１７）からなる再構築物を以下のコピー数およびｐ
ｃｌＢ１２ｏＱＤＮＡ量で含１工する＋１８ｐｇ（２コ
ピー）、３２．５Ｏｇ（５コピー）、１３０ｐｇ（２０
コピー）。検量はニコチアナ・タバカムゲノム（Ｂｅｎ
ｎｅｔおよびＳｍｉ　ｔｈ、　Ｐｒｏｃ、　Ｒ，Ｓｏｃ
、　Ｌｏｎｄ、　８２７４　＋２２７−２７４．１０７
６＞の大きさとしての＋５Ｘ１０’ｋｂｐおよびｐＣＩ
Ｂ＋２０９の大きさとしての９．７ｋｂｌ）に基づいて
いる。 ゲルは０．２５　Ｎ　　ｌ（ＣＩで１５分間処理され、
そしてＤＮＡ試料はゲルからシーンスクリーン・プラス
Ｒ（デュポン）に０．４　Ｎ　　Ｎ　ａ　ＯＨで６０時
間キャピラリー移送により移される。膜を２倍ＳＳＣで
洗浄し、乾燥させ、そしてＳＷ溶液（１％ＢＳＡ、０．
５Ｍ　　ＮａＨ２ＰＯａ　。 ｐ　ＬＩ　７．　Ｏ１７％ＳＤＳ、　１ａｆｆｌＥＤＴ
Ａ）中５５℃で８時間プレハイブリダイゼーションを行
う。 タバコＡ　ＩＩ　Ａ　Ｓ遺伝子プローブは以下のように
合成される　１．４２ｋｂｐ　Ｎｃｏｌ　−Ｂｇｌｌｌ
タバコ５ｕＲＡ断片を酵ＥＩ　Ａ　ＨＡ　Ｓ遺伝子断片
の単離に対して実施例１５に記載したようにｐｃ＋ｎ１
２０７から単離する。このＮｃｏｌ　−Ｂｇｌｌ！断片
＋００ｎｇがプライムタイムキット（インターナンヨナ
ル・バイオテクノロジー社）を用いて製造会社により推
奨される方法に従いランダムプライム反応で放射標識さ
れる。１０′ｃｐｍ　／μｇＤＮＡより高い比活性を得
るために、１００μＣｉ　　（３０００Ｃｉ／ｍＭｏ１
）　　α　−コ２Ｐ　　　　ｄＣＴＰが１００μ１反応
物中で使用される。製造会社により推奨される方法に従
ってＧ５０スピンカラム（クイック・スピン・カラム、
ベーリンガー・マンハイム）に通して、標識ＤＮＡを組
み込まれなかったヌクレオチドから分離する。 放射標識ＤＮＡを沸騰水浴中で５分間加熱し、水上で冷
却し、そして１−あたり１０’ｃｐｍの最終活性までプ
レハイブリダイゼーション反応液に添加する。絶え間無
く揺らしながらプロットをハイブリッド形成させる。２
０時間後、プロットを２倍ＳＳＣで１５分間すすぎ、４
０ｍＭＮａＨｚＰＯｔ　、ｐＨ７，ｏ、１ｍＭＥＤＴΔ
、１％ＳＤＳおよび０．１２５Ｍ　　ＮａＣ１１ｇで洗
浄し、そ
【７て２倍ＳＳＣですすぐ（全て室温で行う）
。膜をサラン・ラップ（Ｓａｒａｎ＠ｗｒａｐ）〔ユニ
オン・カーバイド（Ｕｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ）　’
Ｊの２枚のシート間に湿らせてマウントしそしてクロネ
ックス・ライトニング・プラス・スクリーン（デュポン
）およびＸＡＲ−５フイルム（コダック）でフルオログ
ラフィーを行う。１時間、１６時間および４日露出のプ
ロットがとられる。 フルオログラフ内に出現したハンドの同定はに、　Ｌｅ
ｅ等、Ｅｌｉｔ口ＯＪ、　７：１２４１−１２４８（１
０８８）（７）制限地図に基づいて行われる。タバコ５
ｕＲＡａ伝子は約４．５５ｋｂｐ位にバンドを生じ、そ
して５ｕＲＢ遺伝子は約５．９ｋｂｐ位にバントを生じ
る。 各試料の５ｕＲＡおよび５ｕＲＢ遺伝子の活性および再
構築物のコピー数は次のように決定される。ＸＡＲ−５
フイルムはザイネー・ソフト・レーザー・スキャニング
・デンソトメーター・モデル５Ｌ−５０４−ＸＬ（バイ
オメト・イノストルメント・インコーボレーテッド、カ
リフォルニア州フラートン）を用いてスキャンされる。 各バンドに対して対策のバンドのピーク強度が０、■と
１の間の光学単位（ＯＤ）となるように露出が選択され
る。露出を行うとそのバンドの全体のＯＤがバンドの強
度の総和によりａｌｌ＋定される。全体のＯＤは活性を
与える露出時間により増幅される。標情曲線はＩＩ￥構
築物のコピー数における５ｕＲＡ遺伝子の活性に基づい
て描かれ、そして各遺伝子のバンドの活性は試験された
試料のコピー数を決定するために内挿される。 ＣＧＡ１４０２を用い実施例２３および２４に従って得
られたトランスジェニック植物の除草剤耐性は実施例１
１ａにおいて記載されたように実質的に決定される。低
ディスクを胃なるトランスジェニック植物から切り出し
、重量を測定し、そして次に下側を上にして５Ｕ８７２
を０，１０．１００および３００ｐｐｂｔｌ−含ｆｒす
る固化ＭＳＢＮ培地上に載せる。培養プレートを明所中
２５−２８℃でインキュベートする。 ブレーティング１．４．６および８週後にディスクの重
量を測り、新鮮重量増加を決定する。 ディスクを視覚で検査し、そしてｗ条および／またはカ
ルス形成を評価する。 姓二 ノＬｙ。 一ンスンエニ ノくコ １の 番号′ １００％ ８０％ ６．７％ １．２％ 八４　　２９９１±９０【 １００％ ２８４７±５４８ ９５％ ３３３±１７４　１９±１５ １１　　に　　０．６％ ８２　３０７６±８９８ Ｃ２２５２０±１８７６ Ｄ［１２２６５６±３２２　　　　７０±１４″１００
％　　　　　　２．６％ Ｅ　　　　　　　４３３Ｂ±１６６２　　　８７±１９
”１００％　　　　　　２％ ａ・・・カナマイシン上で選択され、そして滅菌苗条培
養物として確立されたＨ　ａ　ｖ　ａ　ｎ　ａ　３９タ
バコ形質転換体。 異なるトランスジェニック植物から誘導された葉ディス
クは示されたレベルの５Ｕ８７２上にブレーティングさ
れた（プレートあたり７個）。ブレーティング時のディ
スクあたりの平均新鮮重量は３，１４±０．４３■だっ
た。 ｂ・・Ａ　アラヒドプンス・タリアナ、実施例１６から
のＣＧＡＩ４０２，３５３／野生型Ａ　ＨＡ　Ｓで形質
転換された植物 Ｂ　アラビトプシスの野生型ＡＨＡＳｌ！！を伝子のゲ
ノムクローンで形質転換された植物（スルホニル尿素感
受性） ＣｐｃＩ８２００で形質転換された対照植物、カナマイ
シン耐性 Ｄ　クロロスルホロン耐性突然変異ＧＨ−５０からのΔ
！＋　Ａ　Ｓのゲノｌ、クローンで形質転換された植物
。 Ｇ、　ｌｌａｕｇａｎ等、同上。この遺伝子を含む植物
はクロ［−１スルフロンに耐性であるが、５Ｕ８７２に
は耐性でない。 Ｅ　野生型タバコ、Ｈａｖａｎａ３８園芸品種Ｃ・・・
６種の植物は各タイプＡ−Ｄ　Ｉ）　’Ａなる形質転換
植物から再生された。植物番号Ａ３とＡ４は除草剤耐性
であるがＡｔ、Ａ２、Ａ５およびＡ６は示さなかった。 ｄ・・・４０日後側定したディスクあたりの平均新鮮重
量■±標準偏差（ｎ＝７）；データはまたｏ　ｐｐｂで
生長させた対照ディスクの百分率生長として表されてい
る。 ｅ・・・葉ディスクは漂白され、生長しないかまたはカ
ルスを全く形成しない。 ごの結果から、カリフラワーモザイクウィルスからの３
５３プロモーターの発現制御下にある野生型スルホニル
尿素感受性アラビトプンスのＡＩＩＡＳ遺伝子からなる
ΔＨＡ　Ｓ遺伝子構築物で形質転換されたトランスジェ
ニックタバコ植物が５Ｕ８７２に対して晶められた耐性
を示すことが明らかである。 ｂ）　ランスジェニック　バコ　　のサザン丘エ タバコの上方の葉からのＤＮＡを実施例１５におけるア
ラビドプシス植物ＤＮＡの単離に際して記載した方法に
従って単離する。対照植物ｔｌ　ａ　ｖ　ａ　ｎ　ａ　
３８からの、およびＣＧＡ　ｌ　４０２を用いて作製し
た実施例２３および２４のトランスジェニック植物（植
物番号Ａ３およびＡ４、表３参照）からのＤＮＡを制限
酵素Ｎｅｏ　Ｉで消化し、そして以下の変更を行って実
施例３３に記載した操作でサザン分析を行う： （１）使用されるＡ　ＨＡ　Ｓ遺伝子は１．７ｋｂの５
ｃａｌｌ／Ｂｇｌｌｌ　アラビトブシスΔ１−１ΔＳ断
片である。その調製および放射標識は実施例１５および
１７に記載した操作に従って行う。 （２）制限酵素Ｎｅｏ　ｌで切断した実施例１６のｐｃ
ｔＢ１２１２プラスミドＤＮＡをコピー数再構築のため
に使用する。コピー数再構築の計算はｐＣＩＢ１２１２
の大きさとして６．８ｋｂｌ）を用いて実施例３３に従
って行う。 （３）標識断片１１００ｎをハイブリダイセージクン反
応のために使用する。 （４）ハイブリダイセージクンを６５℃で行う。 行われる洗浄は以下の通りである＝ （ａ）２倍ＳＳＣ，室温で３０分間。 （ｂ）３倍ＳＳＣ，ｌＸ５ＤＳ　　１１．６５°Ｃテ２
時間。 ＋ＣＩＯ，３倍ＳＳＣ，＋％ＳＤＳ、６５°Ｃで１時間
。 フルオログラフィーは実施例３３に記載した方法に従っ
て行われる。 サザンプロットの１６時間および７２時間の露出で以下
の結果が観察される：対照植物Ｈａｖａｎａ３８ＤＮΔ
はハイブリッド形成バンドを示さない。形質転換された
タバコ植物ＤＮＡ（植物番号Ａ３およびＡ４）はｐｃＩ
Ｂ１２１２およびｐｃＩＢ１２１３（実施例１６）のキ
メラＣａＭＶ３５Ｓアラビドプシス八〇　Ａ　Ｓ遺伝子
内のアラビドプシスＡ　ＨＡ　Ｓコード配列を含むと期
待される断片に相当する３　ｋｂ９にバンドを示す。コ
ピー数再構渠物を有するＡ３およびＡ４内の３　ｋｂｐ
バンドの強度の比較に基づいて、形質転換された植物が
４倍体ゲノムあたりＣａＭＶ３５ＳアラビドプシスＡ）
ＩＡＳ遺伝子を１コピー含むと推定される。 Ｇ　１−１−５０アラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子（Ｂ。 Ｊ、Ｍａｘｕｒ等、ＰＩａｎｔ　Ｐｈｙｓｌｏｌ、８５
：１１１０−１１１７，１９８７　；に、　ｗ、　ｔｌ
ａＢｈｎ等、　Ｍｏ　１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　
２１１　：２６６−２７１１９８８）の推定アミノ酸配
列のアミノ酸残基６７４−６８９．３４４−３５６およ
び１９６−２１１にそれぞれ相当するＡＬＳ　６、ＡＬ
Ｓ８およびＡＬＳ９ペプチド断片はＤａｖｅ　Ｋｌａｐ
ｐｅｒ博士にューヨーク州チャペルヒル、ノースカロラ
イナ医科大学細菌学および免疫学科）から入手される。 ＡＬＳ６、ＡＬＳ８およびＡＬＳ９ペプチドの配列はそ
れぞれＧＴＦＮＤＶＩＴＥＧＤＧＲＩＫＹ、ＧＬＧＳＹ
ＰＣＤＤＥＬＳＬ。 およびＧＱＶＳＲＲＭＩＧＴＤＡＦＱＥＴである。ペプ
チドはバイオサーチ・ペプチド・シンセサイザーでＢＯ
Ｃアミノ酸を用いて合成される。 システィン残基を含有するＡＬＳ８はＮ−スクシンイミ
ジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰ
ＤＰ）とともにＪ、　Ｃａｒｌｓｓｏｎ等、　Ｂｌｏｃ
ｈｅｍ、　Ｊ、　１７３ニア２３−７３７（ｆ９７８）
の方法の変法を用いてキャリアータンパク質に結合させ
る。 オボアルブミンに結合したペプチドは免疫原として使用
され、ウシ血清アルブミン（ＵＳＡ）への結合は抗血清
をアッセイするために使用される。キャリアータンパク
質（オボアルブミンまたはＵＳＡ）１００■は０．ＯＩ
ＭＮ−エチルモルホリンｔｉｃ　ｌ、　　ｐＨ７，５１
０−中に溶解される。５ＰＤＰ　Ｃピアース・ケミカル
社（Ｐｉｅｒｒ、ｅ　Ｃｈｅｍｔｅａｌｓ　Ｃｏ、　）
］　　５０１１１ｇをエタノール１０ｄ中に溶解させ、
そして２ｒＲ１づつタンパク質溶液に３分間隔で添加す
る。反応混合物を添加の間回転させる。修飾したタンパ
ク質を水に対して透析して未反応の５ＰＤＰを除去する
。必要ならば０．１％ＳＤＳを添加して沈澱した複合体
を溶解させる。結合したチオール基の数は一部を過剰の
ジチオトレイトールと処理した後の光学−度ＯＤ、４．
から計算される。チオール基に対して１．５モル過剰の
ペプチドが修飾タンパク質の残部に添加され、そして１
２時間反応させる。結合したペプチドの量は反応終了後
にＯＤ、４．から計算され、そしてゲル口過による非結
合ペプチドの分離後に複合体のアミノ酸分析から計算さ
れる。典型的には、４−１０モルのペプチドがキャリア
ー１モルあたり結合される。 ＡＬＳ６およびＡＬＳ９ペプチドをＡｖｒａｖｍｅａＳ
およびＴｅｒｎｙｃｋ、　ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓＬ
ｒｙ　６：５３（１９８９）により記載されたようにリ
ン酸緩衝液（ＰＢＳ）中４℃でＫ　Ｌ　Ｈに結合させる
。１ｍＪＰＢＳ中に懸濁したＫ　Ｌ　８３．３■あたり
ペプチド１■を使用して（モル比約１：３００に相当す
る）１■／−懸濁液としてペプチドは添加される。 等量の０．２％グルタルアルデヒドを絶えずかくはんし
ているペプチド／ＫＬＨ混合物に一滴づつ非常にゆっく
り添加する。反応混合物を回転器上に４℃で２４時間設
置し、次にＰＢＳに対して４℃で一晩透析する。混合物
中の総タンパク質濃度を２８０ｎｍでの吸光度から計算
する。 ウサギの免疫化のために、同様なペプチド複合体ＡＬＳ
６−ＫＬＨ％ＡＬＳ９−ＫＬＨおよびＡＬＳ８−オボア
ルブミンを使用する。ＰＢＳｔ−中のこの混合物１．５
■（各ペプチド複合体０．５■およびこれらの複合体内
の各ＡＬＳペプチド断片約１６０μｇに相当する）を完
全７０インドのアジュバントｌ−と乳化させる。混合物
０．５−を片方の肩に皮下注射し、そして０゜５−を片
方の後足の半鍵様／半模様筋肉内に筋肉注射する。３０
日後、不完全フロイントのアジュバント中に乳化させた
１、　５■抗原混合物のブーストを両方の肩内に皮下注
射する。全部で３７日後、動物から採血し、そして血液
３〇−心臓採血により採取する。血清を通常の方法で調
製し、そして凍結させる。さらに１週間後、さらに採血
する。３週間後、動物を再びさらに抗原で追加抗原刺激
し、そしてｌおよび２週間後に採血する。 血清は各抗原ペプチド断片ＡＬＳ６、ＡＬＳ９およびＡ
ＬＳ８に対して、遊離ペプチド：血清希釈剤＝１＝３０
０ないしｌ　：　３００００である一連の範囲０，０３
ないし３１．６２μｇ／ｒｄで、Ｍ、　−Ｍ、　Ｃｏｒ
ｄｏｎｎｌｅｒ等、Ｐｌａｎｔａ　１５８：３６９−３
７６（１９８３）に記載された標準直接エリザを用いて
試験される。ウサギ番号１９８６（４育種家からの４つ
の異なるバッチ）からの特定の血清はに対して、八、。 すなわち３．１６μｇ／−のペプチド濃度での血清希釈
として表される半量高活性はＡＬＳ６に対しては１：２
６１５ないし１：６０００、ＡＬＳ８に対しては１：２
６１５０ないし好ましくは１：３００００、そしてΔＬ
Ｓ９に対しては１：３０００ないし１：５５００の範囲
であることが見出される。 ｂ）　　　゛モニ　ム′　　　　　　の　　：形質転換
されたタバコ植物番号Ａ３およびＡ４（表３）から、お
よび対照タバコＨａ　ｖ　ａ　ｎａ３８からの幼若葉ま
たは根を集め、液体窒素で急速に冷凍し、そして−８０
°Ｃで保存する。 凍結組織を冷抽出緩衝液（８６，４ｍＭＫＨｔＰ　Ｏｒ
／に２ＨＰ０１　ｐＨ６，７，２，０ｍＭピルビン酸ナ
トリウム（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカル
ズ（ＢＭＢ）、インデイアナ州インデイアナポリス）　
、１．ＯｍＭＤＴＴ％　ｌ　ＯａＭＦ八Ｄ　へＢＭＢ）
、０．５ｍＭＴＰＰ　（ＢＭＢ）、０．５ｍＭＥＤＴＡ
、０．５ｍＭＭｇＣＩ２．１０％グリセロール。使用直
前に、２．０μ１Ｍベンズアミジン（シグマ・ケミカル
社、ミズーリ州セントルイス）、１０．０−と−アミノ
−ｎ−カプロン酸（シグマ）、１．０ｍＭロイペプチン
（シグマ）および１．ＯｍＭＰＭｓＦ　（シグマ）を添
加する。）内に２■／ｇ組織を含有する冷却ブレンダー
カップに添加する。混合物をどろどろのペースト状につ
りつぶす。ペーストをミラクロース（Ｍｌ「ａｃｌｏｔ
ｈ）　　（カルビオケムーベーリング・ダイアグノステ
ィクス、カルフォルニア州う・ジョーラ）を通して口過
し、抽出物を集め、そして容量を決定する。抽出物ｌ−
あたり超特級硫酸アンモニウム（シュワルツ／マンバイ
オチック。 ＩＣＮバイオケミカルズ、オハイオ州クリーブランド）
１１４．０■を添加することにより、抽出物を２０％硫
酸アンモニウム飽和とする。溶液を氷上で１５分間かく
はんして硫酸アンモニウムを溶解させ、その間に少量の
２．５　Ｍ　トリス溶液を添加することによりｐＨを追
跡し、そして６，７に維持する。抽出物を２００００Ｘ
ｇ（ツルバール５Ａ−Ｂｏｏローター内１４０００ｒｐ
ｍ）で４℃１５分間遠心分離する。上清を新たなチュー
ブに移し、そして５９．０■／−硫酸アンモニウムを添
加することにより硫酸アンモニウム飽和を３０％まで高
める。硫酸アンモニウムを溶解させ、その溶液を上記の
ように遠心分離する。上清を捨て、そして４°Ｃキャビ
ネット内にチューブを倒立させることによりペレットを
乾燥させる。あらゆる残りの上清をティッシュペーパー
で注意深く除去する。ペレットを最初の抽出物ｌＯ−あ
たり４００ｍＭＫＨｚＰＯ，／に２ＰＯ，緩衝液（ｐ　
Ｈ６，７）中に懸濁する。タンパク質含量をＢＳＡプロ
テインアッセイリージェント（ピアース・ケミカルズ、
イリノイ州ロックフォード）で濃度標準としてＢＳＡを
用いて定量する。硫酸アンモニウム沈澱抽出物をアッセ
イまで一８０℃で保存する。 Ｃ）の ル−ミ゛ 各抽出物から４００ｎＭＫＨ２ＰＯ，／に２ＰＯ，緩衝
液（ｐＨ６，７）１０μ！中にタンパク質２０μｇを含
有する５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料を調製する。各試料を等容
量の２倍試料緩衝液（０，１Ｍトリス−）（ＣＩｐＨ６
，８，２０％シタ糖、２．０％ＳＤＳ、４．０％２−メ
ルカプトエタノール（シグマ）、０．０１２％ブロモフ
ェノールブルー（シグマ））と混合する。混合物を５分
間煮沸し、そして４−２０％５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲルグラジェントゲル（３４Ｘ７Ｑ　Ｘ　ｌ　ａｍ　
；第−純薬株式会社）上に流す。分子蚤を推定するため
に前染色されたタンパク質［レインボーマーカーズ」　
〔アマルシャム（八ｍｅｒｓｈａｍ）　）を包含させる
。ゲルは、ＩＸＰΔＧＥ緩衝ｒｇ、（０，０２５Ｍ１−
リス−ＨｅｌｐＨ８，３，０，１９２Ｍグリシン、０．
１Ｍ　　５ＤＳ）中の５Ｅ２００ミニチユアスラブゲル
ユニツト〔ホーファー・サイエンティフィック・インス
トルメンツ（ｆｌｏｅｆｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）　、　　カリフォルニア州す
ンフランシスコ〕内で泳動される。電気泳動は９０ボル
トで３０分間、次に１２０ボルトで１時間またはブロモ
フェノールブルー染料がゲルの末端まで達するまで行わ
れる。 ｄ）　ニス　ンブロ　−　ン ゲルはＬＫＢマルチホア■ツバプロットユニット（ファ
ルマシアＬＫＢ／バイオテクノロジ、スウェーデン、ウ
プサラ）を用いてニトロセルロース（孔径０２４５μｍ
；シュライヒヤー・アンド−シュニル社、ニューハンプ
シャー州キーン）上にブロッティングされる。プロッテ
ィングは製造会社の指示により、連続的緩衝系を用い９
０分間行われる。終わったら、供給者の指示に従ってフ
ィルターをボンセラＳ　（ＰｏｎｃｅａｕＳ）（シグマ
・ダイアグノスティクス、ミズーリ州セントルイス）で
染色することにより、移送を確認する。 ｅ）　ム　ステ　ニン　： トットブロットブロッキング溶液（０，１４ＭＮａＣＩ
、８ｍＭＮａｚＨＰＯｒおよび２ｍＭＮａ　Ｈ□Ｐ　Ｏ
ｈ　ｐ　Ｈ７，３まで、１．０％ＢＳＡ　Ｃプロット規
格、プロメガ、ウィスコンシン州マジソン）、０．０２
％ＮａＮ５（シダ？）、２．０９１ｉ’子ヒツジの血清
〔ギブコ・ラボラトリーズ・ライフ・テクノロジー社（
Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｔｅｓ　Ｌｉｒｅ　Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、）　、　　ニューヨ
ーク州グランドアイランド〕５０ｍ１内でゆっくりかく
はんしながら１時間室温でインキュベートすることによ
りフィルターをプレブロックする。フィルターをドツト
プロット洗浄溶液（１０，０ｍＭトリス、０．０５％ツ
イーン２０（プロメガ）、０．０２％ＮａＮ＊（ジグ？
）Ｉ）Ｉ（８，０に調整、１．０％までの子ヒツジの血
〆ｎ（ギブコ）および０．２５％までのＢＳＡ　（プロ
メガ）〕　５〇−中１０分間２回洗浄する。１次抗体結
合のために、血清番号１９８６　（１：２０００希釈）
の抗−ＡＨＡ　Ｓ抗体５μｌを含有するドツトプロット
希釈液１〇−中室温で４５分間フィルターをインキュベ
ートする。ドツトプロット希釈液は１０ＭＮａＯＨでｐ
　Ｈ７，４に調整した、０．０１　ＭＮａＣｌ、５．６
ｍＭＮ　ａ　ｔＨＰ　Ｏ＋および１４ｍＭＮａＨｚＰＯ
ｔｐＨ７，３，１，０％ＢＳＡ　（プロット規格、プロ
メガ）、０．０５％ツイーン２０（プロメガ）、０．０
２％ＮａＮａ（シグマ）、Ｌθ％子ヒツジの血清（ギブ
コ）である。フィルターを上記のように２回洗浄する。 ２次抗体結合のために、抗−ウサギＴｇＧ（全分子）ア
ルカリホスファターゼコンジュゲート（シグマ・ケミカ
ル社、ミズーリ州セントルイス）１５μｌ　（１：　１
０００希釈）を含有するドツトプロット希釈液（上記）
１５Ｊ中室温で４５分間フィルターをインキュベートす
る。フィルターを上記のように２回洗浄し、次にアルカ
リホスファターゼ緩衝液（０，１Ｍトリス−Ｈｅ　ｌ　
ｐＨ９，５，０，１Ｍ　　ＮａＣ１，５，０ｍＭＭ　ｇ
　ＣＩ　２　）中に５分間浸漬する。発色反応のために
、ＢＣＩＰ基質４８μ！およびＮＢＴ基質９９μｐ（プ
ロトプロット・イムノスクリーニング・キットプロメガ
、ウィスコンシン州マンソン）がアルカリホスファター
ゼ緩衝液（上記）１５ｄに添加される。フィルターをこ
の溶液内に入れ、そして反応を暗箱内でゆっくりかくは
んしながら室温で進める。発色は約５分間で認められる
。フィルターをアルカリホスファターゼ緩衝液ですすぎ
、そして写真をとる。 形質転換されたＡ３および八４の根の試料からは各々６
５ｋＤ（キロダルトン）のバンドが得られる。対照タバ
コＨａｖａｎａ３８には存在しなかった。６５ｋＤのバ
ンドのほかに全ての試料には５５ｋＤより小さい多くの
交差反応バンドが見られる。６５ｋＤのバンドはアラビ
ドプシスＡＨＡＳタンパク質に対してほぼ期待される大
きさである。 サリチル酸、安息香酸、ポリアクリル酸および１．２．
３−ベンゾチアゾール−７−カルボン酸のＮａＯＨの添
加によりｐＨを６．０と８．０の間に調整した口過滅菌
溶液を滅菌塗布ハケで塗布することによりカルスを化学
的誘導する。 以下の濃度が試験された：　０．１　ｍＭ、　０．５ｍ
Ｍ５１ｍＭ、　５ｍ１Ｊ、１０ｍＭ、および５０ｍＭ、
カルスを２日間インキュベートし、そして次に集め、液
体窒素で凍結し、そして実施例３７に記載した遺伝子誘
導をアッセイするまで一８０°Ｃで保存する。 植物における化学的誘導は、植物ミスタ−を用いて葉に
細かいスプレーとして上記溶液を塗布することにより得
られる。植物に２日間生長を続けさせ、そして次に集め
、液体窒素で凍結し、そしてアッセイまで一８０℃で保
存する。 １０胆ｊ劃ニーＬ：　　　　　　　　　　Ｎ　　　　　
の　　　セ実施例３６に記載したように誘導され、そし
て集められたカルスまたは植物材料は、実施例３８に記
載したＲＮＡの単離およびブライマー伸長アッセイによ
りｍＲＮΔ種の誘導をアッセイされる。平行して、植物
材料から得られたカルスまたは細胞培養物を１００ｐｐ
ｂＳＬ１８７２または１００ｐｐｂＳＵ４６４を含有す
る固化ＭＸ１培地上にブレーティングし、これらの除草
剤に対する耐性を調べる。 ＡＨＡＳ転写物のマツピングのために、アプライド・バ
イオシステムズ・シンセサイザーおよびｂ−シアノエチ
ルホスホルアミデート化学を用いて１８塩基オリゴヌク
レオチドを合成する。プライマー配列は以下のとおりで
ある：（ａｌアラビドプシス遺伝子： ５　’　ＡＧＧＡＧΔＴＧＧＴＴＴＧＧＴＧＧＡ３　’
＋ｂ）タバコ５ｕＲＡ遺伝子： ５　’　ＡＴＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧ３　’
ｔｅｌタバコ５ｕＲＩ３遺伝子： ５　’　ＧＡＴＴＴＧＧΔＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣ３’オ
リゴヌクレオチドは逆相高圧液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）により精製される。いずれかのオリゴヌクレ
オチド５ｐＭｏｌにγ−′２Ｐ　　ＡＴＰ　（６００Ｑ
Ｃｉ／ｍＭｏ　ｌ　　１０ｕＣ４／ｕｌ）２００１ｔＣ
ｉを用イテリン酸化する（Ｍａｎｉａｌｉｓ等、同上ｐ
、　１２５）。３７℃で３０分間インキュベーション後
、反応液を１００μｌに希釈し、フェノール／クロロホ
ルムでオリゴヌクレオチドを抽出し、そして次にキャリ
アーＲＮＡ５０μｇで３回沈澱させる。最後のベニ澱を
逆転写酵素緩衝液（５０［ＤＭ＋−リス−〇ＣＩｐ　Ｈ
７，５，４０ｍＭＫＣＩ　、　３ｍＭＭｇ　ＣＩ　２　
）中に２蒔の濃度で再懸濁する。標識オリゴヌクレオチ
ドの比活性は約３　Ｘ　Ｉ　Ｏ’ｃｐｍ／ｐＭｏｌと決
定される。 ｂ）至上］Ｕ冒ηま設工 全ＲＮＡはり、　Ｍ、　Ｌａｇｒｉｍｉｎｉ　等、　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ　
８４ニア５４２（１９８７）により記載されたように実
質的に調製される。組織を液体窒素下で乳鉢と乳棒です
りつぶす。すりつぶした組織を組織１ｇあたり２．５−
の割合で粉砕緩衝ｉｆｆｌ（Ｌａｇｒｌｍｉｎｉ等、同
上）に添加する。次に等容量のフェノールを添加し、エ
マルジョンをプリンクマンポリトロン内でホモゲナイズ
する。１／２容量のクロロホルムを添加し、そしてエマ
ルジョンをゆっくり１５分間混合する。遠心分離により
相を分離し、モして水相を除去する。０．３Ｍまでの酢
酸ナトリウムおよび２．５容量のエタノールを添加する
ことによりＲＮＡを沈澱させる。沈澱を遠心分離により
集めそして滅菌水２−中に再懸濁する。塩化リチウムを
３Ｍの最終濃度まで添加し、そして４℃で一晩放置する
。 沈澱を遠心分離により集め、そしてペレットを水冷８０
％エタノールで洗浄する。ベレットを乾燥させ、そして
滅菌水５００μｌ中に再懸濁する。この全ＲＮＡ調製物
の濃度は分光学的に決定される。また、カルス組織がお
よそ３１１１１の大きさの角片に切断され、そしてポリ
トロン段階に先立ち液体窒素内で粉砕するために前冷却
された乳鉢と乳棒に添加されることを除いて、ＲＮＡは
上記カルスから抽出されてもよい。 Ｃ）プｊヱｌ乙二独五ニー 全ＲＮＡ５０μｇを５００μ！エツペンドルフチユーブ
内で凍結乾燥する。ＲＮＡを放射標識オリゴヌクレオチ
ド溶液３０μｌ内に再懸濁し、そして７０℃に１０分間
加熱する。チューブを３７℃まで冷却し、そして−晩イ
ンキユベートする。３７℃の水浴からチューブを取り除
くことなく、１０×逆転写酵素緩衝液（５００ｍＭトリ
ス−ＨＣｌｐＨ７，５，４００ｍＭＫＣＩ、３０ｍＭＭ
ｇＣＩ　２　）　２　ｕ　ｊ７．　５■／Ｉｎ！ウシ血
清アルブミンＩｕ１．１００ｍＭジチオトレイトール５
μｌ、１０ｘｄＮＴＰ　（各ｄＮＴＰがＨ。 ０中１０ｍＭ）　５μｌ、Ｈｔ０３μＣＲＮａｓｉｎ（
８０単位）２μ！、および逆転写酵素（４００単位）２
μｌを添加し、そして反応液を３７℃で３０分間インキ
ュベートする。反応を終了させるために、３Ｍ酢酸ナト
リウム５μｍ、　ｐＨ５および無水エタノール１５０μ
ｌを添加する。チューブを一２０℃で３０分間放置し、
沈澱を遠心分離により集め、８０％エタノールで洗浄し
、そして風乾させる。沈澱を荷動染料（９０％ホルムア
ミド、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％
キシレンシアツール、１ｍＭＥＤＴΔ）１０−２０ｕｌ
中に懸濁し、そして伸長産物を６％配列決定ゲル（Ｍａ
ｎｉａｔｌｓ等。 同上）上で分離する。伸長産物をオートラジオグラフィ
ーにより視覚化する。 実】０汁ｌ」−：　　ヌ　し　−ゼマ　ビンそれぞれタ
バコ５ｕＲＡおよび５ｕＲＢを含有するプラスミドｐｃ
ＩＢ１２０９およびｐＣＩＢ１２１０　（実施例１７）
を制限酵素Ｎｃｏｌで消化し、ウシ腸ホスファターゼで
脱ホスホリル化し、そしてγ−”Ｐ　　ＡＴＰでリン酸
化する。 フェノール抽出およびエタノール沈澱に続いて、ＤＮＡ
をそれぞれＢａｍ１ｌｌ　とＥｃｏＲｌで消化し、そし
て低ゲル化温度のアガロースゲルでの電気泳動の後それ
ぞれ５３４ｂｐおよび４８４ｂｐの断片が単離される。 プローブをホルムアルデヒドハイブリダイゼーシタン緩
衝液（＾、　Ｊ、　Ｂｅｒｋ等、Ｃｅ１１１２ニア２１
，１９？？）中に約２ｎＭの濃度で再懸濁する。 プローブの比活性は約５　Ｘ　１０ｃｐｍ／ｐＭｏｌで
ある。 凍結乾燥した全ＲＮＡ（５０μｇ）をプローブ溶液３０
μｌに溶解し、そしてチューブを６５℃に１０分間加熱
し、次に４８℃でハイプツト形成させる。Ｓ１ヌクレア
ーゼ処理およびゲル電気泳動は、４００単位／ｒｎｌの
３１６度および３０℃のインキュベーション温度を用い
て上記のように実質的に行われる。適当なＳ１ヌクレア
一ゼ濃度は実験室での試験により決定される。 ５ｕＲＡおよび５ｕＲＢ遺伝子の３１末端はまた、Ｂｃ
ｌｌ／　ＸｈｏｌおよびＢｇｌｌｌ／　Ｂａｍ１ｌｌ断
片をそれぞれ用いてこの操作に従ってマツピングされる
。 爽胤桝土ｌ：　　　　　　のマ　ピン ＡＨＡＳ遺伝子の転写開始部位はＳｌヌクレアーゼマツ
ピングおよびプライマー伸長分析の組合せにより決定さ
れる。ＣａＭＶ３５Ｓの葉およびアラビドプシスＡＨＡ
Ｓ形質転換植物から単離されたＲＮＡを用いるプライマ
ー伸長試験およびアラビドプシスプライマーのオートラ
ジオグラムは１５７ｂｐバンドの存在を示す。ブライマ
ー自身は５′ホスフエートで標識されており、それゆえ
に伸長産物の大きさはｍＲＮＡが３５３プロモーター内
の期待される部位で開始されそしてプロモーターから誘
導された８９ｂｐおよびアラビドプシス遺伝子から誘導
された６８ｂｐを含有することを示している。タバコ５
ｕＲＡおよび５ｕＲＢブライマーが使用されたとき、同
様に予測される大きさの断片が検出される。　しかしな
がら、ブライマー伸長分析だけがｍＲＮＡの５′末端を
同定するために使用されることはできない。例えば、ｍ
ＲＮＡは上流部位からスプライスされた５′末端を含み
得る。最終的に５′末端を決定するために、高解像度Ｓ
ｔヌクレアーゼマツピングがブライマー伸長と組み合わ
せて使用される。Ｎｃｏ　Ｉ断片が５１末端で標識され
、そしてＢａｍ１ｌｌ　とＥｃｏＲＩでそれぞれ消化さ
れて、それぞれタバコ５ｕＲＡおよび５ｕＲＢ遺伝子の
鎖特異性プローブが得られる。これらのプローブはトラ
ンスジェニックタバコおよびトウモロコシの葉から単離
されたＲＮＡ内のＡＨＡＳ転写物の５１末端をマツピン
グするために使用される。 以下に上記した配列ユないし９を示す。 Ｃ１５ｑｂ−２０，５ｅｑ Ｊ＆之　：４３５ ＬＫＶＤＡＣ！５Ｖ１４ＰＱＫＮＸＧ　　　１ＣＡＡＣ
ＴＣＣＴＣＡ　　ＣＣＡＧＡＴにＣ′ｒＧ　　ＣＧＣＡ
ＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＡＣ八丁入Ａ　へＡＧＡＡＣＡＧ
ＧＧＣ配列１ Ｌ！ＥＯ５ＡＡＣＧＧＧＶＹＬＶＰＲＲ配列２ Ｃ３ｓａ１６ｓｅｑ、Ｄａｔ　　４２　　＋　３７５１
　　↑ＴＧＣＴＴＴＧＣＡ　　ＧＧＧＣＡＴＧＡＡＴ　
　ＡＣＴＣＴＴＣＴＧＧ　　ＡＡＧＧＭＧＣＡＣＡＴＣ
ＡＡＡＧＡＡＧ５１　　八ＧＣＴＴＴＧＡＣＴ　　ＴＣ
ＧＧＣＴＣＡＴＧ　　ＧＣＡＴＧＡＴＧＡＡ　　ＴＴＣ
；ＧＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＧＧＧＡｌｏｌ　　　Ｇ
ＴＴＴＣＣＣＣＴＴ　　ＧＧＧＴＡＴＡＡＡＡ　　ＴＣ
ＴＴＣＡＡＴＧＡ　　ＧＧＡＡＡＴＣＣＡＧ　　ＣＣＡ
ＣＡＡＴＡＴＧｌｓＩ　　　ＣＴＡＴＴＣＡＧＧＴ　　
ＴＣＴＴＧＡＴＧＡＧ　　ＴＴＧＡＣＧＭＧＧ　　ＧＧ
ＡＡＧＧＣＣＡＴ　　ＣＡＴＴＧＣＣＡＣＡ２０１　　
　ＣＧＴＧＴ？ＧＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＴ　ＧＴＧ
ＧＧＣＧＧＣＡ　　ＣＡＧＴＡＴＴＡＣＡ　　ＣＴＴＡ
ＣＡＡＧＣＧ２５１　　　ＧＣＣＡＡＧＧＣＡＧ　　Ｔ
ＧＧＣＴＧＴＣＴＴ　　ＣＡＧＣＴＧＧＴＣＴ　　ＴＧ
ＧＧＧＣＴＡＴＧ　　ＧＧＡＴＴＴＧＧＴＴ３０１　　
ＴＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴ　ＧＣＴＧ
ＴＧＧＣＣＡ　ＡＣＣＣＡＧＧＴＧＴ　　ＣＡＣＴＧＴ
ＴＧＴ？３５１　　　ＧＡＣ八丁へＧＡＣＧ　　ＧＡＧ
ＡＴＧＧＴＡＧ　　ＣＴＴＣＣ配列４ 配列３ へへＱＹＹ丁− ＹＸＲＰＲＱＷＬＳＳＡＧＬＧＡＭＧｒＧＬ−配列６ 配列５ 配列７（１） 配列７（３） 配列７（２） 配列７（４） 配列７（５） 配列８（２） 配列８（１） 配列８（３） 配列８（４） 配 列 ？（ｌ） ４７Ｇ ｏＳ　ｅｒＰｈｅＬｅｕＬｅｕＶａ　ｌ　５ｅｒＴｈｒ
ＬｅｕＬｅｕＬｅｕＰｈｅＬｅｕＶａ　Ｉｌｌ　ｅｓｅ
ｒｌ　ｌｉ１０５０　　　　　　　　　　１０７［１１
０９０１１Ｇ ｙｒＬｅｕＡｓ　ｐＡ　ｌ　ａｌｌ　ｉ　５ＡｓｎＴｈ
ｒＡ　ｌ　ａＡｒｇＡ　１　ａＡｓ　ｐＶａ　ｌ　Ｇ　
ｌ　ｙＶａ　ＩＧＩ　ｕＰｒｏＬｅｕ　ＴｈｒＴｒｐＡ
ｓｐＡｓｐＧ　１ｎＶａ　ＩＡ　ｌａＡ　ｌ　ａＴｙｒ
＾１ａ１１３０１１５０＋１７０１１９０ ８５Ｇ Ｇ１ｎＡｑｎＴｙｒ＾１ａｓｅｒＧ ｉｓＳｅｒｌｌｉｓＧ１ｙＧｌｎＴｙｒＧｌｙＧｌｕＡ
ｓｎＬｅｕＡｌａＧＩｕＧ１１２１θ ＴＡＧＧＴｒＡＧＡＴｒＡＣＡＴｒＡＡＴＣＡＴＧＴＣ
ＡＴｒＡＧＡＡＧＡＴＣロ゛配 列９（３） 配 列 図面の簡単な説明 第１図はｐｃＩＢ１２５３の４．０　ｋｂｐ　Ｘｂａｌ
１１挿入物の物理的地図を示す説明図である。制限エン
ドヌクレアーゼ部位ＥｅｏＲＩ　、ｌ１ｉｎｃｌｌ、旧
ｎｄ■、Ｎｃｏｌ、　ＸｂａｌおよびＸｈｏｌが示され
ている。この断片はＤＣＩＢ１２００からクローン化さ
れ、モして５ＪＬＣＩＩ　−Ｂｇｌｌｌアラビドプシス
ＡＨＡＳ遺伝子断片へのハイブリダイゼーションを示す
。 第２図はｐｃＩＢ１２５５の７．５　ｋｂｐ　ＥｅｏＲ
Ｉ挿入物の物理的地図を示す説明図である。制限エンド
ヌクレアーゼ部位ＢａｍＨＩ　、　ＥｃｏＲＩ　、旧ｎ
ｄ■、にｐｎｌ、　ＰＳｔｌおよび５ａｌｌが示されて
いる。この断片はＤＣＩ　Ｂ　１２０２からクローン化
され、そして５ａｃｌｌ　−Ｂｇｌｌｌアラビドプシス
ＡＨＡＳ遺伝子断片へのハイブリダイゼーションを示す
。

Claims (64)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）高められたレベルのアセトヒドロキシ酸シンター
    ゼ（ＡＨＡＳ）酵素により耐性が引き起こされる除草性
    のＡＨＡＳ阻害剤に耐性である植物細胞。
  2. （２）前記耐性が高められたレベルのＡＨＡＳ酵素によ
    り引き起こされ、そして該ＡＨＡＳが野生型ＡＨＡＳの
    性質を実質的に有する請求項１記載の植物細胞。
  3. （３）前記ＡＨＡＳが、前記除草性のＡＨＡＳ阻害剤に
    感受性である植物細胞から誘導された野生型ＡＨＡＳの
    性質を実質的に有する請求項２記載の植物細胞。
  4. （４）前記高められたレベルのＡＨＡＳ酵素が、前記除
    草性のＡＨＡＳ阻害剤に感受性である他の同様な自然に
    生じる植物細胞内のＡＨＡＳ酵素のレベルに比べ少なく
    とも２倍高い請求項１記載の植物細胞。
  5. （５）前記高められたレベルのＡＨＡＳ酵素が、前記除
    草性のＡＨＡＳ阻害剤に感受性である他の同様な自然に
    生じる植物細胞内のＡＨＡＳ酵素のレベルに比べ少なく
    とも１０倍高い請求項１記載の植物細胞。
  6. （６）前記高められたレベルのＡＨＡＳ酵素が、内因性
    のＡＨＡＳコード配列の高められた発現に起因する請求
    項１記載の植物細胞。
  7. （７）前記高められたレベルのＡＨＡＳ酵素が、内因性
    のＡＨＡＳ遺伝子の多重コピーに起因する請求項１記載
    の植物細胞。
  8. （８）前記高められたレベルのＡＨＡＳ酵素が、内因性
    のＡＨＡＳ遺伝子の非コード配列における突然変異に起
    因する請求項１記載の植物細胞。
  9. （９）前記高められたレベルのＡＨＡＳ酵素が、外因性
    のＡＨＡＳ遺伝子に起因する請求項１記載の植物細胞。
  10. （１０）前記外因性のＡＨＡＳ遺伝子が、野生型ＡＨＡ
    Ｓの性質を実質的に有するＡＨＡＳをコードする請求項
    ９記載の植物細胞。
  11. （１１）前記外因性のＡＨＡＳ遺伝子のコード配列が、
    前記除草性のＡＨＡＳ阻害剤に感受性である植物細胞か
    ら誘導される請求項１０記載の植物細胞。
  12. （１２）ＡＨＡＳの高められた発現を提供するプロモー
    ターに操作可能に連結された、植物細胞内で機能的なＡ
    ＨＡＳをコードするＤＮＡ配列からなるキメラＤＮＡ構
    築物を安定に組み入れた請求項１記載の植物細胞。
  13. （１３）植物細胞内で機能的であるＡＨＡＳをコードす
    るＤＮＡ配列および移送ペプチドをコードするＤＮＡ配
    列からなり、前記コード配列が前記ＡＨＡＳの高められ
    た発現を提供するプロモーターに操作可能に連結されて
    いるキメラＤＮＡ構築物を安定に組み入れた請求項１記
    載の植物細胞。
  14. （１４）前記プロモーターが化学的に調節可能なプロモ
    ーターである請求項１２記載の植物細胞。
  15. （１５）単子葉植物細胞である請求項１記載の植物細胞
    。
  16. （１６）双子葉植物細胞である請求項１記載の植物細胞
    。
  17. （１７）トウモロコシ、小麦、大麦、イネ、モロコシ、
    サトウキビ、テンサイ、ダイズ、プラッシカ、ヒマワリ
    、ニンジン、タバコ、レタス、キュウリ、トマト、ジャ
    ガイモ、ワタ、アラビドプシス、ロリウム、フェストゥ
    カ、ダクチリス、およびポプラ植物細胞からなる群から
    選択される請求項１記載の植物細胞。
  18. （１８）スルホニル尿素除草剤に耐性である請求項１記
    載の植物細胞。
  19. （１９）Ｎ−ｏ−メトキシ−およびエトキシカルボニル
    フェニルスルホニル−Ｎ′−（ジフルオロメトキシ置換
    ピリミジニル）−尿素、Ｎ−ｏ−（２−メトキシ−およ
    び２−エトキシ−エトキシ）−フェニルスルホニル−Ｎ
    ′−（メチルおよび／またはメトキシ置換トリアジニル
    ）−尿素、およびＮ−ｏ−（２−クロロエトキシ）−フ
    ェニルスルホニル−Ｎ′−（メチルおよび／またはメト
    キシ置換トリアジニル）−尿素からなる群から選択され
    る除草剤に耐性である請求項１８記載の植物細胞。
  20. （２０）イミダゾリノン除草剤に耐性である請求項１記
    載の植物細胞。
  21. （２１）トリアゾロピリミジン除草剤に耐性である請求
    項１記載の植物細胞。
  22. （２２）請求項１記載の植物細胞からなり、除草性のア
    セトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）阻害剤に耐性
    である植物。
  23. （２３）請求項１４記載の植物細胞からなる請求項２２
    記載の植物。
  24. （２４）請求項２２記載の植物の種子およびその他のム
    カゴ。
  25. （２５）野生型遺伝子内のＡＨＡＳに連結したプロモー
    ターとは異なるプロモーターに操作可能に連結した野生
    型ＡＨＡＳをコードするＤＮＡ配列からなるキメラＤＮ
    Ａ構築物。
  26. （２６）前記プロモーターが植物細胞内で機能的である
    請求項２５記載のキメラＤＮＡ構築物。
  27. （２７）野生型ＡＨＡＳをコードするＤＮＡ配列と野生
    型遺伝子内のＡＨＡＳに連結したプロモーターとは異な
    るプロモーターに操作可能に連結した移送ペプチドをコ
    ードするＤＮＡ配列とからなる請求項２６記載のキメラ
    ＤＮＡ構築物。
  28. （２８）前記プロモーターが調節可能である請求項２６
    記載のキメラＤＮＡ構築物。
  29. （２９）前記プロモーターが化学的に調節可能である請
    求項２８記載のキメラＤＮＡ構築物。
  30. （３０）前記プロモーターが光により調節可能である請
    求項２８記載のキメラＤＮＡ構築物。
  31. （３１）前記プロモーターが熱により調節可能である請
    求項２８記載のキメラＤＮＡ構築物。
  32. （３２）前記プロモーターがカリフラワーモザイクウィ
    ルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターである請求項２６
    記載のキメラＤＮＡ構築物。
  33. （３３）前記プロモーターが病原関連（ＰＲ）タンパク
    質プロモーターである請求項２９記載のキメラＤＮＡ構
    築物。
  34. （３４）前記移送ペプチドが葉緑体移送ペプチドである
    請求項２７記載のキメラＤＮＡ構築物。
  35. （３５）除草性のＡＨＡＳ阻害剤に感受性であるタバコ
    （ニコチアナ・タバカム）から誘導された野生型ＡＨＡ
    ＳをコードするＤＮＡ配列からなる請求項２５記載のキ
    メラＤＮＡ構築物。
  36. （３６）除草性のＡＨＡＳ阻害剤に感受性であるアラビ
    ドプシス・タリアナから誘導された野生型ＡＨＡＳをコ
    ードするＤＮＡ配列からなる請求項２５記載のキメラＤ
    ＮＡ構築物。
  37. （３７）除草性のＡＨＡＳ阻害剤に感受性であるトウモ
    ロコシ（ゼア・メイズ）から誘導された野生型ＡＨＡＳ
    をコードするＤＮＡ配列からなる請求項２５記載のキメ
    ラＤＮＡ構築物。
  38. （３８）野生型ＡＨＡＳをコードするＤＮＡ配列と葉緑
    体移送ペプチドをコードするＤＮＡ配列とからなり、こ
    れらＤＮＡ配列が除草性のＡＨＡＳ阻害剤に感受性であ
    るタバコ（ニコチアナ・タバカム）から誘導される請求
    項２７記載のキメラＤＮＡ構築物。
  39. （３９）選択可能なマーカーをコードするＤＮＡ配列か
    らなる請求項２５記載のキメラＤＮＡ構築物。
  40. （４０）前記選択可能なマーカーがハイグロマイシン耐
    性である請求項３９記載のキメラＤＮＡ構築物。
  41. （４１）野生型ＡＨＡＳコード配列の多重コピーからな
    る組換えＤＮＡ。
  42. （４２）野生型ＡＨＡＳ遺伝子の多重コピーからなる請
    求項４１記載の組換えＤＮＡ。
  43. （４３）前記ＡＨＡＳコード配列が除草性のＡＨＡＳ阻
    害剤に感受性であるタバコ（ニコチアナ・タバカム）か
    ら誘導される請求項４１記載の組換えＤＮＡ。
  44. （４４）選択可能なマーカーをコードするＤＮＡ配列か
    らなる請求項４１記載の組換えＤＮＡ。
  45. （４５）前記選択可能なマーカーがハイグロマイシン耐
    性である請求項４４記載の組換えＤＮＡ。
  46. （４６）植物細胞の形質転換のためのベクターである請
    求項２６記載のキメラＤＮＡ構築物からなる組換えＤＮ
    Ａ。
  47. （４７）微生物内で機能的な複製開始点を含む請求項４
    ６記載の組換えＤＮＡ。
  48. （４８）大腸菌内で機能的な複製開始点を含む請求項４
    ７記載の組換えＤＮＡ。
  49. （４９）アグロバクテリウム内で機能的な複製開始点を
    含む請求項４７記載の組換えＤＮＡ。
  50. （５０）植物細胞の形質転換のためのベクターである請
    求項４１記載のＤＮＡからなる組換えＤＮＡ。
  51. （５１）トウモロコシ（ゼア・メイズ）の野生型ＡＨＡ
    ＳをコードするＤＮＡ配列からなる組換えＤＮＡ。
  52. （５２）トウモロコシの野生型ＡＨＡＳ遺伝子からなる
    請求項５１記載の組換えＤＮＡ。
  53. （５３）プラスミドｐＣＩＢ１２５３である請求項５１
    記載の組換えＤＮＡ。
  54. （５４）プラスミドｐＣＩＢ１２５５である請求項５１
    記載の組換えＤＮＡ。
  55. （５５）次式配列７： 【遺伝子配列があります】 配列７（２） 【遺伝子配列が有ります】 配列７（３） 【遺伝子配列が有ります】 配列７（５） で表されるＤＮＡ配列のコード配列からなる請求項５１
    記載の組換えＤＮＡ。
  56. （５６）次式配列８： 【遺伝子配列が有ります】 配列８（１） 【遺伝子配列が有ります】 配列８（２） 【遺伝子配列が有ります】 配列８（４） で表されるＤＮＡ配列のコード配列からなる請求項５１
    記載の組換えＤＮＡ。
  57. （５７）（ａ）野生型植物細胞を増加する量の除草性Ａ
    ＨＡＳ阻害剤の存在下で培養し、 （ｂ）段階（ａ）からの生き残りの植物細胞を前記除草
    性ＡＨＡＳ阻害剤の存在下で継代培養し、（ｃ）段階（
    ｂ）で得られた植物細胞を野生型ＡＨＡＳ特性を実質的
    に有するＡＨＡＳの存在およびＡＨＡＳ酵素の高められ
    たレベルを分析し、そして （ｄ）段階（ｃ）に記載した所望の特性を有する植物細
    胞を選択し、そして培養する、 ことからなる請求項１記載の植物細胞の調製方法。
  58. （５８）植物細胞を請求項４６記載の組換えＤＮＡで形
    質転換する請求項１記載の植物細胞の調製方法。
  59. （５９）植物細胞を請求項５０記載の組換えＤＮＡで形
    質転換する請求項１記載の植物細胞の調製方法。
  60. （６０）請求項１記載の細胞からなる植物細胞の混合物
    を除草性のＡＨＡＳ阻害剤の存在下で培養し、そして生
    き残りの細胞を単離することからなる所望の遺伝子型を
    示す植物細胞を選択する方法。
  61. （６１）農園内の全ての植物が植物防除量の除草性アセ
    トヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）阻害剤と接触さ
    れる該除草性ＡＨＡＳ阻害剤に耐性の請求項２２記載の
    植物からなる農園内の雑草を防除する方法。
  62. （６２）農園内の全ての植物が化学調節剤および同時に
    または引き続いて植物防除量の除草性ＡＨＡＳ阻害剤と
    接触される該除草性ＡＨＡＳ阻害剤に対する耐性が化学
    調節剤により調節可能である請求項２３記載の植物から
    なる農園内の雑草を防除する請求項６１記載の方法。
  63. （６３）（ａ）天然の供給源またはゲノムもしくはｃＤ
    ＮＡライブラリ−から野生型アセトヒドロキシ酸シンタ
    ーゼ（ＡＨＡＳ）をコードする第一のＤＮＡ成分配列を
    単離し、 （ｂ）段階（ａ）の該ＤＮＡ成分配列を、野生型遺伝子
    内の前記ＡＨＡＳに連結されたプロモーターとは異なる
    がしかし植物内で機能的であるプロモーターに、それら
    を同時にまたは引き続いて連結することにより操作可能
    に連結する、 ことからなる植物に除草性ＡＨＡＳ阻害剤に対する耐性
    を与えることができるキメラＤＮＡ構築物の製造方法。
  64. （６４）（ａ）天然の供給源またはゲノムもしくはｃＤ
    ＮＡライブラリーから野生型アセトヒドロキシ酸シンタ
    ーゼ（ＡＨＡＳ）をコードする第一のＤＮＡ成分配列を
    単離し、 （ｂ）移送ペプチドをコードする第二のＤＮＡ成分配列
    を単離し、 （ｃ）段階（ａ）および（ｂ）の成分配列を連結し、（
    ｄ）段階（ｃ）の生成ＤＮＡ配列を、野生型遺伝子内の
    前記ＡＨＡＳに連結されたプロモーターとは異なるがし
    かし植物内で機能的であるプロモーターに、それらを同
    時にまたは引き続いて連結することにより操作可能に連
    結する、 ことからなる植物に除草性ＡＨＡＳ阻害剤に対する耐性
    を与えることができるキメラＤＮＡ構築物の製造方法。
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