CN100537768C - 氮限制条件下生长得以改善的植物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明，提供了一种通过增加植物的2-OG含量，制备植物的氮吸收和代谢活性增加且在氮减少也就是在与通常栽培条件相比更加限制氮的栽培条件下生长发育和/或产量得以改善的植物方法。尤其是，本发明提供了通过导入GDH基因或ECASPC基因，在植物内表达导入的GDH基因或ECASPC基因增加2-OG含量，或者通过在植物叶面撒布脯氨酸增加植物2-OG含量，提高植物的氮吸收和代谢活性，制备在与通常栽培条件相比更加限制氮的栽培条件下生长发育和/或产量提高的植物的方法。此外，还提供了在氮限制条件下栽培这种植物的方法。

Description

氮限制条件下生长得以改善的植物的制备方法
技术领域
本发明涉及一种在氮限制条件下改善植物的生长和产量的方法。
发明背景
近代的集约农业中所见到的以供给氮为目的的大量施用复合肥料，在实现产量显著增加的同时也使氮以过剩的硝酸盐形式向周边环境释放，造成由于江河、湖沼富营养化而产生的环境污染，或随着硝酸在农作物中的累积造成对健康的威胁，再有，残留在土壤中的氮产生温室效应气体等环境方面的问题。此外，在氮肥的制造阶段中需要大量的电力，这也成为农业环境负担的原因。也就是说，为了确保持续性发展，需要较少使用化肥，尤其是氮肥的农业方法。
但是，除了豆科等例外，植物无法固定空气中的氮，这种氮营养完全依赖于由外部供给的硝酸或氨。因而，氮对植物的生长发育而言是最大的限制因子。今后的农业需要面对在维持、增加现行产量之外，同时还要考虑减少上述环境负担的持续性这样看似矛盾的问题。致力于这些问题的努力，即尤其是致力于减少氮源的条件下可以获得充分的生长和产量的植物开发和栽培的工作还远远不足。例如，对于近代的集约农业，还提倡有利于环境的所谓持续型、有机农业法，而这种考虑环境型的有机农业方法中控制氮肥施用的另一方面，在其产量方面又有很多问题。
植物的品种改良的观点出发，也没有能够解决这些问题的育种实例，即，还没有在减少氮肥施用的氮限制条件下获得足够的生长和/或产量的成功的植物育种的例子。因此，需要开发出在较少施加氮肥的情况下，通过改变/改善植物的氮利用率，使产量得以维持/改善的品种，以及用于培育上述植物品种的技术。
已知的是，在植物中将无机氮同化成有机形式的第一阶段主要是将氨吸收到谷氨酸中用于生成谷氨酰胺。这是由谷氨酰胺合酶(GS)和谷氨酸合酶(GOGAT)所催化的反应，该反应中作为这两种酶反应的总合，将1分子的氨同化成1分子2-OG产生1分子谷氨酸。这种GS/GOGAT循环被认为是植物中同化氮的主要途径(文献：Miflin andLea：1976，Phytochemistry，15：873-885)。
另一方面，在微生物中，据利用蓝细菌(Cyanobacteria)和大肠杆菌的研究报道了2-OG和谷氨酰胺的数量的平衡调节与硝酸的吸收和同化相关的酶基因的表达(文献：Forchammer and Tandeau-marsac，1995，JBacterial 177：2033-2040；Jiang等，1998，biochemistry 37：12795-12801)。然而，由拟南芥(Arabidopsis)中分离出与同这种调节相关的PII蛋白质高度同源的基因，然而将这种基因导入烟草中并过量表达，并没有观察到硝酸含量的增加，因此认为高等植物中氮的累积与微生物中的不同(文献：Hsieh等，1998，Proc Natl Acad Sci Usa 95：13965-13970)。另一方面，据报道利用在反义方向导入了铁氧化还原蛋白依赖型谷氨酸合酶基因而使谷氨酸合酶基因表达降低的烟草，对硝酸还原酶(以下简称为NR)的表达进行了研究，其结果显示添加了硝酸以及蔗糖、2-OG时，NR的转录水平升高，而添加谷氨酰胺时NR的转录水平降低(文献：Ferrario-Mery等，2001，Planta 213：265-271)，该文献中还指出在高等植物中，2-OG和谷氨酰胺的数量也与NR的调节相关。然而，这些发现仅仅涉及NR，而对于2-OG对氮限制条件下的植物的生长发育中的影响却没有提及。此外，由于2-OG是一种比较不稳定的化合物，因此认为以撒布等为目的的使用是不实际的。
此外，还制备出了导入了GDH基因的转基因植物，据报道，为赋予植物对除草剂草丁膦(phosphinothricin)抗性为目的在烟草和玉米中导入来源于大肠杆菌的NADP依赖型GDH基因(gdhA)，干燥重量、氨基酸总含量和水溶性碳水化合物含量都有显著增加(Lightfoot等，CA2180786，1996)。同样，Tian等人(CN00109779.2)报道，与没有导入基因的烟草相比，向烟草中导入来自链孢霉属(Neurospora)的NADP依赖型GDH基因，其生长发育良好。而且，据报道，向番茄中导入来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的NADP依赖型GDH基因，果实中的游离氨基酸含量增加(文献：kisaka等JP11-376710)，并且在马铃薯中导入相同的基因，块茎的重量和块茎数量增加(kisaka等，JP2000-404322)。然而，这些报道均没有阐明导入基因的功能，导入的基因如何发挥作用，或由怎样的效果产生这些性质。而且，也没有涉及氮限制条件下的植物的生长和/或产量的改善。
另一方面，至今为止还没有在植物中导入天冬氨酸转氨酶基因的报道。
发明的公开
本发明旨在提供一种植物培育方法，所述植物的氮吸收和代谢活性增强，且在减少氮，即在在将氮限制到比通常的栽培条件低的栽培条件下生长发育和/或产量得以改善。此外提供一种在氮限制条件下栽培这种植物的方法。
本发明人假设植物细胞存在着用于感知氮营养状态的信号分子，并且将2-酮戊二酸(2-OG)认作此种信号分子。也就是说，2-OG是全面控制植物细胞的氮吸收、代谢的信号分子，认为如果人为地增减这种物质的含量，能够维持植物细胞的氮吸收、代谢的亢进状态。此外，由于考虑到这种亢进状态的植物能够活跃地吸收外部的氮，因而认为在限制氮的条件下，氮营养也是充足的，从而使生长发育和产量得以改善。进而，本申请发明人发现，实际上经由过表达谷氨酸脱氢酶(以下简称为GDH)活性或天冬氨酸转氨酶(以下简称为ASPC)活性，使植物细胞中的2-OG含量得以增加，2-OG含量增加的植物在氮限制条件下生长发育和/或产量得到改善，由此完成了本发明。
因此，本发明就是一种植物的制备方法，其特征在于通过提高所述植物中的2-OG含量，使所述植物在与在将氮限制到比通常的栽培条件低的栽培条件下生长发育和/或产量得到改善。
此外，本发明涉及在将氮限制到比通常的栽培条件低的栽培条件下，生长发育和/或产量得以改善的植物及其种子，其特征在于通过导入GDH基因或ASPC基因，使这些基因在植物体内表达，由此增加2-OG的含量。此外，本发明还涉及在将氮限制到比通常的栽培条件低的栽培条件下，生长发育和/或产量得以改善的植物的制备方法，其特征在于导入GDH基因或ASPC基因，使这些基因在植物体内表达，结果使所述植物的2-OG含量得以增加。
具体地说，本发明涉及在将氮限制到比通常的栽培条件低的栽培条件下，生长发育和/或产量得以改善的植物的制备方法，其中在上述方法中，在对于各种植物建立的标准氮肥量的下限至下限的1/10的氮量范围内获得与标准氮肥量栽培条件相等或更高的生长发育和/或产量。
本发明涉及栽培由上述方法制备的植物的方法，其特征在于在限制氮的条件下栽培。尤其是，本发明还涉及在对各种植物建立的标准氮肥量的下限至下限的1/10的氮肥量范围条件下栽培由上述方法制备的植物的方法。
进而，本发明涉及改善在将氮限制到比通常的栽培条件低的栽培条件下，生长发育和/或产量的方法，其包括叶面撒布脯氨酸。
附图的简要说明
图1是构建的质粒载体模式图。Nos-Pro：胭脂碱合酶启动子；NPTII是新霉素磷酸转移酶；Nos-Ter：胭脂碱合酶终止子；35S-Pro是花椰菜花叶病毒35S启动子；Mtd-AN-GDH是添加了线粒体转运肽的源于构巢曲霉的谷氨酸脱氢酶基因(GDH)；HPT：潮霉素磷酸转移酶；H是HindIII，B：BamH I，X：Xba I，SP：Spe I，E：EcoR I；LB：左边缘，RB：右边缘。
图2表示的是转化的马铃薯的PCR分析结果。A：An-GDH基因的特异引物的使用，B：NPTII基因特异性引物的使用。泳道1：100bp分子量标记，泳道2：未转化的马铃薯、泳道3：转化的马铃薯Mtd1、泳道4：转化的马铃薯Mtd2、泳道5：转化的马铃薯Mtd3、泳道6：转化的马铃薯Mtd5、泳道7：转化的马铃薯Mtd8。
图3表示的是转化的拟南芥PCR分析结果。A：An-GDH基因的特异引物的使用，B：NPT II基因特异性引物的使用。泳道1：100bp的分子量标记，泳道2：未转化的拟南芥、泳道3：转化的拟南芥Mtd2、泳道4：转化的拟南芥Mtd3、泳道5：转化的拟南芥Mtd4。
图4表示的是转化的马铃薯的Northern分析结果。A：从叶组织中提取的RNA、B：从块茎中提取的RNA。对10μg总RNA进行电泳、用溴化乙锭染色的图像(A，B中均为下侧的图像)。以全长An-GDH基因作为探针。泳道1：未转化的马铃薯、泳道2：转化的马铃薯Mtd1、泳道3：转化的马铃薯Mtd2、泳道4：转化的马铃薯Mtd3、泳道5：转化的马铃薯Mtd5、泳道6：转化的马铃薯Mtd8。
图5表示的是转化的拟南芥的Northern分析结果。采用了从叶组织中提取的RNA。对10μg总RNA进行电泳、用溴化乙锭染色的图像(下侧的图像)。以全长An-GDH基因作为探针。泳道1：未转化的拟南芥，泳道2：转化的拟南芥Mtd2、泳道3：转化的拟南芥Mtd3、泳道4：转化的拟南芥Mtd4。
图6A-C是表示GDH转化植物(拟南芥)的2-酮戊二酸(2-OG)、尿素、硝酸含量的图。纵轴表示的是每份鲜重的摩尔数(nmol)。Mtd3-10：GDH转化拟南芥(no.3系统)、哥伦比亚(Columbia)：未转化的拟南芥。(n＝3)。
图6D-F是表示GDH转化植物(马铃薯)的2-酮戊二酸(2-OG)、尿素、硝酸含量的图。纵轴表示的是每份鲜重的摩尔数(nmol)。Mtd8：GDH转化马铃薯、对照：未转化的马铃薯。(n＝3)。
图7是表示在含有任意浓度KNO3的PNS培养基中培养3周的拟南芥叶组织的2-OG含量的图。纵轴表示的是每份鲜重的摩尔数(nmol)。C：未转化的拟南芥、M：转化的拟南芥(Mtd3系统)。(n＝3)。
图8是表示在含有任意浓度KNO3的PNS培养基中培养3周的拟南芥叶组织的硝酸含量的图。纵轴表示的是每份鲜重的摩尔数(nmol)。C：未转化的拟南芥、M：转化的拟南芥(Mtd3系统)。(n＝3)。
图9是高等植物谷氨酸脱氢酶氨基酸序列的比对结果。AtGDH1：拟南芥GDH1、AtGDH2：拟南芥GDH2、LeGDH：番茄(Lycopersiconesculentum)GDH、NtGDH：烟草(Nicotiana tabacum)GDH、ZmGDH：玉米(Zea mays)GDH
图10是霉菌GDH和植物(番茄)GDH氨基酸序列的比对结果。AaGDH：泡盛曲霉(Aspergillus awamori)GDH、ANGDH：构巢曲霉GDH、LeGDH：番茄GDH
图11是表示在马铃薯叶面撒布展布剂、尿素和脯氨酸水溶液，撒布1小时后以及5小时后叶组织内的游离脯氨酸含量的图(n＝6)。A：撒布1小时后、B撒布5小时后
图12是表示在马铃薯叶面撒布展布剂、尿素和脯氨酸水溶液，撒布1小时后以及24小时后叶组织内的2-OG含量的图(n＝6)。A：撒布1小时后、B撒布24小时后
图13表示MtdECASPC转化的拟南芥的基因组PCR分析结果。用ECASPC特异的引物进行PCR分析。进行以94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟为一个循环的30个循环反应。以1％琼脂糖凝胶电泳后，用溴化乙锭染色。泳道1：1：1kbp分子量标记，泳道2：mtdECASPC质粒DNA、泳道3：mtdECASPC转化的拟南芥，mtdECASPC2-2、泳道4：mtdECASPC转化的拟南芥，mtdECASPC6-2、泳道5：mtdECASPC转化的拟南芥，mtdECASPC8-1、泳道6：mtdECASPC转化的拟南芥，mtdECASPC9-1。
图14：表示MtdECASPC转化的拟南芥的RT-PCR分析结果。用QIAGEN公司的Plant RNeasy mini-kit试剂盒从拟南芥的叶组织中提取RNA。RT-PCR是采用TaKaRa的RNA-PCR试剂盒，用ECASPC特异引物进行的。进行94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟为一个循环的的30个循环反应。以1％琼脂糖凝胶进行电泳后，用溴化乙锭染色。泳道1：1：1kbp分子量标记，泳道2：mtdECASPC质粒DNA、泳道3：没进行逆转录酶反应的RNA、泳道4-5：未转化的拟南芥、泳道6：mtdECASPC转化的拟南芥，mtdECASPC2-2、泳道7：mtdECASPC转化的拟南芥，mtdECASPC6-2、泳道8：mtdECASPC转化的拟南芥，mtdECASPC8-1、泳道9：mtdECASPC转化的拟南芥，mtdECASPC9-1.
用于实施发明的最佳方式
如上所述，本申请发明人假定植物细胞存在用于感知氮营养状态的信号分子。也就是说，存在着全面控制植物细胞的氮吸收、代谢的信号分子，认为如果人为增减这种物质的含量，就能够维持植物细胞的氮吸收以及代谢的亢进状态。此外，由于考虑到这种亢进状态的植物能够活跃地吸收外部的氮，因而认为在限制氮的条件下，氮营养也是充足的，可见生长发育和产量改善。进而，本申请发明人将这种信号分子假定为2-酮戊二酸(2-OG)。
植物将无机氮同化成有机形式的第一阶段主要是谷氨酸掺入进氨以生成谷氨酰胺，这是由谷氨酰胺合酶(GS)和谷氨酸合酶(GOGAT)所催化的，就像已经提到的那样一般认为这种GS/GOGAT循环是植物中氮同化的主要途径。因而，认为植物细胞中氮的同化程度或氮的缺乏程度由2-OG的量反应。
本发明人设计出以过量表达谷氨酸脱氢酶(GDH)活性或天冬氨酸转氨酶(ASPC)活性作为增加植物细胞的2-OG含量的一种手段。GDH催化将氨吸收到2-OG中以生成谷氨酸以及从谷氨酸分解出氨以反向生成2-OG的可逆反应。但是，一般认为由于GDH一般对氨有高Km值，与在细胞内通过将氨吸收到2-OG中以生成谷氨酸的生成谷氨酸的反应相比，GDH更倾向于在将谷氨酸分解成2-OG和氨的方向起作用，预计该反应的结果是2-OG含量增加。另一方面，由于天冬氨酸转氨酶是催化转移草酰乙酸的氨基的反应的酶，该反应的结果是生成天冬氨酸和2-OG，预计2-OG的含量增加。
本发明人制备出导入有GDH基因或ASPC基因的转化植物，确认2-OG含量确实增加，进而确认在与通常栽培条件相比更为限制氮的栽培条件下这些植物生长发育和产量发生改善。
在本发明的一个实施方式中，在植物中导入含有谷氨酸脱氢酶(为GDH)基因或天冬氨酸转氨酶(ASPC)基因的核酸构建体，通过谷氨酸脱氢酶基因或天冬氨酸转氨酶(ASPC)基因的表达使2-OG含量增加，获得在与通常栽培条件相比更为限制氮的栽培条件下生长发育和/或产量获得改善的植物。
此外，本发明的其它实施方式中，通过增加内源性GDH基因或内源性ASPC基因的拷贝数和/或转录量增强GDH或ASPC的活性，增大植物体中的2-OG含量，获得在与通常栽培条件相比更为限制氮的栽培条件下生长发育和/或产量获得改善的植物。为了增大转录量，例如可以导入表达转录活性因子的基因构建体，和/或可以导入增强子这样的cis作用元件。这种转录活性因子和cis作用元件是本领域技术人员所熟知的。
本发明中利用的谷氨酸脱氢酶其来源没有特别的限定，但较为优选的是采用源于曲霉属的微生物的谷氨酸脱氢酶。更为优选的是，采用源自构巢曲霉和泡盛曲霉的谷氨酸脱氢酶。进而，本发明还可以利用其酶蛋白质中有1个以上的氨基酸缺失、取代、添加的谷氨酸脱氢酶，只要其具有上述谷氨酸脱氢酶活性、具有在生物体内生理条件下优先催化由谷氨酸生成2-OG和氨的反应活性即可。
此外，本发明所用的天冬氨酸转氨酶其来源也没有特别的限定，但优选的是采用源于大肠杆菌(Escherichia ecoli)的微生物的天冬氨酸转氨酶。进而，本发明还可以利用其酶蛋白质中有1个以上的氨基酸缺失、取代、添加的天冬氨酸转氨酶，只要其具有上述天冬氨酸转氨酶活性即可。
此外，就与谷氨酸脱氢酶或天冬氨酸转氨酶在植物细胞的细胞器的定位而言，不仅可以采用位于细胞质的谷氨酸脱氢酶或天冬氨酸转氨酶，也可以采用位于线粒体、叶绿体、过氧化物酶体等处的谷氨酸脱氢酶或天冬氨酸转氨酶。因此，本发明中还可以利用在其N端或C端添加了用于将这些酶蛋白质转移至这些细胞器内的信号肽或转运肽的谷氨酸脱氢酶或天冬氨酸转氨酶的基因。
基于已经公开的序列信息，本领域技术人员能够较为容易地制得上述谷氨酸脱氢酶或天冬氨酸转氨酶基因或其cDNA。例如，就构巢曲霉的谷氨酸脱氢酶而言，其基因组基因的核苷酸序列公开为Genbank的登录号X16121中的序列。其核苷酸序列如序列号1中所示，其氨基酸序列如序列号2中所示。如果根据这些序列合成出扩增包括编码蛋白质的部分的DNA片段的PCR引物、以从构巢曲霉中提取的RNA作为模板进行RT-PCR，就能够容易地获得谷氨酸脱氢酶的cDNA。构巢曲霉的谷氨酸脱氢酶基因的cDNA序列如序列号17中所示。构巢曲霉可以由例如美国典型培养物保藏中心的ATCC10074或ATCC11267获得。此外，就泡盛曲霉的谷氨酸脱氢酶基因而言，其基因组基因公开为GENBANK中的登录号Y15784。其核苷酸序列如序列号3中所示，氨基酸序列如序列号4中所示。此外，泡盛曲霉的谷氨酸脱氢酶基因的cDNA序列如序列号18中所示。泡盛曲霉本身可以由美国典型培养物保藏中心的ATCC10548或ATCC11358获得。可以根据这些菌株及序列信息以与上述方法相似的方法获得谷氨酸脱氢酶cDNA。
构巢曲霉的GDH和泡盛曲霉的GDH的同源性在氨基酸序列方面约为84％(图10)。
此外，构巢曲霉、泡盛曲霉、马铃薯(Lycopersicon esculentum)的GDH氨基酸序列的比对结果表示于图10中，拟南芥GDH1、拟南芥GDH2、马铃薯GDH、烟草(Nicotiana tabacum)GDH、玉米(Zeamays)GDH的氨基酸序列的比对结果示于图9中。
进而，本发明中，利用谷氨酸脱氢酶基因和其它的编码从谷氨酸产生2-OG的各种酶的基因，可以获得植物中2-OG含量提高的、在与通常栽培条件相比更加限制氮条件的栽培条件下生长发育和产量得到改善的植物。这种酶包括例如天冬氨酸转氨酶或丙氨酸转氨酶。
例如，就大肠杆菌K-12菌株的天冬氨酸转氨酶而言，其基因组DNA的碱基序列登录为GENBANK登录号X03629。如果根据这些序列合成出扩增包括编码蛋白质的区域的DNA片段的PCR引物、用这种引物以从大肠杆菌K-12菌株中提取的染色体DNA作为模板进行RT-PCR，就能够容易地获得谷氨酸脱氢酶基因。
此外，根据本发明，可以通过叶面撒布脯氨酸作为提高植物内的2-OG含量的方法改善在与通常栽培条件相比更加限制氮条件的栽培条件下的植物的生长发育和产量。叶面撒布的脯氨酸被吸收到叶组织中，代谢到谷氨酸中。进而，这种谷氨酸经内源性谷氨酸脱氢酶代谢成2-OG，能够提高组织内的2-OG。通过叶面撒布这种脯氨酸2-OG含量提高的植物，在与通常栽培条件相比更加限制栽培期间的氮施用量的条件下其生长发育和产量得到改善。
本发明中使用的核酸构建体可以由本领域技术人员公知的方法制成。就包括分离核酸构建体，确定其序列的方法的分子生物学方法而言，可以参照例如Sambrook等人，《分子克隆-实验室手册》(Molecularcloning-Laboratory manual)，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress等文献。或者，以PCR方法为代表的基因扩增对于用于制备本发明中使用的核酸构建体是必要的，对于这种方法可以参照F.M.Ausubel等人(eds)，Current Procotols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons，Inc.(1994)等文献。
本发明中使用的核酸构建体一般可以含有在植物细胞内起作用的适当的启动子，例如胭脂碱合酶基因、花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、胭脂碱合酶基因的终止子等适当的终止子、其它对于表达必要的或有利的序列、以及用于选择转化体的标记基因，例如卡那霉素的抗性、G418抗性、潮霉素抗性等抗药性基因。这种构建体所使用的启动子可以是组成型启动子或器官特异的或是生长发育阶段特异的启动子，可以根据使用的宿主、必要的表达量、特定表达的器官或生长发育阶段进行选择。本发明的优选实施方式中，使用器官和生长发育阶段中非特异表达的强启动子，例如使用CaMV35S启动子这样的启动子。作为器官特异性启动子，采用菜豆球蛋白基因启动子或马铃薯块茎蛋白基因启动子等。本发明的最优选实施方式中，使用以CaMV35S启动子这样的强组成型启动子驱动该谷氨酸脱氢酶基因或天冬氨酸转氨酶基因的构建体。
本发明中使用的基因导入方法没有特别的限定，本领域技术人员可以根据公知的方法根据相应的宿主选择向植物细胞或植物体导入基因的方法。例如，本发明的一个实施方式中，利用使用农杆菌的基因导入方法。这种转化体系中，优选的是使用二元载体。利用农杆菌时，在转化时使用的核酸构建体进而包括与必须导入到植物细胞中的DNA序列邻接的T-DNA区域。优选实施方式中，移入的序列是插入在左右的T-DNA边界序列之间。基于这种T-DNA的转化载体的合适的设计和构建是本领域技术人员所熟知的。此外，用于在植物中感染具有这种核酸构建体的农杆菌的条件也是本领域技术人员所熟知的。对于这些技术和条件，可以参照例如秀润社、细胞工学册增刊“模式植物的实验方法：大米和拟南芥”(1996)。
本发明中，还可以利用其它的基因导入方法。作为使用的基因导入方法的实例，可以例举为使用聚乙二醇或钙的DNA原生质体导入法、根据电穿孔的原生质体转化法、根据基因枪的导入法等。
进行像上述这样的基因的操作的植物种类没有特别的限定，除了利用植物自身进行转化的情况之外，优选容易转化且植物体中建立了再生系统的植物种类。本发明中合适的植物除了具有前述特性的植物之外，从减少农业的环境负荷的观点出发，更优选建立了大量栽培技术的植物种类。作为用于实施本发明的植物，可以例举为，例如所有芸苔科植物之外、还有番茄、马铃薯、玉米、小麦、大米、甘蔗、大豆、高梁等。此外，作为难以给予大量氮的植物，有树木和果树等，可以例举为白杨，桉树和苹果树等。这些植物中的GDH或ASPC活性和特性与本发明的一个实施方式中使用的源自于构巢曲霉的GDH(序列号1和2)或源自于大肠杆菌K-12菌株的ASPC(序列号19和20)等同。因此，通过导入源自于构巢曲霉的GDH(序列号1)或源自于大肠杆菌K-12菌株的ASPC(序列号19)可以增大这些植物中的2-OG含量。此外，本发明中也可以以相同方式使用源自这些植物中任一种的GDH基因或ASPC基因。进行像上述这样的遗传操作的器官、细胞没有特别的限定，可以根据使用的宿主、基因导入法等进行选择。作为例子，可以列举为器官外植体、花粉、培养细胞、胚、植物体等，但不仅限于此。
接下来，选择出进行像上述这样操作的植物细胞用以转化。这种选择，例如可以基于转化中使用的核酸构建体上存在的标记基因的表达。例如，标记基因是抗药性基因时，可以通过含有适当浓度的抗生素或除草剂等培养基上培养操作的植物细胞或使其生长发育进行选择。或者，标记基因是β-葡糖醛酸糖苷酶基因、萤光素酶基因等基因时，可以通过对其活性进行筛选来选择。这样鉴定出的转化体如果不是植物体，例如原生质体、愈伤组织、外植体等时，可进行向植物体的再生。对于这种再生可以利用本领域技术人员所公知的、基于使用的宿主细胞的方法。
这样获得植物体能用通常的方法也就是与非转化体同样的条件栽培，为了鉴定出含有本发明的核酸构建体的转化植物，除了基于前述标记基因进行选择之外，还可以利用各种分子生物学方法。例如，可以利用用于检测出重组DNA插入片段的有无和其结构的Southern印迹或PCR。为了检出和测定源于导入的核酸构建体的RNA转录产物，可以利用Northern印迹或RT-PCR等。
接着，对于获得的转化体的谷氨酸脱氢酶基因或天冬氨酸转氨酶基因的表达，通过该谷氨酸脱氢酶或天冬氨酸转氨酶蛋白质量、mRNA量或酶活性进行评价。例如，谷氨酸脱氢酶蛋白质或天冬氨酸转氨酶蛋白质量可以通过Western印迹等方法评价，mRNA量可以通过Northern印迹、定量的RT-PCR法评价。此外，植物提取液中的谷氨酸脱氢酶活性的测定可以根据Ameziane等的方法(AmezianeR.，Bernhard K.，and Lightfood D.，Plant and Soil，221：47-57，2000)进行。植物提取液中的天冬氨酸转氨酶的活性可以按照chao等的方法进行测定(Chao YP，Lai ZI，Chen P，Chen JT.，Biotechnology Progress，15-453-458，1999)。
进而，评价确认了谷氨酸脱氢酶基因或天冬氨酸转氨酶基因的表达或表达的增强的转化植物的2-OG含量。2-OG含量可以例如破碎转化植物全部或其中一部分，制备其抽提液，通过例如酶法定量。对于植物抽提液的制备及2-OG的定量，可以通过Usuda的方法进行(UsudaH.，Plant Physiol，78：859-864，1985)。
对于2-OG含量的增加，在通常的栽培条件及与通常的栽培条件相比更加限制氮的条件下，其地上部分(例如，叶部、茎部或这二者，或花器、果实部分)或其地下部分(例如，根、块茎)中的2-OG含量与导入基因的原株系相比，增大1.2倍以上时，就判定为其含量增加。
这样一来，对于确认2-OG含量的增加的转化植物，在栽培期间可以在与通常栽培条件相比更为限制氮的栽培条件下栽培，可以评价其生长发育或产量。这里所称的与通常栽培条件相比更为限制氮的栽培条件，是指各种植物的栽培时施加比通常使用的标准氮量、也就是标准的氮肥量更少的氮量的条件，例如70％以下，优选50％以下的量。尤其是，如果按照本发明，给予减少到标准氮量的下限至下限的1/10量程度的范围的氮量的栽培条件下达到与给予标准氮量的栽培条件同等以上的生长和/或产量。例如，就农作物而言，对于各种农作物建立标准的氮肥量。例如，对于马铃薯，一般认为每10a的氮肥量标准的是7kg(JRT日本马铃薯研究会主页：http://www.jrt.gr.jp/mini/pm_index.html；吉田淰著，享受所有关于马铃薯的百科(まるごと楽しむジヤガイモ百科)，农文协，1988)，对于大米，一般认为是每10a5-15kg(日向康吉、羽柴辉良编，植物生产农学实验手册，softscience公司，1995；奈良县农业技术中心主页，http//www.naranougi.jp/sehi-kijyun/sehikijyun-index.html)。此外，拟南芥等实验植物中，含有5mM以上的硝酸盐的培养基是适于生长发育的标准培养基(Matinez-Zapater J.M.，and Salinas J.ed.，Methods inMolecular Biology Arabidopsis Protocols，Humana Press，NewJersey，1998)。这样的标准氮肥量或标准培养基中的氮量是本领域技术人员所熟知的。
在与通常栽培条件相比限制氮的条件下也就是在上述这样的减少了标准氮量的下限至下限的1/10量程度的范围的氮量下栽培转化植物，评价其生长发育和/或产量。生长发育可以通过测定地上部分或植物体全部的草的高度、叶数、鲜重或干燥重量来评价。本说明书中所谓生长发育的改善，定义为至少1个与这样的植物体的部分或全部相关的参数(例如草的高度、叶数、鲜重或干燥重量)，与同时期在标准的氮肥量下开始栽培的对照植物相比，超过1.2倍以上的状态。此外，产量可以基于该植物的收获部位例如马铃薯的块茎、水稻的种子的总数、单位重量或该收获部位的总重量来评价。因此，本说明书中所谓的产量的改善(或增加)，定义为这样的收获部位与同时期在标准氮肥量下开始栽培的作为对照的植物区相比，增至1.2倍以上的。
这样，如果鉴定出与通常栽培条件相比限制施加氮量的条件下的生长发育和产量与作为对照的非转化体相比得到改善的转化体，调查这种转化是否能保持稳定遗传。为此，可以在通常条件下随之培育，栽培和采种，解析其后代的性状、其分离。可以以与初代(T1)转化体同样方式解析后代中导入的核酸构建体的有无，其位置、其表达等。
在与通常栽培条件相比限制氮的条件下的生长发育和产量得到改善的转化植物，也就是解除了氮限制条件下的生长抑制的转化植物，就其源于整合于导入基因组的核酸构建体的序列而言可以是半合条件下或纯合条件下获得，半合子或纯合子可以通过必要的交配等，在后代中得到。从整合到基因组中的核酸构建体中获得序列通过孟德尔学说在后代中分离。因此，从转化体的特征的稳定性的观点出发为了获得子代植物和种子，希望使用纯合子植物。
此外，转化体在许多情况下，作为基因座，外来基因插入于1处，但是插入于多个基因座中的多拷贝转化体并不鲜见。由于导入基因的安全性等原由，本发明中更优选单拷贝转化体。例如，通过核对T2(第2世代)中的卡那霉素抗性的分离比，可以选择出导入基因是1个基因座也就是单拷贝转化体。T1是半合子、导入基因为1个基因座时，按照孟德尔法则，T2中，卡那霉素抗性和敏感型以3:1的比例分离。此外，导入的基因以多拷贝存在时，抗性转化体的出现频率就高。因此，获得的T2种子再次播种在含有卡那霉素的培养基中，选择显示3:1的分离比的系统，通过选择出认为导入基因存在于1个基因座中的转化体，可以获得单拷贝转化体。
这样获得的转化植物可以按照与天然存在的同种植物相同的栽培条件进行栽培，在与通常栽培条件相比限制施用氮量的条件下栽培，可以获得等同或优于非转化体植物的产物。此外，通过与同种的非转化植物同样的方法可以容易地获得种子。如果有必要，获得种子的保存、杀菌、害虫驱除等可以按照本领域熟知的通常的方法进行。
这样，可以增加导入如了基因的植物的2-OG含量，除这些方法之外，还可以通过叶面撒布氨基酸的一种脯氨酸增加植物的2-OG含量。具体的说，可以将20mg/l-500mg/l范围的脯氨酸水溶液与适当的展布剂一起通过喷洒等方式撒布于植物的叶面。此外，对于氮的限制条件中生长发育，以与上述同样的条件和方法进行评价。
通过对由NADP-GDH基因或天冬氨酸转氨酶基因的过量表达操作获得的植物进行制备、产量调查，以及成分分析的以下的实施例，或者关于受到脯氨酸叶面撒布的植物的产量调查，成分分析的以下的实施例，对本发明进行详细说明。
实施例
实施例1由构巢曲霉获得的NADP依赖型GDH基因的分离和Ti质粒载体的构建
(1)构巢曲霉获得的NADP依赖型GDH基因的分离
在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中接种构巢曲霉，30℃下培养一夜，进而将所获得的菌落在葡萄糖液体培养液中培养2天。从增殖的菌中提取总RNA。
采用poly(A)Qucik mRNA Isolation Kit(stratagene公司)纯化mRNA后，用第一链cDNA合成试剂盒(Amersham Bioscience公司)制成第一链cDNA。以制成的第一链cDNA为模板进行PCR反应。PCR反应条件是94℃-3分钟；94℃-45秒、59℃-30秒、72℃-90秒、35个循环；72℃-10分钟，采用Perkin-Elmer公司的PCR系统24000进行。所用的引物有5’-TCT AGA ATG TCT AAC CCC CTT GTT GAG-3’(序列号5)和5’-GAG CTC TCA CCA CCA GTC ACC CTG GTC-3’(序列号6)。其结果是，确定出约1.4kbp的条带，与预测的基因大小一致。用TA-Cloning-Kit对所得PCR产物进行克隆。用测序仪(ABI公司377A)确定所得克隆的碱基序列。与已知的从构巢曲霉获得的NADP依赖型GDH基因相一致，表示为An-GDH(序列号17)。
(2)Ti质粒载体的构建
进而，将编码线粒体转运肽的碱基序列添加到获得的基因上。这是源于番茄的NADP依赖型GDH基因的5’侧的序列，其通过采用引物5’-CTG CAG ATG AAT GCT TTA GCA GCAAC-3’(序列号7)和5’-TCT AGA TAA ACC AAG AAG CCT AGC TG-3’(序列号8)的PCR获得。这样获得的An-GDH基因与编码向线粒体转运的转运肽的碱基序列的连结是用以下4种引物进行的：5’-TCT AGA ATG AAT GCT TTAGCA GCA AC-3’(序列号9)，5’-GGG AAG GTT TAG ACA TTA AACCAA GAA GCC T-3’(序列号10)，5’-AGG CTT CTT GGT TTA ATGTCT AAC CTT CCC-3’(序列号11)和5’-GAG CTC TTA CGC CTCCCA TCC TCG AA-3’(序列号12)。添加了向线粒体转运的转运肽序列的GDH基因作为Mtd-An-GDH。这种Mtd-An-GDH基因与由农杆菌产生的用于转化的载体、Ti质粒，pIG121-Hm的GUS区域置换(图1)。所得Ti-质粒导入到根癌农杆菌(Agrobacterium Tumefaciens)，EHA101中，用于拟南芥和马铃薯的转化。
实施例2.马铃薯转化体的制备
马铃薯(品种为May Queen)的转化是按照Gordon等人(文献：PlantCell Reports，1993，12：324-327)的方法进行的。切下无菌诱导的微型块茎，制成块茎切片、栽培在添加了2mg/l玉米素和0.1mg/l吲哚乙酸的MS琼脂培养基上，25℃下24小时培养，持续培养16天。含有构建的基因的农杆菌接种在含有50mg/l卡那霉素和50mg/l潮霉素的YEP培养基(10g/l细菌用胰蛋白胨，10g/酵母提取物，1g/l葡萄糖)中，28℃下振荡培养过夜。在24小时培养的块茎切片中加入农杆菌液感染。10分钟后，用经灭菌的滤纸，去除剩余的农杆菌液，移载到先前使用的皿中，相同条件下培养24小时。之后，将块茎切片移栽到含有50mg/l卡那霉素，300mg/l盐酸氨噻肟头孢菌素(cefotaxime hydrochloride)，2mg/l玉米素和0.1mg/l吲哚乙酸的MS琼脂培养基中，进行转化体的选择。将再分化的根再次移到前述选择培养基中，进行抗性的鉴定。将清楚地呈现卡那霉素抗性的根移栽到含有50mg/l卡那霉素，300mg/l盐酸氨噻肟头孢菌素(cefotaxime hydrochloride)的MS琼脂生根培养基中，诱导根的分化。至少切取三次生根的再分化植物的茎顶部，移栽到选择生根培养基中，进行卡那霉素抗性的鉴定，排除嵌合个体。使这样获得的5个个体与土壤相适应，获得块茎。
实施例3.拟南芥转化体的制备
向拟南芥导入基因是按照Bechtold等人(文献：C.R.Acad.Sci.Paris，Life Science 316：1194-1199，1993)的方法进行的。将拟南芥的种子播种在培养土中，将24℃下日长为16小时栽培10天的幼苗每次移栽一株到一块石棉上，在相同条件下继续栽培2周时间。植物一抽苔就打尖，继续栽培一周。在含有50mg/l卡那霉素和50mg/l潮霉素的的YEP培养基中28℃下振动培养农杆菌24小时，通过离心(7,000rpm，10分钟)收集菌体。将菌体悬浮于用于渗透的悬浮培养液(1/2ms盐，1/2 B5维生素，5％蔗糖，0.5g/lMES，0.044μM苯甲酸嘌呤，pH 5.7)中。去掉已经开花、结果的花器后浸渍于农杆菌悬液中，进入干燥器，进行15分钟的减压(40mmHg)处理。在1个月栽培后，采集处理的植物的种子。将种子播种于含有50mg/l卡那霉素和100mg/l氨噻肟头孢菌素(cefotaxime)的MS琼脂培养基中，进行选择。这样获得的3株转化体被更新至T3世代，不产生卡那霉素抗性的分离系统用于分析。
实施例4.导入基因的确认
从选出的显示卡那霉素抗性的个体，即5个马铃薯，3个拟南芥和非感染植物中提取DNA。DNA的提取是按照Honda等人(文献：Hondaand Hirai，1990，Jpn J Breed 40：339-348)的方法进行的。进行用提取的DNA，采用An-GDH基因特异的引物5’-TCT AGA ATG TCT AACCCC CTT GTT GAG-3’(序列号13)和5’-GAG CTC TCA CCA CCAGTC ACC CTG GTC-3’(序列号14)，和用于扩增载体内的NPTII基因的引物5’-CCC CTC GGT ATC CAA TTA GAG-3’(序列号15)和5’-CGG GGG GTG GGC GAA GAA CTC CAG-3’(序列号16)的PCR分析。反应以94℃-3分钟；94℃-45秒、55℃-30秒、72℃-90秒、35个循环；72℃-10分钟，采用Perkin-Elmer公司的PCR系统2400进行。对PCR产物进行采用0.1％琼脂糖凝胶的电泳，用溴化乙锭染色。
其结果是，由于在选出的转化马铃薯(图2)和转化拟南芥(图3)中，证实了An-GDH基因特异的条带(约1.5kbp)和NPTII基因特异的条带(约1.1kbp)，非感染植物中，没有这些条带，表明含有An-GDH基因的T-DHA区域导入在转化马铃薯和转化拟南芥中。
实施例5.导入基因的表达的确认(NORTHERN分析)
为了证实导入基因的表达，采用经证实导入了An-GDH基因的转化马铃薯和转化拟南芥，进行NORTHERN分析。
根据SDS-苯酚法从转化马铃薯的叶组织、块茎和转化拟南芥的叶组织中提取RNA。提取出的RNA在含18％甲醛的1.2％琼脂糖凝胶中进行电泳，用溴化乙锭染色。点样在尼龙膜(HybondN+)上后，用UV固定，进行杂交。以全长An-GDH基因用作探针。Northern blot和探针的制备采用的是Roche Diagnostics公司的Dig-High Prime DNALabeling And Detection Starter Kit II和PCR Dig Probe SynthesisKit。
其结果是，在转化马铃薯的叶组织和块茎中，确认出An-GDH基因特异的条带(图4)。从而判明导入的基因在转化马铃薯的叶组织和块茎中的转录表达。另一方面，转化拟南芥叶组织中，确认出An-GDH基因特异的条带(图5)。这提示导入的基因在转化拟南芥的叶组织中转录表达。非转化马铃薯和非转化拟南芥中，没有发现An-GDH基因特异的条带。
实施例6.导入基因的表达(NADP-GDH活性)
为了证实导入基因的表达，用经证实已经导入An-GDH基因的转化马铃薯和转化拟南芥，进行NADP-GDH活性的测定。
活性的测定是采用Ameziane等人(文献：Plant and Soil，2000，221：47-57)的方法进行的。用液氮冰冻转化马铃薯(约0.2g)和转化拟南芥的叶组织(约0.2g)，用乳钵破碎后，加入5倍重量的提取缓冲液{200mM Tris(pH8.0)，14mM β-巯基乙醇，10mML-半胱氨酸-HCl，0.5mMPMSF}。移到离心管中，4℃下，以12,000rpm离心30分钟后，超滤(Millipore，Ultrafree 0.5 filter unit，Biomax-10)上清，进而用提取缓冲液清洗3次。
在含有100mM Tris(pH8.5)，20mM 2-酮戊二酸，10mMCaCl2，0.2mM NADPH，200MmNH4Cl的反应液中加入先前提取的粗酶液，测定340nm处的吸收度的减少。用Bradford法以牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白质提取的粗酶液中的蛋白质浓度。
其结果是，发现转化马铃薯的活性比非转化马铃薯高约20-50倍(表1).转化拟南芥中也发现其活性比非转化拟南芥高约5-12倍(表2)。由于未发现非转化体有任何NADP-GDH活性，因此认为这种活性就是由导入的An-GDH基因的表达产生的活性。
表1.转化马铃薯和转化马铃薯的NADP-GDH活性
 
NADP-GDH活性(μmol/分/mg蛋白质)
非转化体 0.11
转化体
Mtd2 2.12
Mtd5 4.64
Mtd8 5.85
表2.转化拟南芥和转化拟南芥的NADP-GDH活性
 
NADP-GDH活性(μmol/分/mg蛋白质)
非转化体 30.0±5.2
转化体
Mtd2 393.5±71.3
Mtd3 356.5±70.3
Mtd4 153.9±29.5
实施例7.导入了GDH基因的拟南芥和马铃薯的2-酮戊二酸(2-OG)、尿素和硝酸含量
测定转化马铃薯(Mtd8)和转化拟南芥(Mtd3)的叶组织中的2-OG，尿素和硝酸含量。马铃薯是将在500g Power Soil和500g蛭石的混合土壤中栽培1个月的生长旺盛植物体的叶组织用作材料。拟南芥是用在PNS培养基(含5mM KNO3)中生长发育3周的植物体的叶组织作为材料。提取的方法是按照Agarie等人(文献：Plant Science，2002，162：257-265)的方法进行的。用液氮破碎叶组织(约0.1g)后，加入200μl的3％HCO4充分混合。以12,000rpm离心10分钟后，将上清转移到其它的管中。在残留的沉淀中再次加入200μl的3％HCO4，充分混合。以12,000rpm离心10分钟后，将上清转移到上次的那支管中。在回收的上清中加入50-70μl的5M的K2CO3，使溶液中和。用石蕊试纸，确认液体的pH为中性后，用灭菌水将液体体积调制成600μl，制成测定用的试样。硝酸和尿素的测定中各自采用的是Roche Diagnostics公司的硝酸和尿素/氨F-试剂盒。对Ameziane等人(文献：前述)的方法进行了改变以测定2-OG含量。在475μl的反应液{0.1M Tris-HCl(pH8.5)，1.0mMCaCl2，0.2mM NADPH，0.2M NH4Cl}中加入20μl提取的试样，测定340nm波长处的吸光度后，加入5μl(10个单位)的谷氨酸脱氢酶(GDH)，在37℃下反应10分钟。再次测定340nm波长处的吸光度，根据加入酶液后的吸光度与加酶之前的吸光度值之差，计算出2-OG酸含量。
其结果是，转化拟南芥的2-OG含量增加至非转化拟南芥的2.6倍，尿素含量增加至非转化拟南芥的2倍，硝酸含量增加至非转化拟南芥的1.2倍。另一方面，转化马铃薯中的2-OG含量也增加至非转化马铃薯的1.7倍，尿素含量增加至非转化马铃薯的1.5倍，硝酸含量增加至非转化马铃薯的1.3倍(图6A-F)。
进而，在培养拟南芥时，采用在培养基中的氮浓度调整为10，5，3，0.3，0.1mM的培养基中培养3周的拟南芥的叶组织，测定2-OG含量和硝酸含量。其结果发现转化拟南芥的2-OG含量与非转化拟南芥的2-OG含量的差异随着培养基中的氮含量的减少而增加(图7)。根据该结果，认为导入的GDH具有分解谷氨酸，合成2-OG和氨的功能。此外，在含有3mM以上的氮时，转化拟南芥和非转化拟南芥的硝酸含量的累积量均保持大致稳定，经证实在这种条件下转化拟南芥的累积量最大增加至非转化拟南芥的1.3倍。经证实在0.3和0.1mM的氮条件下也有2.5-4.5倍的增加(图8)。根据这些结果，表示在转化拟南芥的叶组织中，与非转化拟南芥相比累积了更多的硝酸，这反映氮的吸收效率增加了。
实施例8.导入了GDH基因的拟南芥和马铃薯的叶组织的氮同化相关酶的活性
测定转化拟南芥和转化马铃薯的叶组织(约0.1g)中的NADH依赖型谷氨酸合酶(NADH-GOGAT)、硝酸还原酶(NR)和谷氨酸合酶(GS)的酶活性。马铃薯是将在500g Power Soil和500g蛭石的混合土壤中栽培1个月的生长旺盛植物体的叶组织用作材料。拟南芥是用在PNS培养基(含5mM KNO3)中生长发育3周的植物体的叶组织作为材料。粗酶液的提取是按照Groat等人(文献：Plant Physiol，1981，67：1198-1203)的方法进行的。用液氮破碎叶组织后，加入500μl的冰冷的提取缓冲液{100mM Mes-NaOH(pH7.5)，100mM蔗糖，2％(v/v)硫基乙醇，15％乙二醇，0.1％PMSF}，轻轻地混合。0℃下以12,000rpm离心20分钟后，用Ultrafree(Biomax-10k，Millipore公司)提纯上清。用相同的缓冲液清洗3次后，溶解于100μl的缓冲液制成酶液。
同样，NADH-GOGAT活性的测定也是按照Groat等人(文献：前述)的方法进行。制备500μl的反应液{100mM K-磷酸盐(pH8.2)，100μMNADH，2.5mM 2-酮戊二酸，10mM L-谷氨酰胺，1mMaminooxyacetate}后，加入10μl酶液混合。测定340nm的吸光度3分钟，测定伴随NADH的消耗吸光度值的减少。
NR的活性是按照Ferrario-Mery等人(文献：Planta，197，202：510-521)的方法进行的。制备490μl的反应液{50mM Mops-KOH(pH7.8)，1mM NaF，10mM KNO3，0.17mM NADH，10mM MgCl2或5mMEDTA}，各自加入10μl的酶液混合。16分钟后，加入500μl 1％的磺酰胺(3N HCl中的)，进而加入10μl 2％的N-萘基-1-二氯水合乙二胺(N-naphthyl-1-ethylene diamine dicholorhydrate)。以12,000rpm离心5分钟后，测定540nm的吸光度。从加入MgCl2的反应的值中减去加入EDTA的反应时的值以获得NR活性。
GS的活性是按照Ferrario-Mery等人(文献：前述)的方法进行的。在480μl的反应液{80mM谷氨酸，20mM MgSO4，1mM EDTA，100mMtricine，6mM羟胺，8mM ATP}中加入20μl的酶液，30℃下反应15分钟。加入500μl的0.37MFeCl3，0.2M三氯乙酸，0.67N HCl液，停止反应后，测定540nm的吸光度。
以牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白质用Bradford法测定提取的酶液中的蛋白质浓度。其结果是，转化拟南芥的NADH-GOGAT活性、NR活性、GS活性各自增加至非转化拟南芥的1.38倍、1.40倍、1.25倍(表3)。另一方面，在转化马铃薯中的NADH-GOGAT活性、NR活性、GS活性也各自增加至非转化马铃薯的1.33倍、1.36倍、1.01倍(表4)。通过以上结果，表示转化拟南芥和转化马铃薯与非转化体相比，不仅氮的吸收效率提高了，而且与氮代谢相关的酶的活化，氮的代谢效率也提高了。
表3.转化拟南芥的酶(Mtd3)活性
 
NADH-GOGAT NR GS
非转化体(A) 482.4±86.8 1.88±0.22 188.3±24.9
转化体(B) 667.5±107.5 2.63±0.37 235.7±28.4
比(B/A) 1.38 1.40 1.25
(单位/mg蛋白质)
表4.转化马铃薯的酶(Mtd8)活性
 
NADH-GOGAT NR GS
非转化体(A) 38.6±4.1 0.21±0.04 99.0±20.7
转化体(B) 51.5±2.4 0.29±0.03 99.6±8.5
比(B/A) 1.33 1.36 1.01
(单位/mg蛋白质)
实施例9.转化马铃薯的产量调查
用转化马铃薯进行产量调查。产量调查中，采用从转化马铃薯和非转化马铃薯获得的种子马铃薯。在改变氮浓度的条件下栽培时，就生长发育和块茎重量、块茎数等进行调查。设立作为标准条件的在8.5升的罐中加入3kg的Power Soil(氮总量为1.2kg)的情况和作为低氮标准的在7号罐中加入300g的Power Soil(氮总量为0.12kg)的情况的2组，土壤的剩余部分由蛭石(无养分)填补。播种3个月后就产量、地上部分、块茎重量、块茎数进行调查。
其结果是，在氮为1.2g的组中，转化马铃薯的块茎重量和块茎数各自增加至非转化马铃薯的1.12-1.13倍和1.09-1.23倍(表5)。氮为0.12g组(氮限制条件)中，转化马铃薯的块茎重量和块茎数，各自增加至非转化马铃薯的1.29-1.35倍和1.24-1.56倍(表6)。
表5.在氮为1.2g的组中转化马铃薯的产量调查(n≥8)
Figure C200480020600D00241
表6.在氮为0.12g的组中转化马铃薯的产量调查(n≥8)
Figure C200480020600D00242
实施例10.转化拟南芥的生长发育调查
用转化拟南芥(Mtd3)进行生长量的调查。播种在PNS培养基(氮源仅为硝态氮)的KNO3浓度改变为0.1，0.3，3，5mM，加入了1％蔗糖的培养基(使用Thermo8cm皿)中，每个皿中培养8株。播种3周后测定地上部分重量。数据以每组中3个皿中的平均值和误差表示所有8株的地上部分重量。其结果是，转化拟南芥在低氮条件下生长发育比非转化拟南芥更为良好，呈现为生长量为非转化拟南芥鲜重的1.1-1.14倍(表7)。
表7.含有任意浓度KNO3的PNS培养基(含1％蔗糖)中生长发育的转化发育拟南芥和非转化拟南芥的鲜重(g)
 
KNO<sub>3</sub>浓度 0.1mM 0.5mM 1.0mM 5.0mM
非转化体(A) 0.0704 0.1265 0.2026 0.5895
±0.0073 ±0.0054 ±0.0037 ±0.0032
转化体(B) 0.0800 0.1441 0.2232 0.6101
±0.0073 ±0.0054 ±0.0037 ±0.0032
比(A/B) 1.14 1.14 1.10 1.03
实施例11.脯氨酸水溶液向马铃薯植物的叶面撒布
采用马铃薯(品种为May Queen)，就在叶面撒布脯氨酸时进行生长发育和产量的效果调查。将马铃薯块茎播种在装入了1.5kg的PowerSoil(吴羽化学)的7号罐中。Power Soil中所含氮肥如表8所示。在通常的栽培中，使用5g氮肥作为基肥，而本栽培试验在低氮条件下进行栽培。
叶面撒布设立展布剂组(Approach B1，花王)、尿素组(展布剂+0.87mM尿素)、脯氨酸组(展布剂+1.75Mm脯氨酸)这三组，自播种后一个月时(开花前立即)起每周对每株喷洒约20ml。撒布合计进行6次(6周)，播种3周后进行收获。
表8.马铃薯栽培试验的氮施肥条件
 
氮总量 0.6g
·硝态氮量 0.075g
·氨态氮量 0.525g
实施例12.脯氨酸叶面撒布马铃薯叶组织的游离脯氨酸含量和2-酮戊二酸含量的测定
在马铃薯叶面撒布扩展剂和尿素、脯氨酸各水溶液后，随时间变化测定游离脯氨酸含量和2-酮戊二酸含量。叶面撒布后，1，3，5，8小时时从植物的茎顶部取样三份叶组织，充分水洗作为试样。用液氮冰冻破碎后，加入5倍鲜重的80℃下加温的80％乙醇，进而在80℃下培养20分钟。12,000rpm离心10分钟后，将上清转移到其它管中。再次，加入80％乙醇在80℃下培养20分钟，离心，回收上清，总共进行3次同样的提取。乙醇提取物在冷冻干燥后，加入300μl灭菌水和200μl乙醚，充分混合后，12,000rpm下离心10分钟。去除上层的乙醚层后，将水层转移到200μl的其它管中，再次冷冻干燥。溶解于200μl的0.02N盐酸后，用0.22μm滤膜过滤。用日立高速氨基酸分析装置(L8800)分析如此获得的提取液。用同样的植物试样，进行2-OG含量的测定。2-OG的提取和含量的测定用与实施例7中所述的方法相同的方法进行。
其结果是，叶面撒布1小时后的叶组织中的脯氨酸含量在3组间没有观察到有显著差别，撒布5小时后脯氨酸撒布组的叶组织中的游离脯氨酸含量显著增加(图11)。认为叶面撒布的脯氨酸被吸收到叶组织中。同样地，叶组织中的2-OG含量的测定结果是，叶面撒布1小时后的叶组织中的2-OG含量在3组间没有观察到有显著差别，发现在撒布24小时后脯氨酸撒布组的叶组织中的游离2-OG含量显著增加(图12)。认为叶面撒布的脯氨酸在被吸收到叶组织中后，代谢为2-OG，吸收到TCA循环中。
实施例13.脯氨酸叶面撒布马铃薯的产量调查
对播种1个月时的马铃薯植物每周叶面撒布6次展布剂和尿素、脯氨酸水溶液。对每组6个罐的各组进行栽培，茎数统一为1根，自播种起进行3个月的栽培。收获各罐中的块茎，求出每个罐中的块茎重量和块茎数。
其结果是，在块茎重量方面，展布剂组每罐中的块茎重量为145.8g，尿素组为140.1g、脯氨酸组为158.4g，脯氨酸组的块茎重量增加为展布剂的1.1倍。另一方面，块茎数量方面，展布剂组为8.2个，尿素组为6.8个、脯氨酸组为8.2个，认为就块茎数而言没有差异(表9)。根据以上结果，表明块茎产量增加了。
表9.脯氨酸撒布的马铃薯产量      (n＝6)
 
展布剂组 尿素组 脯氨酸组
块茎总重量(每株) 145.8±16.3 140.1±10.6 158.4±18.0
比 [1.00] [0.96] [1.10]
块茎总数(每株) 8.2±1.9 6.8±1.6 8.2±1.0
比 [1.00] [0.83] [1.00]
实施例14.导入了从大肠杆菌获得的天冬氨酸转氨酶(ECASPC)基因的转化拟南芥的制备
基于大肠杆菌中已经报道的天冬氨酸转氨酶(ECASPC)基因的序列信息(GENBANK登录号X03629)，分离ECASPC基因(核苷酸序列：序列号19，氨基酸序列：序列号20)。在相同的基因上，如实施例1中所述，添加了向线粒体转运的转运肽序列(mtdECASPC)。以植物转化用的Ti-质粒载体pBI121的GUS区城置换该基因后，转化根癌农杆菌EHA105。用这种农杆菌以与实施例3同样方法将mtdECASPC基因导入到拟南芥中。播种在含有卡那霉素的培养基中，选择出抗性个体(T1世代)，在下个世代中获得卡那霉素抗性和感受性以3:1分离的系统(T2世代)。进而在下个世代中，选择所有个体显示出抗性的系统(T3世代)的4个系统(mtdECASPC2-2，mtdECASPC6-2，mtdECASPC8-1和mtdECASPC9-1)。所得转化体中导入基因的确认通过基因组PCR按与实施例4相同方式进行。此外，按照RT-PCR法解析导入基因的转录表达。用Plant Rneasy Mini-Kit从拟南芥叶组织中提取RNA。RT-PCR是采用TaKaRa的RNA-PCR试剂盒，用ECASPC特异引物进行的。进行94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟的30个循环反应。以1％琼脂糖凝胶进行电泳后，用溴化乙锭染色。
其结果是，显示出卡那霉素抗性的转化拟南芥中，确认出与用作阳性对照的mtdECASPC质粒载体DNA作为模板时相同大小的条带(图13)。该结果提示，显示出卡那霉素抗性的转化拟南芥的基因组内导入了mtdECASPC基因。
实施例15.ECASPC基因转化拟南芥的氮限制条件下的生长发育的调查
用所得拟南芥，根据实施例10的主要内容进行生长量的调查。采用氮源仅为硝态氮的PNS培养基。培养基的KNO3浓度为5mM和10mM，各加入1％蔗糖。无菌播种种子，一周后，留下生长发育一致的10株。进而2周(自播种3周后)后，测定这10株的地上部分重量。2组植株的平均值和误差表示于表10中。其结果显示，导入了mtdECASPC基因的拟南芥与没有导入基因的非转化拟南芥相比，其地上部分鲜重显著增加，氮为5mM的组中显示为1.18-1.28倍，氮为10mM的组中显示为1.12-1.38倍。
表10.
 
5mM 10mM
非转化体 335.6±10.5 352.2±25.5
转化体
mtdECASPC2-2 405.4±0.8 394.7±10.3
mtdECASPC6-2 394.7±7.7 436.4±3.4
mtdECASPC8-1 430.3±5.8 484.6±7.0
mtdECASPC9-1 420.6±13.2 467.5±2.2
(mg，n＝2)
实施例16.导入了mtdECASPC基因的拟南芥的2-OG含量的测定
采用实施例14中选择出的4个系统的导入了mtdECASPC基因的拟南芥进行2-OG含量的测定。无菌播种在KNO3浓度为5mM，含有1％蔗糖的PNS培养基中，采用24℃下日长为16小时生长发育2周的植物的地上部分。2-OG的提取和含量测定以与实施例7所述的方法相同的方法进行。
其结果表明，导入了mtdECASPC基因的转化拟南芥的地上部分组织中的2-OG含量显著增加为没有导入相同基因的非转化拟南芥的1.27-1.93倍。该结果与导入GDH基因的转化植物中所发现的结果极为相似。
表11.导入了mtdECASPC基因的拟南芥的2-OG含量
 
2-OG含量(μmol/g.F.W) 比
非转化体 0.188±0.010 1.00
转化体
mtdECASPC2-2 0.254±0.029 1.35
mtdECASPC6-2 0.363±0.085 1.93
mtdECASPC8-1 0.239±0.066 1.27
mtdECASPC9-1 0.268±0.080 1.42
(n>3)
序列表
<110>味之素公司
<120>氮限制条件下生长得以改善的植物的制备方法
<130>0P05262
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<160>20
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>2334
<212>DNA
<213>构巢曲霉
<220>
<221>CDS
<222>(400)..(445)
<220>
<221>CDS
<222>(499)..(774)
<220>
<221>CDS
<222>(828)..(1882)
<400>1
Figure C200480020600D00301
Figure C200480020600D00311
Figure C200480020600D00321
Figure C200480020600D00331
Figure C200480020600D00341
<210>2
<211>459
<212>PRT
<213>构巢曲霉
<400>2
Figure C200480020600D00342
Figure C200480020600D00351
Figure C200480020600D00361
<210>3
<211>2571
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<213>泡盛曲霉
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<220>
<221>CDS
<222>(1472)..(2243)
<400>3
Figure C200480020600D00381
Figure C200480020600D00391
Figure C200480020600D00401
<210>4
<211>370
<212>PRT
<213>泡盛曲霉
<400>4
Figure C200480020600D00421
Figure C200480020600D00431
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>5
Figure C200480020600D00432
<210>6
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>6
Figure C200480020600D00433
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<212>DNA
<213>人工的
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<400>7
Figure C200480020600D00441
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>8
Figure C200480020600D00442
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>9
Figure C200480020600D00443
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>10
Figure C200480020600D00444
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>11
Figure C200480020600D00451
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<213>人工的
<220>
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<400>12
Figure C200480020600D00452
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<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>13
<210>14
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<212>DNA
<213>人工的
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<223>PCR引物
<400>14
Figure C200480020600D00454
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>15
Figure C200480020600D00461
<210>16
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>16
Figure C200480020600D00462
<210>17
<211>1380
<212>DNA
<213>构巢曲霉
<400>17
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<210>18
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<212>DNA
<213>泡盛曲霉
<400>18
Figure C200480020600D00472
<210>19
<211>1191
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1188)
<400>19
Figure C200480020600D00491
Figure C200480020600D00501
Figure C200480020600D00511
<210>20
<211>396
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>20
Figure C200480020600D00521
Figure C200480020600D00531

Claims (6)

1.一种制备在将氮限制到比通常的栽培条件低的栽培条件下，生长发育和/或产量得以改善的植物的方法，其包括在植物中导入谷氨酸脱氢酶基因并在植物体内表达该基因，结果与未导入谷氨酸脱氢酶基因的植物相比所述植物的2-OG含量提高至1.2倍以上，其中与未导入谷氨酸脱氢酶基因的植物相比生长发育和/或产量增加至1.2倍以上。
2.一种制备在将氮限制到比通常的栽培条件低的栽培条件下，生长发育和/或产量得以改善的植物的方法，其包括在植物中导入ECASPC基因并在植物体内表达该基因，结果与未导入ECASPC基因的植物相比所述植物的2-OG含量提高至1.2倍以上，其中与未导入ECASPC基因的植物相比生长发育和/或产量增加至1.2倍以上。
3.一种栽培导入了谷氨酸脱氢酶基因使得与未导入谷氨酸脱氢酶基因的植物相比2-OG含量提高至1.2倍以上的植物的方法，其包括在将氮限制到比通常的栽培条件低的条件下栽培所述植物。
4.一种栽培导入了ECASPC基因使得与未导入ECASPC基因的植物相比2-OG含量提高至1.2倍以上的植物的方法，其包括在将氮限制到比通常的栽培条件低的条件下栽培所述植物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在施用标准氮肥量的下限至下限的1/10范围的氮的条件下所获得的生长发育和/或产量等同于施用标准氮肥量的栽培条件下的生长发育和/或产量、或增加至施用标准氮肥量的栽培条件下的生长发育和/或产量的1.2倍以上。
6.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中限制氮的栽培条件就是指在标准氮肥量的下限至下限的1/10范围的氮肥施用量的条件。
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Enzyme redundancy and the important of 2-oxoglutarate inplant ammonium assimilation. Hodges M.J.Exp.Bot.,Vol.53 No.370. 2002
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Transgenic tomato plant carryiing a gene forNADP-dependent glutamate dehydrogenase(gdhA) fromAspergillus nidulans. Hiroake KISAKA, et al.Plant science,Vol.164 No.1. 2003
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