KR100640284B1

KR100640284B1 - 인산농도의 변화에 관계없이 벼의 모든 조직에서 항상발현하는 고친화성 인산 운반체 유전자, 상기 유전자의프로모터 및 상기 유전자를 이용하여 형질전환된 식물체의생산방법

Info

Publication number: KR100640284B1
Application number: KR1020040015772A
Authority: KR
Inventors: 남재성; 김도훈; 서현미; 정순재; 이영병; 권오창; 김경태; 이재헌; 정영수; 은무영; 남민희; 이기환
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2004-03-09
Filing date: 2004-03-09
Publication date: 2006-10-31
Also published as: KR20050090611A

Abstract

본 발명은 인산 농도의 변화에 관계없이 벼(Oryza sativa L.)의 모든 조직에서 항상 발현하는 서열번호 1에 기재된 염기서열 및 아미노산 서열을 가지는 신규한 고친화성 인산 운반체 유전자, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 상기 유전자의 프로모터 및 상기 유전자를 이용하여 인산 흡수력 및 수송능력 등 인산 이용능력이 향상된 형질전환 식물체의 생산방법에 관한 것이다.

벼(oryza sativa L.), 고친화성 인산 운반체 유전자, 인산 이용능력, 모든 조직

Description

인산농도의 변화에 관계없이 벼의 모든 조직에서 항상 발현하는 고친화성 인산 운반체 유전자, 상기 유전자의 프로모터 및 상기 유전자를 이용하여 형질전환된 식물체의 생산방법{A high-affinity phosphate transporter gene that is expressed constitutively in the whole rice plant regaredless of phosphate concentration change, a promoter of said gene and a production method of transgenic plants using said gene}

도 1A 및 1B는 인산농도의 변화에 관계없이 벼의 모든 조직에서 항상 발현하는 벼의 고친화성 인산 운반체 OsPT4 유전자와 프로모터 영역을 포함하는 염기서열을 표시한 것이다.

도 2A는 벼의 캘러스(callus) 배양세포를 이용하여 인산 결핍 조건에서 OsPT4의 다양한 발현 양상을 조사한 결과이다.

도 2B 및 2C는 인산 농도와 인산 결핍시간에 따른 OsPT4 유전자의 다양한 발현 양상을 조사한 결과이다.

도 3은 인산 충분조건과 결핍조건에서 벼 식물체의 조직 특이적인 OsPT4 유전자의 발현 양상을 조사한 결과이다.

도 4는 OsPT4 유전자의 세부적인 조직 특이적 발현 양상을 조사하기 위해서 OsPT4 유전자의 프로모터에 GUS 리포터 유전자를 연결시킨 구조물을 아그로박테리 아를 이용하여 형질전환된 벼를 생산하고 상기 형질전환체에서 GUS의 활성을 조직 별로 조사한 결과이다.

도 5는 인산 결핍조건에서 OsPT4 유전자가 대량 발현하는 애기장대 형질전환체와 야생형 식물체의 성장을 비교조사한 결과이다. 여기에서 도 5A는 OsPT4 유전자의 발현정도를 RNA 블롯 분석한 결과이며, 도 5B 및 도 5C는 인산 결핍조건에서 애기장대 형질전환체와 야생형 식물체의 성장을 정성, 정량적으로 비교한 결과이다. 또한, 도 5D는 인산결핍에 특이적으로 발현하는 애기장대의 고친화성 인산운반체 유전자(AtPT1)를 분자마커로 이용하여 인산 결핍조건에서 OsPT4 유전자의 발현정도를 야생형 식물체 및 애기장대 형질전환체를 대상으로 RNA 블롯 분석한 결과이다.

본 발명은 인산 농도의 변화에 관계없이 벼(Oryza sativa L.)의 모든 조직에서 항상 발현하는 신규한 고친화성 인산 운반체 유전자, 상기 유전자의 프로모터 및 상기 유전자를 이용하여 형질전환된 식물체의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명은 벼의 유전체에 존재하는 13종의 고친화성 인산 운반체 유전자들 중에서, 특히 토양에서 이용가능한, 인산 농도의 변화에 관계없이 벼의 모든 조직에서 항상 발현하면서 뿌리에서 흡수된 인산을 지상부로 효과적으로 수송하여 식물체의 인산 흡수·이용성을 증진시키는, 새로운 고친화성 인산 운반체 유전자에 관한 것이다.

인산은 식물이 필요로 하는 필수 영양소 중의 하나로서 에너지 전달, 신호 전달, 대사산물의 생합성, 광합성 그리고 호흡 등의 식물세포 내에서 물질 대사과정에 중요한 기능을 할 뿐 아니라 DNA와 RNA의 중요한 구성성분으로 질소와 함께 식물체가 가장 많이 필요로 하는 영양원소이다. 식물체의 성장에 필요한 많은 양의 인산은 주로 비료의 형태로 식물체에서 공급되고 있으나, 대부분의 인산은 토양에서 식물이 이용할 수 없는 유기물 또는 금속이온들과 결합한 형태로 고정화 된다. 따라서 실제 식물이 이용할 수 있는 유효인산의 양은 토양 속에 극히 적은 양으로 존재하고 있다. 특히, 산성 토양의 경우, 과다하게 축적된 알루미늄 이온에 의한 인산의 고정화로 토양의 인산 유효성을 더욱 낮추고 있다. 매년 전체 영농비용의 상당부분이 토양의 유효인산 농도를 증가시키기 위한 비료 구입비용으로 사용되고 있다. 또한, 농업 환경오염원 중에서 비료의 과다 사용으로 인한 토양의 산성화와 염의 집적 등의 토양오염은 작물의 생육에 나쁜 영향을 미칠 뿐 아니라 지표수에 침투하여 수자원의 주 오염원인 부영양화를 초래한다. 농업 환경오염은 농업 생산의 질적 저하를 가져올 뿐 아니라 환경파괴에 의한 국민건강을 위협하므로 그 오염원의 제거는 매우 중요한 문제이다. 이러한 문제는 투입되는 화학비료의 양을 줄임으로써 해결할 수 있다. 현재 화학비료를 대체하기 위한 여러 가지 유기질 비료가 개발되어 사용되고 있으나 아직 많은 문제점이 있다. 따라서 보다 근원적인 문제 해결방안은 식물의 인산 흡수력을 향상시킴으로써 비료의 사용량을 줄이는 것이다.

한편, 벼는 세계적으로 가장 중요한 작물 중의 하나로 최근 몇 년간 전체 유 전자 서열이 밝혀짐으로써 유용유전자를 대량으로 확보하고 이를 선점하고자 하는 많은 노력이 행해지고 있다. 식물의 무기양분 흡수와 관련된 연구는 재배학적 측면의 연구와 식물생리학적 측면의 연구가 오래 전부터 이루어져 왔으나, 최근에는 무기양분 흡수에 대한 분자수준의 기초연구를 토대로 무기양분 흡수와 관련한 유전자들을 이용하여 작물의 생육과 수량을 증가시키고 극도로 양분이 제한된 조건에서도 생장이 가능한 작물을 육종하기 위한 연구들이 세계적으로 활발히 진행되고 있다.

이와 관련한 종래의 연구 경향은 주로 재배, 생리학을 중심으로 하는 인산결핍 스트레스에 관한 연구였다. 1990년대 들어서면서 인산결핍에 대한 식물체의 반응을 분자수준에서 이해하고 응용하려는 새로운 경향의 연구들이 시작되었다. 현재 인산 운반체 유전자들은 애기장대, 토마토, 감자, 담배, 벼, 보리 등에서 분리되어 이들 유전자들의 구조와 발현 조절 특성들이 밝혀지고 있다. 그러나 아직 인산 흡수와 관련한 유전자들의 발현유도 기작이나 인산 운반체에 대한 분자세포생물학적 이해가 부족하여 유전자 조작에 의한 식물의 인산흡수 체계를 변화시켜서 기대하는 만큼의 인산 흡수능력이 향상된 새로운 식물체는 개발이 되지 않고 있다. 다만, 담배 현탁세포에 애기장대의 고친화성 인산 운반체를 대량 발현시키면 인산 결핍조건에서 세포성장률이 증가된다는 보고가 있는 바, 고친화성 인산 운반체를 이용한 인산 흡수력 개선 연구의 필요성을 제시하고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 인산 농도의 변화에 관계없이 벼의 모든 조직에서 항상 발현하는 신규한 고친화성 인산 운반체 유전자를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자의 프로모터를 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 유전자를 이용하여 인산 흡수력 및 수송능력 등 인산 이용능력이 향상된 형질전환 식물체의 생산방법을 제공하는데 있다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 인산 농도의 변화에 관계없이 벼(Oryza sativa L.)의 모든 조직에서 항상 발현하는, 서열번호 1의 염기서열 및 아미노산 서열을 갖는 인산 운반체 유전자 OsPT4를 제공한다.

다른 목적에 따라, 벼 식물체의 뿌리에서는 인산 결핍 조건에서 다소 발현이 증가되나 다른 모든 조직에서는 인산 농도의 변화에 관계없이 항상 발현하는, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 상기 인산 운반체 유전자 OsPT4의 프로모터를 제공한다.

또다른 목적에 따라, 상기 유전자를 이용하여 인산 흡수력 및 수송능력의 인산 이용능력이 향상된 형질전환 식물체의 생산방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 구성을 실시예에 의하여 상세히 설명하나, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1: 인산 농도 변화에 관계없이 벼의 모든 조직에서 항상 발현하는 OsPT4 유전자의 분리>

(단계 1) OsPT 유전자의 분리

본 발명에서는 우리나라 재배 품종인 동진벼(Oryza sativa L.)를 영남작물시험장으로부터 구입하여 사용하였다. 먼저, 동진벼에서 genomic DNA를 분리하여 벼의 전체유전체 염기서열을 토대로 각 벼 유래의 고친화성 인산 운반체 유전자 (OsPT)에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primer)를 각각 제작한 다음(표 1 참조), 통상적인 PCR 방법을 이용하여 각 유전자의 코딩 영역을 증폭하였다. 그 후, 상기 증폭된 산물을 pBluescript 클로닝 벡터에 클로닝하여 시퀀싱(sequencing)을 통해 유전자의 염기서열을 확인하였다.

그 결과 분리된 10종의 고친화성 인산 운반체 유전자들 간의 아미노산 염기서열에 대한 상동성을 비교하고, 다른 쌍떡잎 식물과 외떡잎 식물의 고친화성 인산 운반체 유전자와의 진화적인 근연관계를 계통발생학적 방법을 이용하여 조사하였다.

상기 조사 결과, 상기 유전자들 간에 70% 이상의 아미노산 염기서열이 같았 으며, 계통발생학적으로 외떡잎식물인 벼에서 분리된 이들 유전자는 쌍떡잎식물에서 분리된 유사 유전자들과는 분리되어 진화하여 왔음을 밝혀내었다(데이터 미제시).

(단계 2) RNA 블롯팅 분석에 의한 OsPT4 유전자의 분리

(1) 일반적으로 유사기능을 하는 유전자들이 과(family)로 존재하는 경우에는 각 유전자의 발현은 조직 특이적 또는 유도인자 특이적으로 조절되므로 상기 단계 1에서 분리된 10종의 고친화성 인산 운반체 유전자들의 발현 양식을 RNA 블롯(RNA blot) 방법을 이용하여 조사하였다.

이 때 각 유전자를 선택적으로 구분하기 위해서 각 유전자 특이적인 염기서열을 가진 3′ UTR DNA 단편만을 프로브(probe)로 사용하였다. 동진벼 종자에서 유도된 캘러스(callus) 세포를 인산이 충분한 배지(1 mM)와 인산이 결핍된 배지(10 μM)에서 각각 2일간 배양하고, 트리졸 리전트(Trizol REAGENT)(Invitrogen)를 이용하여 RNA를 분리 하였다. 10㎍의 RNA를 1.2% (W/V) 디네이처링 포름알데히드 아가로스 겔(denaturing formaldehyde agarose gel)에서 전기 영동하여 나일론 멤브레인(nylon membrane)(Amersham)에 RNA를 부착시켰다. RNA가 부착된 나일론 멤브레인은 [³²P] dATP로 표지된 프로브를 20% (W/V) SDS, 20X SSPE, 100 g/L PEG (8,000 mwt), 250 mg/L 헤파린(heparin) 및 10ml/L 히어링 스펌 DNA(Hearing sperm DNA)(10 mg/ml)가 포함된 용액과 함께 65℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다.

상기 실험결과, 조사한 10종의 고친화성 인산 운반체 유전자 중 오직 1종의 유전자(OsPT4) 만이 인산농도에 관계없이 항상 발현하는 양상을 보였다(도 2A 참조). 따라서, 이후 특이한 상기 고친화성 인산 운반체 유전자, OsPT4에 대해서 집중적인 연구를 수행하였다. 한편, 상기 OsPT4 유전자의 게놈 클론(genomic clone)의 염기서열은 도 1에 상세히 표기되어 있다.

(2) OsPT4 유전자의 발현을 좀 더 세부적으로 조사하기 위해 인산의 농도와 인산 결핍 시간에 따른 발현정도를 조사하였다. 이 때, 인산의 농도는 각각 20, 100, 250, 500, 1000μM로 달리하여 실험하였으며, 인산 결핍 시간은 0, 1, 2, 3, 4시간으로 하여 실험하였다.

그 결과를 도 2B 및 도 2C에 나타내었다. 상기 도 2B 및 2C에서 알 수 있는 바와 같이, 벼 캘러스 세포에서의 OsPT4 유전자의 발현은 인산의 농도와 인산 결핍 시간에 관계없이 항상 발현되고 있었다.

상기 캘러스(callus) 세포의 발현 양상을 기초로 하여 OsPT4 유전자의 식물체 내에서의 조직 특이적인 발현을 상기와 동일한 RNA 블롯 방법으로 조사하였는바, 뿌리 및 줄기조직에서 각각 인산 충분조건과 인산 결핍조건에 대해 조사하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서, 상기 OsPT4 유전자는 인산농도에 관계없이 벼 식물체 전체에서 항상 발현됨을 확인하였다. 특히, 인산이 결핍된 뿌리에서는 특이적으로 그 발현량이 증가하였다. 이러한 결과는, 식물체가 인산 결핍 환경에서는 인산에 대한 친화도가 높은 고친화성 인산 운반체를 뿌리에 대량 발현 시켜 토양으로부터 보다 효율적으로 인산을 흡수하고, 뿌리에서 흡수된 인산은 OsPT4와 같은 특이한 고친화성 인산운반체를 통해 식물체 전체로 효과적으로 이동될 것이라는 연구와 일치한다.

<실시예 2: OsPT4 유전자의 프로모터의 인산 농도에 따른 조직 특이적 발현 조사>

OsPT4 유전자의 보다 세부적인 조직 특이적 발현을 조사하기 위하여 상기 유전자의 프로모터 영역과 GUS 리포터 유전자를 연결시켜 아그로박테리움(Agrogbacterium)을 사용하여 형질전환체를 만들고, 인산 농도에 따른 GUS의 조직별 활성을 통상적인 GUS 분석방법에 따라 분석하였다.

먼저 벼 형질전환체의 생산과정을 간략히 살펴보면 다음과 같다. OsPT4 유전자의 프로모터 부분을 바이너리 벡터(binary vector) pCAMBIA1381Z(CAMBIA, 1281Z)의 EcoRI/NcoI 사이트에 GUS 리포터 유전자의 ATG 영역과 결합시켜 구조물을 제작한 후, 이를 트리패어렌탈 메이팅(triparental mating) 방법으로 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 균주로 옮겼다. 그 다음 배 형성 능력이 있는 벼의 캘러스 세포를 상기 형질전환된 아그로박테리움 균주로 감염시키고, 하이그로마이신(hygromycin)(50 ㎍/ml)이 포함된 캘러스 증식용 배지에서 형질전환된 캘러스를 선별하여 조직배양 방법을 이용하여 완전한 형질전환된 벼를 생산하였다. 이렇게 형질전환된 벼를 인산 농도가 충분한 조건(1000uM)의 액체배지에서 하루 동안 배양한 후 통상적인 방법에 따라 뿌리, 줄기, 잎의 조직별 GUS 활 성을 조사하였다.

그 결과 도 4에서 OsPT4 유전자는 벼 식물체 전체에서 항상 발현됨을 알 수 있었다. 따라서, 인산이 결핍된 환경에서 식물체의 뿌리는 수많은 뿌리털을 만들어 표면적을 넓혀주고 이를 통해 토양에서 인산을 최대로 흡수하여 체관부를 통해 식물체 전체로 이동시킴으로써 식물체가 인산을 이용할 수 있도록 한다는 기존의 연구결과로 미루어 볼 때, 상기 OsPT4 유전자는 토양 속의 인산이 뿌리털로 흡수된 후에 이를 식물체 전체로 이동시킬 때 중요한 역할을 할 것으로 판단되었다.

<실시예 3: 본 발명 OsPT4 유전자를 이용한 애기장대 형질전환체의 제조 및 발현확인>

벼는 대부분 물속에서 생활하기 때문에 다른 밭작물에 비해 상대적으로 약한 인산 결핍 스트레스를 받는다. 따라서, 벼에서 분리한 상기 고친화성 인산 운반체 유전자의 밭작물에서의 응용가능성을 증명하고 식물체내에서 그 기능을 조사하기 위해 쌍떡잎식물의 대표적인 모델 식물체인 애기장대(Arabidopsis thaliana)에 상기 OsPT4를 대량발현하는 형질전환체를 제조하였다.

애기장대의 형질전환체 생산과정을 간략히 살펴보면 다음과 같다. OsPT4 유전자의 코딩 영역을 본 연구실에서 직접 제작한 바이너리 벡터(binary vector) pCAMBIA1300-35S의 XbaI 사이트에 클로닝하여 OsPT4 유전자가 항상 강하게 발현하는 CaMV 35S 프로모터에 의해서 조절되는 구조물을 제조한 후, 트리패어렌탈 메이팅(triparental mating) 방법으로 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105로 옮겼다. 그 다음, 애기장대 야생형 식물체에 상기 구조물이 포함된 아그로박테리움 튜메파시엔스 EHA105를 사용하여 in planta 형질전환 방법으로 애기장대를 형질전환하였다. T1 식물체에서 수확한 씨앗을 무균 살균처리한 후 카르베니실린(carbenicillin)(100 mg/L)과 하이그로마이신(hygromycin)(20 mg/L)이 첨가된 B5 배지에서 발아시켜서 형질전환된 식물체를 선택하고, OsPT4 유전자의 발현량을 RNA 블롯 방법으로 확인한 후에 다음 세대에서 호모라인의 형질전환 식물체를 얻었다. 상기 순종 형질전환 식물체를 50μM 그리고 1mM의 인산이 첨가된 B5 액체배지에서 생육하여 그 식물 생육 상태를 야생형 식물과 비교 조사하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 T3, T4, T8은 독립적으로 생산된 형질전환체를 임의적으로 표시한 것이다. 먼저 도 5A를 통해 OsPT4 유전자가 야생형 식물체보다 애기장대 형질전환체에서 보다 대량발현됨을 확인할 수 있었다. 또한 도 5B에서는 인산 결핍 조건에서 형질전환체의 생육이 대조군인 야생형 식물체와 비교하여 더 좋은 것을 확인하였다. 정량적인 조사 결과에서도 야생형 식물체와 비교하여 형질전환체에서 생장이 더 좋은 것을 확인하였다. 특히, 조사한 형질전환체 라인 중에서도 가장 OsPT4 유전자의 발현이 높았던 형질전환체(T3)에서는 생장이 약 40% 증가하는 것을 확인하였다(도 5C 참조). 인산결핍에 특이적으로 발현하는 애기장대의 고친화성 인산운반체 유전자(AtPT1)를 분자마커로 이용하여 조사한 실험에서는 인산 결핍 조건에서 OsPT4 유전자가 대량 발현하는 애기장대 형질전환체가 야생형 식물체보다 인산 결핍 스트레스를 적게 받고 있음을 알 수 있었다(도 5D 참조).

이상, 상기 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명자들은 OsPT4 유전자를 대량 발현하는 애기장대 (Arabidopsis thaliana)의 형질전환체들이 인산 결핍조건에서 인산 이용성을 향상시키는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 상기 결과를 바탕으로 할 때, 본 발명은 인산 농도에 관계없이 벼의 모든 조직에서 항상 발현되는 OsPT4 유전자를 제공함으로써 인산 결핍 스트레스를 보다 효율적으로 극복하는 새로운 식물체의 개발을 가능케 하는 뛰어난 효과가 있으며, 또한 식물 자체의 양분 흡수력 및 수송능력을 향상시켜 화학비료의 다량 사용으로 인한 토양과 수자원의 오염을 감소시키므로 생태계의 복원과 쾌적한 환경친화적 농업발전 나아가 작물의 생산량과 생산의 질을 높이는 탁월한 효과가 있다. 더 나아가 배추나 무 같은 밭작물과 다른 화훼류 작물에서의 OsPT4 유전자도 유용하게 이용할 수 있는 가능성을 제시하여 식량산업 및 환경산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 염기서열을 가지며 인산 농도 변화에 관계없이 벼(Oryza sativa L.)의 모든 조직에서 항상 발현하는 고친화성 인산 운반체 유전자.
서열번호 2의 아미노산 서열을 가지며 인산 농도 변화에 관계없이 벼(Oryza sativa L.)의 모든 조직에서 항상 발현하는 고친화성 인산 운반체 유전자.
서열번호 3의 염기서열로 표시되며, 벼(Oryza sativa L.) 식물체의 뿌리에서는 인산 결핍 조건에서 다소 발현이 증가되나 다른 모든 조직에서는 인산 농도의 변화에 관계없이 항상 발현하는 제1항 유전자의 프로모터.
제 1항의 유전자로 형질전환되어, 토양의 인산농도와 관계없이 생장이 우수한 형질전환 애기장대.