CN101815787A - 亚硝酸盐含量降低的植物的产生 - Google Patents

Abstract

本发明一方面涉及产生转基因植物的方法，该方法包括向未修饰的植物中引入编码亚硝酸还原酶的外源基因，其中由所述外源基因编码的亚硝酸还原酶的表达相对于未修饰植物降低了转基因植物的亚硝酸盐含量。本发明也提供包含编码亚硝酸还原酶的外源基因的转基因植物和植物细胞，以及相关用途、嵌合基因和植物转化载体。

Description

亚硝酸盐含量降低的植物的产生

发明领域

本发明涉及产生转基因植物的方法。特别是，本发明涉及降低植物中亚硝酸盐含量的方法以及通过该方法获得的转基因植物和相关用途。

发明背景

氮同化作用对于植物生长非常重要。在植物需要的所有矿物营养中，氮的需求量最大。植物在田地中吸收氮的主要形式是硝酸盐和氨，它们是氮肥的主要成分。植物从土壤中吸收硝酸盐或铵离子，取决于它们的可获得性。硝酸盐在含氧充足的非酸性土壤中更丰富，而铵在酸性或渍水土壤中占优势。烟草的生长参数试验(1999)明确证实了相对生长速率、叶绿素含量、叶面积和根面积随着硝酸盐供给的增加显著增加。

根通过特异转运体的作用吸收硝酸盐和氨(Rothstein等，1998)。植物中存在对硝酸盐具有不同亲和力的不同转运体系。接着硝酸盐或者被胞质酶硝酸还原酶(NR)还原并进入氮同化途径或者被转运至木质部的枝条。硝酸盐从根的表皮细胞和皮层细胞转运至维管系统进一步转运至枝条(Crawford，1995)。它通过质外体进入叶并跨过质膜转运至叶肉细胞。在这里它或者储存在液泡中或者在胞质中被还原并进入初级氮同化途径。当硝酸盐过量时它储存于液泡中。这可作为渗压剂和硝酸盐吸收最少时待用的矿物N的来源(Crawford和Glass，1998)。胞质中存在的硝酸盐是初级氮同化的起点。

硝酸盐在胞质溶胶中被胞质酶硝酸还原酶(NR)还原成亚硝酸盐，其自身被叶子叶绿体或非光合器官质体中的亚硝酸还原酶(NiR)快速还原成铵(Crawford，1995，Crete等，1997，Tobin和Bowsher，2005)。在叶绿体中铵接着进入谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶循环(GS/GOGAT)，在那里它掺入氨基酸库。

NR被认为是生长和硝酸盐同化的限速因子(Solomonson&Barber，1990，Tischner，2000)并且是氮同化的第一个关键步骤。它催化硝酸盐的2电子还原至亚硝酸盐，使用NAD(P)H作为电子供体(Wray和Kinghorn，1989)。

有三种形式的NR；游离NR(活性)、磷酸化NR(活性pNR)和pNR：14-3-3(非活性)。3种类型的比例随外部条件而变化(Kaiser等，2002)。这一复杂的NR调控控制了硝酸盐的还原这样不会在细胞中积累有害量的亚硝酸盐(Lillo等，2003)。Lea等，(2006)证明了烟草植物中NR的翻译后调控对NR活性和相关代谢物水平具有最大作用。采用组成型启动子CaMV(35S)引入NR并因此在转录水平解除对NR的调节对代谢物水平几乎没有影响，因为翻译后调控机制仍然具有活性。然而翻译后调控的丧失会引起嫩烟草叶的褪绿病(Lillo等，2003)。在烟草中，定向突变Ser521至天冬氨酸可防止NR的翻译后磷酸化(Kaiser等，2002，Lillo等，2003，Lea等，2006)。当这一翻译后调控已受到破坏时，NR的组成型活化引起亚硝酸盐积累和褪绿病叶片。

NR的第二个功能为还原亚硝酸盐至一氧化氮和一氧化二氮。已知一氧化氮(NO)在植物防御、生长和发育中具有重要的信号传导作用(Wendehenne等，20040。NO产生只利用1％的NR能力并依赖于亚硝酸盐浓度(Kaiser等，2001，Rockel等，2002)。通过经纯化的玉米NR从亚硝酸盐产生NO可被硝酸盐(50μM)竞争性抑制并且当相对于亚硝酸盐还原更高的硝酸盐还原引起亚硝酸盐水平积累时NO的产生速率增加(Rockel等，2002)。在亚硝酸还原酶(NiR)活性严重降低的转基因烟草中报导了相应的NO释放增加。这也伴随着参与硝酸盐还原调控的14-3-3蛋白质的合成增加(Morot-Gaudry-Talarmain等，2002)，并有可能与控制细胞中亚硝酸盐潜在有害积累的尝试相关。

亚硝酸还原酶(NiR)是硝酸盐同化途径中的第二个酶并涉及从被还原的铁氧还蛋白转移六个电子至亚硝酸盐形成铵(Wray andKinghorn，1989)。绿叶中的NiR分子量为63kDa并且是单体(Crété等，1997)。NiR主要存在于C₃植物叶子的叶绿体和C₄植物叶肉细胞中的叶绿体，以及非绿色组织中的质体(Tobin和Bowsher，2005)。

已显示该酶为金属蛋白(Swarmy等，2005)并包含亚硝酸盐结合的西罗血红素(sirohaem)辅基和可能为起始电子受体的4Fe/4S中心。

NiR由三个紧密折叠在辅因子周围的结构域、西罗血红素和4Fe/4S簇组成。NiR与其电子供体铁氧还蛋白和底物亚硝酸盐形成复合物，4Fe/4S簇从铁氧还蛋白接受电子并将它们转移至西罗血红素，其接着将电子转移至底物亚硝酸盐，其保持结合直至完全还原至氨(Swamy等，2005)。

NiR在细胞核中由NiR基因编码(Dorbe等，1998)，因此该蛋白质必须从胞质转移至叶绿体。菠菜NiR前体蛋白比成熟蛋白长32个氨基酸。这些附加的氨基酸很可能是引导NiR至叶绿体的转运肽序列(Wray和Kinghorn，1989)，在叶绿体中这一肽必须裂解以形成活性蛋白。

在多种植物中鉴定了NiR同种型。烟草中有四个NiR基因：NiR1和NiR3主要编码叶特异性NiRs，NiR2和NiR4主要编码根NiRs(Kronenberger等，1993，Stohr和Mack，2001)。在两个烟草祖先种中发现了这些基因的同系物，茸毛烟草(Nicotiana tomentosiformis)中的NiR1和NiR2以及林生烟草(Nicotiana sylvestris)中的NiR3和NiR4(Kronenberger等，1993)。

在拟南芥菜、菠菜和大豆中只有一种NiR基因，玉米和尖辣椒中有两种，野生燕麦中有三种(Wray和Kinghorn，1989)。烟草NiR的叶和根mRNA比例为3∶1(Kato等，2004)，表明叶NiR在硝酸盐同化中发挥更重要的作用。Kato等.(2004)采用定量RT-PCR也证明了4种NiR基因各自的mRNAs均存在于叶和根中但是NiR2和4仅占叶总NiR mRNA的10％。所有四种基因均在硝酸盐处理后被诱导。

Morot-Gaudry-Talarmain等(2002)产生了NiR活性被严重抑制的反义NiR烟草植物。这些植物显示显著降低的生长，表明植物中的亚硝酸盐细胞毒性可归因于活性氮种类例如NO(一氧化氮)、N₂O(一氧化二氮)和过亚硝酸盐的产生，它们进一步诱导蛋白质和酚环结构中酪氨酸残基的硝化作用。NO释放增加了蛋白质例如14-3-3′s和亲环素的合成。

NiR活性需要为光合作用产物(Tobin和Bowsher，2005)并且发生在叶绿体基质中的被还原的铁氧还蛋白作为电子供体。通过分离完整的菠菜叶绿体证明了亚硝酸盐还原可由与完整叶中检测到的相似速率的光照引发。干扰PSII后的电子传递链并因此终止被还原的铁氧还蛋白可获得性的DCMU(3(3，4-二氯苯基)-1，1-二甲基脲)抑制这一反应并显示亚硝酸盐还原与非循环电子传递活跃地直接连接/偶合(Mohr和Schopfer，1994)。

在根部，硝酸盐同化发生在白色体中。该反应与发生在叶绿体中的反应相似但是由还原等价物(NADPH)通过氧化戊糖磷酸途径的铁氧还蛋白-NADPH氧化还原酶提供(Tobin和Bowsher 2005)。

铵掺入有机化合物是通过谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酰胺-2-酮戊二酸-氨基转移酶(GOGAT)的循环作用进行(Lea和Miflin，1974)。GS将铵掺入谷氨酰胺(Gln)并且谷氨酸(Glu)是通过GOGAT的作用来源自Gln(Lea和Miflin，2003；Glevarec等，2004)。这一过程以循环进行，产生的一个谷氨酸分子被GS用作底物而另一个用于其他氨基酸的合成。这一途径非常重要因为Glu和所产生的Gln是用于主要含N化合物生物合成的供体(Hodges，2002)。

输入循环的为铵，其可源自数种不同的来源，例如初级硝酸盐同化、光呼吸作用和氮再活化(remobilisation)(谷氨酸脱氢酶的脱氨活性)，和底物2-酮戊二酸(2-OG)，其可源自异柠檬酸脱氢酶或氨基转移酶，但是仍不清楚2-OG用于铵同化的准确路径(Hodges，2002)。

由氮固化生成的分子，谷氨酰胺(Gln)和谷氨酸(Glu)，是用于合成细胞中所有其他氨基酸和含N化合物包括核酸、辅因子和叶绿素的氮(N)供体。因此Glu和Gln被称作关键(pivotal)氨基酸，并且硝酸盐还原和GS/GOGAT循环位于氮和碳(C)代谢的交汇处。N和C代谢必须紧密协调，因为N同化需要提供2-OG形式的C骨架、大量ATP以及还原硝酸盐至铵必须的还原剂和将铵掺入Glu和Gln。这一紧密协调已在数个研究中通过N同化活性和代谢物与光合碳同化途径的那些之间的强烈相关性显示出来(Martin等，2005)。在烟草中，当植物遇到升高的CO₂水平时硝酸盐的吸收增强7％(Kruse等，2002)同时相对生长速率增加9％。

氮同化也与硫酸盐同化相关。硫与氮以这样的方式相互作用即一方的缺乏会降低另一方的吸收和同化(Hesse等，2004)。来自暴露于硝酸盐的拟南芥菜植物的微阵列数据证明了数种硫酸盐转运体和同化基因响应硝酸盐处理(Wang等，2003)的表达与硝酸盐转运体和同化基因上调的方式相同。确实，亚硫酸还原酶(SiR)和NiR包含电子转移必需的西罗血红素辅因子和铁硫簇。也已知SiR和NiR可还原其他酶的底物但是对它们自己的底物具有更高的亲和力(Swamy等，2005)。因此N同化活性尤其是NiR活性依赖于硫的存在(Swamy等，2005)。

氮(主要是铵和氨基酸的形式)也可通过再循环氮的途径为植物所用，例如光呼吸作用、衰老和氨基酸分解代谢中达到的那些。当通过线粒体酶甘氨酸脱羧酶(GDC)转化甘氨酸至色氨酸的过程中从C3植物叶子的甘氨酸释放铵时发生光呼吸作用。光呼吸作用途径可导致铵同化速率是硝酸盐还原的速率的10倍，尤其是当环境条件例如干旱导致气孔闭合和叶绿体中二氧化碳利用率低时。

在衰老过程中，蛋白水解后释放的氨基酸发生氨基转移，使得氨基基团转移至Glu。由谷氨酸脱氢酶(GDH)催化的氧化脱氨反应接着使可以释放铵、2-OG和还原力(NADH)。接着铵可作为谷氨酰胺和天冬酰胺合成的底物并且2-OG在三羧酸循环中被代谢(Gleverac等，2004)。

理论上GDH可在胺化方向中发挥作用从铵和2-OG合成谷氨酸。GDH在铵同化中的作用一直以来并将继续存在很大争议。然而，目前有许多证据表明GDH主要以脱氨方向在具有低C/N比例的组织例如发芽的种子和衰老的叶子中发挥作用(即转化氨基酸至转运化合物)(Mifiin和Habash，2002)。

NR和NiR活性的调控在控制整个植物的初级氮同化中是关键性的并对植物的生长和发育具有重要影响。然而在某些条件下硝酸盐可能积累，主要在绿色光合活性组织中，在那里其储存在叶肉细胞的液泡中。在低温和/或太阳照射时段(例如在冬季的温室植物中)可发生高水平的硝酸盐积累，此时具有较少的光合能力同化储存的硝酸盐，或由土壤中的高硝酸盐水平引起。硝酸盐水平增加不仅在植物生长方面而且在消耗植物的人类或动物健康方面具有多种有害后果，以及环境后果。硝酸盐同化的许多不良后果由亚硝酸盐的产生介导。

亚硝胺作为亚硝基化剂与仲胺或叔胺前体之间化学反应的一部分形成。亚硝基化剂的来源为亚硝酸盐，其与水反应产生普通的亚硝基化剂例如亚硝酸(HNO₂)、三氧化二氮(N₂O₃)和过氧化亚硝酸盐(ONOO^-)。这一反应在温度升高(例如，烹饪，吸烟或干燥过程中)或在酸性条件下例如胃中普遍存在(Lee等，2006)。

胃中亚硝胺的形成是内源性亚硝基化作用的结果。口腔细菌化学还原食物和饮料中消耗的硝酸盐至亚硝酸盐，其可在胃的酸性环境中形成亚硝基化剂。这些亚硝基化剂与胺反应产生亚硝胺并引起DNA链断裂或DNA交联。

烟草中的亚硝胺由微生物还原硝酸盐至亚硝酸盐形成，这发生在衰老和加工(curing)过程中细胞破坏并且细胞内容物变得可被存在于叶子上的微生物所用时。来源自亚硝酸盐的亚硝基化剂与烟草生物碱反应形成烟草-特异亚硝胺(TSNAs)。亚硝酸盐自身在叶子褐变和干茎阶段形成。叶子中残留的硝酸盐和亚硝酸盐的量对该反应和所产生TSNAs的量具有重要作用(Staff等，2005)。

亚硝胺化合物与人类癌症相关。这由John Bames和Peter Magee首先于1956年报导，他们证明了二甲基亚硝胺(DMNA)在大鼠中诱导肝肿瘤。这引起对其他亚硝胺致癌性质的研究，检测了约300种亚硝胺并且发现90％在各种实验动物中具有致癌性(Ellis等，1998)。人种群研究将亚硝胺与癌症主要是食道癌、口腔癌和咽癌联系起来(Isaacson，2005)。

硝酸盐可经来自天然存在的叶菌群、污染物(Isaacson，2005)或来自肠道或口腔细菌(Ellis et al，1998)的微生物还原至亚硝酸盐。多达25％所摄取的硝酸盐被唾液腺从血液中吸收并分泌至唾液中。其中20％被口腔中的兼性厌氧菌还原至亚硝酸盐，这些兼性厌氧菌利用硝酸盐作为氧气的备选电子受体以产生ATP。是亚硝酸盐作为主要的亚硝基化剂，因为硝酸盐自身会不经修饰地离开人体因为硝酸盐不能被人体的酶代谢。

与硝酸盐过量相关的另一问题是高铁血红蛋白的形成，它可引起蓝婴综合征，其中血红蛋白的携氧能力被亚硝酸盐阻断，引起婴儿化学窒息。胎儿血红蛋白即3个月内婴儿中的主要形式比成人血红蛋白更容易被亚硝酸盐氧化至高铁血红蛋白。血红细胞包含将高铁血红蛋白转化回血红蛋白的高铁血红蛋白还原酶，但是这一酶的活性是成人中的一半。包含蔬菜(硝酸盐含量增加的另一来源)的婴儿食物自愿(voluntarily)检测为低于100ppm，因为菠菜常常超出这一限制，所以产品经常被标注不得用于小于三月龄的婴儿(Greer等，2005)。

由于这些健康问题，许多管理当局对绿叶蔬菜例如菠菜和莴苣中允许的硝酸盐量设定了限制(例如，European Commission Regulation653/2003)，视收获时间而定。这些限制使得任何高硝酸盐含量的产品无法销售。因此人们已进行了许多努力通过控制含氮肥料的应用或改进的作物栽培系统降低植物的硝酸盐含量(Isolovich等，2002)。一些当局也对饮用水中的硝酸盐量设定了限制。

改变植物特性的一种可选择方法为通过使用基因工程技术。向植物中引入并操作目标特性的特异编码序列以改变它们的生理学已证明对许多农作物物种和模型植物例如烟草、小麦、大麦、拟南芥菜和玉米是成功的。生产包含抗除草剂特性的植物在一些国家是商业上可接受的，尤其是美国、西班牙和中国。包含对消费者有利特性的农作物也变得可获得，例如金米(Syngenta)，在其基因组中插入了八氢番茄红素合酶基因(来自玉米)和胡萝卜素去饱和酶基因(来自噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovara))使得农作物中维生素A的水平增加(Paine等，2005)。尽管如此，绝大多数的遗传修饰在研究中用作了解特异基因在植物中的功能的工具。

土壤细菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumifaciens)提供了用于稳定插入外源基因至植物的工具并可用于许多植物物种的转化，包括烟草、土豆、番茄、拟南芥菜、桉树等(Hoekema等，1983，Bendahmane等，2000)。根癌农杆菌天然将其自身的质粒DNA转移至植物基因组中作为转染植物的工具。根癌农杆菌包含与细菌染色体分离的质粒，称作Ti质粒。在Ti质粒中具有可转移至被感染植物中的DNA区域称作转移-DNA(T-DNA)。该Ti质粒中也包含促进该T-DNA转移的基因例如vir区(赋予感染毒力的区域)。一个特异的目标基因(或复数个基因)可插入根癌农杆菌的转移-DNA(T-DNA)中并接着用于感染植物并生成转基因种群。

和目标基因一样，选择性标记基因通常为T-DNA的一部分，例如可赋予表达该基因的植物卡那霉素抗生素抗性的新霉素磷酸转移酶II(NPTII)，使得筛选已转化植物的方法可行(Angenon等，1994)。农杆菌介导的转移可使得多于一个拷贝的T-DNA插入植物基因组中。多个拷贝已显示可导致基因表达下调或基因沉默(Vaucheret等，1998，Han等，2004)。

已研究了NR蛋白质在烟草、土豆和拟南芥菜中的调控(例如Lea等，2006)。已克隆了NR序列并用于过表达研究(Lea等，2004)和下调研究(Lillo等，2004)。

这些研究引起对NR翻译后调控的进一步认识，该调控经植物进化用于避免亚硝酸盐积累的潜在问题。当NR过度表达或下调时，亚硝酸盐水平在整个白天和夜晚降低(Lea等，2006)，这引起具有最终损伤效应的亚硝酸盐积累(Lillo等，2003，Lea等，2004)。这很可能归因于NiR不能在夜间还原叶子中的亚硝酸盐，因为当不存在光合作用时无法获得所需要的还原剂-被还原的铁氧还蛋白。

Stitt等(1999)开发了一种可选择的方法，他们利用具有低NR活性的烟草突变体并观察到该植物中硝酸盐含量的积累，这也是不利的。与此相反，土豆叶子中的低NR活性引起转基因块茎中硝酸盐水平降低(Djennane等，2002)。

相反，未对NiR进行广泛研究。Takahashi等(2001)产生了过度表达菠菜NiR的拟南芥菜植物并且发现包含多于两个该转基因拷贝的株系具有低水平的mRNA。这一基因沉默现象可归因于该植物应用的数种不同机制，例如整合在一个基因座上的多个拷贝的超甲基化和来自RNAi机制的共抑制(Vaucheret等，1998，Han等，2004)。具有一个或两个NiR基因拷贝的株系显示出显著更高水平的¹⁵N-标记还原氮。这一研究专注于提高硝酸盐同化但是没有研究转基因植物中的硝酸盐和亚硝酸盐水平。

烟草中烟草NiR基因的过表达也引起NiR活性增加至两倍(Crété等，1997)。然而观察到烟草叶NiR表达的转录后调控，因为尽管存在NiR mRNA的组成型表达，NiR活性和蛋白质水平在含铵基质中显著降低。未报道这对硝酸盐和亚硝酸盐水平的作用。

Ozawa和Kawahigashi(2006)分离了稻NiR基因并使其过度表达于市售稻品种(Koshihikari)中用作生产转化稻的筛选系统。引入NiR可得到与野生型植物相比较好的生长和愈伤组织的再生能力。

因此，需要缓解与植物中硝酸盐和/或亚硝酸盐积累相关的不利作用的方法。特别是需要降低植物中亚硝酸盐含量的方法，该方法可例如增强氮同化和/或降低该类植物对动物或人类的毒性。

发明简述

一方面，本发明提供产生转基因植物的方法，其包括向未修饰的植物中引入编码亚硝酸还原酶的外源基因，其中由该外源基因编码的亚硝酸还原酶的表达相对于未修饰的植物降低了该转基因植物中的亚硝酸盐含量。

另一方面，本发明提供一种转基因植物，其包括编码亚硝酸还原酶的外源基因，其中与未修饰的植物相比该植物中的亚硝酸盐含量降低。

另一方面，本发明提供编码亚硝酸还原酶的外源核酸序列在通过用该外源核酸序列转化植物以降低植物亚硝酸盐含量中的用途。

另一方面，本发明提供一种嵌合基因，其包含(a)编码亚硝酸还原酶的核酸序列，和(b)可引导该亚硝酸还原酶在包含该嵌合基因的植物中表达的启动子序列，排除了下列：(i)包含编码来源自烟草(Nicotiana tabacum)或菠菜(Spinacia oleracea)的亚硝酸还原酶的核酸序列和花椰菜花叶病毒35S启动子的嵌合基因，和(ii)包含编码来源自稻(Oryza sativa)的亚硝酸还原酶的核酸序列的嵌合基因。

另一方面，本发明提供一种嵌合基因，其包含(a)编码亚硝酸还原酶的核酸序列，和(b)能够引导该亚硝酸还原酶在包含该嵌合基因的植物中表达的启动子序列，排除包含编码来源自烟草、稻或菠菜的亚硝酸还原酶的核酸序列的嵌合基因。

另一方面，本发明提供一种嵌合基因，其包含(a)编码亚硝酸还原酶的如SEQ ID NO：2中定义的核酸序列，或其编码功能性亚硝酸还原酶的片段，或其编码与SEQ ID NO：3定义的多肽具有至少90％的氨基酸序列同一性的功能性亚硝酸还原酶的变异体；和(b)能够引导该亚硝酸还原酶在包含该嵌合基因的植物中表达的启动子序列。

另一方面，本发明提供包含上文定义的嵌合基因的植物转化载体。

另一方面，本发明提供包含上文定义的转化载体的植物或植物细胞。

另一方面，本发明提供包含编码亚硝酸还原酶的外源基因的植物细胞，其中与未修饰的植物细胞相比该植物细胞中的亚硝酸盐含量降低。

“未修饰的植物”意指用外源基因转化之前的植物。换言之，“未修饰的”指通过用外源基因转化可随后从其产生转基因植物的任何植物。因此“未修饰的”不以任何其它方式限制植物的性质。该植物可为来源自任何物种或株系的野生型植物或可为已通过一个或更多个之前所述的遗传修饰(包括引入其他转基因或内源基因的删除或失活)而被修饰的植物。在优选的实施方案中，所述未修饰的植物为茄科，更优选为Cestoideae亚科，更优选为烟草属并且最优选地所述未修饰的植物为烟草(Nicotiana tabacum)。

转基因植物为通过向未修饰的植物引入编码亚硝酸还原酶的外源基因生成。“外源基因”意指该基因从外部来源转化至未修饰的植物。该外源基因可具有与未修饰的植物中编码亚硝酸还原酶的内源基因相同或不同的核酸序列。该外源基因可来源自例如编码任何物种的亚硝酸还原酶的基因组DNA或cDNA序列。通常该外源基因来源自不同来源并具有与内源基因不同的序列。或者，引入具有与内源基因相同的序列的外源基因可用于增加植物中存在的该内源基因序列的拷贝数。

一般而言，除非另外指明，当提及“植物”时其包括任何发育阶段的植物，包括单个细胞和种子。因此在具体的实施方案中，本发明提供具有如本文定义的“转基因植物”的一个或更多个特性的植物细胞例如分离的植物细胞。

优选该外源基因与植物中编码亚硝酸还原酶的内源基因不同。例如，该外源基因优选与未修饰植物中编码亚硝酸还原酶的内源基因具有小于95％的序列同一性。更优选该外源基因与内源亚硝酸还原酶基因具有小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于60％、小于50％或小于40％的序列同一性。

相似的，优选该外源基因编码的亚硝酸还原酶与植物中的内源基因编码的亚硝酸还原酶不同(在氨基酸/多肽水平上)。例如，该外源基因产物优选与未修饰植物中的内源基因产物具有小于95％的序列同一性。更优选该外源基因与内源亚硝酸还原酶基因具有小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于60％、小于50％或小于40％的序列同一性。

优选编码亚硝酸还原酶的外源基因是异源基因，其指该外源基因来源自与未修饰植物的物种不同的物种。在一个优选的实施方案中，该异源基因来源自拟南芥属的供体植物，更优选来自拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)。

在另一个实施方案中，编码亚硝酸还原酶的外源基因可来源自任何其他植物物种，包括但不限于来自下列属之一的物种：烟草属(Nicotiana)、稻属(Oryza)、辣椒属(Capsicum)、菠菜属(Spinacia)和玉蜀黍属(Zea)。举例而言，该外源基因可来源自烟草(Nicotianatabacum)、稻(Oryza sativa)、辣椒(Capsicum annuum)、菠菜(Spiaciaoleracea)或玉米(Zea mays)。在其他实施方案中，该外源基因来源自稻之外的植物物种，例如稻属植物之外或稻种植物之外。或者，该外源基因可来源自烟草、稻或菠菜之外的物种。

来自拟南芥菜的亚硝酸还原酶的基因组和cDNA序列分别定义于SEQ ID NOs 2和1。该基因组序列包含四个外显子和三个内含子以及5′和3′非翻译区。cDNA序列SEQ ID NO：1包含SEQ ID NO：2碱基1248-1623，1820-2175，2257-2545和2623-3362处的四个外显子。因此该编码序列加上3个内含子(即该基因组序列减去5′和3′非翻译区)延伸自SEQ ID NO：2的碱基1248-3362。这些序列编码的亚硝酸还原酶的氨基酸序列定义于SEQ ID NO：3。

优选该外源基因包含如SEQ ID NO：2定义的核酸序列或其编码功能性亚硝酸还原酶的片段，或其编码与SEQ ID NO：3定义的多肽具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％氨基酸序列同一性的功能性亚硝酸还原酶的变异体。在一个实施方案中，SEQ ID NO：2的核酸序列片段包含SEQ ID NO：1的cDNA序列(即SEQ ID NO：2的残基1248-1623，1820-2175，2257-2545和2623-3362)或其变异体。在另一实施方案中，SEQ ID NO：2的核酸序列片段包含外显子和内含子，即SEQ IDNO：2的残基1248-3362或其变异体。

在另一实施方案中，该外源基因包含编码亚硝酸还原酶的SEQ ID NOs：18，20，22，24，28，28，30或32中任一定义的核酸序列，或其编码功能性亚硝酸还原酶的片段，或其编码与SEQ ID NOs：19，21，23，25，27，29，31或33中任一定义的多肽具有至少70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的功能性亚硝酸还原酶的变异体。编码功能性亚硝酸还原酶的变异体核酸序列可选择性地与SEQ ID NOs：1，2，18，20，22，24，28，28，30或32的一个或更多个具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％核苷酸序列同一性。这些核酸序列的变异体和片段包括基因组DNA序列(例如包含包括5′和/或3′非翻译区的全长基因座)、包含编码序列和内含子的DNA序列(例如，不包括5′和/或3′非翻译区)和与特定SEQ ID NOs相关的cDNA序列。

在一个实施方案中，该外源基因包含一个或更多个内含子，其可为存在于可衍生该外源基因的基因组序列中的内含子。在外源基因中包含内含子可提高转基因植物中从该外源基因转录的RNA的稳定性，藉此增强亚硝酸还原酶的表达水平。内含子的剪切涉及RNA周围的蛋白质复合物，其可保护免于将该RNA识别为“外源性”的酶对RNA的降解。

可通过任何适当的转化技术将外源基因引入经修饰的植物中，只要可引起该外源基因编码的亚硝酸还原酶在该转基因植物中表达。通常该外源基因为包含与来源自不同基因的启动子序列融合的亚硝酸还原酶编码序列的嵌合基因。该嵌合基因可克隆至适合于转化植物的任何构建体中。优选编码亚硝酸还原酶的外源基因与能够引导该外源基因在该植物中组成型表达的启动子序列相连。例如，在一个实施方案中，该启动子序列为来源自香石竹蚀环病毒的组成型启动子。该启动子序列可引导由该外源基因编码的亚硝酸还原酶在任何一种或多于一种的植物组织中表达。优选该亚硝酸还原酶在启动子控制下至少在该植物的叶子中表达于该转基因植物中。在一些实施方案中，该外源基因编码叶绿体亚硝酸还原酶，其可例如通过N-端靶向序列(转运肽)被转运至叶绿体区室。

在本发明的实施方案中，相对于未修饰的植物，即与用外源基因转化之前的植物相比，转基因植物的亚硝酸盐含量降低。因为亚硝酸盐含量的任何降低都是有利的，所以转基因植物中亚硝酸盐水平没有特别的限制性，只要它可检测地低于未修饰植物的水平。优选相对于未修饰植物亚硝酸盐含量降低了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％，更优选更大的降低。亚硝酸盐含量可通过例如下文所述的任何适当技术测定。

可在一种或更多种植物组织中降低亚硝酸盐含量，例如在表达了由外源基因编码的亚硝酸还原酶的组织中。在其他组织中，有可能与未修饰植物相比转基因植物中的亚硝酸盐含量不是可检测的更低。因此在一个实施方案中，例如，与未修饰植物相比转基因植物叶子中的亚硝酸盐含量降低，而转基因植物根部的亚硝酸盐水平不比未修饰植物的更低。

在本发明的实施方案中，将外源基因引入未修饰植物生成第一代转基因植物，即用外源基因直接转化产生的T₀植物。第二代转基因植物(即T₁植物)可通过第一代转基因植物的繁殖产生，例如通过其有性或无性繁殖。优选第二代转基因植物通过第一代转基因植物自交产生，即通过自体受精或自花授粉。以这种方式可能生成对于编码亚硝酸还原酶的外源基因是纯合的第二代转基因植物。预计25％通过第一代转基因植物自交生成的第二代转基因植物就该外源基因而言是纯合的。

本方法优选涉及通过用外源基因独立转化复数个未修饰植物生成复数个转基因植物的方法。换言之，该方法可在多个单独的植物上重复以产生一系列的来源自单个转化事件的转基因植物。来源自这些转基因植物的株系在它们的性质(包括亚硝酸盐含量降低的程度)上存在差异。因此在一些实施方案中，该方法涉及筛选通过该方法产生的转基因植物(第一代、第二代或后续世代植物)和筛选具有所需性质(例如亚硝酸盐含量降低)的植物用于进一步繁殖。

优选通过引入外源基因生成的第一代转基因植物包含外源基因的单一拷贝。该方法优选涉及例如在筛选具有单一拷贝的第一代转基因植物用于繁殖之前检测第一代转基因植物中外源基因的拷贝数，。

在另一实施方案中，该方法进一步包含测定由独立转化事件生成的复数个转基因植物各自的亚硝酸盐含量。可在第一代、第二代或后续世代转基因植物中测定亚硝酸盐含量。该方法优选进一步包含筛选一个或更多个相对于未修饰植物亚硝酸盐含量降低的转基因植物并繁殖该亚硝酸盐含量降低的转基因植物。

附图简述

现参考以下具体的实施方案和图仅以举例方式描述本发明，其中：

图1显示了拟南芥NiR PCR产物的琼脂糖凝胶成像。将PCR产物上样至1％(w/v)琼脂糖/TBE凝胶。扩增子的预测大小为2.1Kbp。λ＝λPst1标记，A＝AtNiR PCR产物。

图2显示了来自pKSAtNiR的SacI消化片段的琼脂糖凝胶成像。将消化物上样至1％(w/v)琼脂糖/TBE凝胶。片段的预测大小为2.1Kbp，2.8Kbpλ＝λPst1标记，P＝pKSAtNiR.

图3显示了来自pBNPAtNiR的XhoI消化片段的琼脂糖凝胶成像。将消化物上样至1％(w/v)琼脂糖/TBE凝胶。片段的预测大小为13.124Kbp、1112bp、178bp，λ＝λPst1标记，B＝pBNPAtNiR。

图4显示了与大肠杆菌pBNPAtNiR相比，AvaI限制性消化根癌农杆菌pBNPAtNiR克隆1和2的琼脂糖凝胶成像，上样至1％(w/v)琼脂糖/TBE凝胶。λ＝λPst1标记，A1＝根癌农杆菌pBNPAtNiR克隆1，A2＝根癌农杆菌pBNPAtNiR克隆2，E＝大肠杆菌pBNPAtNiR。相同的限制图谱表明保留了结构完整性。

图5显示了使用引物对ARA5R和CERV3F从pBNPAtNiR进行的烟草基因组DNA PCR。PCR产物上样至1％(w/v)琼脂糖/TBE凝胶。产物的预测大小为662bp。λ＝Pst1 DNA标记，1-10＝pBNPAtNiR株系1-10，C＝对照野生型DNA，P＝质粒DNA，W＝水。

图6显示了使用引物对PIVR1和CERV3从pBNPLUC进行的烟草基因组DNA PCR。产物的预测大小为703bp。1-11＝pBNPRicNiR株系1-11。

图7显示了用AbAtNiR作为探针的AtNiR植物蛋白印迹分析。M＝

标记，1-11＝分别为AtNiR株系1-11，At＝拟南芥菜叶蛋白。

图8显示了用AbAtNiR作为探针的AtNiR植物蛋白印迹分析。M＝

标记，12-22＝分别为AtNiR株系12-12，At＝拟南芥菜叶蛋白。

图9显示了用AbAtNiR作为探针的来自AtNiR株系9(a)1-12(b)13-24的T1植物的蛋白印迹分析。M＝

标记，T＝烟草WT叶蛋白，At＝拟南芥叶蛋白，1-24＝筛选的个体。

图10显示了开花时的温室烟草植物。图中显示了来自各个株系的两株植物。AtNiR＝pBNPAtNiR株系2和14，LUC＝pBNPLUC＝株系3和11，WT＝野生型。

图11显示了AtNiR、LUC和WT株系之间在荚果充实(pod filling)期a)可溶性蛋白和b)NiR活性的比较。

图12显示了硝酸盐供给试验随机化区组设计的图示。

图13显示了AtNiR和WT株系(上部叶和下部叶)的比较和不同硝酸盐水平时NiR和NR活性之间的关系。使用的单位为nmol亚硝酸盐每mg蛋白每分钟。

图14显示了生长在不同硝酸盐浓度上的WT和转基因AtNiR烟草的源叶和库叶(sink leaf)的比较并分析了a)NiR酶活性b)亚硝酸盐含量。

图15显示了生长在不同硝酸盐浓度上的WT和转基因AtNiR烟草的源叶和库叶的比较并分析了a)NR酶活性b)硝酸盐含量。

图16显示了下列质粒图谱：a)pBNPAtNiR(二元接受载体，包含基因组拟南芥菜亚硝酸还原酶序列(NiR)的pBNPCRVT)；b)pBNPLUC(二元接受载体pBNPCRVT，其包含萤光素酶序列)和c)pBNPCRVT接受载体和用于克隆的限制性位点。

图17显示了拟南芥菜亚硝酸还原酶的cDNA(SEQ ID NO：1，叶绿体靶向序列加下划线)和氨基酸(SEQ ID NO：3)序列。

图18和19显示了拟南芥菜亚硝酸还原酶的基因组DNA序列

图20显示了辣椒亚硝酸还原酶的cDNA(SEQ ID NO：18)和氨基酸(SEQ ID NO：19)序列。

图21显示了稻亚硝酸还原酶的核苷酸(SEQ ID NO：20)和氨基酸(SEQ ID NO：21)序列。

图22显示了菠菜亚硝酸还原酶的核苷酸(SEQ ID NO：22)和氨基酸(SEQ ID NO：23)序列。

图23显示了烟草亚硝酸还原酶1的核苷酸(SEQ ID NO：24)和氨基酸(SEQ ID NO：25)序列。

图24显示了烟草亚硝酸还原酶2的核苷酸(SEQ ID NO：26)和氨基酸(SEQ ID NO：27)序列。

图25显示了烟草亚硝酸还原酶3的核苷酸(SEQ ID NO：28)和氨基酸(SEQ ID NO：29)序列。

图26显示了烟草亚硝酸还原酶4的核苷酸(SEQ ID NO：30)和氨基酸(SEQ ID NO：31)序列。

图27显示了玉米亚硝酸还原酶的核苷酸(SEQ ID NO：32)和氨基酸(SEQ ID NO：33)序列。

发明详述

本发明实施方案涉及用编码亚硝酸还原酶的外源基因转化植物。编码亚硝酸还原酶的植物DNA序列例如可回收自天然宿主细胞或可直接体外合成。从天然宿主提取使得新序列的从头分离成为可能，但是体外DNA合成通常需要预知序列信息。直接体外化学合成可通过连续的人工合成或通过自动化操作完成。DNA序列也可通过复性和连接片断的标准技术或通过本领域的其他已知方法构建。该克隆操作的实例描述于Sambrook等(1989)。

编码亚硝酸还原酶的DNA序列可通过直接克隆植物基因组DNA的片段分离。适当的基因组DNA片段可通过使用限制性核酸内切酶、声裂法、物理剪切或其他本领域已知的方法进行片段化获得。各种植物中的亚硝酸还原酶序列为本领域已知，并且其他基因可通过与已知亚硝酸还原酶的序列或结构同源性鉴定。因此编码亚硝酸还原酶的DNA序列可通过鉴定已知在不同生物体中表达的序列接着从所选生物中分离该同源编码序列获得。编码序列可通过从植物组织分离信使RNA(mRNA或polyA+RNA)或分离蛋白并进行其序列的“回译”获得。用于RNA分离的组织根据以下原则筛选即适当的基因编码序列被认为以对分离最优的水平表达在该组织中。

各种从植物组织中分离mRNA的方法为本领域技术人员熟知，包括例如使用固定化在惰性基质上的寡-dT寡核苷酸。所分离的mRNA可用于通过采用逆转录酶(RT)或其他具有逆转录活性的酶产生其互补DNA序列(cDNA)。从cDNAs库中分离单个的cDNA序列可通过克隆至细菌或病毒载体中或通过应用使用经选择的寡聚核苷酸引物的聚合酶链式反应(PCR)达成。从mRNA产生和分离特异cDNA可通过在已知为RT-PCT的过程中组合逆转录和PCR步骤达成。

许多方法可通过富集或筛选方法用于提高分离所需序列的效率，这些方法包括分离和比较多于一种来源的mRNA(或所得单链或双链cDNA)以鉴定主要在所选组织中表达的那些序列。许多不同的筛选、杂交或克隆方法为本领域技术人员已知，包括cDNA-AFLP、级联杂交和用于选择性克隆或差异克隆的市售试剂盒。

鉴定为亚硝酸还原酶的克隆区段例如可通过评价功能性进行验证，例如通过将所克隆区段与启动子序列连接并将嵌合构建体引入可评价亚硝酸还原酶活性的宿主细胞或无细胞体系。

所选cDNA可接着用于评价其来源基因的基因组特征，其方式为在植物基因组DNA的DNA印迹法中用作杂交探针揭示就该序列而言基因组的复杂性。或者，来自cDNA的序列信息可用于设计寡核苷酸并且将这些以相同的方式用作杂交探针；用于产生杂交探针的PCR引物或用于用于直接基因组分析的PCR引物。

相似地，所选cDNA可用于评价其来源基因的表达概况，其方式为在从各种植物组织或从发育或时间序列提取的RNA的RNA印迹法中用作杂交探针。来自cDNA的序列信息可再次用于设计可用做杂交探针的寡核苷酸、用于产生杂交探针或直接用于RT-PCR。这些所选cDNA或衍生的寡核苷酸可接着用作杂交探针探测克隆基因组DNA片段文库并鉴定重叠DNA序列。

在本发明的实施方案中，该外源基因可与引导亚硝酸还原酶在转基因植物中表达的启动子偶联。术语“启动子”可用于指位于基因编码序列上游(即5′端)由RNA聚合酶识别并结合以起始转录的DNA序列区。

一般而言植物组织中存在四种类型的启动子：组成型、组织特异型、发育调控型和诱导/阻遏型，尽管应理解的是这些类型不一定相互排斥。

组成型启动子在植物发育过程中持续引导植物各部分的基因表达，尽管该基因不以相同的水平表达于所有的细胞类型中。已知的组成型启动子的实例包括与花椰菜花叶病毒35S转录物(Odell等，1985)、稻肌动蛋白1基因(Zhang等，1991)和玉米泛素1基因(Cornejo等，1993)相关的那些。组成型启动子例如香石竹蚀环病毒(CERV)启动子(Hull等，1986)为本发明尤其优选。

组织特异型启动子为引导基因在植物的一个(或一些)部分中表达的启动子，通常在那些植物部分的整个生命中发挥作用。组织特异型启动子通常也包括特异性并不绝对的启动子，即它们也可以低水平引导在优选组织之外的组织中的表达。本领域已知的组织特异型启动子的实例包括与马铃薯块茎中表达的patain基因和小麦、大麦或玉米胚乳中表达的高分子量麦谷蛋白基因相关的那些。

发育调控型启动子引导基因在植物发育特定时间在植物的一个或更多个部分的表达变化。该基因可在其他时间以不同水平(通常更低)在那一植物部分表达并且也可表达于其他植物部分中。

诱导型启动子可引导基因响应诱导物的表达。当不存在诱导物时该基因不表达。诱导物可直接作用于启动子序列或通过抵消阻遏物分子的作用发挥功能。诱导物可为化学物质例如代谢物、蛋白质、生长调节剂或毒性元素，生理应激例如热、创伤或渗透压或病原体或害虫作用的间接后果。发育调控型启动子可描述为在植物生命循环特定的点响应植物产生的内源诱导物或环境刺激的特异型诱导型启动子。已知的诱导型启动子的实例包括如Warner等(1993)所述的与创伤反应相关、Benfey&Chua(1989)公开的与温度反应相关和Gatz(1995)描述的化学诱导的那些。

在本发明的某些实施方案中，编码亚硝酸还原酶的嵌合基因可转化至植物细胞中，引起该亚硝酸还原酶在启动子引导下的受控表达。该启动子可获自不同来源包括动物、植物、真菌、细菌和病毒，并且不同的启动子可在不同组织中以不同效率工作。启动子也可合成地构建。

在本发明的实施方案中，使用与编码亚硝酸还原酶的内源基因具有有限程度的序列同源性或序列同一性的编码亚硝酸还原酶的外源基因。与公开序列例如SEQ ID NO：1具有所需程度的序列同一性的序列也定义于本文。同源性可根据两个DNA(或多肽)序列之间的同一性百分比测定。一般而言，将待比较的两个序列进行比对得到这些序列之间的最大相关性。检测这两个序列之间的比对，测定两个序列之间具有精确核苷酸(或氨基酸)对应的位点数量，除以该比对的总长度并乘以100得到同一性百分比数值。这一同一性百分比数值可在待比较序列的全长上测定，这尤其适用于具有相同或非常相似长度并高度同源的序列，或者在更短的限定长度上测定，这更适用于长度不等或具有较低水平同源性的序列。举例而言，与本文定义的核苷酸或氨基酸序列的序列同一性程度可在至少15、至少30、至少50、至少100、至少200、至少500或至少1000个残基上测定。

比较两个或更多序列之间的同一性的方法为本领域熟知。因此例如Wisconsin Sequence Analysis Package，版本9.1(Devereux J.等，1984)(可获自Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin，USA)中可用的程序，例如程序BESTFIT和GAP可用于测定两个多聚核苷酸之间的同一性百分比和两个多肽序列之间的同一性百分比。BESTFIT采用Smith和Waterman(1981)的“局部同源性”算法并且寻找两个序列之间的最佳单个相似区域。BESTFIT更适用于比较长度不类似的两个多聚核苷酸或两个多肽序列，该程序假定较短的序列表示较长序列的一部分。相反，GAP根据Needleman和Wunsch(1970)的算法比对两个序列寻找“最大相似性”。GAP更适用于比较大约具有相同长度的序列并且预期在完整长度上进行比对。分别地，优选各程序中使用的参数“空位权重”和“长度权重”对于多聚核苷酸序列为50和3，对于多肽序列为12和4。优选当两个被比较的序列最优比对时测定同一性和相似性百分比。

用于测定序列之间的同一性和/或相似性的其他程序为本领域已知，例如BLAST程序家族(Karlin&Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci USA 87：2264-2268，如Karlin&Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：5873-5877中所修改，可获自美国生物技术信息中心(NCBI)，Bethesda，Maryland，USA并可从NCBI的主页www.ncbi.nlm.nih.gov进入)。这些程序例证了用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性实例。这样的算法包含于Altschul等，1997 JMol.Biol.215：403-410的NBLAST和XBLAST程序。可用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。可使用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索以获得与本发明蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可采用如Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402中描述的空位BLAST(Gapped BLAST)。或者，可采用PSI-Blast进行检测分子之间远源关系的叠代搜索(上文)。当应用BLAST、空位BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比较的数学算法的另一优优选非限制性实例为Myers和Miller，1988.CABIOS4：11-17的算法。该算法包含于ALIGN程序(版本2.0)中，其为GCG序列比对软件包的一部分。

本领域已知的用于测定序列之间同一性和/或相似性的程序的另一非限制性实例为FASTA(Pearson W.R.和Lipman D.J.，Proc.Nat.Acac.Sci.，USA，85：2444-2448，1988，为Wisconsin Sequence AnalysisPackage的一部分)。优选在多肽序列比较中(包括比较之前核苷酸序列首先被翻译至氨基酸序列时)使用BLOSUM62氨基酸替换矩阵(Henikoff S.和Henikoff J.G.，Proc.Nat.Acad.Sci.，USA，89：10915-10919，1992)。

两个序列之间的同一性百分比可使用与上文所述的那些相似的技术测定，可设置或不设置空位。在计算同一性百分比时通常计算精确匹配。

优选使用BESTFIT程序测定查询多聚核苷酸或多肽序列与本发明多聚核苷酸或多肽序列的同一性百分比，查询序列和参比序列进行最优比对并且程序的参数设定为默认值。

如本文所使用，术语“同系物”指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有某些同源性的实体。本文中，术语“同源性”可与“同一性”等同。尽管同源性也可理解为相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，在本发明上下文中优选以序列同一性表达同源性。

如本文所使用术语“核苷酸序列”与“核酸序列”同义并指寡核苷酸序列或多聚核苷酸序列及其变异体、同系物、片段和衍生物(例如其部分)。该核苷酸序列可为基因组的或合成的或重组来源，其可为双链或单链不论其表示正义链或反义链。与本发明相关的术语“核苷酸序列”或“核酸”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。

由于遗传密码的简并性，可容易地产生这样的核苷酸序列：对于原始核苷酸序列编码的一些或所有氨基酸而言改变其中的三联密码子使用并藉此产生与原始核苷酸序列具有低同源性但是编码与原始核苷酸序列编码的氨基酸序列相同或变异的氨基酸序列的核苷酸序列。举例而言，对于绝大多数氨基酸而言遗传密码的简并性在三联密码子的第三位(摇摆位)(参见Stryer，Lubert，Biochemistry，第三版，Freeman Press，ISBN 0-7167-1920-7)，因此所有的三联密码子在第三位“摇摆”的核苷酸序列与原始核苷酸序列约66％一致，然而经修改的核苷酸序列将编码与原始核苷酸序列相同或变异的一级氨基酸序列。

因此，本发明进一步涉及对于至少一个氨基酸编码三联密码子具有替代的三联密码子使用但是编码与原始核苷酸序列编码的多肽序列相同或变异的多肽序列的任何核苷酸序列。

而且，特定生物体通常对哪些三联密码子用于编码氨基酸具有偏好。偏好的密码子使用表可广泛获得并可用于制备密码子优化基因。该密码子优化技术常规用于优化异源宿主中的转基因表达。

通常编码如本发明所使用的亚硝酸还原酶的核苷酸序列为采用重组DNA技术制备。然而，在本发明的可选择实施方案中，该核苷酸序列可采用本领域已知的化学方法完全或部分合成(参见CaruthersMH等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等(1980)NucAcids Res Symp Ser 225-232)。

编码已知亚硝酸还原酶的序列可例如经修饰以提供用于本发明的备选外源基因。例如，可使用合成寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸包含侧接所需突变位点的核苷酸序列。

一种适当的方法描述于Morinaga等(Biotechnology(1984)2，第646-649页)。向核苷酸序列中引入突变的另一方法描述于Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，第147-151页)。

替代定位突变，例如上文描述的，可使用市售试剂盒例如Stratagene的GeneMorph PCR突变试剂盒或Clontech的Diversify PCR随机突变试剂盒随机引入突变。EP 0 583 265提到了优化以PCR为基础的突变的方法，其也可与突变DNA类似物的用途(例如EP 0 866796中描述的那些)组合。

获得新序列的第三种方法为通过使用任何数量的限制性酶或者使用一种酶例如Dnase I将不一致的核苷酸序列片段化，并重新组装编码功能蛋白质的全核苷酸序列。或者可使用一个或多个不一致核苷酸序列并在全核苷酸序列的重新组装中引入突变。进行“重排”的适当方法可见EP0 752 008、EP1 138 763、EP1 103 606。重排也可与如US6,180,406和WO 01/34835中描述的其他形式DNA突变组合。

因此，可体内或体外在核苷酸序列中产生多个定点或随机突变，并接着通过各种方法筛选所编码亚硝酸还原酶提高的功能性。例如采用在计算机芯片上(in silico)和exo mediated的重组方法(见WO00/58517、US 6,344,328、US 6,361,974)在所产生变异体保留与已知蛋白质非常低的同源性时进行分子进化。藉此获得的该类变异体可与已知蛋白质具有显著的结构相似性但是具有非常低的氨基酸序列同源性。

此外，多聚核苷酸序列的突变或天然变异体可与野生型或其他突变或天然变异体重组产生新的变异体。也可筛选该类新变异体所编码多肽提高的功能性。

通过适当的植物转化载体可将外源基因引入本发明植物中。植物转化载体可包含表达盒，其在5′-3′转录方向包含启动子序列、亚硝酸还原酶编码序列和任选3′非翻译的、包括用于RNA聚合酶的终止信号和用于多聚腺苷化酶(polyadenylase)的多聚腺苷酸化信号的终止子序列。启动子序列可以单个或更多个拷贝存在，并且这些拷贝可相同或为如上文所述的启动子序列的变异体。终止子序列可获自植物、细菌或病毒基因。适当的终止子序列为例如豌豆rbcS E9终止子序列、来源自根癌农杆菌胭脂碱合酶的nos终止子序列和花椰菜花叶病毒的35S终止子序列。本领域技术人员熟知其他适当的终止子序列。

该表达盒也可包含基因表达增强机制以增加启动子的强度。该类增强子元件的实例为来源自豌豆质体蓝素基因启动子一部分的元件并且为国际专利申请号WO 97/20056的主题。这些调控区可来源自与启动子DNA序列相同的基因或来源自不同的基因，来自烟草或其他生物体，例如来自茄科或来自Cestroideae亚科的植物。所有调控区应可在待转化组织的细胞中操作。

启动子DNA序列可来源自与用于本发明的亚硝酸还原酶编码序列相同的基因或来源自不同的基因，来自烟草或其他生物体，例如来自茄科或来自Cestroideae亚科的植物。当提及“嵌合基因”时，意指该编码亚硝酸还原酶的核酸序列来源自与引导其表达的启动子序列不同的来源(例如来自不同的基因或来自不同的物种)。

该表达盒可整合于基础植物转化载体中，例如pBIN 19 Plus、pBI101或本领域已知的其他适当的植物转化载体。除了表达盒，植物转化载体还包含对于转化过程必须的序列。这些可包括农杆菌vir基因，一个或更多个T-DNA边界序列和选择性标记或其他用于鉴定转基因植物细胞的工具。

术语“植物转化载体”指可体内或体外表达的构建体。优选该表达载体整合于生物体的基因组中。术语“被整合”优选涵盖稳定整合于基因组中。

转化植物的技术为本领域熟知并且包括例如农杆菌介导的转化。构建遗传修饰植物的基本原理为在植物基因组中插入遗传信息以获得所插入遗传材料的稳定维持。一般技术的综述见Potrykus(Annu RevPlant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文章。

通常在农杆菌介导的转化中将携带目标外源DNA即嵌合基因的二元载体通过共培养农杆菌和来自目标植物的外植体从适当的农杆菌株转移至目标植物。接着使转化的植物组织在筛选培养基上再生，该筛选培养基包含筛选标记和植物生长激素。另一选择为花浸蘸法(Clough&Bent，1998)，通过该方法使完整植物的花芽与包含嵌合基因的农杆菌株混悬液接触，在结实之后，被转化的个体发芽并通过在筛选培养基上的生长进行鉴定。用农杆菌直接感染植物是一种被广泛应用的简单技术，其描述于Butcher D.N.等，(1980)，Tissue CultureMethods for Plant Pathologists，D.S.Ingrams和J.P.Helgeson编辑，203-208。

其他适当的转化方法包括采用例如聚乙二醇或电穿孔技术、粒子轰击、显微注射和使用碳化硅纤维直接将基因转移至原生质体。

采用冲击(ballistic)转化进行植物转化，包括碳化硅晶须技术，教授于Frame BR，Drayton PR，Bagnaall SV，Lewnau CJ，BullockWP，Wilson HM，Dunwell JM，Thompson JA&Wang K(1994)中。通过碳化硅晶须介导的转化产生可育的转基因玉米植物教授于The PlantJournal 6：941-948)，病毒转化技术教授于例如Meyer P，Heidmann I&Niedenhof I(1992)。使用木薯花叶病毒作为用于植物的载体系统教授于Gene 110：213-217。关于植物转化的其他教导见EP-A-0449375。

另一方面，本发明涉及携带编码亚硝酸还原酶的核苷酸序列的载体系统以及将其引入生物体例如植物的基因组中。该载体系统可包含一种载体，但它也可包含两种载体。在两种载体的情况下，该载体系统通常称作二元载体系统。二元载体系统进一步详细描述于GynheungAn等，(1980)，Binary Vectors，Plant Molecular Biology Manual A3，1-19。

一种普遍采用的植物细胞转化系统使用来自根癌农杆菌的Ti质粒或来自发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的Ri质粒An等，(1986)，Plant Physiol.81，301-305和Butcher D.N.等，(1980)，TissueCulture Methods for Plant Pathologists，D.S.Ingrams和J.P.Helgeson编辑，203-208。在本发明所需外源基因的各种引入植物的方法后存在和/或插入其他DNA序列可能是必要的。例如，如果使用Ti-或Ri-质粒转化植物细胞，则可连接至少Ti-和Ri-质粒T-DNA的右边界，且通常可连接右边界和左边界，作为引入基因的侧翼区。对T-DNA在植物细胞转化中的用途已进行了大量研究并描述于EP-A-120516；Hoekema，The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，第五章；Fraley，等，Crit.Rev.Plant Sci，4：1-46；和An等，EMBO J.(1985)4：277-284。

用编码亚硝酸还原酶的外源基因转化的植物细胞根据熟知的组织培养方法使其生长和维持，例如通过在适当的添加了必要生长因子例如氨基酸、植物激素、维生素等的培养基中培养细胞。

与本发明相关的术语“转基因植物”包括包含编码本发明亚硝酸还原酶的外源基因的任何植物。优选该外源基因整合入该植物的基因组中。

术语“转基因植物”和“嵌合基因”不包括受控于也存在于其天然环境中的它们的天然启动子的它们天然环境中的天然核苷酸编码序列。

一方面，本发明的核酸序列、嵌合基因、植物转化载体或植物细胞为分离形式。术语“分离的”指该序列至少基本不含与该序列在天然状态下或在天然状态中发现时相关的至少一种其他成分。

一方面，本发明的核酸序列、嵌合基因、植物转化载体或植物细胞为经纯化的形式。术语“纯化的”指一种相对纯状态-例如至少约90％纯，或至少约95％纯或至少约98％纯。

用本发明外源基因转化的植物包括与园艺工业、花卉工业、林业和/或农业相关的那些。该植物可为生长用于提供切花目的的植物。该植物可为番茄、黄瓜、碧冬茄属(Petunia)、石竹属(Dianthus)、云杉属(Picea)、松属(Pinus)、桉属(Eucalyptus)、杨属(Populus)，双子叶物种例如马铃薯、烟草、棉花、莴苣、茄子、甜瓜、南瓜、豌豆、油菜、大豆、甜菜或向日葵，或单子叶物种例如小麦、大麦、黑麦、稻或玉米。更优选该植物为茄科。更优选该植物为Cestroideae亚科。更优选该植物为番茄、马铃薯、茄子、碧冬茄属或烟草的一种或更多种。更优选该植物为烟草属。最优选该植物为烟草。编码亚硝酸还原酶的适当外源基因也可获自这些物种。

本发明也包括与本文所讨论的序列互补的核苷酸序列或任何衍生物、片段或其衍生物的用途。如果该序列与其片段互补那么该序列可用作鉴定其他生物体中相似编码序列的探针等等。

如本文所使用，术语“变异体”指非内源遗传密码表达的蛋白，当与成熟蛋白质序列内天然或野生型序列比较时引起一个或更多个氨基酸改变(即氨基酸缺失、添加或替换)。

实施例

现参考以下实施例仅以举例方式描述本发明。

收获的叶材料中残留的硝酸盐/亚硝酸盐可导致有害化合物例如N-亚硝胺的形成。这些与数种人类癌症例如消化道癌、肝癌、肺癌和肾癌相关(Ellis等，1998)。主要的亚硝基化剂为亚硝酸盐(Morikawa等，2004)。在以下实施例中，本发明人预通过控制NiR的活性影响细胞中亚硝酸盐的累积。特别是本文证明了在一个实施方案中可通过增加烟草中叶绿体亚硝酸还原酶的活性降低叶子的亚硝酸盐含量。

选择适当的候选基因整合入烟草植物的基因组中。该基因需要与适当的启动子/调控序列偶联，这取决于该基因在转基因植物中所需的表达位点和时间。为了影响硝酸盐/亚硝酸盐的积累候选基因应为初级氮同化基因例如NiR。为了降低叶中的残留硝酸盐，该基因的过表达提供增强的能力同化细胞中的硝酸盐和亚硝酸盐。

如上文所述，植物中硝酸盐还原酶的过表达导致亚硝酸盐水平有害性积累。本发明发明人假设NiR过表达为防止硝酸盐供给过多的有害效应的更适当的备选方法，因为氨的任何潜在积累将比亚硝酸盐的积累更容易被耐受。

引入包含与内源序列同源的序列的转基因可引起共抑制(Crété和Vaucheret，1999)。因此在以下优选的实施方案中，引入在核苷酸水平与烟草的内源亚硝酸还原酶不相同或相似的转基因。在本研究中，分离NiR(拟南芥菜)基因并在香石竹蚀环病毒组成型启动子(CERV(Hull等，1986))的控制下引入烟草植物中。对所得转基因植物进行详细的生理学、生物化学和分子学分析。

在植物遗传修饰中，通常在根癌农杆菌的辅助下将完整的DNA分子整合入细胞的核基因组。这些细胞再生形成愈伤组织，加入植物激素后可通过已确立的组织培养操作(Hansen等，1994)使愈伤组织产生可育的成熟植物。农杆菌介导的转化可以整合转移DNA(或T-DNA)的大片段至基因组并引起最小的重排。它通常转移插入基因的一至五个拷贝并具有高转化效率(Hansen和Wright，1999)。

可阻止整合转基因表达的植物防御系统内操作的机制包括DNA甲基化和RNA干扰(RNAi)。由于这些基因沉默机制，在以下实施例中鉴定在烟草中过表达而没有被沉默的候选NiR基因。在这一实施例中，鉴定与内源烟草NiRs具有最小同源性的NiR基因。

NiR基因的数量随植物物种变化：拟南芥菜、稻、辣椒和菠菜具有一个，玉米中有两个，而烟草比较独特具有四个。这归因于烟草基因组的四倍体特性，它从两个烟草祖先种林生烟草和茸毛烟草融合演化而来。在茸毛烟草中发现了NiR1和NiR2基因的同系物，在林生烟草中发现了NiR3和NiR4的同系物(Kronenberger等，1993)。

GenBank中有烟草、拟南芥菜、菠菜、稻和辣椒的全长NiRcDNA序列。仅有玉米的部分cDNA序列。八个NiR蛋白质序列均具有相似的ORF长度、分子量和等电点，但是pH7时的电荷具有显著差异。这些序列包括将NiR蛋白靶向叶绿体或质体的转运肽。在转移至叶绿体后，转运肽裂解。使用基于网站http:/www.cbs.dtu.dk/services/TargetP的服务器预测各序列的转运肽长度。结果显示于表1。

名称	种	SEQ IDNO.s(核苷酸、氨基酸)	登录号	长度(bp)	ORF长度a.a.	Mr	等电点
								AtNiR	拟南芥菜	1，3	AK221199	1761	587	65.61	5.96
CapNiR	辣椒	18，19	AF065616	1767	589	66.1	6.89
								RicNiR	稻	20，21	D50556	1791	597	66.25	6.89
SpinNiR	菠菜	22，23	X07568	1785	595	66.5	6.53
								TobNiR1	烟草	24，25	X66145	1752	584	65.2	5.89
TobNiR2	烟草	26，27	AB103507	1764	588	65.9	6.95
								TobNiR3	烟草	28，29	AB093533	1764	588	65.7	6.12
TobNiR4	烟草	30，31	AB093534	1755	585	65.57	6.71
								ZeaNiR	玉米	32，33	M23456	1704	568	63.24	6.04

表1：Genbank中不同NiR cDNAs的详述和登录号。使用载体NTI软件计算分子量(Mr)、等电点和pH7时的电荷。

名称	蛋白长度	cTP值	mTP值	其他	预测目标序列长度	预测位置
							AtNiR	586	0.793	0.232	0.053	25	叶绿体
CapNiR	588	0.773	0.312	0.079	49	叶绿体
							RicNiR	596	0.913	0.444	0.018	28	叶绿体
SpinNiR	594	0.961	0.098	0.041	32	叶绿体
							TobNiR1	583	0.696	0.458	0.056	47	叶绿体
TobNiR2	587	0.734	0.330	0.047	51	叶绿体
							TobNiR3	587	0.779	0.209	0.091	51	叶绿体

名称	蛋白长度	cTP值	mTP值	其他	预测目标序列长度	预测位置
							TobNiR4	584	0.633	0.380	0.048	48	叶绿体
ZeaNiR	567	0.189	0.469	0.41	102	线粒体

表2：NiR蛋白预测靶序列长度的详述。cTP和mTP值分别用于靶向叶绿体和线粒体的蛋白，该值越接近1，预测越可信。使用http:/www.cbs.dtu.dk/services/Target P的TarpetP分析肽。

采用EMBL Clustawl程序将NiR蛋白序列与烟草NiR1序列比对。拟南芥菜NiR基因与烟草NiR 1具有最小的双子叶多肽序列相似性(70％同源性)，使其成为在烟草中过表达的良好候选。

实施例中使用的一般方法

以下方法用于后续的具体实施例中。技术人员将理解本文描述的许多方法可直接或经过略微修改应用于备选实施方案中。例如，尽管对于用拟南芥菜亚硝酸还原酶修饰烟草在下文中描述了用于DNA操作、植物转化和硝酸盐/亚硝酸盐水平测定的方法，但是相似的方法可用于用备选亚硝酸还原酶基因转化其他植物类型。

植物材料

这一研究中使用的烟草植物为烟草品种K326，其为常见的、商业种植的烤烟品种。

这一研究中使用的拟南芥植物为拟南芥菜品种Columbia。

植物生长条件

拟南芥

将拟南芥菜种子表面播撒在繁殖盘中的Levingtons F1堆肥上。植物在24小时光照下和24℃生长，手工浇水。

烟草

在普通温室条件(平均22℃和16小时光照)下将烟草种子表面播撒繁殖盘中的Levingtons F1堆肥上。盖上繁殖盘的盖子，一旦种子发芽即逐渐除去。当幼苗具有两片真正的叶子时将它们移植到含盆栽用堆肥(Levingtons M2)的6英寸盆中。

转化体

通过种植于含有繁殖混合堆肥(Levingtons F1)的小格中使组织培养植物适应温室环境。一周后，将植物转移至含盆栽堆肥(LevingtonsM2)的6英寸盆中，该堆肥含有4g/l包含微量元素和常量元素的

(Scotts Professional Ltd，Bramford，Suffolk，UK)缓释肥料。通过自动控制的通心管滴灌给植物浇水。在这些条件下烟草植物经过10周开花。温室的平均温度为22℃，16小时日照。

硝酸盐供给试验

为了控制烟草植物接受的硝酸盐的量，向植物供给包含硝酸钾作为唯一氮(N)源的受控营养液，如表3所示。

化学物质	终浓度
		硼酸硫酸铜硫酸铁硫酸镁氯化锰三氧化钼硫酸锌氯化钙磷酸钾pH7硝酸钾	1mM0.15μM5μM1mM0.5μM50nM0.35μM1mM0.5mM10，5或1mM

表3：在供给试验中使用的经改变的Hoaglands溶液(Matt等，2001)的配方。该培养基用0.2M碳酸钠溶液缓冲。

如上所述使烟草种子发芽。当幼苗具有2片真正的叶子时将它们移植至含盆栽堆肥(Levingtons M2)的1英寸单元(modules)中并使其继续生长2周。将幼苗移植至含1cm粘土卵石(Hydro-Leka ClayPebbles；Gro Well Hydroponics，Warwick，UK)并竖立在直径25cm垫盘上的盆中。用所需Hoaglands溶液(10、5或1mM硝酸盐，见表3)将垫盘填充至边缘并每日补满。

DNA提取和纯化

从植物提取基因组DNA

可应用各种方法从植物组织中提取基因组DNA

1.QIAgen植物DNA提取法

使用QIAgen DNeasy植物DNA提取试剂盒(#69106)(QIAgenLtd.，Crawley，UK)根据使用说明从叶样品提取基因组DNA。这一方法可提供适用于基因分离和克隆策略的大量非常纯净的DNA。该试剂盒的原理利用在高盐条件下DNA特异吸收于基于硅胶的膜而污染物例如蛋白质、碳水化合物、多酚类和其他植物代谢产物被洗去。

2.手工DNA提取

应用第二种更快速DNA提取法用于转基因植物群的PCR筛选。该方法以比方法1低得多的浓度提供高质量DNA(Edwards等，1991)。

将由0.2M Tris-HCl(pH 8)、0.25M NaCl、25mM EDTA、0.1％SDS、40μg/ml RNAse组成的提取缓冲液的400μl等分试样加入100mg植物材料中。用微型杵在微量离心管中研磨。将溶液涡旋并在台式微量离心机中13,000rpm离心10分钟。将350μl澄清上清转移至新的离心管中并加入350μl氯仿∶异戊醇(24∶1)。将样品颠倒5次并于室温下放置10分钟，接着13,000rpm离心10分钟。将300μl水相转移至新的微量离心管中并加入300μl异丙醇。将试管颠倒5次并于室温下放置10分钟，接着13,000rpm离心10分钟沉淀DNA。倾去上清，使DNA沉淀晾干。最后加入50μl无菌蒸馏水(SDW)，使DNA于4℃溶解。

3.快速碱处理植物材料

快速碱处理用于制备用于PCR分析的植物材料(Klimyk等，1993)。将0.5cm叶尖置于96孔PCR板上。加入40μl 0.25M NaOH并在PCR仪上100℃“煮沸”2分钟裂解植物细胞。接着将PCR板于冰上冷却5分钟。加入60μl 0.25M HCl/0.5M Tris中和溶液并短暂涡旋，然后3,000rpm离心5分钟。将50μl该溶液转移至干净的PCR板并4℃保存。

从大肠杆菌提取DNA(碱性裂解法)

使用经修改的Sambrook等，(1989)方法提取转化质粒DNA。除溶液II外所有溶液高压灭菌。使3ml过夜培养物于37℃生长并将1.5ml在微量离心管中通过在13,000rpm离心2分钟沉淀。排去上清，加入100μl溶液I(50mM葡萄糖、25mM Tris/HCl pH 8、10mM EDTA)，通过涡旋使细胞重悬。用200μl溶液II(0.2M NaOH、1％SDS)裂解细胞并将试管颠倒3次。最后加入150μl溶液III(60ml 5M醋酸钾、11.5ml醋酸、28.5ml SDW)沉淀蛋白和染色体DNA。将试管颠倒3次，于室温下放置1分钟后13,000rpm离心2分钟。将上清转移至新的微量离心管中。加入1ml 100％乙醇沉淀DNA，将样品-20℃放置至少15分钟。通过13,000rpm离心10分钟收集DNA，用70％乙醇洗涤并在干燥器中干燥。通过加入50μl T.E.溶液(10mM Tris/HCl pH 8、1mM EDTA)和10μg/ml RNase溶液使DNA重悬。这一方案通常获得约0.5μg-1μg/μl质粒DNA。

从农杆菌提取DNA(经修改的Mo-Bio方法)

为了从已转化的根癌农杆菌中提取质粒DNA，将4ml根癌农杆菌培养物置于微量离心管中并在台式微量离心机中13,000rpm离心1分钟。使用Mo-Bio DNA提取试剂盒(#UC-12300-250 Cambio Ltd.，DryDrayton，Cambridge，UK)，其应用与碱性裂解DNA提取操作相同的原理但是遵循更严格的清洁过程。这涉及在高盐条件下DNA与硅膜的结合以及洗去杂质例如消化的RNA和其他细胞组分。接着用SDW从膜上洗脱DNA。因为该试剂盒主要是设计用于从大肠杆菌提取DNA，因此需要略微改动使用说明(所有的溶液均由Mo-Bio试剂盒提供)。将已沉淀的细胞重悬于100μl溶液I中，加入200μl溶液II，将试管颠倒三次。加入650μl溶液III，颠倒三次并将溶液13,000rpm离心6分钟以沉淀碎片。将上清上样至旋转过滤柱(由试剂盒提供)并6,000rpm离心30秒。弃去收集管中的液体，加入300μl溶液IV并6,000rpm离心30秒。弃去收集管中的液体。向旋转过滤器中加入100μl SDW并在6,000rpm离心30秒之前放置1分钟。用10μl 5M NaCl和200μl乙醇沉淀洗脱液，在冰上放置15分钟。13,000rpm离心10分钟沉淀DNA并接着用100μl 70％乙醇洗涤，接着短暂旋转2分钟。将沉淀晾干并接着重悬于10μl SDW中用于限制酶切消化分析。

DNA沉淀

用l/10体积的5M NaCl和2体积的乙醇于-20℃沉淀质粒DNA至少15分钟。将溶液在台式离心机中13,000rpm离心10分钟。倾去上清并加入100μl 70％乙醇。将溶液继续离心5分钟。倾去上清并将样品在台式干燥器中干燥5分钟。将DNA沉淀重悬于SDW至所需应用需要的体积。

DNA定量和分析

DNA定量

通过紫外分光光度法估算DNA浓度。DNA在260nm处具有紫外线的最大吸收峰。通过取5μl DNA样品和495μl SDW将DNA样品稀释。在光程长度为1cm的石英比色管中以SDW做空白在260nm和280nm处测量吸光度(A)。260nm处的一个吸光度单位等同50μg/mlDNA。使用下式计算DNA浓度

(A₂₆₀样品-A₂₆₀空白)x50x100＝μg/ml DNA

其中50是双链DNA系数，100是稀释倍数。

为了计算DNA样品的纯度，也测量280nm处的吸光度。蛋白质和其他污染物吸收280nm处的光。因此，260∶280比值表示纯度，1.8-2.0的值表明蛋白质或酚的污染很少或没有。

琼脂糖凝胶电泳

在包含0.01μg/ml溴化乙锭的1xTBE(Tris-borate：90mM Tris，90mM硼酸，2mM EDTA)中制备琼脂糖凝胶(1％)。将DNA样品与1/6th上样缓冲液(60％蔗糖，5％蛋黄(Egg Yellow))混合。将λDNA标记梯度(5μl)与DNA样品一起上样至凝胶并通过在1xTBE缓冲液中于120伏特电泳1.5小时进行分离。在紫外透照仪(UVP BiolmagingSystems，UVP Inc.，Cambridge，UK)上观察凝胶并照相。

λDNA标记

为了提供电泳分离的DNA大小的可视引导，用50单位的限制性内切酶PstI(Promega Biosciences Inc.，Southampton，UK)在包含2.5μlBSA(10mg/ml)、25μl PstI缓冲液(Promega)并加入SDW至250μl的反应液中消化60μgλDNA(Promega Biosciences Inc.，Southampton，UK)。将消化物于37℃温育12小时，通过加入5μl 0.5M EDTA终止反应。接着加入50μl 6x Blue上样缓冲液(60％蔗糖、100mM TrispH8、0.25％溴酚蓝)。提供5μl制备的标记，约1μgDNA梯度。

从琼脂糖凝胶分离

为了分离并纯化DNA片段，首先将它们在琼脂糖凝胶上电泳分离。在低能量紫外透照仪上观察凝胶并切出所需的DNA片段置于微量离心管中。根据使用说明使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAgenLtd，Crawley，UK)。该原理涉及在高盐存在下DNA吸收至硅膜。任何污染物均被洗去并通过柱子。

将三体积的GQ缓冲液加入一体积的凝胶中并于50℃将该混合物温育10分钟，每2-3分钟搅拌直至凝胶切片完全溶解。混合物的颜色应仍然为黄色，表明该混合物处于DNA吸附至QIAquick膜的最佳pH。

将一凝胶体积的异丙醇加入各样品中。将样品加入柱子中并13,000rpm离心1分钟。在加入0.5ml QG缓冲液之前弃去流出液以去除所有微量的琼脂糖。通过加入0.75ml缓冲液PE洗涤柱子并离心1分钟。在进一步离心柱子前弃去流出液。接着通过加入100μl洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.5)至柱子中心洗脱DNA，放置1分钟后13,000rpm离心1分钟。

如前所述沉淀DNA(100μl)并在SDW中重悬至用于各具体应用所需的体积。

DNA操作

限制性酶切消化

限制性核酸内切酶购自Promega(Promega Biosciences Inc.，Southampton，UK)或New England Biolabs(New England Biolabs(UK)Ltd，Hitchin，Herts，UK)。

所有的限制酶切消化通常使用1μgDNA进行。用10个单位的核酸内切酶在30μl反应液中将其消化，该反应液包括3μl适当的10x缓冲液。反应于37℃温育2小时，除非另外指明。

碱性磷酸酶处理用于克隆的质粒

为了防止具有相容核酸内切酶位点的消化的质粒再连接，通过磷酸酶消化去除5′端磷酸基团。该操作使用虾碱性磷酸酶(PromegaBiosciences Inc.，Southampton，UK)进行。将由2μl 10x虾碱性磷酸酶缓冲液、1μl虾碱性磷酸酶和2μg剪切DNA组成的20μl反应液于37℃温育30分钟。通过将酶65℃加热20分钟失活终止反应。无需进一步纯化可将DNA用于连接。

DNA片段的连接

使用0.1μg剪切载体(例如pSK或pBNP)和0.5μg插入物(例如经消化的拟南芥菜亚硝酸还原酶扩增DNA)进行连接反应。在连接反应中使用由0.1μg载体DNA、0.5μg插入物DNA、1μl T4DNA连接酶(Promega Biosciences Inc.，Southampton，UK)和2μl 10x T4连接酶缓冲液(Promega)的20μl连接反应液。作为阴性对照，在连接反应中仅使用载体。

将连接混合物在室温下温育2小时。用3μlSDW稀释2μl反应液并加至40μl电感受态细胞用于转化大肠杆菌。

TOPO TA克

对于新PCR扩增子的分析，将扩增子克隆至适当的载体。TOPOTA是用于直接插入Taq聚合酶扩增的PCR产物的一步克隆策略。它应用Taq聚合酶的末端转移酶活性将脱氧腺苷(A)添加至PCR产物的3′端。提供具有单个胸苷(T)悬突的线性化载体(

4-

Invitrogen Life Technologies，Paisley，UK)，其与拓扑异构酶一起使得PCR插入物与载体连接。该反应使用1μl新鲜PCR产物，将其加入1μl

载体、1μl盐溶液(与

TA克隆试剂盒一起提供；Invitrogen Life Technologies，Paisley，UK)和加SDW至6μl的混合物中。如生产商(Invitrogen Life Technologies，Paisley，UK)所述，在转化至One

TOP10感受态细胞之前将该反应在室温下温育5分钟。

DNA测序

将10μl纯化的质粒DNA(100ng/μl)送至LARK Technologies Inc.，Saffron Walden，Essex，UK测序所有的质粒克隆验证PCR扩增子或转基因的存在。通用引物(M13F、M13R、T3和T7)由Lark提供，但是序列特异引物与DNA((10μl 30μM溶液)一起递送。返回序列色谱图并输入Vector NTI Advance^TM软件组(Invitrogen Corporation，Bioinformatics，UK)用于通过与数据库序列比对进行分析或进行BLAST分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。

细菌操作

细菌

对于所有克隆实验使用大肠杆菌Novablue(

MerckBiosciences Ltd，Nottingham，UK)。

对于向烟草中的转化实验使用根癌农杆菌LBA4404。

用于转化的电感受态细菌的产生

所有的培养基、生长烧瓶和离心管在使用前高压灭菌。将单个细菌菌落接种至5ml丰富生长培养基2YT(2x酵母和胰蛋白胨；10g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L NaCl)中过夜培养。培养物在37℃(大肠杆菌)或28℃(根癌农杆菌)生长。在细菌菌株要求的温度下将500ml 2YT加热一个半小时，用过夜培养物接种预热的培养基并使其生长至OD₆₀₀为0.4-0.6。接着将培养物于冰上冷却30分钟。在超速离心机中4℃4,000rpm离心15分钟收获细胞。用250ml的10％冰冷甘油洗涤细胞，离心并重复洗涤。收获细胞并重悬于2ml冰冷甘油、酵母和胰蛋白胨培养基(GYT；10％甘油，0.125％酵母提取物，0.25％胰蛋白胨)中。将90μl等分试样迅速冷冻于液氮中并-80℃保存直至使用。

电穿孔和转化DNA至大肠杆菌

将40μl电感受态细胞和5-100ng DNA混合并置于预冷却的电穿孔杯(EQUIBIO，Geneflow Ltd，Staffordshire，UK)中，于1.5伏特、800欧姆和25μFD(BioRad Gene Pulser，BioRad Laboratories，UK)进行电穿孔。向杯中加入1ml 2YT培养基并将混合物倾倒至30ml的通用容器中并在振荡培养箱中37℃温育1小时。接着将10μl细胞接种至氨苄西林(100μg/ml)Luria-Bertani(LB)琼脂板(1.5g琼脂/100ml，4粒circle grow细菌生长培养基(BIO 101 Inc.，California，USA)/100ml)或卡那霉素(50μg/ml)LB琼脂板。将板子37℃温育过夜。作为对照，将等同的等分试样涂布于不合氨苄西林的LB板上。

已转化大肠杆菌的蓝白筛选

当使用pBluescript克隆载体(pSK；

UK)时，多克隆位点位于编码报告蛋白β-半乳糖苷酶的细菌lacZ基因中。β-半乳糖苷酶裂解无色底物X-GAL(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷)生成半乳糖和蓝色的不溶性产物，其可作为标记。lacZ基因的上游为诱导型启动子，其在加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖糖苷(IPTG)时诱导lacZ的转录。因此，如果克隆成功，lacZ基因被破坏并且不会合成β-半乳糖苷酶报告蛋白并且不会形成蓝色。

将已转化细胞接种至AXI琼脂板(1.5g琼脂/100ml、4粒circlegrow/100ml、氨苄西林100μg/ml、IPTG 0.1mM、XGal 0.004％)。37℃温育过夜后白色菌落的存在表明插入物成功连接至pSK。任何蓝色菌落表明pSK载体重新连接并且不包含插入物。

电穿孔和转化DNA至农杆菌

将40μl根癌农杆菌电感受态细胞和0.5μg质粒DNA混合，置于预冷却的杯中，于1.5伏特、600欧姆和25μFD进行电穿孔。向杯中加入1ml 2YT培养基并将混合物倾倒至30ml的通用容器中并在振荡培养箱中28℃温育2小时。接着将100μl细胞接种至卡那霉素(50μg/ml)和链霉素(100μg/ml)LB琼脂板。将板子于28℃温育两天。

用于DNA提取的已转化大肠杆菌培养物的生长

使用无菌的木质牙签从板子挑取菌落并置于含有适当抗生素的3ml 2YT培养基中。接着将培养物在振荡培养箱中于37℃生长过夜。

用于DNA提取的已转化农杆菌培养物的生长

使用木质牙签从板子挑取菌落并置于含有卡那霉素(50μg/ml)和链霉素(100μg/ml)抗生素的5ml 2YT培养基中。接着将培养物在振荡培养箱中于28℃生长2天。

转基因烟草的生成

采用无菌技术在无菌超净台(sterile flow cabinet)中进行所有操作。

从7-8周龄的烟草植物切取两片最嫩的叶片在8％Domestos中灭菌10分钟并用SDW洗涤4次。沿着较小的叶脉(而不是主脉)切取直径为1cm的圆叶片并在约25ml的根癌农杆菌培养物(A₆₀₀0.6-0.8)中浸渍过夜。将溶液漩涡混合约2分钟。接着将圆叶片印迹到滤纸上。以每板10个圆叶片置于添加了2.2μM 6-苄基氨基嘌呤(BAP)(一种细胞因子生长调节剂)和0.27μM 1-萘乙酸(NAA)(一种植物生长素生长调节剂)的Murashige和Skoog培养基(Duchefa Biochemie BV，Holland)上。也放置未浸渍圆叶片的对照圆叶片。用粘着膜将板子密封并置于具有人工光照的22℃生长室中。两天后将圆叶片转移至包含抗生素头孢噻肟(500μg/ml)和卡那霉素(100μg/ml)的板子上(每板5圆片)。也放置仅包含头孢噻肟的对照板。每14天将圆叶片转移至新鲜的培养基中。约8-10周后可检测到愈伤组织和苗。当苗足够大时如前转移至添加了2.2μM BAP和头孢噻肟以及卡那霉素的Linsmaier和Skoog培养基(LS)中(从每个圆叶片只取一根苗)。两周后将苗置于具有相同培养基但不含卡那霉素的瓶中。两周后将优势苗转移至含有含头孢噻肟(250μg/ml)的LS培养基的新瓶中。又两周后将苗转移至仅含LS培养基的瓶中。当苗产生根时将它们种植于温室中(见上文)。

通过聚合酶链式反应(PCR)进行DNA扩增

从细菌培养物扩增DNA

为了快速筛选细菌菌落中转基因的存在，通过PCR直接扩增菌落。使用无菌牙签接触细菌菌落的中心。将牙签置于包含50μl 2YT培养基和抗生素筛选的U形底盖着的96孔板(

Corning Inc.，NY，USA)的孔中。对待筛选的各菌落进行该操作。将板子在振荡培养箱中37℃温育2小时。

产生用于多个待筛选菌落的PCR master mix。各反应的终体积为10μl并由1μl Taq缓冲液(

Epsom，Surrey，UK)、1μl 2mMdNTP溶液、0.1μl正向引物(100pmol/μl)、0.1μl反向引物(100pmol/μl)、0.3μl Taq聚合酶(5U/μl；

)和7.5μl SDW组成。吸取10μlPCR反应混合物至短裙边PCR微量滴定板

的各孔中。采用96孔复制器(replicator)

转移不多于0.5μl培养物至PCR板中。建立包含PCR空白(无DNA)和阳性对照的对照孔。PCR条件取决于所采用的模板和引物，但是按照常规如下：95℃4分钟，35个循环的95℃30秒，55℃复性30秒并72℃模板延伸1分钟，结束于72℃4分钟的′精制′步骤。

完成的反应液上样至琼脂糖凝胶用于电泳。

扩增DNA用于克隆

传统的Taq DNA聚合酶每500个碱基会产生一个错误，因此用于克隆目的，应用提高PCR扩增可信度和效率并降低错配的PCR附加物。将Taq Extender^TM PCR附加物(Stratagene，UK)加入25μl PCR扩增反应液中。这通常由50ng模板、2.5μl Taq extender缓冲液、2.5μl2mM dNTP溶液、0.25μl正向引物(100pmol/μl)、0.25μl反向引物、加SDW至25μl组成。

扩增条件为用于菌落PCR(见2.9.1)的扩增条件。将5μl已完成的反应液上样至琼脂糖凝胶用于电泳分析

扩增DNA用于筛选转基因烟草

当产生了转基因植物群，如前文所述提取基因组DNA。通过PCR使用描述用于菌落PCR的相同方法分析转基因的存在，但是使用植物基因组DNA作为模板。产生用于多个待筛选植物的PCR master mix。各反应的终体积为10μl并由1μl Taq缓冲液(

Epsom，Surrey，UK)、1μl 2mM dNTP溶液、0.1μl正向引物(100pmol/μl)、0.1μl反向引物(100pmol/μl)、0.3μl Taq聚合酶(5U/μl；

)和6.5μlSDW组成。

吸取9μlPCR反应混合物和1μl基因组DNA至PCR板建立包含PCR空白(无DNA)和阳性对照的对照孔。PCR条件取决于所采用的模板和引物，但是按照常规如下：95℃4分钟，35个循环的95℃30秒，55℃复性30秒并72℃模板延伸1分钟，结束于72℃4分钟的′精制′步骤。

将PCR产物上样至琼脂糖凝胶用于电泳

实时PCR分析拷贝数

采用BIO-RAD I-cycler^TM实时检测系统(Bio-Rad Laboratories，UK)进行实时PCR试验。SYBR Green荧光DNA结合染料(Green Supermix，Bio-Rad Laboratories，UK)用于检测扩增子。随着扩增DNA量的增加，它达到显著高于背景的荧光水平，这一点被称作阈值循环(Ct)。Ct与反应液中目标DNA的量具有线性关系。待测样品中目标DNA的量可通过比较样品阈值循环和由参比标准(BIORAD技术说明2697)的阈值循环获得的标准曲线计算。应用两种方法估算转基因的拷贝数。

绝对定量

绝对定量方法基于使用定量量的DNA并将PCR信号与标准曲线相关以推断拷贝数(BIO-RAD技术说明2697)。也可应用为已知转基因株系但拷贝数未知的虚拟校准品用以和其他转基因株系比较。这假设至少一个株系包含一个拷贝。

通过37℃温育至少2小时用Ssp1核酸内切酶(1μg基因组DNA、5μl Ssp1缓冲液(Promega)、10单位Ssp1核酸内切酶(Promega)、加SDW至50μl)消化基因组DNA。将酶于70℃失活10分钟。使用一个转基因株系(虚拟校准品)的质粒DNA(pBNPAtNiR)和基因组DNA的系列稀释生成标准曲线用以比较标准曲线效率。在PCR反应中使用引物对At1300F和At1440R(0.25pM正向引物、0.25pM反向引物、12.5μl SYBR-green mix(Bio-Rad laboratories，UK)、1μl稀释的DNA、加SDW至25μl)。PCR反应条件为：95℃3分钟1个循环，接着45个循环的95℃30秒，55℃30秒。通过间隔30秒的80个循环的以0.5℃递增将温度从55℃上升至95℃生成熔解曲线。所有反应进行4个重复并通过I-cycler iQ^TM软件(Bio-Rad laboratories，UK)收集数据。对于各转基因样品，分析250ng基因组DNA并与标准曲线比较。这一操作假设转基因植物之一仅包含该转基因的一个拷贝并且最高Ct值是具有最低拷贝数的株系。比较Ct值，1Ct的差异表示目标DNA的两倍差异。不包含DNA的对照和非转基因基因组DNA也包括在内。

比较Ct法

这一方法使得可以通过比较转基因和内源基因的Ct值分析未知量的DNA(German等，2003，Weng等，2004)。每基因组的内源基因(或参比基因)拷贝数保持恒定，而转基因(或目标基因)的拷贝数可变化，因此目标基因与参比基因的比值表明该转基因的拷贝数。为了使Ct计算有效，必须考虑目标扩增效率和参比扩增效率，因此需生成目标基因和参比基因二者的标准曲线。所使用的参比基因为硝酸还原酶(NR)并使用引物对NIAF和NIAR，目标基因为AtNiR并使用引物对At1300F和At1440R。提取基因组DNA但是不定量并使用两组引物加入相同体积的DNA扩增各样品。PCR反应(0.25pM正向引物、0.25pM反向引物、12.5μl SYBR-green mix(Bio-Rad laboratories，UK)、1μlDNA、加SDW至25μl)为95℃3分钟1个循环，接着45个循环的95℃30秒和55℃30秒。通过间隔30秒的80个循环的以0.5℃递增将温度从55℃上升至95℃生成熔解曲线。该熔解曲线用于鉴定生成了正确的扩增子。Weng等，(2004)的等式用于计算拷贝数。

[(Ct_tar-I_tar)/S_tar]-[(Ct_ref-I_ref)/S_ref]

X₀/R₀＝2

其中：

Ct_tar或Ct_ref＝目标基因和参比基因的Ct值

I_tar或I_ref＝相对标准曲线的截距

S_tar或S_ref＝相对标准曲线的斜率

2是标准曲线的稀释倍数

引物设计

根据它们被要求的应用差别地设计引物。通过Invitrogen CustomPrimers(Invitrogen^TM，Paisley，UK)合成所有引物。采用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)根据用于非特异性引物位点的公用序列检查所有引物的序列。

克隆引物

手动设计克隆引物，其方式为截取待克隆DNA片段5′和3′端约20bp的序列并在末端加入需要的核酸内切酶位点和3个额外的碱基对以确保有效的消化。接着在VectorNTI软件程序(InvitrogenCorporation，Bioinformatics，UK)上分析引物的双链和发夹形成以及熔解温度以验证它们适合用于克隆(见表4)。

引物名称	5′至3′的引物序列	引物描述
			ARFULLF(SEQ ID NO：4)	ATCGAGCTCGGATCCATGACTTCTTTCTCTCTCAG	用于拟南芥菜NiR具有BamHI和SacI位点的5′克隆引物
ARFULLR(SEQ ID NO：5)	GATGAGCTCGGATCCTACCTCAATCTTCATTCTC	用于拟南芥菜NiR具有KpnI和SacI位点的3′克隆引物

表4.经合成并应用于克隆拟南芥菜NiR克隆的引物描述

PCR和测序引物

采用VectorNTI软件程序(Invitrogen Corporation，Bioinformatics，UK)设计引物，用于PCR生成长度为400和800bp之间的产物用于快速扩增和通过琼脂糖凝胶电泳验证。

引物名称	5′至3′的引物序列	引物描述
			ARA3F(SEQ ID NO：6)	TTTATCACCGCTAATTCA	在1292bp处与拟南芥菜NiR的正链复性
ARA3R(SEQ ID NO：7)	TTAGGATAGATGGTTCA	在1726bp处(全长序列)与拟南芥菜NiR的互补链复性
			ARA5F(SEQ ID NO：8)	CTCTTTATCTTTAGTACA	在515bp处(全长序列)与拟南芥菜NiR的正链复性
ARA5R(SEQ ID NO：9)	AGAGAGGAGGAACAGACA	在389bp处与拟南芥菜NiR的互补链复性
			CERV3F(SEQ ID NO：10)	TGTTAAGGCATCGAAAAA	在CERV启动子正链的-70bp处复性
LUC3OUT(SEQ ID NO：11)	GGATTACGTCGCCAGT	在LUC正链的1502bp处复性
			LUC5OUT(SEQ ID NO：12)	TCTTCCAGCGGATAGA	在LUC互补链的46bp处复性
PIVR1(SEQ ID NO：13)	GATCAGCTGCACATCAACAAATTTTGGTCA	在互补链上LUC内含子的3′复性

表5：经合成并应用于筛选转基因植物群的引物描述

实时PCR引物

使用基于网站的软件Mfold(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold)设计引物。扩增子的所需大小小于150bp使得可以快速扩增和分析并且复性温度为55℃。

引物名称	5′至3′的引物序列	引物描述
			AT1300F(SEQ ID NO：14)	TGCTGATGACGTTCTTCC	拟南芥菜NiR的正向实时引物

引物名称	5′至3′的引物序列	引物描述
			AT1440R(SEQ ID NO：15)	TGCAAGAAGCATGTAC	拟南芥菜NiR的反向实时引物
NIAF(SEQ ID NO：16)	GGTCTTTCAAGCCTCGGTCTG	烟草NR的正向实时引物
			NIAR(SEQ ID NO：17)	GGAAGGGAATTCGTTAACCAA	烟草NR的反向实时引物

表6：用于实时PCR试验的引物描述

蛋白质分析

可溶性蛋白测量

根据Bradford(1976)测量蛋白质浓度。根据待进行的分析类型提取植物材料。在96孔微量滴定板中用200μl制备的Bradford′s试剂(用SDW1∶4稀释；Bio-Rad laboratories，Munich，Germany)稀释各提取物(1μl至5μl)。在微量滴定板分光光度计(MicroTeK，KontronInstruments，USA)中于595nm一式三份测量各样品。牛血清白蛋白(BSA)用于生成标准曲线。在读取595nm处的吸光度之前充分混合样品并放置10分钟。然后从BSA校正曲线计算各样品的蛋白质浓度。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

用Overcoat缓冲液(100mM Tris pH 7.5、10mM KCl₂、5mMMgCl₂、0.4M蔗糖、10％甘油、10mM β-巯基乙醇)从植物材料提取用于SDS-PAGE分析的蛋白质。用100μl Overcoat缓冲液在微量离心管中用微型杵研磨约100mg叶材料。将提取物保存于冰上并13,000rpm离心5分钟，转移上清用于分析。等分10μg蛋白并加入NuPAGE样品缓冲液(Invitrogen^TM，Paisley，UK)。所有样品均于70℃加热10分钟变性。

如Laemmli(1970)所述采用NuPAGE迷你凝胶系统(Invitrogen^TM，Paisley，UK)进行变性SDS-PAGE凝胶电泳。将蛋白质样品上样至预制的4-12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶(Invitrogen^TM，Paisley，UK)上并在1xMOPS电泳缓冲液(20x储备液；1M 3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPs)、1M Tris Base、2％SDS、20.5mM EDTA-加SDW至500ml)中电泳。使用5μl SeeBlue标记(Invitrogen^TM，Paisley，UK)或8μl Westerntransfers用于测定分子质量。将0.5ml NuPAGE抗氧化剂(Invitrogen^TM，Paisley，UK)加入上层槽中进行凝胶电泳并于200伏特电泳1小时。凝胶用考马斯蓝(25ml水/甲醇/醋酸60∶30∶10中10mg Brilliant BlueR-250)染色使蛋白质可视化或用于蛋白质印迹转移中(见下文)。

蛋白印迹转移

用SureLock^TM mini-cell(Invitrogen^TM，Paisley，UK)和转移缓冲液(50ml 20x NuPage转移缓冲液、850ml SDW、100ml甲醇、1ml抗氧化剂)将蛋白质印迹至硝酸纤维素膜上(0.45μm孔径，Invitrogen^TM，Paisley，UK)。硝酸纤维素膜、滤纸和垫片均在1x转移缓冲液中预浸湿。将SDS-PAGE凝胶置于硝酸纤维素膜上(确保膜和凝胶之间没有明显的气泡)，接着在凝胶/膜组合的两边均放置滤纸。将两个印迹垫置于阴极芯中并将凝胶三明治置于顶部这样凝胶距离阴极芯最近。预浸湿的印迹膜置于顶部并且闭合阴极芯。接着向阴极槽装入转移缓冲液。外缓冲液槽装入SDW并于30伏进行western 1.5小时。

将硝酸纤维素膜置于封闭溶液(Tris缓冲盐水(TBS)Tween；20mM Tris pH 7.6、0.8％NaCl、含5％奶粉的0.1％Tween20)中以封闭非特异位点。将其轻微搅拌温育至少2小时或过夜。

使用针对NiR蛋白(Covalab Ltd.，Cambridge，UK)区域设计的合成肽(16-聚体)在兔子中产生用于检测烟草亚硝酸还原酶(TobNiR)和拟南芥菜NiR(AtNiR)多肽的特异抗体。这些一抗制备(1∶1000稀释)于TBS-Tween(见上文)中。将膜加入抗体溶液中并于室温振摇至少1小时。去除一抗并用TBS-Tween(约50ml)洗涤膜，短暂洗涤三次后进行三次15分钟的洗涤。在TBS-Tween中以1∶4000稀释度加入二抗(抗-兔、马辣根过氧化物酶连接的抗原；Amersham Biosciences，Bucks，UK)并振摇温育2小时。如上所述洗涤膜。

使用ECL检测试剂(Amersham Biosciences，Bucks，UK)检测抗体结合。将等量的ECL检测试剂1和2加在一起，置于膜上并室温下温育直至5分钟。从膜上排干过量的试剂并用粘着膜将膜覆盖。接着暴露于胶片(Kodak BioMax Film，Anachem，Luton，UK)。通常5分钟暴露后显示条带。

报告基因测定法

B-葡萄糖醛酸苷酶染色

为了鉴定报告基因β-葡萄糖醛酸苷酶(GUS)在特定植物细胞类型中的存在，加入底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-GLUC)，其被GUS还原时产生局部蓝色产物。

将植物材料浸渍和温育在GUS染色缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液pH 7、0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾、1mM X-GLUC、0.1％Triton X-100)中并37℃温育过夜。去除溶液并将材料在70％乙醇中于37℃温育去除任何叶绿素。这需要进行2天，每5小时重复更换70％乙醇，尤其是在组织非常绿的情况下。当去除了所有的叶绿素，可容易见到蓝色的GUS染色。

定量萤光素酶测定法

萤光素酶是一种具有多用途的和常用的报告基因。来自萤火虫(Photinus pyralis)的蛋白在ATP、镁和氧的存在下催化萤光素的生物发光氧化，并且释放的光子可在光度计(Lumistar Galaxy，BMGLabtechnologies，Offenbery，Germany)中测量。通过在200μl冷的萤光素酶研磨缓冲液(LGB；1mM DTT、100mM磷酸钾缓冲液pH 7)中研磨约100mg叶材料测量萤光素酶活性。将样品保存于冰上。在4℃下在台式微量离心机中10,000rpm离心样品5分钟。将上清转移至新的1.5ml微量离心管或96孔板中并将50μl样品置于白色96孔板中，一式三份。注入50μl Bright-Glo检测试剂(Promega Biosciences Inc.，Southampton，UK)并通过光度计计算各样品在光度计上的相对光单位(RLU)。

酶活性测定法

亚硝酸还原酶活性测定法

将约1g组织在5ml冰冷提取缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5、100μM PMSF、1mM EDTA、10mM巯基乙醇)中研磨，4℃8,000rpm离心15分钟。移除上清用于分析并保持于冰上。将90μl粗酶溶液加入390μl温的测定溶液中(50mM Tris-HCl pH 7.5、1mM亚硝酸钠、1mM甲基紫精，30℃)。通过加入120μl连二亚硫酸钠溶液(25mg/ml连二亚硫酸钠的290mM碳酸氢钠溶液)起始反应。

立即取样0点样品(T0)，该过程由移除10μl反应液，将其加入240μl水中和充分混合终止反应组成。主体反应液在30℃温育5-15分钟，视反应速度而定。5或15分钟后移除10μl反应混合物，将其加入240μl水中并充分混合终止反应。将50μl各终止反应液置于96孔板中(一式三份)并加入50μl 1％(w/v)磺胺的3N HCl溶液和50μl0.02％(w/v)N-萘基乙二胺二盐酸盐(N-NED)，放置15分钟使显示任何颜色。在540nm处读取吸光度。从T0值减去T5(或T15)值测量亚硝酸盐浓度随时间的变化。亚硝酸钾可用于生成标准曲线。

硝酸还原酶活性测定法

硝酸还原酶(NR，EC 1.6.6.1)催化硝酸盐2电子还原至亚硝酸盐。该酶的测定法为基于吸光度的测定法，测量检测混合物中亚硝酸盐离子随时间的增加(Ferrario-Méry等，1998)。NR具有不同的活化状态，磷酸化(非活性)和非磷酸化(活性)状态，所使用的测定法用于测定最大NR活性，即该酶的非磷酸化形式。

使用与亚硝酸还原酶测定法相同的提取物。将400μl粗酶溶液加入600μl测定溶液中(50mM Tris-HCl pH 7.5、30mM硝酸钾、0.15mM NADH、20μM FAD、0.1mM EDTA、0.1mM DTT)。立即取样0点样品(T0)，该过程由移除50μl反应液和加入50μl1％(w/v)磺胺的3N HCl溶液和50μl 0.02％(w/v)N-NED组成。主体反应液在30℃温育60分钟，1小时后移除50μl反应液并将其加入50μl 1％(w/v)磺胺的3N HCl溶液和50μl 0.02％(w/v)N-NED中。显色15分钟并于540nm读取吸光度。从T60值减去T0值测量亚硝酸盐浓度随时间的变化。亚硝酸钾用于生成标准曲线。

谷氨酸脱氢酶测定-胺化活性

谷氨酸脱氢酶(GDH，EC 1.4.1.3)胺化作用通过同化2-酮戊二酸催化氨转化成谷氨酸。该酶测定法测量340nm处NADH的吸光度，其由于GDH-胺化活性引起NADH氧化而降低(Turano等，1996)。

使用与亚硝酸还原酶测定法相同的提取物。

将50μl粗酶溶液加入200μl检测溶液(50mM Tris-HCl pH 7.5、0.2mM NADH、0.2M氯化铵、1mM氯化钙)中。反应液在30℃温育并在340nm每20秒读取动态吸光度，持续5分钟(或直至背景读数稳定)。加入10μl底物(10mM 2-酮戊二酸)起始反应并监测340nm处的吸光度。计算A₃₄₀随时间降低的速率并除以NADH的消光系数(6.22)作为活性的量度。

谷氨酸脱氢酶测定-脱氨活性

谷氨酸脱氢酶(GDH，EC 1.4.1.3)脱氨作用催化谷氨酸转化成氨和2-酮戊二酸。该酶测定法测量340nm处NADH的吸光度，其由于GDH的脱氨活性引起NAD被还原而增加(Turao等，1996)。

使用与亚硝酸还原酶测定法相同的提取物。将50μl粗酶溶液加入200μl检测溶液(50mM Tris-HCl pH 9、0.25mM NAD、1mM氯化钙)中。反应液在30℃温育并在340nm每20秒读取动态吸光度，持续5分钟(或直至背景读数稳定)。加入10μl底物(1M谷氨酸钠盐)起始反应并监测340nm处的吸光度。计算A340随时间的增加速率并除以NADH的消光系数(6.22)作为GDH脱氨活性的量度。

测定硝酸盐和亚硝酸盐含量

测定植物组织中的硝酸盐含量

为了测定植物组织中的硝酸盐含量，在高酸度条件下用植物提取物中的硝酸盐硝化水杨酸。形成的复合物在410nm有最大吸收。形成的生色团为5-硝基水杨酸。这一方法非常灵敏并且不受氯化物、亚硝酸盐或铵离子的干扰(Cataldo等，1975)。

在1.5ml微量离心管中用微型杵研磨约100mg组织。加入300μl提取缓冲液(50mM磷酸缓冲液pH7.5)并将匀浆在微量离心管中4℃13,000rpm离心15分钟。转移上清至新的1.5ml微量离心管中用于分析。将10μl上清和40μl检测溶液(5％水杨酸的硫酸溶液)混合并使反应在室温下进行20分钟。缓慢加入950μl 2N氢氧化钠升高pH至12以上。冷却样品至室温并在分光光度计中测定410nm的吸光度。也测量10μl等分试样中1-60μg硝酸盐标准品用于生成校正曲线。制备由提取物、40μl硫酸(无水杨酸)和950μl 2N氢氧化钠组成的对照提取物以考虑任何色素沉着作用。

测定植物组织中的亚硝酸盐含量

可从NR测定法或NiR测定法测定植物组织中的亚硝酸盐含量，因为两种测定法均测量0点提取物中亚硝酸盐的量。从各测定法生成的亚硝酸盐校正曲线计算这一数值，从总量减去空白测定溶液的亚硝酸盐含量得到亚硝酸盐含量

叶绿素测量

应用两种方法测量叶组织的叶绿素含量。起初提取方案是唯一可用的方法，但是后来可以购买手提式检测仪。

叶绿素提取和定量

叶绿素不溶于水。在光谱的红光区进行叶绿素测定因为辅助色素(类胡萝卜素)在蓝光区有强烈吸收。在黑暗处进行提取是非常重要的因为叶绿素是光不稳定的，因此所有的提取物在任何时候都必须包裹在锡纸中保存。

在液氮中研磨约100mg组织，接着加入500μl提取溶液(80％丙酮)并将该溶液涡旋30秒。将该溶液4℃、2,000rpm离心5分钟。保存澄清的绿色上清并包裹在锡纸中。用另一体积的提取溶液再提取沉淀并加入原始提取的上清中。测量652nm处的吸光度。

总叶绿素＝27.8x A₆₅₂μg/ml

其中27.8为叶绿素a和b的消光系数(Hipkins和Baker，1986)。

2.14.2原位叶绿色含量

手提式CCM-200叶绿素含量检测仪(Opti-Sciences，Inc.，Hudson，NH，USA)为电池驱动并经设计用于快速、非破坏性地测定完整叶样品中的叶绿素含量。CCM-200利用吸光度估算叶组织中的叶绿素含量。使用两个波长，一个波长在叶绿素吸收范围内而另一个用于补偿机械差异例如组织厚度。该检测仪测量两个波长并计算与样品中叶绿素的量成比例的CCI(叶绿素含量指数)。CCI为相对叶绿素值。不计算每单位面积中的绝对叶绿素含量。

氨基酸分析

采用EZ：faast^TM试剂盒(Macclesfield，Cheshire，UK)提取和衍生化叶样品中的游离氨基酸，接着通过液相色谱-质谱(LC/MS：Perkin Elmer Series 200，Applied Biosystems，Warrington，Cheshire，UK)进行定量。该操作由下列组成：固相提取样品；将20μl各样品提取物和100μl内标缓慢吸入与氨基酸结合而使干扰化合物流过的吸附剂填充尖头。弃去流出液，将200μl洗涤溶液(N-丙醇)缓慢通过吸附剂尖头并弃去。每天从EZ：faast^TM试剂盒(氢氧化钠和N-丙醇)提供的试剂制备新鲜的洗脱介质并将200μl缓慢地部分通过尖头接着与吸附剂颗粒一起注入玻璃管形瓶中。使用玻璃吸管向各样品中加入50μl体积的氯仿并通过涡旋10秒钟使衍生化氨基酸移动至有机相将溶液乳化。在第二次再乳化之前将反应物放置1分钟。用玻璃吸管向溶液中加入100μl异辛烷并重复涡旋。在用巴斯德吸管去除部分有机相(约50μl)之前将样品放置1分钟，转移至自动采样器管形瓶中并在温和的氮气流中干燥。将样品重新溶解于100μl HPLC流动相组分(10mM甲酸铵水溶液：10mM甲酸铵的甲醇溶液1∶2，v/v)中。将自动采样器转移至安装了EZ：faast AAA-MS HPLC柱的LC/MS。EZ：faast^TM试剂盒提供了氨基酸标准品，在跑样之前进行10、50和100μl氨基酸标准品跑过柱子的校准操作。

统计学分析

采用Microsoft Excel(2002)软件计算所有的平均值。为了计算各样品组的标准误差，用标准偏差除以所研究样品数量(n)的平方根。

实施例1

拟南芥亚硝酸还原酶(AtNiR)构建体的生成和转化烟草植物

在这一实施例中，分离基因组AtNiR基因，克隆至转化构建体中并插入烟草植物中。接着表征转基因种群并分析转基因的表达和NiR活性。

分离拟南芥菜NiR并克隆至pBluescript

拟南芥NiR的全长基因组基因座长度为4380bp(数据库登录号D14824，见图18&19)。在以下实施方案中，分离包含编码序列和内含子(全长基因座中存在的3′和5′非翻译区除外)的基因组克隆。基因组克隆的长度为2115bp并包含3个内含子和4个外显子。外显子跨越基因组克隆的核苷酸1-376、573-928、1010-1298、1376-2115bp或全长基因座的核苷酸1248-1623、1820-2175、2257-2545和2623-3362。cDNA序列(登录号BAA03561)长度为1761bp(见图17)。

为了分离拟南芥NiR，从种子生长拟南芥菜品种Columbia植物，取样3周大植物的莲座叶并使用Quiagen DNA Easy小量制备提取试剂盒提取DNA。在通过PCR分离基因组拟南芥菜NiR(AtNiR)之前定量DNA并在琼脂糖凝胶上检测。

针对拟南芥菜NiR基因的5′和3′端设计基因组拟南芥菜NiR序列的引物(分别为引物ARFULLF和ARFULLR-见上文)。在这些末端添加附加的核酸内切酶位点用于克隆目的，在5′端添加SacI和BamHI限制性位点并且在3′端添加KpnI和SacI位点。通过PCR采用TAQextender校正读码酶(Stratagene)扩增基因组拟南芥菜NiR基因，见图1。

用核酸内切酶SacI消化已扩增的DNA并连接至克隆载体pBluescript(pSK，Stratagene)。该载体也用SacI消化并用磷酸酶处理防止再连接。已连接片断经电穿孔至电感受态大肠杆菌细胞。通过蓝白筛选方法(见上文)筛选已转化的大肠杆菌菌落。将所筛选克隆过夜培养并分离DNA，用限制性核酸内切酶消化并通过凝胶电泳分离以验证拟南芥菜NiR基因(AtNiR)的存在，见图2。接着将所选质粒递交Lark Technologies进行测序用于验证。将收到的来自Lark的序列数据与GenBank核苷酸序列比对并且显示没有错误。

pBNPAtNiR二元载体构建

为了整合转基因盒至植物细胞需要适当的植物转化载体。本研究中使用被称作pBINPLUS(pBNP)(Engelen等，1995)的经修饰pBIN19载体。将组成型香石竹蚀环病毒(CERV：Hull等，1986)启动子和胭脂碱合酶(NOS)终止子序列克隆至pBNP产生接受载体pBNPCRVT，其可用于接受分离的NiR基因和报告基因LUC(见图16)。pSKAtNiR和接受载体pBNPCRVT二者用核酸内切酶BamHI和KpnI消化以分离AtNiR片段和载体pBNPCRVT。所需片段在琼脂糖凝胶上分离、连接并转化至电感受态大肠杆菌细胞。用BamHI和KpnI或BamHI和SacI核酸内切酶位点将分离的NiR序列定向克隆至pBNPCRVT。将萤光素酶(Promega Life Sciences，UK)连接至BamHI和KpnI位点。

提取已转化菌落的DNA，用核酸内切酶消化并在琼脂糖凝胶上电泳以验证片段正确连接，称作pBNPAtNiR，见图3.

转化pBNPAtNiR至根癌农杆菌

为了达到有效基因转移至烟草中，质粒pBNPAtNiR经电穿孔至电感受态根癌农杆菌(LBA 4404)。有必要检查该二元质粒在电穿孔后包含于农杆菌中并且在植物转化起始前仍是完整的。因此从已转化的根癌农杆菌中提取DNA并用AvaI消化以检查二元载体的存在。

如图4所示，根癌农杆菌包含完整的pBNPAtNiR质粒，因为从大肠杆菌和根癌农杆菌消化物生成的片段大小(4.47Kbp、3.61Kbp、3.12Kbp、1.11Kbp、912bp和178bp)相同。

Datta等(1999)的研究显示NiR活性随着玉米中不断增加的硝酸盐水平而增加，并且对桦树和烟草的启动子研究均鉴定出硝酸盐响应元件(Dorbe等，1998，Warning等，2000)，因此为了刺激NiR表达，将一半的稻植物置于高硝酸盐供给(Phostrogen)上。

作为对照质粒，将萤火虫LUC(Promega)克隆至pBNPCRVT二元载体以产生二元质粒pBNPLUC。这也转化至根癌农杆菌用于植物转化。

用pBNPAtNiR和pBNPLUC转化烟草

为了生成转基因种群，用pBNPAtNiR和pBNPLUC转化烟草品种K326植物。

筛选转基因烟草种群

设计引物用于验证转基因种群。正向引物CERV3F与启动子的3′端杂交而反向引物ARA5R和PIVR1分别与AtNiR和LUC序列的反义链杂交。从未转化植物提取的基因组DNA没有回收到扩增子。PCR筛选显示于图5和6，其涉及用pBNPAtNiR和pBNPLUC转化的植物种群使得AtNiR 662bp和LUC 703bp产物的扩增成为可能。pBNPAtNiR和pBNPRicNiR二者的转化效率大于90％。

使植物脱离组织培养基并接着生长于温室中。

NiR蛋白在转基因种群中的表达

通过获取开花前期(8周龄)具有高水平NiR活性的植物叶9取样pBNPAtNiR和pBNPLUC的转基因植物群。制备叶材料用于蛋白印迹分析并采用Bradfords方法定量总可溶蛋白，使用各植物的10μg总叶蛋白。各种群的叶蛋白提取物用特异于AtNiR的抗体检测以测定转基因的表达。蛋白印迹结果明确显示22个pBNPAtNiR转基因植物中有12个表达系(见图7和8)。将拟南芥菜叶蛋白用作对照。丢弃不显示表达的AtNiR T₀株系。生化分析AtNiR植物的NiR活性并发现与对照相比NiR活性增加。

初级pBNPAtNiR转化子中的拷贝数量

分析初级转化子的拷贝数量。从愈伤组织生成的初级转化子独立于转基因植物，但是由于转基因的体细胞克隆变异、位置和拷贝数效果，它们可显示不同的表型。因此，优选产生纯合T₁转基因植物用于本发明。

采用Biorad I-cycler qPCR仪器(实时PCR)和上文描述的绝对比较DNA法进行拷贝数量分析。制备并定量各初级转基因AtNiR系的基因组DNA。设计AtNiR基因的引物并用于采用SYBER Green作为荧光DNA标记的qPCR反应中。所有的反应一式三份进行。

Ct(阈值循环)值定义荧光超过固定阈值的循环数，视DNA存在的量而定。Ct值用于计算拷贝数。

为了验证所计算的拷贝数是正确的，在各系的T₁种群上进行分离分析。自花授粉的单拷贝亲本应产生1∶2∶1比例的纯合子、杂合子和无效子代。这由对幼苗的蛋白印迹分析测定。使初级转基因株系自体授粉并收集种子，来自各系的24粒种子在小单元堆肥中萌芽，不是所有的株系显示100％萌芽，但是大部分萌芽。经过两周的生长后取第一片真正的叶子用于蛋白印迹分析并提取叶蛋白。进行蛋白印迹分析并用AbAtNiR检测，如图9所示。选择显示转基因NiR单一拷贝的株系用于生成纯合T₁植物(见实施例2)。

在生长和发育的初级阶段未从初级(T₀)转基因植物观察到可辨别的表型。然而，在自体授粉和结荚(pot setting)过程中记录到一种表型。pBNPAtNiR株系未与对照种群一样快速衰老尽管他们处于相同的发育阶段并处于相同的时序年龄(见图10)。

取样来自植物的叶材料，取叶5并分析总可溶性蛋白和NiR活性，因为这一叶在明显衰老因为对照种群中的叶变黄但AtNiR种系没有变黄。图11显示的结果明显证明了NiR活性仍然存在于AtNiR转基因植物中，但是在LUC种群中不可检测并且在WT种群中只有一株植物显示出活性。AtNiR种群和对照种群之间可溶性蛋白几乎不存在差异。

实施例2

过表达拟南芥菜亚硝酸还原酶的烟草植物的表征

在这一实施例中，T₁AtNiR转基因植物和野生型(WT)烟草生长在不同的亚硝酸盐浓度上用于生化和分子分析。分析老源叶与嫩库叶对比以评价从初级N同化转换至N再活化以及这一转变在转基因株系中是否被改变。

纯合株系的筛选

为了生成纯合株系用于分析，将实施例1中生成的所选AtNiR株系的T₁种子植入堆肥填充单元。为了达到准确数量的重复(3个区组中3个重复)用于在3个不同氮水平的实验中进行统计分析，各AtNiR株系需要27个纯合植物。为了获得每个株系27个纯合植物，种植各株系的160颗种子，因为只有四分之一的后代就AtNiR而言是纯合的。采集各植物的叶尖并置于96-孔板中，采用快速碱处理植物材料方案分离DNA(见上文)。通过实时PCR使用Bio-Rad iCycler^TM分析来自各植物的提取物以测定转基因的拷贝数。这采用比较Ct值方法进行评价。

每个植物的提取物进行一次反应，使用转基因引物对At1440R和At1300F(针对拟南芥菜亚硝酸还原酶设计)和内源引物对NRF和NRR(针对烟草硝酸还原酶)。在各板子上使用K326 WT烟草和质粒DNA生成用于各引物组的标准曲线。在一次实时PCR反应中一起分析包含48株植物的组。选择1.5或更高的相对Ct比为鉴定纯合植物的工具，而任何低于1.5的数值被认为是杂合型。

3个不同浓度硝酸盐处理的T₁NiR的表征

筛选T₁纯合株系后，硝酸盐补料方案需要来自各AtNiR株系(2、9、14和16)的27个纯合个体，因为在各处理(硝酸盐浓度)中各株系有三株植物在3个重复的区组中。

采用随机化区组设计进行供给试验以通过统计学分析结果评价株系之间的任何显著差异。各区组包含一组完整的1、5和10mM硝酸盐处理、来自AtNiR株系的9个纯合个体和一个WT对照。各处理上生长三株植物在各区组中总共得到45株植物。这一设计在各区组中重复，各区组中的植物和处理在其中随机化(见图12的设计示意图)。

当取样植物时，合并各区组中的三个重复，最终提供各AtNiR株系在各处理上来自各区组的一组数据用于比较。采用ANOVA检验进行分析。

植物的生长和硝酸盐应用

将筛选的纯合T₁个体种植于包含粘土卵石的5英寸盆中并竖立于7英寸垫盘中。各处理用彩色编码的旗子标记以表示该植物属于哪一种供给方案；黄色＝10mM，红色＝5mM，蓝色＝1mM硝酸盐供给。每日将垫盘加满以维持稳定的供给并使生长8周直至出现花芽的初始预兆。对于植物的生长不同硝酸盐水平并不明显直至第四周，那时1mM由于缺乏N而显示矮化迹象。

所有的植物在10mM硝酸盐上生长迅速，在5mM上稍微缓慢而在1mM硝酸盐上更加缓慢。

AtNiR株系在不同硝酸盐水平上的生长习惯

研究植物生长以评价增加的NiR活性是否与不同水平硝酸盐存在下叶的生物量增加相关。测量各AtNiR个体和WT对照植物的叶长和植物高度。从各植物取样下部源叶(3和4)。对于库叶，去除各植物高于第一次取样位点10片叶子的2片叶子(位置14和15)。对于一个区组中包含三个重复的各组进行测量并平均并计算标准偏差。

株系之间植物高度没有显著变化，最大的差异在硝酸盐水平之间，1mM明显引起植物严重矮化。

叶长度的情况也是如此，最明显的差异来自生长于1mM硝酸盐上的材料。与生长在5mM或10mM硝酸盐上的植物相比，在这些植物中，上部库叶的叶长度略有降低并且在下部源叶中显著降低。但是，在AtNiR植物和WT对照之间未观察到显著差异。

生长于不同硝酸盐水平上的AtNiR株系的生化分析

如之前所述检测氮同化酶活性和代谢物以测定当进行不同的N方案时转基因对N代谢的任何作用。

在10am和4pm之间进行植物取样。如前所述取样相同的叶片，提供库叶源叶二者用于分析。采用手提式叶绿素测量仪取各叶片3个叶绿素读数，各叶片的底部、中部和尖部各一个。平均各叶片读数。

将来自一个区组包含三个重复的各组的叶片样品适当合并。在液氮中研磨样品并如上文所述进行提取用于分析NiR、NR和GDH胺化活性、亚硝酸盐和硝酸盐含量以及总可溶性蛋白含量。如图13所示，当总NiR和NR结果之间相互作图时，AtNiR植物与WT植物比较时群集(cluster)不同，表明来自AtNiR转基因的作用。

NiR活性和亚硝酸盐含量

与WT植物比较所有AtNiR株系的NiR活性增加(见图14a)，不仅在不同的硝酸盐浓度上并且在与上部叶比较的下部叶中。这一活性增加的P-值＜0.001，表明所引入的AtNiR基因增加了转化株系中的NiR活性。

该结果显示了与其他氮方案相比1mM硝酸盐处理上尤其是在上部库叶中NiR活性的巨大差异。所有的AtNiR转基因株系比WT显示出高得多的NiR活性，为5mM和10mM硝酸盐处理植物的5倍。相对于野生型植物一些AtNiR转基因株系中的亚硝酸盐含量降低(见图14b和表7)，尤其是在更高的硝酸盐浓度和在下部叶中。

NR活性和硝酸盐含量

一般情况下在来自用更高硝酸盐供给(10mM)处理的植物叶子中观察到更高的硝酸盐含量。总体而言，下部叶中比上部叶中的硝酸盐含量更高。AtNiR转基因植物倾向于显示与WT植物相比硝酸盐含量降低(见图15和表7)。

叶绿素含量、可溶性蛋白和GDH活性

与WT植物相比AtNiR株系之间的可溶性蛋白含量未发生变化，仅有的差异在于硝酸盐供给之间，更高浓度与可溶蛋白增加相关。这与叶绿素含量相同，其未在AtNiR植物和WT植物之间显示任何的统计学差异。

表7

氨基酸分析

检测叶片提取物中的游离氨基酸用于上文的生化分析。进行氨基酸谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)和脯氨酸(Pro)的定量。分析这五种氨基酸因为Glu、Gln、Asp和Asn是从N同化形成的铵离子掺入合成的前四个氨基酸。Pro从Glu直接合成并且Pro水平已显示为叶年龄(Maslcaux等，2000)、应激(Hare和Cress，1999)和氮状态(Vaucheret等，1992)的标志。因此，AtNiR株系和WT植物之间这些氨基酸的任何差异可能表明由于引入AtNiR对N同化途径的改变。

采用EZ：faast^TM(

Macclesfield，Cheshire，UK)方法在20μl各叶提取物中衍生化游离氨基酸。从各样品中分离并纯化氨基酸，接着通过液相色谱法-质谱法(LC/MS)进行定量。

通过控制LC/MS的软件(

QS)的数据分析部分进行氨基酸含量的测定。计算和校正是基于包含200nmoles/ml浓度所有氨基酸的内标。图8显示的结果表明某些转基因株系显示更高水平的特定氨基酸。例如，株系14和16比野生型植物显示更高的天冬氨酸和天冬酰胺水平。

表8

本申请中提及的任何出版物均通过引用并于本文。所述方法和产物的各种修改和变化对本领域技术人员而言是显而易见的，并且不偏离本发明范围。尽管结合具体的优选实施方案描述了本发明，但应理解的是所要求的本发明不应过分受限于这些具体的实施方案。实际上，本领域技术人员显而易见所实施本发明的所述方式的各种修改均在以下权利要求的范围内。

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Claims (54)

1.一种产生转基因植物的方法，其包括向未修饰的植物中引入编码亚硝酸还原酶的外源基因，其中该外源基因编码的亚硝酸还原酶的表达相对于未修饰的植物降低了该转基因植物中的亚硝酸盐含量。

2.权利要求1的方法，其中所述未修饰的植物为茄科。

3.权利要求2的方法，其中所述未修饰的植物为Cestoideae亚科。

4.权利要求3的方法，其中所述未修饰的植物为烟草属。

5.权利要求4的方法，其中所述未修饰的植物为烟草。

6.任一项前述权利要求的方法，其中所述外源基因为编码来源自与未修饰植物不同物种的亚硝酸还原酶的异源基因。

7.任一项前述权利要求的方法，其中所述外源基因来源自拟南芥属供体植物。

8.权利要求7的方法，其中所述外源基因来源自拟南芥菜。

9.权利要求8的方法，其中所述外源基因包含SEQ ID NO：2定义的核酸序列，或其编码功能性亚硝酸还原酶的片段，或其编码与SEQ ID NO：3定义的多肽具有至少90％氨基酸序列同一性的功能性亚硝酸还原酶的变异体。

10.权利要求1至6任一项的方法，其中所述外源基因包含编码亚硝酸还原酶的SEQ ID NOs：18，20，22，24，28，28，30或32中任一定义的核酸序列，或其编码功能性亚硝酸还原酶的片段，或其编码与SEQ ID NOs：19，21，23，25，27，29，31或33中任一定义的多肽具有至少90％氨基酸序列同一性的功能性亚硝酸还原酶的变异体。

11.任一项前述权利要求的方法，其中由所述外源基因编码的亚硝酸还原酶与未修饰植物中内源基因编码的亚硝酸还原酶具有小于90％的氨基酸序列同一性。

12.任一项前述权利要求的方法，其中所述编码亚硝酸还原酶的外源基因与能够引导该外源基因在该植物中组成型表达的启动子序列相连。

13.权利要求12的方法，其中所述启动子序列为来源自香石竹蚀环病毒的组成型启动子。

14.任一项前述权利要求的方法，其中通过引入外源基因生成第一代转基因植物，从第一代转基因植物产生第二代转基因植物。

15.权利要求14的方法，其中所述第二代转基因植物由第一代转基因植物自体受精产生。

16.权利要求15的方法，其中所述第二代转基因植物对于所述编码亚硝酸还原酶的外源基因是纯合的。

17.任一项前述权利要求的方法，其中通过引入外源基因生成的第一代转基因植物包含该外源基因的单个拷贝。

18.任一项前述权利要求的方法，其中由所述外源基因编码的亚硝酸还原酶在所述转基因植物的叶中表达。

19.任一项前述权利要求的方法，其中所述转基因植物的亚硝酸盐含量相对于未修饰植物降低了至少10％。

20.任一项前述权利要求的方法，其中通过用外源基因独立转化复数个未修饰植物生成复数个转基因植物。

21.权利要求20的方法，其进一步包括测定各转基因植物或它们后代的亚硝酸盐含量。

22.权利要求21的方法，其进一步包括选择一个或更多个相对于未修饰植物亚硝酸盐含量降低的转基因植物，并繁殖所述亚硝酸盐含量降低的转基因植物。

23.一种转基因植物，其包含编码亚硝酸还原酶的外源基因，其中相对于未修饰植物所述植物中的亚硝酸盐含量降低。

24.权利要求23的转基因植物，所述植物为茄科。

25.权利要求24的转基因植物，所述植物为Cestoideae亚科。

26.权利要求25的转基因植物，所述植物为烟草属。

27.权利要求26的转基因植物，所述植物为烟草。

28.权利要求23至27中任一项的转基因植物，其中所述外源基因包含编码来源自不同物种的亚硝酸还原酶的异源基因。

29.权利要求23至28中任一项的转基因植物，其中所述外源基因来源自拟南芥属植物。

30.权利要求29的转基因植物，其中所述外源基因来源自拟南芥菜。

31.权利要求30的转基因植物，其中所述外源基因包含SEQ ID

NO：2定义的核酸序列，或其编码功能性亚硝酸还原酶的片段，或其编码与SEQ ID NO：3定义的多肽具有至少90％氨基酸序列同一性的功能性亚硝酸还原酶的变异体。

32.权利要求23至28中任一项的转基因植物，其中所述外源基因包含编码亚硝酸还原酶的SEQ ID NOs：18，20，22，24，28，28，30或32中任一定义的核酸序列，或其编码功能性亚硝酸还原酶的片段，或其编码与SEQ ID NOs：19，21，23，25，27，29，31或33中任一定义的多肽具有至少90％氨基酸序列同一性的功能性亚硝酸还原酶的变异体。

33.权利要求23至32中任一项的转基因植物，其中由所述外源基因编码的亚硝酸还原酶与未修饰植物中内源基因编码的亚硝酸还原酶具有小于90％的氨基酸序列同一性。

34.权利要求23至33中任一项的转基因植物，其中所述编码亚硝酸还原酶的外源基因与能够引导该亚硝酸还原酶在该转基因植物中组成型表达的启动子序列相连。

35.权利要求34的转基因植物，其中所述启动子序列为来源自香石竹蚀环病毒的组成型启动子。

36.权利要求23至35中任一项的转基因植物，其中所述植物为通过向野生型植物引入外源基因生成的第一代转基因植物。

37.权利要求36的转基因植物，其中所述第一代转基因植物包含所述外源基因的单个拷贝。

38.权利要求23至35中任一项的转基因植物，其中所述植物为来源自第一代转基因植物繁殖的第二代或后续世代的转基因植物，所述第一代转基因植物为通过向野生型植物引入所述外源基因生成。

39.权利要求38的转基因植物，其中所述第二代或后续世代转基因植物对于所述编码亚硝酸还原酶的外源基因是纯合的。

40.权利要求23至39中任一项的转基因植物，其中由所述外源基因编码的亚硝酸还原酶在所述转基因植物的叶中表达。

41.权利要求23至40中任一项的转基因植物，其中所述转基因植物的亚硝酸盐含量与野生型植物相比至少低10％。

42.编码亚硝酸还原酶的外源核酸序列在通过用外源核酸序列转化植物降低植物亚硝酸盐含量中的用途。

43.权利要求42的用途，其中所述植物为烟草属。

44.权利要求42或权利要求43的用途，其中所述外源核酸序列来源自拟南芥属的植物。

45.权利要求42至44中任一项的用途，其中由所述外源核酸序列编码的亚硝酸还原酶与未修饰植物中内源基因编码的亚硝酸还原酶具有小于90％的氨基酸序列同一性。

46.权利要求42至45中任一项的用途，其中所述编码亚硝酸还原酶的外源核酸序列与能够引导该亚硝酸还原酶在该转基因植物中组成型表达的启动子序列相连。

47.一种嵌合基因，其包含(a)编码亚硝酸还原酶的核酸序列，和(b)能够引导该亚硝酸还原酶在包含该嵌合基因的植物中表达的启动子序列，排除了以下：(i)包含编码来源自烟草或菠菜的亚硝酸还原酶的核酸序列和花椰菜花叶病毒35S启动子的嵌合基因，和(ii)包含编码来源自稻的亚硝酸还原酶的核酸序列的嵌合基因。

48.权利要求47的嵌合基因，其包含编码亚硝酸还原酶的SEQ IDNO：2定义的核酸序列，或其编码功能性亚硝酸还原酶的片段，或其编码与SEQ ID NO：3定义的多肽具有至少90％氨基酸序列同一性的功能性亚硝酸还原酶的变异体。

49.权利要求47的嵌合基因，其包含编码亚硝酸还原酶的SEQ ID NOs：18，22，24，28，30或32中任一定义的核酸序列，或其编码功能性亚硝酸还原酶的片段，或其编码与SEQ ID NOs：19，23，25，27，29，31或33中任一定义的多肽具有至少90％氨基酸序列同一性的功能性亚硝酸还原酶的变异体。

50.权利要求47或权利要求48的嵌合基因，其中所述启动子序列能够引导所述亚硝酸还原酶在包含所述嵌合基因的植物中组成型表达。

51.权利要求50的嵌合基因，其中所述启动子序列是来源自香石竹蚀环病毒的组成型启动子。

52.一种植物转化载体，其包含权利要求47至51中任一项定义的嵌合基因。

53.一种植物或植物细胞，其包含如权利要求52定义的转化载体。

54.一种植物细胞，其包含编码亚硝酸还原酶的外源基因，其中与未修饰的植物细胞相比所述植物细胞中的亚硝酸盐含量降低。

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