CN107109432A

CN107109432A - 生产质体转化体的方法

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Publication number: CN107109432A
Application number: CN201680002875.2A
Authority: CN
Inventors: 山口明日香; 大熊二郎; 近藤康弘; 广濑佳嗣
Original assignee: Honda Motor Co Ltd
Current assignee: Honda Motor Co Ltd
Priority date: 2015-08-28
Filing date: 2016-08-24
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2036-08-24
Also published as: EP3180436A2; US20180216124A1; JP2017042159A; BR112017005716A2; CN107109432B; JP6696806B2

Abstract

生产质体转化体的方法，包括：过程(a)，其中将编码具有中和亚硝酸盐毒性功能的蛋白质的基因引入植物组织中，和过程(b)，其中将在过程(a)中插入基因的植物组织在包含具有抑制野生型植物细胞生长的浓度或抑制野生型植物再生的浓度的亚硝态氮的培养基中培养，从而筛选通过将基因插入质体基因组而获得的质体转化体。

Description

生产质体转化体的方法

技术领域

本发明涉及生产质体转化体的方法，更具体地，涉及一种生产质体转化体的方法，其中将外源基因引入至具有分化的质体的植物组织中，并将编码中和亚硝酸盐毒性的蛋白质的基因如亚硝酸还原酶基因用作选择标记基因以筛选转化体。

本申请要求于2015年8月28日提交的日本专利申请第2015-169817号以及于2016年3月17日提交的日本专利申请第2016-054448号的优先权，其内容通过引用并入本文。

背景技术

植物的质体(色原体)是植物细胞中含有色素的细胞器，具有其自身的基因组，并且进行自生长。叶绿体(其为一种质体)是植物细胞的最显著的特征，进行光合作用、碳、氮和硫同化作用等。叶绿体包含基因组中编码叶绿体中总可溶性蛋白质的约50％的蛋白质的基因，并且具有非常高的蛋白质合成能力。特别地，在高等植物中，已知在细胞中存在多个叶绿体，并且叶绿体基因组的数目与核基因组一样多，为5,000-10,000。当将外源基因引入至在植物中大量存在的叶绿体中时，由于在植物中存在大量产生由外源基因编码的蛋白质的可能，所以质体转化技术正被致力于作为廉价的蛋白生产技术。

高等植物中的质体转化基本上通过插入设计用于在与质体基因组同源的序列之间插入感兴趣的基因和药物选择标记基因的载体来实现。通过基因枪法将载体引入植物细胞中，然后在包含可选择药物的培养基(筛选培养基)上重复培养包含通过同源重组转化的质体基因组的细胞，并筛选包括转化质体的细胞。在该过程中，将细胞群从野生型质体和转化的质体混合(异质)的状态变为所有细胞保留转化的质体的(同质)状态，从筛选的同质转化细胞再生植物，从而获得质体转化植物。也就是说，质体转化方法主要包括将外源基因插入质体基因组的转化过程和筛选含有转化质体基因组的细胞和植物的过程。

到目前为止，已经在大量植物中尝试了根据这种方法的高等植物中的质体转化。然而，仅在双子叶植物烟草中建立了稳定的转化系统。一般来说，在烟草的质体转化方法中，使用来源于叶绿体的再生系统进行向一块叶组织的引入。通过使用壮观霉素/链霉素灭活的基因(氨基糖苷-3'-腺苷酸转移酶；aadA)作为选择标记的壮观霉素抗性筛选(参见非专利文献1)、使用卡那霉素抗性基因作为选择标记的卡那霉素抗性筛选(参见非专利文献2和3)和使用bar基因的除草剂草胺膦(phosphinothricin，PPT)抗性筛选等进行引入后的转化质体的筛选。

另一方面，在单子叶植物中，已经尝试用在双子叶植物中成功使用的筛选方法来制备质体转化体。例如，据报道，根据与烟草相同的aadA基因/链霉素筛选或bar基因/PPT筛选，进行了水稻愈伤组织(去分化细胞群)中的质体转化(参见非专利文献5、6和7)。然而，在所有报道中，制备的产物为异质转化体，未能获得同质转化体。此外，转化体的制备效率低。然而有另一报道，该报道包括通过使用多个玉米芽作为引入材料的aadA基因筛选可以制备质体转化体的事实，但是具体方法的细节未知(参见专利文献1)。

以这种方式，单子叶植物中的质体转化是困难的。其主要因素被认为是由于在双子叶植物中成功的筛选方法不能成功用于筛选单子叶植物的事实。由于物种之间细胞的药物敏感性和响应系统不同，因此有必要修改相关领域的筛选方法或根据目标物种开发新的筛选系统。实际上，由于单子叶植物对广泛用于烟草等的壮观霉素具有抗性，因此不可能根据aadA基因/壮观霉素筛选完全去除非转化体。

作为单子叶植物的有效转化体筛选方法，已经开发了一种筛选方法，其中在目标为核基因组的转化中一些药物抗性基因用作选择标记。使用最广泛的是利用抗生素潮霉素及其抗性基因的筛选方法。还有效地使用利用除草剂草胺膦或草甘膦的筛选方法。然而，由于核基因组的真核蛋白表达系统与包括原核系统的质体基因组的蛋白表达系统不同，因此仅在真核系统中有效的潮霉素不能用于质体转化方法。在目标为核基因组的转化中使用药物抗性基因的筛选方法中的一些可以应用于单子叶植物的质体转化方法，但是这种筛选方法的效果有限且不稳定(参见非专利文献7)。另外，在单子叶植物水稻中，作为目标为核基因组的转化中的筛选方法，报道了使用亚硝酸还原酶基因作为选择标记基因的核转化方法(参见专利文献2和非专利文献8)。

另一方面，在与转化方法相关的技术中，作为促进基因引入质体的方法，公开了将外源基因引入其中质体已分化并且其再生能力未降低的愈伤组织的方法(参见专利文献3)。在该方法中，使用由转化的水稻诱导的绿色愈伤组织作为引入材料，该转化的水稻中促进叶绿体发育的转录因子过表达。与将作为一般的引入材料的质体引入未发育的黄白色愈伤组织的方法相比，该方法显示出更高的引入效率。然而，在该方法中，需要预先通过进行核基因组的转化来制备适当地形成绿色(greening)愈伤组织的菌株，并且除了增加过程数量之外，还不知道对其它单子叶植物的适用性。

引用列表

专利文献

[专利文献1]

美国专利申请，公开号：2005/0198704

[专利文献2]

PCT国际公开号：WO 2005/012520

[专利文献3]

日本专利第5320782号

非专利文献

[非专利文献1]

Svab and Maliga,Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America(美国国家科学院院刊),1993,vol.90,p.913-917.

[非专利文献2]

Carrer et al.,Molecular Genetics and Genomics(分子遗传和基因组学),1993,vol.241,p.49-56.

[非专利文献3]

Hunag et al.,Molecular Genetics and Genomics(分子遗传和基因组学),2002,vol.268,p.19-27.

[非专利文献4]

Ye et al.,Plant Physiology(植物生理学),2003,vol.133,p.402-410.

[非专利文献5]

Khan and Maliga,Nature Biotechnology(自然生物技术),1999,vol.17,p.910-915.

[非专利文献6]

Lee et al.,Molecules and Cells(分子和细胞),2006,vol.21,p.401-410.

[非专利文献7]

Li et al.,Agricultural Sciences in China(中国农业科学),2009,vol.8,p.643-651.

[非专利文献8]

Nishimura et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America,2005(美国国家科学院院刊),vol.102,p.11940-11944.

发明内容

技术问题

当使用其中将专利文献2中报道的亚硝酸还原酶基因等作为选择标记基因的核转化方法时，可以以足够筛选效率制备水稻核转化体。然而，还不知道该筛选方法是否可以应用于质体转化。

本发明提供了对于包括单子叶植物在内的广泛的植物物种高效生产质体转化体的方法，在所述广泛的植物物种中，基因引入到目前为止非常困难，并且使用耐药性的转化体的筛选非常困难。

问题的解决方案

本发明人针对上述问题进行了研究，并发现当制备质体转化体时，插入编码具有中和亚硝酸盐毒性功能的蛋白质的基因如亚硝酸还原酶基因作为选择标记基因，可以显著地提高筛选效率，并且可以在包括单子叶植物的广泛的植物物种中高效地制备质体转化体，从而完成本发明。

也就是说，本发明的生产质体转化体的方法、质体转化体和生产蛋白质的方法包括以下方面。

[1]一种生产质体转化体的方法，其包括：过程(a)，其中将编码具有中和亚硝酸盐毒性功能的蛋白质的基因引入植物组织中；和过程(b)，其中将在过程(a)中插入基因的植物组织在包含具有抑制野生型植物细胞生长的浓度或抑制野生型植物再生的浓度的亚硝态氮的培养基中培养，从而筛选通过将基因插入质体基因组而获得的质体转化体。

[2]根据[1]项所述的生产质体转化体的方法，

其中基因为亚硝酸还原酶基因。

[3]根据[1]或[2]项所述的生产质体转化体的方法，

其中所述质体包括至少一种选自叶绿体、白色体、造粉体、黄化质体、油质体、蛋白质体和前质体的质体。

[4]根据[1]-[3]项中任一项所述的生产质体转化体的方法，

其中过程(a)还包括将一种或两种或更多种物种的其它外源基因引入植物组织中。

[5]根据[1]-[4]项中任一项所述的生产质体转化体的方法，

其中过程(b)还包括由筛选的质体转化体形成植物。

[6]质体转化体，其中编码具有中和亚硝酸盐毒性功能的蛋白质的基因插入在质体基因组中。

[7]根据[6]项所述的质体转化体，

其中基因为亚硝酸还原酶基因。

[8]一种生产蛋白质的方法，还包括从通过[4]项的生产质体转化体的方法产生的质体转化体或从由质体转化体形成的植物中回收由外源基因编码的蛋白质。

发明的有益效果

本发明的生产质体转化体的方法具有优异的筛选效率。因此，可以在双子叶植物和单子叶植物中高效生产质体转化体。特别地，其中编码具有中和亚硝酸盐毒性功能的蛋白质的基因用作选择标记基因的筛选方法非常适合作为多种植物的筛选方法。

附图说明

图1是柳枝稷质体转化载体的构建体的模式图。

图2A是显示实施例1<7>中柳枝稷的愈伤组织在不同浓度的亚硝酸钠中生长速率的结果的图。

图2B是显示实施例1<7>中柳枝稷植物在不同浓度的亚硝酸钠中的再生率的结果的图。

图3是在PCR中获得的PCR扩增产物的电泳图谱，实施PCR是为了在实施例1<8>中确认是否已经将转化载体引入5个单独的继代培养的植物中。

具体实施方式

本发明的生产质体转化体的方法包括下述过程(a)和(b)，过程(a)，其中将编码具有中和亚硝酸盐毒性功能的蛋白质的基因引入植物组织中，和过程(b)，其中将在过程(a)中插入基因的植物组织在包含具有抑制野生型植物细胞生长的浓度或抑制野生型植物再生的浓度的亚硝态氮的培养基中培养，从而筛选通过将基因插入质体基因组而获得的质体转化体。

此外，作为另一方面，在所述生产方法中，所述过程(a)还可以包括将一种或两种或更多种的其它外源基因引入植物组织中；并且过程(b)可以进一步包括由筛选的质体转化体形成植物。

在本说明书中，术语“植物组织”是指具有质体或前质体的植物组织，并包括例如分化的植物组织、分化至质体形成的愈伤组织和未分化的愈伤组织。

“包含具有抑制野生型植物细胞生长的浓度或抑制野生型植物再生的浓度的亚硝态氮的培养基”的实例包括含有浓度为0.5-2.0g/L，更优选为0.8-2.0g/L的亚硝酸钠的培养基。

短语“中和亚硝酸盐毒性”和“亚硝酸盐毒性中和”是指植物中过量的亚硝酸盐被代谢掉，因此由亚硝酸盐导致的细胞毒性被中和。

在本发明的生产质体转化体的方法中，“编码具有中和亚硝酸盐毒性功能的蛋白质的基因”(以下称为“亚硝酸盐毒性中和基因”)用作选择标记。在植物中，亚硝酸盐被认为是在质体中进行的氮代谢过程中的中间代谢物，已知其会引起细胞毒性。一般来说，由于亚硝酸盐通过亚硝酸还原酶迅速地代谢为氨，因此没有观察到毒性作用。然而，当在亚硝酸盐的量超过亚硝酸还原酶的固有代谢能力的条件下进行培养时，愈伤组织生长和植物再生被显著抑制。当按照质体转化将亚硝酸盐毒性中和基因引入质体时，植物中过量的亚硝酸盐被转化体中具有中和亚硝酸盐毒性的功能的蛋白质代谢掉。结果，植物组织可以在亚硝酸盐的量超过亚硝酸还原酶的固有代谢能力的条件下存活。

亚硝酸还原酶基因优选作为亚硝酸盐毒性中和基因。亚硝酸还原酶基因没有特别限定，只要编码具有亚硝酸还原酶活性的蛋白质的基因即可。亚硝酸还原酶基因可以来源于作为宿主的植物物种，或亚硝酸还原酶基因可以来源于物种不同于宿主的生物体。此外，亚硝酸还原酶基因可以为编码包括在原始生物体中的天然亚硝酸还原酶的基因，或可以为编码其中天然亚硝酸还原酶被适当修饰的蛋白质的基因。修饰蛋白质的实例包括其中至少一个氨基酸被缺失、替换或添加而不损害亚硝酸还原酶活性的蛋白质以及其中各种标签被添加到亚硝酸还原酶的N末端或C末端的蛋白质。标签的实例包括广泛用于重组蛋白的表达和纯化的标签，例如His标签，血细胞凝集素(HA)标签，Myc标签和Flag标签。此外，编码天然亚硝酸还原酶的基因的实例可包括天然亚硝酸还原酶基因和其简并密码子被在作为宿主的植物中使用率高的密码子取代的亚硝酸还原酶基因。

作为亚硝酸还原酶基因，具体地，例举了编码铁氧化还原蛋白-亚硝酸还原酶(以下简称为“NiR基因”)的基因。铁氧化还原蛋白-亚硝酸还原酶是利用铁氧化还原蛋白作为电子供体并将亚硝酸根离子转化为氨离子的亚硝酸还原酶。亚硝酸还原酶基因的实例包括来源于单子叶植物的亚硝酸还原酶基因，例如来源于稻(Oryza sativa)的NiR基因(D50556.1，非专利文献8)、来源于玉蜀黍(Zea mays)的NiR基因(EU957616.1,XP_008648080.1,Lahners K.et al.,Plant Physiol.1988,vol.88,p741-746)、来源于小麦(Triticum)的NiR基因(FJ527909.1)、来源于大麦(Hordeum vulgare)的NiR基因(AK371794.1，S78730.1)和来源于高粱(Sorghum bicolor)的NiR基因(XM_002454557.1)；来源于双子叶植物的亚硝酸还原酶基因，例如来源于烟草(Nicotiana tabacum)的亚硝酸还原酶基因(AB093533.1,AB245431.1,Kronenberger J.et al.,Mol.Gen.Genet.,1993,vol.236,p.203-208.)、来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的亚硝酸还原酶基因(NM_127123.2)、来源于黄瓜(Cucumis sativus)的亚硝酸还原酶基因(EF397679.1)、来源于马铃薯(Solanum tuberosum)的亚硝酸还原酶基因(U76701.1)、来源于苜蓿(Medicagopolymorpha)的亚硝酸还原酶基因XM_003614772.1)、来源于野茶树(Camellia sinensis)的亚硝酸还原酶基因(JX987133.1)、来源于豆梨(Pyrus calleryana)的亚硝酸还原酶基因(KC545876.1)、来源于碧桃(Prunus persica)的亚硝酸还原酶基因(AB061671.1)、来源于卷柏(Selaginella)的亚硝酸还原酶基因(XM_002987367.1)和来源于菠菜(Spinaciaoleracea)的亚硝酸还原酶基因(Back E.et al.,Mol.Gen.Genet.,1988,vol.212,p.20-26.)；以及来源于藻类或肝脏的亚硝酸还原酶基因，例如来源于小立碗藓(Physcomitrellapatens)的亚硝酸还原酶基因(XM_001776973.1)、来源于衣藻(Chlamydomonas)的亚硝酸还原酶基因(XM_001696735.1)和来源于小球藻(Chlorella vulgaris)的亚硝酸还原酶基因(XM_005844460.1)(数字表示NCBI登录号)。

作为在过程(a)中引入植物组织中的亚硝酸还原酶基因，优选来源于禾本科(Poaceae)植物的NiR基因。例如，例举了编码具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽的基因或具有其中SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的至少一个氨基酸被缺失、取代或添加的氨基酸序列并编码具有亚硝酸还原酶活性的多肽的基因。

在本说明书中，短语“具有亚硝酸还原酶活性”是指具有将植物中亚硝酸盐的浓度降低至可以正常生长的浓度的作用。

另外，作为另一方面，短语“具有亚硝酸还原酶活性”是指即使在亚硝酸钠的浓度为0.7g/L以上的培养基中进行培养时，植物细胞能够生长或植物能够再生。

与亚硝酸还原酶基因相反，编码降低植物中亚硝酸盐浓度的蛋白质或具有中和由亚硝酸盐引起的毒性的功能的蛋白质的基因可用作亚硝酸盐毒性中和基因。例如，在植物细胞中，根据硝酸还原酶将亚硝酸盐还原成一氧化氮的途径是已知的。一些细菌包括使亚硝酸盐形成硝酸盐的亚硝酸氧化酶。这样的酶可以通过以与亚硝酸还原酶基因相同的方式降低亚硝酸盐的丰度而直接中和亚硝酸盐毒性。另一方面，推测亚硝酸盐引起的细胞毒性是由亚硝酸盐与过氧化物酶和血红蛋白反应时产生的二氧化氮引起的，二氧化氮诱导蛋白质的氧化或硝化、膜脂质的过氧化、DNA的突变等。因此，通过调节与亚硝酸盐反应的过氧化物酶和血红蛋白的丰度或其机制，可以间接中和亚硝酸盐毒性。因此，编码降低与亚硝酸盐反应的过氧化物酶的丰度的蛋白质的基因，以及编码具有抑制由过氧化物酶和血红蛋白产生的二氧化氮诱导蛋白质氧化的功能的蛋白质的基因也可用作亚硝酸盐毒性中和基因。

也就是说，“亚硝酸盐毒性中和基因”的一个方面是至少一种选自直接中和由亚硝酸盐引起的细胞毒性的基因和间接中和由亚硝酸盐引起的细胞毒性的基因的基因。

例如，例举了至少一种选自以下的基因：亚硝酸还原酶基因、硝酸还原酶基因，亚硝酸氧化酶基因、编码降低与亚硝酸盐反应的过氧化物酶的丰度的蛋白质的基因以及编码具有抑制由过氧化物酶和血红蛋白产生的二氧化氮诱导蛋白质氧化的蛋白质的基因。

在本发明的生产质体转化体的方法中，过程(a)包括将用作转化体的选择标记的亚硝酸盐毒性中和基因引入植物组织中。具体地，过程(a)包括将并入亚硝酸盐毒性中和基因的载体引入植物组织中。

并入亚硝酸盐毒性中和基因的载体没有特别限定，只要并入到载体中的外源基因可以在植物组织中的质体内表达。载体可以通过例如以下方法获得。使用基于质粒pBluescript的载体(可从Stratagene购得)、基于pUC载体等作为载体主链。在其多克隆位点处，克隆质体基因组序列内两种类型的相邻的同源重组靶序列。接下来，在两种类型的同源重组靶序列之间并入表达盒，其中从上游排列具有启动子序列的DNA、5’调节区、亚硝酸盐毒性中和基因的多核苷酸以及具有终止子序列的DNA。因此，获得了在质体中表达亚硝酸盐毒性中和基因的载体。

此外，可以将无启动子的表达盒并入其下游，这种无启动子表达盒中没有启动子序列并入至亚硝酸盐毒性中和基因的上游，质体基因组内源基因的启动子序列或其下游序列用作一个同源重组靶序列，并且顺序地包括5’调节区、亚硝酸盐毒性中和基因的多核苷酸、终止子序列和另一侧的同源重组靶序列。因此，获得在质体中表达亚硝酸盐毒性中和基因的载体。为了将多核苷酸并入至表达载体中，可以使用公知的基因重组技术，并且可以使用商业的表达载体制备试剂盒。

在载体中，在亚硝酸盐毒性中和基因上游的并且引起亚硝酸盐毒性中和基因表达的启动子没有特别限定，只要启动子在质体内部作为启动子起作用即可。优选原核型启动子。

引起亚硝酸盐毒性中和基因在质体内部表达的启动子的实例包括核糖体RNA操纵子启动子(Prrn)、编码光合体系II的D1蛋白的psbA基因启动子(PpsbA)和编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的大亚基的rbcL基因启动子(PrbcL)。

此外，添加到亚硝酸盐毒性中和基因序列的上游的5'调节区的序列的实例包括大肠杆菌噬菌体T7的基因10基因5'非翻译区(5'-UTR)、rbcL基因的5'-UTR、psbA基因的5'-UTR、H⁺-ATPaseβ亚基基因(atpB)的5'-UTR、psbA基因的翻译起始密码子下游序列(下游盒：DB盒(DB-box))、破伤风毒素片段C(TetC)基因的DB盒、绿色荧光蛋白(GFP)基因的DB盒和新霉素磷酸转移酶II型(NPTII)基因的DB盒。

在过程(a)中，为了将载体引入植物组织，可以使用本领域技术人员已知的各种方法，例如基因枪法、聚乙二醇法、电穿孔法(电穿孔)、脂质体法、阳离子脂质体法、磷酸钙沉淀法、脂转染法或显微注射法。

在过程(a)中，用作引入亚硝酸盐毒性中和基因的引入材料的植物组织没有特别限定，只要组织来源于植物即可。例如，当制备植物转化体时，可以将亚硝酸盐毒性中和基因引入用作一般引入材料的未分化愈伤组织。未分化愈伤组织可以通过一般方法制备。

在过程(a)的转化中，作为用于引入亚硝酸盐毒性中和基因的材料，可以使用具有与野生型植物组织相同的亚硝态氮敏感性水平的植物组织，其基因型没有特别限定。也就是说，引入材料可以是野生型植物组织或已经经历某种基因修饰的突变植物组织。

在过程(a)的转化中，作为引入亚硝酸盐毒性中和基因的材料，可以使用具有成熟的质体的植物组织。质体在未分化的愈伤组织中不发育，并保持为未分化的前质体(即原始质体)。然而，当具有成熟的质体的植物组织用作引入材料时，可以提高转化值质体基因组中的效率。

用作引入材料并且具有成熟的质体的植物组织可以是分化的植物组织或可以是分化至质体成熟的愈伤组织。为了诱导质体的分化，可以调节愈伤组织的培养条件或可以处理植物激素。质体的实例包括造粉体、叶绿体、黄化质体(etioplasts)、油质体、蛋白质体、有色体(chromoplasts)、白色体(leucoplasts)和前质体。在本发明中，优选至少一种选自叶绿体、造粉体、黄化质体、白色体和前质体的组的质体，特别优选至少一种选自前质体和叶绿体的组的质体。

例如，当质体是叶绿体时，植物的叶片或茎片可以用作引入材料，可以从绿色愈伤组织或丛生芽(multiple shoot)的愈伤组织诱导叶绿体分化。在绿色愈伤组织中，诱导愈伤组织中的前质体分化为叶绿体。此外，在丛生芽中，愈伤组织分化，并形成具有多个聚集芽的组织。当在其中有助于分化和去分化的植物激素如植物生长素和细胞分裂素的平衡被调节的培养基上培养愈伤组织时，可以从愈伤组织诱导绿色愈伤组织或丛生芽。例如，愈伤组织的培养基的植物生长素浓度降低，细胞分裂素浓度增加，可诱导叶绿体形成，并获得绿色愈伤组织。此外，可以通过在来自愈伤组织的培养基的仅含有低浓度细胞分裂素的培养基上培养愈伤组织获得丛生芽。

由于愈伤组织中叶绿体分化被诱导，可以使用通过去分化包含大量叶绿体的叶子组织的细胞获得的愈伤组织或通过去分化非绿色组织如成熟种子、未成熟胚和根的细胞获得的愈伤组织(来源于非绿色组织的愈伤组织)。愈伤组织可以通过常规方法生产，例如，在含有植物激素如植物生长素和细胞分裂素的培养基上培养植物组织。

具有成熟的质体的植物组织可以通过过表达编码促进愈伤组织中质体分化的蛋白质的基因而获得。此外，可以诱导和分化来源于其中编码促进质体分化的蛋白质的基因过表达的转化体的愈伤组织以形成质体。编码诱导分化的蛋白质的基因的实例包括作为转录因子的GLK基因(Rossini et al.,Plant Cell,2001,vol.13,p.1231-1244.)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的CES 101基因(RLK family:Niwa et al.,Plant CellPhysioly,2006,vol.47,p.319-331.)(参见专利文献3)。可以通过通常用于转化植物方法将编码促进质体分化的蛋白质的基因引入愈伤组织或植物中。

过程(b)包括通过将在过程(a)中插入亚硝酸盐毒性中和基因的植物组织在至少包含具有抑制野生型植物细胞生长的浓度或抑制野生型植物再生的浓度的亚硝态氮的培养基中培养来筛选通过将亚硝酸盐毒性中和基因插入质体基因组而获得的质体转化细胞(称为质体转化体)。

进一步地，过程(b)可以包括由筛选的质体转化体形成植物。

此外，培养基中抑制野生型植物细胞生长的浓度或抑制野生型植物再生的亚硝态氮的浓度优选为0.5g/L以上，更优选为0.8g/L以上。

在植物中，首先，从培养基中吸收的硝态氮通过细胞质中的硝酸还原酶被还原成亚硝酸盐。所得的有毒亚硝态氮被吸收至质体中，然后通过由亚硝酸还原酶的亚硝酸盐毒性中和基因编码的蛋白质迅速转化为氨，并作为氮源用于细胞生长和植物再生。当在含有过量亚硝酸盐的培养基上培养植物时，仅含有野生型质体的细胞因为由停滞和积累的亚硝酸盐代谢物引起的亚硝酸盐毒性而死亡。另一方面，在通过质体转化并入亚硝酸盐毒性中和基因的过表达盒的含转化质体的细胞中，由于亚硝酸盐代谢被激活，因此细胞生长和植物再生是可能的。也就是说，在过程(b)中，尽管通过将亚硝酸盐毒性中和基因插入质体基因组而获得的质体转化体可以生长或被分化，但是非转化体的生长被抑制，并且最终非转化体死亡。

亚硝酸盐代谢系统(其中从培养基吸收的硝态氮被硝酸还原酶还原成亚硝酸盐，然后所得的亚硝态氮通过在质体中的亚硝酸盐毒性中和基因编码的蛋白质迅速转化成氨)是几乎所有植物都具有的(Krapp A.Current Opinion in Plant Biology,2015,vol.25,p.115-122.)。也就是说，可以在各种植物中实施本发明的其中亚硝酸盐毒性中和基因用作选择标记的生产质体转化体的方法。实际上，在许多具有NiR基因的亚硝酸还原酶基因的植物中，许多植物包含硝酸还原酶基因，例如稻(X15819.1,Hamat HB et al.,Mol.Gen.Genet.,1989,vol.218,p.93-98.)、玉蜀黍(NM_001305856.1,MorrisonKM.etal.,Physiologia Plantarum,2010,vol.140,p.334-341.)、大麦(X57844.1,SchnorrKM et al.,Mol.Gen.Genet.,1991,vol.227,p.411-416.)、高粱(XM_002444445.1)、小米(Setaria italic)(XM_004973598.2)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)(XM_003570500.2)、烟草(Nicotiana tabacum)(AB245431.1)、拟南芥(J03240.1,CrawfordNM.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1988,vol.85,p.5006-5010.)、荠菜(Capsellarubella)(XM_006300626.1)、欧洲油菜(Brassica napus)(D38220.1)、亚麻荠(Camelina)(XM_010473671.1)、蓖麻油植物(AF314093.1)、甜菜(Beta vulgaris ssp.)(EU163265.1)、萝卜(原变种)(Raphanus sativus var.sativus)(KM272859.1)、胡萝卜亚种(Daucus carotasubsp)(HQ402930.1)、大豆(Glycine max)(NM_001251221.1,Wu S.,et al.,PlantMol.Biol.,1995,vol.29,p.491-506.)、菜豆(Phaseolus vulgaris)(XM_007141046.1)、草莓(Fragaria)(XM_004300392.2)、苜蓿(HQ840748.1)、番茄(Solanum lycopersicum)(XM_004250307.2)、马铃薯(Solanum tuberosum)(NM_001288022.1)、黄瓜(Cucumis sativusL.)(HM755943.1)、香瓜(Cucumis melo)(XM_008462231.1)、南瓜(Cucurbita)(M33154.1)、菠菜(Spinacia oleracea)(M32600.1)、芝麻(Sesamum indicum)(XM_011099324.1)、棉花(Gossypium spp)(XM_012612465.1)、荷花(Nelumbo nucifera)(XM_010247609.1)、葡萄(Vitis vinifera)(JF796047.1)、桃(Amygdalus persica)(AB061670.1)、蜜柑(Citrusunshiu)(XM_006434048.1)、豆梨(Pyrus calleryana)(KC545876.1)、可可(Theobromacacao)(XM_007018888.1)、油棕(Elaeis guineensis)(XM_010910909.1)、海枣(Phoenixdactylifera)(XM_008796303.1)、麻风树(Jatropha curcas)(XM_012222767.1)、杨树(Populus)(XM_011013830.1)、桉树(Eucalyptus)(XM_010065034.1)、白桦(Betulaplatyphylla)(X54097.1)、阔叶椴(Tilia platyphyllos)(AY138811.1)、桑树(Morusalba)(KF992020.1)、小果野蕉(Musa acuminate)(XM_009419369.1)、小立碗藓(Physcomitrella patens)(AB231618.1)、小球藻(Chlorella)(U39930.1)、团藻(Volvox)(XM_002955110.1)和杜氏盐藻(Dunaliella salina)(KC108654.1)。

植物可以由在过程(b)中筛选的质体转化细胞形成。具体地，将筛选的质体转化细胞(质体转化体)转移到其中调节促进再生的激素的平衡的含亚硝酸盐的培养基中，并在明亮的地方培养。由此，形成植物。

在本发明的生产质体转化体的方法中，在过程(a)中，除了亚硝酸盐毒性中和基因之外，还将一种或两种或更多种的其它外源基因引入植物组织。因此，可以产生其中引入有亚硝酸盐毒性中和基因和其它外源基因的转化体。例如，当其他外源基因的表达盒和亚硝酸盐毒性中和基因的表达盒并入到同一载体中时，可以生产其中亚硝酸盐毒性中和基因和其它外源基因均并入质体基因组的质体转化体。其它外源基因没有特别限定，优选为构建体基因，更优选为编码可用作药物制剂或工业源材料的蛋白质的构建体基因。

外源基因的实例包括纤维素酶。

当引入有亚硝酸盐毒性中和基因和外源基因的转化体生长并增殖时，获得其中外源基因编码的蛋白质在转化体的质体内表达并积累的转化体。因此，当从转化体回收外源基因编码的蛋白质时，可以产生某些蛋白质。转化体可以以与转化前的宿主植物相同的方式生长和增殖。此外，考虑到蛋白质的特性，可以通过与从一般植物组织回收特定蛋白质时相同的方法从转化体回收蛋白质。例如，将转化体分解，然后均质化，通过色谱法等分馏所获得的组织提取物，并回收其中目标蛋白质浓缩的馏分。

也就是说，本发明的一个方面是一种生产蛋白质的方法。该方法包括其中将一种或两种或更多种物种的其它外源基因与编码具有中和亚硝酸盐毒性功能的蛋白质的基因一起引入植物组织中的过程；其中将引入了亚硝酸盐毒性中和基因的植物组织在至少包含具有抑制野生型植物细胞生长的浓度或抑制野生型植物再生的浓度的亚硝态氮的培养基中培养，由此筛选通过将基因插入质体基因组而获得的质体转化体的过程；由筛选的质体转化体形成植物的过程；以及从植物中回收由外源基因编码的蛋白质的过程。

特别地，本发明的生产质体转化体的方法优选用于生产迄今为止其基因引入和转化体筛选非常困难的单子叶植物的质体转化体。该方法优选用于产生禾本科(Poaceae)植物的质体转化体，禾本科植物例如水稻、高粱、玉米、小麦、大麦、燕麦、珍珠麦、柳枝稷、意大利黑麦草(Italian ryegrass)、多年生黑麦草(perennial ryegrass)、梯牧草(timothygrass)、牛尾草(Meadow fescue)、小米、狐尾粟(fixtail millet)、甘蔗和珍珠粟(pearlmillet)。例如，在快速生长植物如禾本科植物的大生物量植物中，当将编码有用蛋白质的基因并入质体基因组时，获得能够大规模生产有用蛋白质的质体转化体。

例如，在水稻质体转化体中，使用水稻的质体基因组DNA中的同源重组将亚硝酸还原酶基因插入质体基因组中，然后在含亚硝酸盐的培养基中培养以进行筛选。因此，可以获得水稻质体转化体。作为插入到水稻的质体基因组中的亚硝酸还原酶基因，可以使用来源于下述实施例中使用的水稻品种Kasalath的亚硝酸还原酶基因。可以通过专利文献3中描述的已知技术进行质体基因组DNA中的同源重组。例如，可以将插入在水稻质体基因组DNA的靶同源重组区之间并且其中并入有亚硝酸还原酶基因的载体引入水稻愈伤组织或其中质体分化的愈伤组织中。并入亚硝酸还原酶基因的质体基因组DNA的位置没有特别限定，优选插入在例如trnI基因和trnA基因之间。另外，为了筛选并入有亚硝酸还原酶基因的转化体，类似于专利文献2，用于筛选的培养优选在添加有具有在通常的野生型水稻中抑制植物的生长或再生的浓度的亚硝酸盐的培养基中进行。

实施例

接下来，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，本发明不限于以下实施例。

实施例1

<1>柳枝稷再生株的制备

通过60％(v/v)硫酸盐处理除去柳枝稷品种“Alamo”的成熟种子的皮，并且使用种子用杀真菌剂用于灭菌。将灭菌的种子通过次氯酸处理进一步进行表面灭菌，并保留在愈伤组织诱导培养基(PVC培养基：MS盐和维生素，30g/L麦芽糖，22.6μM 2,4-二氯苯氧基乙酸，4.4μM BAP，2.5mM MES，3g/L结冷胶，pH为5.7)中。将种子在28℃下在黑暗中培养几个月。然后，将生长的愈伤组织分类为每个种子衍生的独立株(independent strain foreach derived seed)。选择并培养其中预期具有再生能力的紧密愈伤组织生长的株。此外，所选株的紧密愈伤组织保留在再生培养基(PVS培养基：MS盐和维生素，30g/L麦芽糖，1.4μM赤霉素A₃，2.5mM MES，3g/L结冷胶，pH为5.7)上，在28℃、光照下培养4周，然后确认植物的再生能力。将证实具有高再生能力的株的愈伤组织继代培养并生长为实验材料。

<2>筛选可选择的药物

为了开发适于质体转化的新筛选方法，使用上述<1>中制备的再生株的愈伤组织来检查野生型植物细胞对各种药物的敏感性。根据当在具有不同药物浓度的PVC培养基上培养时是否生长柳枝稷愈伤组织来确认细胞对药物的敏感性。进一步地，对于一些药物，还确认了在具有不同药物浓度的PVS培养基上保留的愈伤组织和对植物再生的抑制效果。

表1显示了敏感性检查结果。在表中，“A”表示愈伤组织生长和植物再生被抑制，“B”表示愈伤组织生长和植物再生未被抑制，以及“-”表示未进行实验。

[表1]

<3>其中各种药物抗性基因用作选择标记的质体转化载体的制备

制备用于质体转化的载体，其中在上述<2>中确认了对正常细胞增殖有抑制作用的药物中对卡那霉素、氯霉素、争光霉素、噻草酮、氟禾草灵和亚硝酸钠具有抗性的基因用作选择标记基因。具体来说，可以使用AphA-6(卡那霉素抗性基因)、CAT(氯霉素抗性基因、Ble(争光霉素抗性基因)、mCT(噻草酮和氟禾草灵抗性基因：ACCase酶的突变的CT结构域)和PSR1(除来源于水稻品种Kasalath的亚硝酸还原酶基因的cDNA的5'末端的信号肽区域以外的区域)(SEQ ID NO：2)作为选择标记基因。使用分离的或通过PCR人工合成的选择标记基因。参考迄今为止已经报道的外源蛋白的高表达实例，选择并设计了其中发生了与质体基因组同源重组的区域、终止子和翻译控制序列(Daniell et al.,Methods in MolecularBiology,2005,Vol.286,p.111-138；Verma and Daniell,Plant Physiology,2007,Vol.145,p.1129-1143)。组分序列通过PCR扩增，并使用限制酶位点连接，或进行InFusion方法(Clontech)，从而制备载体。

图1显示质体转化载体的构建体。在图1中，“HR1”表示质体基因组同源重组序列(trnI区)(SEQ ID NO：3)，“HR2”表示质体基因组同源重组序列(trnA区)(SEQ ID NO：4)，“P1”表示启动子(rrn启动子)和与其下游连接的翻译控制序列(T7g10)，“SM”表示选择标记基因，“T1”表示终止子(psbA终止子)，“P2”表示启动子(psbA启动子)，“MCS”表示作为某些基因的插入位点的多克隆位点，以及“T2”表示终止子(rps16终止子)。

<4>绿色愈伤组织和丛生芽的形成

在上述<1>中制备的柳枝稷再生株中形成绿色愈伤组织和丛生芽。

具体地，在上述<1>中制备和继代培养的愈伤组织中，将在继代培养后培养3-4周的愈伤组织保留在绿化以及丛生芽诱导培养基(ML1R3培养基：Ahmadabadi et al.,(2007)Transgenic Research,vol.16,p.437-448)中，并在28℃光照下培养约4周，从而获得绿色愈伤组织和丛生芽。

<5>向柳枝稷质体中引入基因并筛选转化的细胞

将上述<3>中制备的质体转化载体引入柳枝稷绿色愈伤组织和丛生芽中，并筛选转化体细胞。作为用于比较引入效率的对照组，使用在绿化诱导前的继代培养愈伤组织。

首先，用手术刀将上述<4>中制备的柳枝稷绿色愈伤组织和丛生芽切碎成约2mm的组织片，并在PVC培养基的中心部位布置成直径为35mm的圆形。另外，将上述<3>中制备的质体转化载体用Hispeed Plasmid Midi Kit(可购自QIAGEN)纯化，并用0.6μm的金颗粒包覆。将涂有金颗粒的质体转化载体通过基因枪法引入布置在PVC培养基中的组织片中。根据Okuzaki等人的方法(Okuzaki and Tabei,Plant Biotechnology,2012,vol.29,p.307-310)进行DNA-金颗粒溶液的调整和通过基因枪法的基因引入。

将引入处理后的组织铺展在几个PVC培养基上，并在28℃下黑暗中培养4-7天。对于每种类型的质体转化载体，在表2的筛选条件下额外培养引入和培养后的组织，并筛选转化的质体和含有转化的质体的细胞。筛选培养后的组织保留在含有各种可选药物的PVS培养基上，并在28℃光照下诱导植物再生。

[表2]

<6>基因引入的确认

筛选培养后，从再生植物采样2mm片的组织。根据通过Phire Plant Direct PCRKit(可购自Thermo Fisher Scientific)使用特异性扩增转化载体片段的引物组的扩增DNA片段的存在，确认转化载体是否被引入。回收和纯化后，确认扩增的DNA片段的序列，并且片段确认为目标DNA片段。这些植物被证实为目标质体转化体。

另外，表3显示通过各种筛选方法进行引入实验的平板培养基的平板数并确认其中引入转化载体的转化体株的数量。在没有亚硝酸钠筛选的情况下，在筛选后再生的所有植物中，确认没有来源于转化载体的扩增DNA片段，并且未获得质体转化体。另一方面，在亚硝酸钠筛选中，通过在绿化诱导之前转化到愈伤组织，从48个平板获得15株质体转化体，并且通过转化到绿色愈伤组织和丛生芽，从12个平板获得5株质体转化体。基于这些结果，发现亚硝酸还原酶基因用作选择标记的亚硝酸钠筛选在获得质体转化体中是有效的，特别是，通过进行向绿色愈伤组织和丛生芽的引入非常有效地获得叶绿体转化体。

[表3]

<7>亚硝酸钠筛选的详细条件的研究

在亚硝酸钠筛选中，为了更有效地确定筛选浓度，在不同浓度的亚硝酸钠条件下培养野生型柳枝稷，并检查野生型细胞对亚硝酸钠的敏感性。

具体而言，在PVC培养基和含有浓度为0、0.25、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0g/L的亚硝酸钠的PVS培养基上，每个板上保留14个柳枝稷愈伤组织块，为每种浓度条件制备三个板。将PVC培养基在28℃下在黑暗中培养，并将PVS培养基在28℃光照下培养4周。培养后，测量在PVC培养基中生长的愈伤组织的数量，并测量在PVS培养基中再生植物的愈伤组织的数量。计算生长速率和再生速率。

图2A显示在不同浓度的亚硝酸盐中的愈伤组织生长速率的结果。图2B显示在不同浓度的亚硝酸钠中的植物再生速率的结果。PVC培养基中的愈伤组织生长在0.7g/L的亚硝酸钠中急剧降低，并且在0.9g/L或更高时完全抑制(图2A)。另一方面，PVS培养基中的植物再生在0.8g/L的亚硝酸钠中急剧降低，并在1.0g/L时完全抑制(图2B)。这些结果表明，在转化的柳枝稷细胞的筛选中亚硝酸钠的浓度优选为0.8g/L以上。

<8>保持通过亚硝酸钠筛选获得的插入基因

通过亚硝酸钠筛选进行筛选并通过在上述<6>中进行PCR确认了插入基因片段的扩增的再生植物被转移并开始在含有浓度为0.8g/L的亚硝酸钠的MS培养基(1/2MS盐和维生素，15g/L蔗糖，2.5mM MES，3g/L结冷胶，pH为5.7)中生根。然后，每1-2个月将样品在含有浓度为0.8g/L的亚硝酸钠的新MS培养基中继代培养。分离继代培养期间产生的分蘖，并根据相同的株进行继代培养。约1年后，以与上述<6>相同的方式对来自该株的5个单株植物进行PCR。结果，在一个单株中证实了扩增的DNA片段，并且证实了稳定维持的插入基因。图3显示了PCR扩增产物的电泳结果。在图3中，用箭头标记的条带表示扩增的DNA片段，“C”表示阳性对照(使用质体转化载体作为模板获得的PCR产物)流过的泳道。

实施例2

<1>向水稻质体中引入基因并筛选转化的细胞

将PSR1基因引入水稻品种Nipponbare和水稻品种Koshihikari的质体中，并使用亚硝酸钠筛选转化体。具体地，按如下进行。用作再生培养基的MS-NK培养基(Nishimura etal.,Nature Protocols,2006,Vol.1,p.2796-2802)最初含有硝态氮。野生型水稻品种Nipponbare在含有浓度为400mg/L的亚硝酸钠的MS-NK培养基中具有再生能力。然而，即使在亚硝酸还原酶弱且不加入亚硝酸钠的MS-NK培养基中，野生型水稻品种Koshihikari也不再生。

使用相关领域的方法诱导并制备来自根据成熟水稻种子培养的胚泡的愈伤组织。在N6D培养基(Nishimura et al.,Nature Protocols,2006,vol.1,p.2796-2802)的中心部位中将所获得的约2mm的愈伤组织布置在直径约35mm的圆中，并将其用作引入材料。以与实施例1<5>的柳枝稷相同的方式，制备DNA-金颗粒溶液并引入愈伤组织。将引入处理后的愈伤组织铺展在几种N6D培养基上，并在29.5℃下在黑暗中培养3-9天。然后，将来源于水稻品种Nipponbare的愈伤组织转移到含有浓度为800-1000mg/L的亚硝酸钠的MS-NK培养基中，将来源于水稻品种Koshihikari的愈伤组织转移到含有浓度为0-400mg/L的亚硝酸钠的MS-NK培养基中，并且在29.5℃下在明亮处诱导植物再生。从获得的再生个体中采样约2mm的组织片，以与柳枝稷相同的方式通过PCR确认目标DNA片段的插入。

[表4]

引入品种	引入试验板的数量	基因引入确认株数量
			Nipponbare	1	38
Koshihikari	2	49

表4显示进行引入实验的平板培养基的平板数和确认引入转化载体的转化株数量。在两个品种中，以比柳枝稷更高的效率引入基因。

工业实用性

生产质体转化体的方法具有优异的筛选效率，并且可以在双子叶植物和单子叶植物中高效生产质体转化体，因此在工业上极为有用。

序列表

<110> Honda Motor Co., Ltd.

<120> 生产质体转化体的方法

<130> H114343802

<160> 4

<210> 1

<211> 567

<212> PRT

<213> 水稻

<220>

<223> PSR1

<400> 1

Met Pro Val Gln Ser Ser Thr Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Thr Pro

1 5 10 15

Ala Ala Asp Glu Ala Val Ser Ala Glu Arg Leu Glu Pro Arg Val Glu

20 25 30

Gln Arg Glu Gly Arg Tyr Trp Val Leu Lys Glu Lys Tyr Arg Thr Gly

35 40 45

Leu Asn Pro Gln Glu Lys Val Lys Leu Gly Lys Glu Pro Met Ser Leu

50 55 60

Phe Met Glu Gly Gly Ile Lys Glu Leu Ala Lys Met Pro Met Glu Glu

65 70 75 80

Ile Glu Ala Asp Lys Leu Ser Lys Glu Asp Ile Asp Val Arg Leu Lys

85 90 95

Trp Leu Gly Leu Phe His Arg Arg Lys His Gln Tyr Gly Arg Phe Met

100 105 110

Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn Gly Val Thr Thr Ser Glu Gln Thr Arg

115 120 125

Tyr Leu Ala Ser Val Ile Glu Ala Tyr Gly Lys Glu Gly Cys Ala Asp

130 135 140

Val Thr Thr Arg Gln Asn Trp Gln Ile Arg Gly Val Thr Leu Pro Asp

145 150 155 160

Val Pro Ala Ile Leu Asp Gly Leu Asn Ala Val Gly Leu Thr Ser Leu

165 170 175

Gln Ser Gly Met Asp Asn Val Arg Asn Pro Val Gly Asn Pro Leu Ala

180 185 190

Gly Ile Asp Pro Asp Glu Ile Val Asp Thr Arg Ser Tyr Thr Asn Leu

195 200 205

Leu Ser Ser Tyr Ile Thr Ser Asn Phe Gln Gly Asn Pro Thr Ile Thr

210 215 220

Asn Leu Pro Arg Lys Trp Asn Val Cys Val Ile Gly Ser His Asp Leu

225 230 235 240

Tyr Glu His Pro His Ile Asn Asp Leu Ala Tyr Met Pro Ala Val Lys

245 250 255

Gly Gly Lys Phe Gly Phe Asn Leu Leu Val Gly Gly Phe Ile Ser Pro

260 265 270

Lys Arg Trp Glu Glu Ala Leu Pro Leu Asp Ala Trp Val Pro Gly Asp

275 280 285

Asp Ile Ile Pro Val Cys Lys Ala Val Leu Glu Ala Tyr Arg Asp Leu

290 295 300

Gly Thr Arg Gly Asn Arg Gln Lys Thr Arg Met Met Trp Leu Ile Asp

305 310 315 320

Glu Leu Gly Met Glu Ala Phe Arg Ser Glu Val Glu Lys Arg Met Pro

325 330 335

Asn Gly Val Leu Glu Arg Ala Ala Pro Asp Asp Leu Ile Asp Lys Lys

340 345 350

Trp Gln Arg Arg Asp Tyr Leu Gly Val His Pro Gln Lys Gln Glu Gly

355 360 365

Met Ser Tyr Val Gly Leu His Val Pro Val Gly Arg Val Gln Ala Ala

370 375 380

Asp Met Phe Glu Leu Ala Arg Leu Ala Asp Glu Tyr Gly Ser Gly Glu

385 390 395 400

Leu Arg Leu Thr Val Glu Gln Asn Ile Val Ile Pro Asn Val Lys Asn

405 410 415

Glu Lys Val Glu Ala Leu Leu Ala Glu Pro Leu Leu Gln Lys Phe Ser

420 425 430

Pro Gln Pro Ser Leu Leu Leu Lys Gly Leu Val Ala Cys Thr Gly Asn

435 440 445

Gln Phe Cys Gly Gln Ala Ile Ile Glu Thr Lys Gln Arg Ala Leu Leu

450 455 460

Val Thr Ser Gln Val Glu Lys Leu Val Ser Val Pro Arg Ala Val Arg

465 470 475 480

Met His Trp Thr Gly Cys Pro Asn Ser Cys Gly Gln Val Gln Val Ala

485 490 495

Asp Ile Gly Phe Met Gly Cys Leu Thr Lys Asp Ser Ala Gly Lys Ile

500 505 510

Val Glu Ala Ala Asp Ile Phe Val Gly Gly Arg Val Gly Ser Asp Ser

515 520 525

His Leu Ala Gly Ala Tyr Lys Lys Ser Val Pro Cys Asp Glu Leu Ala

530 535 540

Pro Ile Val Ala Asp Ile Leu Val Glu Arg Phe Gly Ala Val Arg Arg

545 550 555 560

Glu Arg Glu Glu Asp Glu Glu

565

<210> 2

<211> 1704

<212> DNA

<213> 水稻

<220>

<223> PSR1

<400> 2

atgcccgtgc agtcgtcgac ggtgtccgca ccgtcctcct cgactccggc ggcggacgag 60

gccgtgtcgg cggagcggct ggagccgcgg gtggagcagc gggagggccg gtactgggtg 120

ctcaaggaga agtaccggac ggggctgaac ccgcaggaga aggtgaagct ggggaaggag 180

cccatgtcat tgttcatgga gggcggcatc aaggagctcg ccaagatgcc catggaggag 240

atcgaggccg acaagctctc caaggaggac atcgacgtgc ggctcaagtg gctcggcctc 300

ttccaccgcc gcaaacatca gtatgggcgg ttcatgatgc ggctgaagct gccaaacggt 360

gtgacgacga gcgagcagac gaggtacctg gcgagcgtga tcgaggcgta cggcaaggag 420

ggctgcgccg acgtgacaac ccgccagaac tggcagatcc gcggcgtcac gctccccgac 480

gtgccggcca tcctcgacgg gctcaacgcc gtcggcctca ccagcctcca gagcggcatg 540

gacaacgtcc gcaaccccgt cggcaacccg ctcgccggca tcgaccccga cgagatcgtc 600

gacacgcgat cctacaccaa cctcctctcc tcctacatca ccagcaactt ccagggcaac 660

cccaccatca ccaacctgcc gaggaagtgg aacgtgtgcg tgatcgggtc gcacgatctg 720

tacgagcacc cgcacatcaa cgacctcgcg tacatgccgg cggtgaaggg cggcaagttc 780

gggttcaacc tccttgtcgg cgggttcatc agccccaaga ggtgggagga ggcgctgccg 840

ctggacgcct gggtccccgg cgacgacatc atcccggtgt gcaaggccgt tctcgaggcg 900

taccgcgacc tcggcaccag gggcaaccgc cagaagaccc gcatgatgtg gctcatcgac 960

gaacttggaa tggaggcttt tcggtcggag gtggagaaga ggatgccgaa cggcgtgctg 1020

gagcgcgctg cgccggacga cctcatcgac aagaaatggc agaggaggga ctacctcggc 1080

gtgcacccgc agaagcagga agggatgtcc tacgtcggcc tgcacgtgcc cgtcggccgg 1140

gtgcaggcgg cggacatgtt cgagctcgcc cgccttgccg acgagtatgg ctccggcgag 1200

ctccgcctca ccgtggagca gaacatcgtg atcccgaacg tcaagaacga gaaggtggag 1260

gcgctgctcg ccgagccgct gcttcagaag ttctccccgc agccgtcgct gctgctcaag 1320

ggcctggtcg cgtgcaccgg caaccagttc tgcggccagg ccatcatcga gacgaagcag 1380

cgggcgctgc tggtgacgtc gcaggtggag aagctcgtgt cggtgccccg ggcggtgcgg 1440

atgcactgga ccggctgccc caacagctgc ggccaggtgc aggtcgccga catcggcttc 1500

atgggctgcc tcaccaagga tagcgccggc aagatcgtcg aggcggccga catcttcgtc 1560

ggcggccgcg tcggcagcga ctcgcacctc gccggcgcgt acaagaagtc cgtgccgtgc 1620

gacgagctgg cgccgatcgt cgccgacatc ctggtcgagc ggttcggggc cgtgcggagg 1680

gagagggagg aggacgagga gtag 1704

<210> 3

<211> 2127

<212> DNA

<213> 柳枝稷

<220>

<223> HR1

<400> 3

gcactctgct gggccgacac tgacactgag agacgaaagc taggggagca aatgggatta 60

gagaccccag tagtcctagc cgtaaacgat ggatactagg tgctgtgcga ctcgacccgt 120

gcagtgctgt agctaacgcg ttaagtatcc cgcctgggga gtacgttcgc aagaatgaaa 180

ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa 240

agcgaagaac cttaccaggg cttgacatgc cgcgaatcct cttgaaagag aggggtgccc 300

tcgggaacgc ggacacaggt ggtgcatggc tgtcgtcagc tcgtgccgta aggtgttggg 360

ttaagtctcg caacgagcgc aaccctcgtg tttagttgcc actataagtt tggaaccctg 420

aacagaccgc cggtgttaag ccggaggaag gagaggatga ggccaagtca tcatgcccct 480

tatgccctgg gcgacacacg tgctacaatg ggcgggacaa agggtcgcga tctcgcgagg 540

gtgagctaac tccaaaaacc cgtcctcagt tcggattgca ggctgcaact cgcctgcatg 600

aagcaggaat cgctagtaat cgccggtcag ccatacggcg gtgaatccgt tcccgggcct 660

tgtacacacc gcccgtcaca ctataggagc tggccgggtt tgaagtcatt acccttaacc 720

gtaaggaggg ggatgcctaa ggctaggctt gcgactggag tgaagtcgta acaaggtagc 780

cgtactggaa ggtgcggctg gatcacctcc ttttcaggga gagctaatgc ttatgcttat 840

tgggtatttt ggtttgacat tgcttcacgc ccaaaaacaa aaagaaggca gctacgtctg 900

aactaaactt ggatatggaa gtcttctttc gtttagggtg aagtaagacc aagctcatga 960

gcttattatc ctaggtcgga acaaattagt tgatagtgat aggatcccct ttttgacgtc 1020

cccatgtccc cccgtgtggc ggcatgggga tgtcaaaagg aaagggatgg agtttttctc 1080

gcttttggcg tagcaggcct ccctttggga ggcccgcgcg acgggctatt agctcagtgg 1140

tagagcgcgc ccctgataat tgcgtcgttg tgcctgggct gtgagggctc tcagccacat 1200

ggatagttca atgtgctcat cagcgcctga cccgaagatg tggatcatcc aaggcacatt 1260

agcatggcgt actcctcctg tttgaatcgg agtttgaaac caaacaaact tctcctcagg 1320

aggatagatg gggcgattca ggtgagatcc catgtagatc taactttcta ttcactcgtg 1380

ggatccgggc ggtccggggg ggggccaccg cggctcctct cttctcgaga atccatacat 1440

cccttatcag tgtatggaga gctatctctc gagcacaggt tgaggttcgt cctcaatggg 1500

aaaatggagc acctaacaac gcatcttcac agaccaagaa ctacgagatc acccctttca 1560

ttctggggtg acggagggat cgtaccattc gagccttttt ttcatgcttt tcccggcggt 1620

ctggagaaag cagtaatcaa taggacttcc ctaatcctcc cttcctgaaa ggaagaacgt 1680

gaaattcttt ttcctttctg cagggaccag gagattggat ctagccataa gaggaatgct 1740

tggtataaat aagccacttc ttggtcttcg accccctaag tcactacgag cgcccccgat 1800

cagtgcaatg ggatgtggct atttatctat ctcttgactc gaaatgggag cagagcaggt 1860

ttgaaaaagg atcttagagt gtctagggtt gggccaggag ggtctcttaa ccccttcctt 1920

tttctgccca tcggagttat ttcccaagga cttgccatgg taagggggag aagggggaag 1980

aagcacactt gaagagcgca gtacaacggg gagttgtatg ctgcgttcgg gaaggatgaa 2040

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<210> 4

<211> 2071

<212> DNA

<213> 柳枝稷

<220>

<223> HR2

<400> 4

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ctgtttcggt gcgggctgcg cgagcggtac caaatcgagg caaactctga atactagata 2040

tgacccaaac aggggtcaag gtcggccagt g 2071

Claims

1.一种生产质体转化体的方法，其包括：

过程(a)，其中将编码具有中和亚硝酸盐毒性功能的蛋白质的基因引入植物组织中；和

过程(b)，其中将在过程(a)中插入基因的植物组织在包含具有抑制野生型植物细胞生长的浓度或抑制野生型植物再生的浓度的亚硝态氮的培养基中培养，从而筛选通过将基因插入质体基因组而获得的质体转化体。

2.根据权利要求1所述的生产质体转化体的方法，其中所述基因为亚硝酸还原酶基因。

3.根据权利要求1或2所述的生产质体转化体的方法，其中所述质体包括至少一种选自叶绿体、白色体、造粉体、黄化质体、油质体、蛋白质体和前质体的质体。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的生产质体转化体的方法，其中所述过程(a)还包括将一种或两种或更多种物种的其它外源基因引入所述植物组织中。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的生产质体转化体的方法，其中所述过程(b)还包括由筛选的质体转化体形成植物。

6.质体转化体，其中编码具有中和亚硝酸盐毒性功能的蛋白质的基因插入在质体基因组中。

7.根据权利要求6所述的质体转化体，其中所述基因为亚硝酸还原酶基因。

8.一种生产蛋白质的方法，包括从通过权利要求4所述的生产质体转化体的方法产生的质体转化体或从由所述质体转化体形成的植物中回收由外源基因编码的蛋白质。