JP6696806B2 - プラスチド形質転換体の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、プラスチド形質転換体の製造方法に関する。より詳細には、分化したプラスチドを有する植物組織に外来遺伝子を導入し、亜硝酸還元酵素遺伝子等の亜硝酸の毒性を消去するタンパク質をコードする遺伝子を選抜マーカー遺伝子として形質転換体の選抜を行うプラスチド形質転換体を製造する方法に関する。

植物のプラスチド（色素体）は、植物細胞内にある色素を含んだ細胞小器官であり、独自のゲノムを有し、自己増殖を行う。プラスチドの１種である葉緑体は、植物細胞を最も特徴づけるものであり、光合成や、炭素・窒素・硫黄同化等を行う。葉緑体は、そのゲノム中に緑葉における全可溶性タンパク質の５０％にものぼるタンパク質をコードする遺伝子を含んでおり、非常に高いタンパク質合成能力を有する。特に高等植物では、細胞内に多数の葉緑体が存在しており、葉緑体ゲノムの数は核ゲノムの５，０００〜１０，０００倍と言われている。植物体中に多数存在する葉緑体に外来遺伝子を導入することにより、当該外来遺伝子がコードするタンパク質を植物体中で大量生産させることができるため、プラスチド形質転換技術は、安価なタンパク製造技術の１つとして注目されている。

高等植物のプラスチド形質転換は、基本的には、プラスチドゲノムと相同な配列間に目的遺伝子と薬剤選抜マーカー遺伝子を挟むように設計したベクターを導入することにより行う。当該ベクターをパーティクルガンにより植物細胞に導入した後、相同組換えにより形質転換したプラスチドゲノムを含む細胞を選抜薬剤入りの培地（選抜培地）上で繰り返し培養し、形質転換プラスチドを含む細胞を選抜する。この過程で野生型プラスチドと形質転換プラスチドが混在する状態（ヘテロプラズミック）の細胞集団を、全ての細胞が形質転換プラスチドを保持する状態（ホモプラズミック）へと変え、選抜されたホモプラズミック形質転換細胞から植物体を再生することによりプラスチド形質転換植物を得る。すなわち、プラスチド形質転換法は大きく、プラスチドゲノムへの外来遺伝子の導入による形質転換工程と、形質転換したプラスチドゲノムを含む細胞、植物体を選抜する工程から構成される。

このような方法による高等植物のプラスチド形質転換はこれまでに多くの植物で試みられているが、安定した形質転換系が確立されているのは双子葉植物であるタバコのみである。タバコのプラスチド形質転換法では、緑葉からの再分化系を利用した葉組織片への導入が一般的である。導入後の形質転換プラスチドの選抜は、スペクチノマイシン／ストレプトマイシン不活化遺伝子（アミノグリコシド３’−アデニルトランスフェラーゼ；ａａｄＡ）を選抜マーカーとしたスペクチノマイシン耐性選抜（非特許文献１参照。）、カナマイシン耐性遺伝子を選抜マーカーとしたカナマイシン耐性選抜（非特許文献２、３参照。）、ｂａｒ遺伝子による除草剤ホスフィノスリシン（ＰＰＴ）耐性選抜（非特許文献４参照。）等により行われている。

一方、単子葉植物では、双子葉植物で成功している選抜方法を用いてプラスチド形質転換体の作製が試みられている。例えば、タバコと同様のａａｄＡ遺伝子／ストレプトマイシン選抜又はｂａｒ遺伝子／ＰＰＴ選抜により、イネのカルス（脱分化細胞群）へのプラスチド形質転換を行ったことが報告されている（非特許文献５、６、７参照。）。しかし、いずれの報告においても、作製されたのはヘテロプラズミック形質転換体であり、ホモプラズミック形質転換体は得られておらず、さらに形質転換体の作製効率も低かった。その他、トウモロコシの多芽体を導入材料とし、ａａｄＡ遺伝子選抜によりプラスチド形質転換体が作製できるとの報告があるものの、具体的な方法についての詳細は不明である（特許文献１参照。）。

このように、単子葉植物においてプラスチド形質転換が困難であるのは、双子葉植物で成功している選抜方法では単子葉植物の選抜が難しいことが大きな要因であると考えられる。薬剤に対する感受性や細胞内の応答系はそれぞれの種で異なるため、目的の種に応じた従来選抜法の改変や新規選抜系の開発が必要である。実際に、単子葉植物は、タバコ等で広く利用されているスペクチノマイシンに耐性を持つため、ａａｄＡ遺伝子／スペクチノマイシン選抜によっては、非形質転換体を完全に除くことができない。

単子葉植物に有効な形質転換体の選抜方法としては、核ゲノムをターゲットとした形質転換において、いくつかの薬剤耐性遺伝子を選抜マーカーとする選抜方法が開発されている。最も広く利用されているのは、抗生物質ハイグロマイシンとその耐性遺伝子による選抜方法であり、除草剤ホスフィノスリシンやグリホサートによる選抜法も有効に利用されている。ただし、核ゲノムの真核型タンパク質発現系は、原核型システムを含むプラスチドゲノムのタンパク質発現系と異なるため、真核型システムのみに有効なハイグロマイシンはプラスチド形質転換法には利用できない。核ゲノムをターゲットとした形質転換において使用されている薬剤耐性遺伝子を用いた選抜方法の中には、単子葉植物プラスチド形質転換法に適用可能なものもあるが、それらの選抜効果は限定的かつ不安定である（非特許文献７参照。）。その他、単子葉植物イネにおいて、核ゲノムをターゲットとした形質転換における選抜方法としては、亜硝酸還元酵素遺伝子を選抜マーカー遺伝子とした核形質転換法が報告されている（特許文献２、非特許文献８参照。）。

一方で、形質転換工程に関わる技術のうち、プラスチドへの遺伝子導入を促進する方法として、プラスチドが分化し、かつ、再分化能が低下していないカルスに外来遺伝子を導入する方法が開示されている（特許文献３参照。）。当該方法は、葉緑体の発達を促進する転写因子を過剰発現させた形質転換イネから誘導された緑色カルスを導入材料として利用するものであり、通常導入材料とされるプラスチドが未発達な黄白色カルスへの導入と比較して導入効率が上昇することが示されている。しかしながら当該方法は、あらかじめ核ゲノムへの形質転換を行って適切に緑化カルスを形成する系統を作製する必要があり、工程の増加に加え、他の単子葉植物への適用性も不明である。

米国特許出願公開第２００５／０１９８７０４号明細書 国際公開第２００５／０１２５２０号 特許第５３２０７８２号公報

Svab and Maliga，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1993，vol.90，p.913-917. Carrer et al.，Molecular Genetics and Genomics，1993，vol.241，p.49-56. Hunag et al.，Molecular Genetics and Genomics，2002，vol.268，p.19-27. Ye et al.，Plant Physiology，2003，vol.133，p.402-410. Khan and Maliga，Nature Biotechnology，1999，vo.17，p.910-915. Lee et al.，Molecules and Cells，2006，vol.21，p.401-410. Li et al.，Agricultural Sciences in China，2009，vol.8，p.643-651. Nishimura et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，vol.102，p.11940-11944.

特許文献２等において報告されている亜硝酸還元酵素遺伝子を選抜マーカー遺伝子とした核形質転換方法を用いることにより、充分な選抜効率によってイネの核形質転換体を作製できる。しかし、当該選抜方法が、プラスチド形質転換にも適用できるかどうかは不明であった。

本発明は、単子葉植物を含む広い植物種において、これまで遺伝子導入や薬剤耐性を利用した形質転換体の選抜が非常に困難であったプラスチド形質転換体を効率よく製造する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく研究した結果、プラスチド形質転換体の作成においても、亜硝酸還元酵素遺伝子等の亜硝酸の毒性を消去するタンパク質をコードする遺伝子を選抜マーカー遺伝子として用いることによって選抜効率を顕著に改善することができ、植物において広くプラスチド形質転換体を効率よく作製できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明に係るプラスチド形質転換体の製造方法、タンパク質の製造方法、及びプラスチド形質転換体の培養方法は、下記［１］〜［６］である。
［１］ （ａ）植物組織に、亜硝酸の毒性を消去するタンパク質をコードする遺伝子を導入する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において前記遺伝子が導入された植物組織を、野生型の植物細胞は増殖又は植物体再生が抑制される濃度の亜硝酸態窒素を含有する培地で培養し、プラスチドゲノムに前記遺伝子が導入されたプラスチド形質転換体を選抜する工程と、
を有し、
前記遺伝子が亜硝酸還元酵素遺伝子であることを特徴とする、プラスチド形質転換体の製造方法。
［２］ 前記プラスチドが、葉緑体、白色体、アミロプラスト、エチオプラスト、エライオプラスト、プロテイノプラスト、又は原色素体（プロプラスチド）である、前記［１］又は［２］のプラスチド形質転換体の製造方法。
［３］ 前記工程（ａ）において、前記植物組織に、さらに１種又は２種以上のその他の外来遺伝子を導入する、前記［１］又は［２］のプラスチド形質転換体の製造方法。
［４］ 前記工程（ｂ）において選抜されたプラスチド形質転換体から、植物体を形成する、前記［１］〜［３］のいずれかのプラスチド形質転換体の製造方法。
［５］前記［３］のプラスチド形質転換体の製造方法を行い、製造されたプラスチド形質転換体又は前記プラスチド形質転換体から形成された植物体から、前記外来遺伝子がコードするタンパク質を回収することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
［６］ 亜硝酸還元酵素遺伝子がプラスチドゲノムに導入された、プラスチド形質転換体を、亜硝酸含有培地で培養する、プラスチド形質転換体の培養方法。

本発明に係るプラスチド形質転換体の製造方法は、選抜効率が優れているため、双子葉植物と単子葉植物のいずれにおいても、プラスチド形質転換体を非常に効率よく製造することができる。特に、亜硝酸の毒性を消去するタンパク質をコードする遺伝子を選抜マーカー遺伝子として用いる選抜方法は、多くの植物における選抜方法として非常に適している。

スイッチグラスプラスチド形質転換ベクターの構造の模式図である。 実施例１＜７＞において、各亜硝酸ナトリウム濃度におけるスイッチグラスのカルス増殖率の結果を示した図である。 実施例１＜７＞において、各亜硝酸ナトリウム濃度におけるスイッチグラスの植物体の再生率の結果を示した図である。 実施例１＜８＞において、継代・維持植物体５個体の形質転換ベクターの導入の有無を確認するためのＰＣＲにおいて得られたＰＣＲ増幅産物の電気泳動像である。

本発明に係るプラスチド形質転換体の製造方法は、下記工程（ａ）及び（ｂ）を有することを特徴とする。
（ａ）植物組織に、亜硝酸の毒性を消去するタンパク質をコードする遺伝子を導入する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において前記遺伝子が導入された植物組織を、野生型の植物細胞は増殖又は植物体再生が抑制される濃度の亜硝酸態窒素を含有する培地で培養し、プラスチドゲノムに前記遺伝子が導入されたプラスチド形質転換体を選抜する工程。

本発明に係るプラスチド形質転換体の製造方法においては、選抜マーカーとして「亜硝酸の毒性を消去するタンパク質をコードする遺伝子」（以下、「亜硝酸毒性消去遺伝子」ということがある。）を用いる。植物において亜硝酸は、プラスチド内で行われる窒素代謝過程の中間代謝物であり、細胞毒性を引き起こすことが知られている。通常は、亜硝酸還元酵素により速やかにアンモニアに代謝されているため毒性影響は見られないが、内在の亜硝酸還元酵素の代謝能を超える量の亜硝酸条件で培養すると、カルス増殖及び植物体の再生が著しく抑制される。プラスチド形質転換によりプラスチド内に亜硝酸毒性消去遺伝子を導入することによって、形質転換体では、亜硝酸の毒性を消去するタンパク質により植物体内の過剰な亜硝酸が代謝される結果、内在の亜硝酸還元酵素の代謝能を超える量の亜硝酸条件であっても生存が可能になる。

亜硝酸毒性消去遺伝子としては、亜硝酸還元酵素遺伝子が好ましい。亜硝酸還元酵素遺伝子としては、亜硝酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするものであれば特に限定されるものではなく、宿主となる植物種由来の亜硝酸還元酵素遺伝子であってもよく、宿主とは異なる生物種由来の亜硝酸還元酵素遺伝子であってもよい。また、元々生物が有している天然の亜硝酸還元酵素をコードした遺伝子であってもよく、天然の亜硝酸還元酵素を適宜改変したタンパク質をコードした遺伝子であってもよい。当該改変としては、例えば、亜硝酸還元酵素活性を損なうことなく、１個又は複数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加させるものや、亜硝酸還元酵素のＮ末端やＣ末端に、各種タグを付加するもの等が挙げられる。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現・精製において汎用されているタグを用いることができる。また、天然の亜硝酸還元酵素をコードした遺伝子の場合、天然の亜硝酸還元酵素遺伝子であってもよく、縮重コドンを、宿主となる植物においてコドン使用頻度の高いものに置換した亜硝酸還元酵素遺伝子であってもよい。

亜硝酸還元酵素遺伝子としては、具体的には、フェレドキシン亜硝酸還元酵素をコードする遺伝子（ＮｉＲ遺伝子）が挙げられる。フェレドキシン亜硝酸還元酵素は、フェレドキシンを電子供与体として機能する亜硝酸還元酵素であり、亜硝酸イオンをアンモニアに変換する作用を持つ。亜硝酸還元酵素遺伝子としては、例えば、イネ由来のＮｉＲ遺伝子（D50556.1、非特許文献８）、トウモロコシ由来のＮｉＲ遺伝子（EU957616.1，XP_008648080.1、Lahners K. et al., Plant Physiol. 1988, vol. 88, p741-746）、コムギ由来のＮｉＲ遺伝子（FJ527909.1）、オオムギ由来のＮｉＲ遺伝子（AK371794.1,S78730.1）、ソルガム由来のＮｉＲ遺伝子（XM_002454557.1）等の単子葉植物由来の亜硝酸還元酵素遺伝子や、タバコ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（AB093533.1,AB245431.1、Kronenberger J. et al., Mol. Gen. Genet., 1993, vol. 236, p203-208.）、シロイヌナズナ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（NM_127123.2）、キュウリ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（EF397679.1）、ジャガイモ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（U76701.1）、ウマゴヤシ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（XM_003614772.1）、チャノキ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（JX987133.1）、マメナシ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（KC545876.1）、モモ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（AB061671.1）、イヌカタヒバ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（XM_002987367.1）、ホウレンソウ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（Back E. et al., Mol. Gen. Genet., 1988, vol. 212, p20-26.）等の双子葉植物由来の亜硝酸還元酵素遺伝子や、ヒメツリガネゴケ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（XM_001776973.1）、クラミドモナス由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（XM_001696735.1）、クロレラ由来の亜硝酸還元酵素遺伝子（XM_005844460.1）等の藻類やコケ類由来の亜硝酸還元酵素遺伝子等が挙げられる（番号は、いずれもＮＣＢＩ登録番号）。工程（ａ）において植物組織に導入される亜硝酸還元酵素遺伝子としては、ＮｉＲ遺伝子が好ましく、単子葉植物由来のＮｉＲ遺伝子がより好ましく、イネ科植物由来のＮｉＲ遺伝子がさらに好ましく、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ亜硝酸還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子がよりさらに好ましい。

亜硝酸還元酵素遺伝子以外であっても、植物体内における亜硝酸濃度を低下させるタンパク質や、亜硝酸による毒性を軽減させ得る機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を、亜硝酸毒性消去遺伝子として用いることができる。例えば植物細胞内では、硝酸還元酵素による亜硝酸を一酸化窒素に還元する経路の存在が知られており、また、一部の細菌では、亜硝酸から硝酸を生成する亜硝酸酸化酵素が存在する。これらの酵素は、亜硝酸還元酵素遺伝子と同様に亜硝酸の存在量を減少させることによって亜硝酸の毒性を直接的に打ち消すことができる。一方、亜硝酸により引き起こされる細胞毒性は亜硝酸がペルオキシダーゼやヘモグロビンと反応することにより発生する二酸化窒素がタンパク質の酸化やニトロ化、膜脂質の過酸化、ＤＮＡの突然変異等を誘発することに起因すると推測されている。したがって、亜硝酸と作用するペルオキシダーゼやヘモグロビンの存在量又は作用機序の調節により間接的に亜硝酸毒性を消去できる可能性もある。そこで、亜硝酸と作用するペルオキシダーゼの存在量を低下させるタンパク質をコードする遺伝子や、ペルオキシダーゼやヘモグロビンによって生じた二酸化窒素がタンパク質の酸化等を誘発することを抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子も、亜硝酸毒性消去遺伝子として用いることができる。

本発明に係るプラスチド形質転換体の製造方法においては、工程（ａ）において、形質転換体の選抜マーカーとして用いる亜硝酸毒性消去遺伝子を導入する。具体的には、亜硝酸毒性消去遺伝子を組込んだベクターを植物組織へ導入する。

亜硝酸毒性消去遺伝子を組込むベクターとしては、プラスチド内において当該ベクターに組み込まれた外来遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限されるものではない。当該ベクターとしては、例えば、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）やｐＵＣ系ベクターなどをベクターバックボーンとして使用し、これらのマルチクローニングサイト等に、プラスチドゲノム配列中の隣接する２種の相同組換えターゲット配列をクローニングする。当該２種の相同組換えターゲット配列の間に上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、５’調節領域、亜硝酸毒性消去遺伝子のポリヌクレオチド、ターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットを組込むことにより、亜硝酸毒性消去遺伝子をプラスチド内で発現させるベクターが得られる。また、亜硝酸毒性消去遺伝子の上流にプロモーター配列を組込まず、プラスチドゲノム内の内生遺伝子のプロモーター配列又はその下流の配列を相同組換えターゲット配列の１つとし、その下流に５’調節領域、亜硝酸毒性消去遺伝子のポリヌクレオチド、ターミネーター配列、もう一方の相同組換えターゲット配列を順に有するプロモーターレス発現カセットを組込むことによっても亜硝酸毒性消去遺伝子をプラスチド内で発現させるベクターが得られる。なお、ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組込みは、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより行うことができ、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。

当該ベクターにおいて、亜硝酸毒性消去遺伝子の上流にあり、亜硝酸毒性消去遺伝子を発現させるプロモーターとしては、プラスチド内でプロモーターとして機能するものであればよく、特に限定されるものではないが、原核型のプロモーターであることが好ましい。

プラスチド内で亜硝酸毒性消去遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、例えば、リボゾームＲＮＡオペロンプロモーター（Ｐｒｒｎ）、光化学系ＩＩのＤ１タンパク質をコードするｐｓｂＡ遺伝子プロモーター（ＰｐｓｂＡ）、リブロース−１，５−ジリン酸カルボキシラーゼの大サブユニットをコードするｒｂｃＬ遺伝子プロモーター（ＰｒbｃＬ）などが挙げられる。

また、亜硝酸毒性消去遺伝子配列の上流に付加する５’調節領域の配列としては、例えば、大腸菌ファージＴ７のｇｅｎｅ１０遺伝子５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、ｒｂｃＬ遺伝子の５’−ＵＴＲ、ｐｓｂＡ遺伝子の５’−ＵＴＲ、Ｈ^＋−ＡＴＰａｓｅβサブユニット遺伝子ａｔｐＢ遺伝子の５’−ＵＴＲ、ｐｓｂＡ遺伝子の翻訳開始コドン下流の配列（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｂｏｘ：ＤＢ−ｂｏｘ）、破傷風菌毒素断片Ｃ遺伝子ＴｅｔＣのＤＢ−ｂｏｘ、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ遺伝子のＤＢ−ｂｏｘ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタイプＩＩ遺伝子ＮＰＴIIのＤＢ−ｂｏｘなどが挙げられる。

工程（ａ）において、植物組織へのベクターの導入は、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。

工程（ａ）において亜硝酸毒性消去遺伝子を導入するための導入材料となる植物組織は、植物由来の組織であれば特に限定されるものではない。例えば、植物の形質転換体の作製において一般的に導入材料として用いられる未分化のカルスに、亜硝酸毒性消去遺伝子を導入することができる。未分化のカルスは、常法により調製することができる。

なお、工程（ａ）の形質転換において、亜硝酸毒性消去遺伝子を導入する材料としては、亜硝酸態窒素に対する感受性が、野生型の植物組織と同程度のものであればよく、その遺伝子型は特に限定されるものではない。すなわち、当該導入材料は、野生型の植物組織であってもよく、何等かの遺伝子改変がなされた変異型の植物組織であってもよい。

工程（ａ）の形質転換において、亜硝酸毒性消去遺伝子を導入する材料としては、発達したプラスチドを有する植物組織を用いてもよい。未分化のカルスではプラスチドは発達しておらず、未分化のプロプラスチド（原色素体）であるが、発達したプラスチドを有する植物組織を導入材料とすることにより、プラスチドゲノムへの形質転換効率を改善することができる。

導入材料として用いる発達したプラスチドを有する植物組織としては、分化した植物体の組織であってもよく、カルスをプラスチドが発達するまで分化させたものであってもよい。プラスチドの分化誘導は、カルスの培養条件の調整や植物ホルモン処理等により行うことができる。なお、プラスチドとしては、アミロプラスト、葉緑体、エチオプラスト、エライオプラスト、プロテイノプラスト、有色体、白色体、原色素体（プロプラスチド）を挙げることができる。本発明においては、葉緑体、アミロプラスト、エチオプラスト、白色体、又は原色素体が好ましく、特に原色素体及び葉緑体が好ましい。

例えば、プラスチドが葉緑体の場合には、植物体の葉や茎の切片を導入材料として用いてもよく、緑化カルスや多芽体等のようにカルスから葉緑体分化が誘導されたものであってもよい。緑化カルスは、カルス中のプロプラスチドが葉緑体に分化するように誘導されたものである。また、多芽体は、カルスが分化し、塊状の多数の芽を持つ組織が形成されたものである。カルスから緑化カルスや多芽体への誘導は、オーキシン、サイトカイニン等の分化や脱分化に寄与する植物ホルモンのバランスが調節された培地でカルスを培養することにより行うことができる。例えば、カルスの培養培地のオーキシン濃度を低下させ、サイトカイニン濃度を上昇させることにより、葉緑体形成が誘導され、緑化カルスが得られる。また、多芽体は、カルスの培養培地からサイトカイニンのみを低濃度に含有させた培地でカルスを培養することにより得られる。

葉緑体分化を誘導するカルスとしては、葉等の葉緑体を多く含む組織の細胞を脱分化させたカルスであってもよく、完熟種子や未熟胚、根等の非緑色組織の細胞を脱分化させたカルス（非緑色組織由来のカルス）であってもよい。カルスは、植物組織をオーキシン、サイトカイニン等の植物ホルモンを含有する培地で培養するなど、常法により製造できる。

発達したプラスチドを有する植物組織は、カルスに、プラスチドの分化を促進するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させることによって得ることもできる。また、プラスチドの分化を促進するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させた形質転換体由来のカルスを誘導してプラスチドが形成されるように分化させたものであってもよい。分化を誘導するタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、転写因子であるＧＬＫ遺伝子（Rossini et al.，Plant Cell，2001，vol.13，p.1231-1244.）や、シロイヌナズナのＣＥＳ１０１遺伝子（ＲＬＫ ｆａｍｉｌｙ：Niwa et al.，Plant Cell Physioly，2006，vol.47，p.319-331.）等が挙げられる（特許文献３参照。）。プラスチドの分化を促進するタンパク質をコードする遺伝子のカルス又は植物体への導入は、植物体への形質転換において一般的に用いられている方法を用いて行うことができる。

次いで、工程（ｂ）として、工程（ａ）において亜硝酸毒性消去遺伝子が導入された植物組織を、野生型の植物細胞は増殖又は植物体再生の少なくともいずれかが抑制される濃度の亜硝酸態窒素を含有する培地で培養し、プラスチドゲノムに亜硝酸毒性消去遺伝子が導入されたプラスチド形質転換細胞（プラスチド形質転換体）を選抜する。

植物体においては、培地から吸収された硝酸態窒素は、細胞質内でまず硝酸還元酵素によって亜硝酸に還元される。生じた毒性のある亜硝酸態窒素は、プラスチド内に取り込まれた後、亜硝酸還元酵素等の亜硝酸毒性消去遺伝子がコードするタンパク質によって速やかにアンモニアに変換され、窒素源として細胞増殖・植物体の再生に利用される。植物体を過剰な亜硝酸を含む培地上で培養した場合、野生型プラスチドのみを持つ細胞は亜硝酸代謝が滞り、蓄積した亜硝酸の毒性により細胞は死滅する。一方で、プラスチド形質転換により亜硝酸毒性消去遺伝子の過剰発現カセットが組込まれた形質転換プラスチドを含む細胞は、亜硝酸代謝が活発化されるため細胞増殖・植物体再生が可能となる。つまり、工程（ｂ）においては、プラスチドゲノムに亜硝酸毒性消去遺伝子が導入されたプラスチド形質転換体は増殖又は分化できるが、非形質転換体は、増殖が抑制され、最終的には死滅する。

培地から吸収された硝酸態窒素が硝酸還元酵素によって亜硝酸に還元された後、生じた亜硝酸態窒素がプラスチド内で亜硝酸毒性消去遺伝子がコードするタンパク質によって速やかにアンモニアに変換されるという亜硝酸代謝系は、ほぼ全ての植物において保存されている代謝系である（Krapp A. Current Opinion in Plant Biology, 2015, vol. 25, p115-122.）。つまり、亜硝酸毒性消去遺伝子を選抜マーカーとして用いる本発明に係るプラスチド形質転換体の製造方法は、様々な植物において実施することができる。実際に、ＮｉＲ遺伝子等の亜硝酸還元酵素遺伝子を有する多くの植物種において、硝酸還元酵素遺伝子は、イネ（X15819.1、Hamat HB et al.，Mol. Gen. Genet., 1989, vol.218, p93-98.）、トウモロコシ（NM_001305856.1、Morrison KM. etal., Physiologia Plantarum, 2010, vol.140, p334-341.）、オオムギ（X57844.1、Schnorr KM et al., Mol. Gen. Genet., 1991, vol. 227, p411-416.）、ソルガム（XM_002444445.1）、アワ（XM_004973598.2）、ブラキポディウム（XM_003570500.2）、タバコ （AB245431.1）、シロイヌナズナ（J03240.1、Crawford NM. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, vol.85, p5006-5010.）、ルベラナズナ（XM_006300626.1）、セイヨウアブラナ（D38220.1）、アマナズナ（XM_010473671.1）、トウゴマ（AF314093.1）、テンサイ （EU163265.1）、ハツカダイコン（KM272859.1）、ニンジン（HQ402930.1）、ダイズ （NM_001251221.1、Wu S., et al., Plant Mol. Biol., 1995, vol.29, p491-506.）、インゲンマメ（XM_007141046.1）イチゴ（XM_004300392.2）、ウマゴヤシ（HQ840748.1）、トマト（XM_004250307.2）、ジャガイモ（NM_001288022.1）、キュウリ（HM755943.1）、メロン（XM_008462231.1）、カボチャ（M33154.1）、ホウレンソウ（M32600.1）、ゴマ（XM_011099324.1）、ワタ（XM_012612465.1）、ハス（XM_010247609.1）、ヨーロッパブドウ （JF796047.1）、モモ（AB061670.1）、ミカン（XM_006434048.1）、マメナシ（KC545876.1）、カカオ （XM_007018888.1）、アブラヤシ（XM_010910909.1）、ナツメヤシ（XM_008796303.1）、ヤトロファ （XM_012222767.1）、ポプラ（XM_011013830.1）、ユーカリ（XM_010065034.1）、シラカンバ （X54097.1）、ナツボダイジュ（AY138811.1）、ホワイトマルベリー （KF992020.1）、バナナ（XM_009419369.1）、ヒメツリガネゴケ（AB231618.1）、クロレラ（U39930.1）、ボル ボックス（XM_002955110.1）、ドナリエラ（KC108654.1）等の多くの植物において保存されている。

工程（ｂ）において選抜されたプラスチド形質転換細胞から植物体を形成することができる。具体的には、選抜されたプラスチド形質転換細胞を、再分化を促進するようホルモンバランスを調整した亜硝酸含有培地に移植し、明所で培養することによって植物体を形成する。

本発明に係るプラスチド形質転換体の製造方法において、工程（ａ）において、前記植物組織に、亜硝酸毒性消去遺伝子と共に、さらに１種又は２種以上のその他の外来遺伝子を導入することにより、亜硝酸毒性消去遺伝子とその他の外来遺伝子が導入された形質転換体を製造することができる。例えば、当該他の外来遺伝子の発現カセットを、亜硝酸毒性消去遺伝子の発現カセットと同じベクターに組込むことにより、亜硝酸毒性消去遺伝子とその他の外来遺伝子の両方がプラスチドゲノムに組込まれたプラスチド形質転換体を製造できる。当該他の外来遺伝子としては、特に限定されるものではないが、構造遺伝子であることが好ましく、医薬品や工業原料として有用なタンパク質をコードする構造遺伝子であることがより好ましい。

亜硝酸毒性消去遺伝子と共に外来遺伝子を導入した形質転換体を増殖・生育させることにより、当該形質転換体のプラスチド内に、当該外来遺伝子がコードするタンパク質が発現して蓄積した形質転換体が得られる。そこで、当該形質転換体から、当該外来遺伝子がコードするタンパク質を回収することによって、任意のタンパク質を製造することができる。当該形質転換体の増殖・生育は、形質転換前の宿主の植物と同様に行うことができる。また、形質転換体からのタンパク質の回収は、タンパク質の性質等を考慮し、一般的な植物組織から特定のタンパク質を回収する場合と同様の手法で行うことができる。例えば、形質転換体を細断した後ホモジナイズし、得られた組織抽出物をクロマトグラフィー法等により分画し、目的のタンパク質が濃縮された画分を回収することができる。

本発明に係るプラスチド形質転換体の製造方法は、特に、これまで遺伝子導入や形質転換体の選抜が非常に困難であった単子葉植物のプラスチド形質転換体の製造に用いられることが好ましい。中でも、イネ、ソルガム、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、エンバク、ハトムギ、スイッチグラス、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、チモシー、メドーフェスク、キビ、アワ、サトウキビ、パールミレット等のイネ科植物のプラスチド形質転換体の製造に用いられることが好ましい。例えば、イネ科植物のように生長が早く植物体の大きなバイオマス植物に、有用タンパク質をコードする遺伝子をプラスチドゲノムに組込むことにより、有用タンパク質を大量生産することが可能なプラスチド形質転換体が得られる。

例えば、イネプラスチド形質転換体は、イネのプラスチドゲノムＤＮＡへの相同組換えを利用して亜硝酸還元酵素遺伝子をプラスチドゲノムへ導入した後、亜硝酸含有培地で培養して選抜することにより、イネプラスチド形質転換体を得ることができる。イネのプラスチドゲノムへ導入する亜硝酸還元酵素遺伝子としては、後記実施例で用いているイネ品種カサラス由来の亜硝酸還元酵素遺伝子を用いることができる。プラスチドゲノムＤＮＡへの相同組換えは、特許文献３に記載されているような公知の手法により行うことができる。例えば、イネプラスチドゲノムＤＮＡの目的の相同組換え領域に挟まれた状態で亜硝酸還元酵素遺伝子を組込んだベクターを、イネのカルス又はプラスチドが分化したカルスに導入することにより行うことができる。亜硝酸還元酵素遺伝子を組込むプラスチドゲノムＤＮＡの位置は特に限定されるものではないが、例えば、ｔｒｎＩ遺伝子とｔｒｎＡ遺伝子の間に挿入することができる。また、亜硝酸還元酵素遺伝子が組み込まれた形質転換体の選抜は、特許文献２と同様に、通常の野生型のイネでは増殖又は植物体再生が抑制される濃度の亜硝酸を添加した培地上で培養することにより選抜できる。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
＜１＞ スイッチグラスの再分化系統の作製
スイッチグラス品種‘Ａｌａｍｏ’の完熟種子を６０％（v/v）硫酸処理により外皮を除去し、種子用殺菌剤で殺菌した。殺菌した種子をさらに次亜塩素酸処理により表面殺菌し、カルス誘導培地（ＰＶＣ培地：ＭＳ ｓａｌｔｓ ａｎｄ ｖｉｔａｍｉｎｓ，３０ｇ／Ｌ ｍａｌｔｏｓｅ，２２．６μＭ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸，４．４μＭ ＢＡＰ，２．５ｍＭ ＭＥＳ,３ｇ／Ｌ ゲランガム，ｐＨ ５．７）に置床した。２８℃、暗所条件下で数カ月培養後、増殖したカルスを由来種子ごとに独立系統として分類し、再分化能を持つと予想されるコンパクトなカルスを増殖する系統を選別・培養した。さらに選別した各系統のコンパクトカルスを再分化培地（ＰＶＳ培地：ＭＳ ｓａｌｔｓ ａｎｄ ｖｉｔａｍｉｎｓ，３０ｇ／Ｌ ｍａｌｔｏｓｅ，１．４μＭ Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ Ａ_３，２．５ｍＭ ＭＥＳ，３ｇ／Ｌ ゲランガム，ｐＨ ５．７）に置床し、２８℃、明所条件下で４週間培養後、植物体の再分化能を確認した。高い再分化能が確認された系統のカルスを実験材料として継代・増殖させた。

＜２＞ 選抜薬剤のスクリーニング
プラスチド形質転換に適した新規選抜法を開発するために、前記＜１＞で作製した再分化系統のカルスを用いて、野生型植物細胞の各種薬剤に対する感受性を調べた。各薬剤に対する細胞感受性は、スイッチグラスカルスの増殖の有無を各濃度の薬剤を含むＰＶＣ培地での培養により確認した。一部の薬剤については、さらに各濃度の薬剤を含むＰＶＳ培地にカルスを置床し、植物体の再生に対する抑制効果も確認した。

感受性を調べた結果を表１に示す。表中、「○」はカルス増殖や植物体再生が抑制されていたことを、「×」はカルス増殖や植物体再生が抑制されていなかったことを、「−」は試験を行わなかったことを、それぞれ意味する。

＜３＞ 各種薬剤耐性遺伝子を選抜マーカーとするプラスチド形質転換ベクターの作製
前記＜２＞において正常な細胞生育に対する抑制作用が確認された薬剤のうち、カナマイシン、クロラムフェニコール、ブレオシン、シクロキシジム、フルアジホップブチル、及び亜硝酸ナトリウムに関して、それぞれに耐性を付与する遺伝子を選抜マーカー遺伝子とするプラスチド形質転換用ベクターを作製した。具体的には、ＡｐｈＡ−６（カナマイシン耐性遺伝子）、ＣＡＴ（クロラムフェニコール耐性遺伝子）、Ｂｌｅ（ブレオシン耐性遺伝子）、ｍＣＴ（シクロキシジム及びフルアジホップブチル耐性遺伝子：ＡＣＣａｓｅ酵素の変異型ＣＴドメイン）、ＰＳＲ１（イネ品種カサラス由来の亜硝酸還元酵素遺伝子のｃＤＮＡから５’末のシグナルペプチド領域を除いた領域）（配列番号２）を選抜マーカー遺伝子として用いた。各選抜マーカー遺伝子は、ＰＣＲにより単離又は人工合成したものを用いた。プラスチドゲノムと相同組換えを起こす領域と、ターミネーター及び翻訳制御配列は、これまでに報告されている外来タンパク質の高発現例を参考に選定して設計した（Daniell et al., Methods in Molecular Biology, 2005, Vol.286, p.111-138； Verma and Daniell, Plant Physiolosy, 2007, Vol.145, p.1129-1143）。各構成要素配列をそれぞれＰＣＲにより増幅し、それらを制限酵素部位を利用した連結、又はＩｎＦｕｓｉｏｎ法（クロンテック）を行うことにより、各ベクターを構築した。

プラスチド形質転換ベクターの構造を図１に示す。図１中、「ＨＲ１」はプラスチドゲノム相同組換え配列（ｔｒｎＩ領域）（配列番号３）を、「ＨＲ２」はプラスチドゲノム相同組換え配列（ｔｒｎＡ領域）（配列番号４）を、「Ｐ１」はプロモーター（ｒｒｎプロモーター）とその下流に連結された翻訳制御配列（Ｔ７ｇ１０）を、「ＳＭ」は選抜マーカー遺伝子を、「Ｔ１」はターミネーター（ｐｓｂＡターミネーター）を、「Ｐ２」はプロモーター（ｐｓｂＡプロモーター）を、「ＭＣＳ」は任意遺伝子の導入部位となるマルチクローニングサイトを、「Ｔ２」はターミネーター（ｒｐｓ１６ターミネーター）を、それぞれ意味する。

＜４＞ 緑化カルス及び多芽体の形成
前記＜１＞で作製したスイッチグラスの再分化系統について、緑化カルス及び多芽体を形成した。
具体的には、前記＜１＞で作製して継代維持していたカルスのうち、継代後３〜４週間培養したカルスを、緑化・多芽体誘導培地（ＭＬ１Ｒ３培地：Ahmadabadi et al.，(2007) Transgenic Research, vol.16，p.437-448）に置床し、２８℃、明所条件下で４週間程度培養することによって緑化カルス及び多芽体を得た。

＜５＞ スイッチグラスプラスチドへの遺伝子導入及び形質転換細胞の選抜
スイッチグラス緑化カルス及び多芽体に、前記＜３＞で作製したプラスチド形質転換ベクターを導入し、形質転換体細胞を選抜した。導入効率の比較コントロールとして、緑化誘導前の継代カルスを用いた。
まず、前記＜４＞で作製したスイッチグラス緑化カルス及び多芽体を、２ｍｍ程度の組織片になるようメスで切り刻み、ＰＶＣ培地の中心部に直径３５ｍｍの円状に並べた。これとは別に、前記＜３＞で作製した各プラスチド形質転換ベクターをそれぞれＨｉｓｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製して０．６μｍの金粒子にコートした。この金粒子にコートしたプラスチド形質転換ベクターを、ＰＶＣ培地に並べた組織片にパーティクルガンによって導入した。ＤＮＡ−金粒子溶液の調整及びパーティクルガンによる遺伝子導入は、奥崎らの方法（Okuzaki and Tabei, Plant Biotechnology, 2012, Vol.29, p.307-310）に従い行った。

導入処理後の組織は、数枚のＰＶＣ培地培地全体に広げ、２８℃、暗条件下で４〜７日間培養した。導入培養後の組織を、プラスチド形質転換ベクターの種類ごとに表２の選抜条件でさらに培養し、形質転換プラスチド及び形質転換プラスチドを含む細胞を選抜した。選抜培養後の組織は、各種選抜薬剤入りのＰＶＳ培地に置床し、２８℃、明所条件下で植物体再生を誘導した。

＜６＞ 遺伝子導入の確認
選抜培養後、再生した植物体から２ｍｍ片の組織をサンプリングし、Ｐｈｉｒｅ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）により、形質転換ベクターの断片を特異的に増幅するプライマーセットを用いて増幅ＤＮＡ断片の有無により、当該形質転換ベクターの導入の有無を確認した。増幅したＤＮＡ断片は、回収・精製後、配列確認を行い、目的のＤＮＡ断片であることを確認し、これらの植物体が、目的のプラスチド形質転換体であることを確認した。

また、各種選抜法による導入実験を行った平板培地のプレート数と形質転換ベクターの導入が確認された形質転換体の系統数を表３に示す。亜硝酸ナトリウム選抜以外では、選抜後に再生された全ての植物体において、形質転換ベクターに由来する増幅ＤＮＡ断片は確認されず、プラスチド形質転換体は一つも得られなかった。これに対して、亜硝酸ナトリウム選抜では、緑化誘導前のカルスへの形質転換により、４８枚のプレートから１５個の系統のプラスチド形質転換体が得られ、緑化カルス及び多芽体への形質転換により、１２枚のプレートから５個の系統のプラスチド形質転換体が得られた。これらの結果から、亜硝酸還元酵素遺伝子を選抜マーカーとした亜硝酸ナトリウム選抜が、プラスチド形質転換体の獲得に有効であること、特に緑化カルス及び多芽体に導入することによって非常に効率よく葉緑体形質転換体が得られることが明らかとなった。

＜７＞ 亜硝酸ナトリウム選抜の詳細条件の検討
亜硝酸ナトリウム選抜について、より効果的な選抜濃度を決定するため、野生型スイッチグラスを各濃度の亜硝酸ナトリウム条件下で培養し、野生型細胞の亜硝酸ナトリウムに対する感受性を調べた。
具体的には、０、０．２５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、又は１．０ｇ／Ｌの亜硝酸ナトリウムを含むＰＶＣ培地又はＰＶＳ培地上に、１プレートあたり１４個のスイッチグラスカルス魂を置床したものを、各濃度条件につき３プレートずつ準備し、ＰＶＣ培地は２８℃、暗所条件下で、ＰＶＳ培地は２８℃、明所条件下でそれぞれ４週間培養した。培養後、ＰＶＣ培地については増殖カルス数を、ＰＶＳ培地においては植物体を再生したカルス数を計測し、それぞれ増殖率又は再生率を算出した。

図２（Ａ）に、各亜硝酸ナトリウム濃度におけるカルス増殖率の結果を、図２（Ｂ）に、各亜硝酸ナトリウム濃度における植物体再生率の結果を、それぞれ示す。ＰＶＣ培地におけるカルス増殖は、亜硝酸ナトリウム０．７ｇ／Ｌで急激に減少し、０．９ｇ／Ｌ以上で完全に抑制された（図２（Ａ））。一方、ＰＶＳ培地における植物体再生は、亜硝酸ナトリウム０．８ｇ／Ｌで急激に減少し、１．０ｇ／Ｌで完全に抑制された（図２（Ｂ））。これらの結果から、形質転換スイッチグラス細胞の選抜における亜硝酸ナトリウム濃度は、０．８ｇ／Ｌ以上が好適であることが示された。

＜８＞ 亜硝酸ナトリウム選抜により得られた導入遺伝子の維持
亜硝酸ナトリウム選抜により選抜され、かつ上記＜６＞で行ったＰＣＲにより導入遺伝子断片の増幅が確認された再生植物体を、亜硝酸ナトリウム０．８ｇ／Ｌを含有するＭＳ培地（１／２ＭＳ ｓａｌｔｓ ａｎｄ ｖｉｔａｍｉｎｓ，１５ｇ／Ｌ ｓｕｃｒｏｓｅ，２．５ｍＭ ＭＥＳ，３ｇ／Ｌ ゲランガム，ｐＨ ５．７）に移植し発根させた。その後１〜２ヶ月ごとに新しい亜硝酸ナトリウム０．８ｇ／Ｌを含有するＭＳ培地に継代した。継代中に発生した分げつは分離し、同系統として継代・維持した。約１年後、当該系統から５個体の植物個体ついて、前記＜６＞と同様にしてＰＣＲを行ったところ、１個体において増幅ＤＮＡ断片が確認され、導入遺伝子が安定して維持されていることが確認された。ＰＣＲ増幅産物の電気泳動の結果を図３に示す。図中、矢印を付したバンドが増幅ＤＮＡ断片であり、「Ｃ」は、ポジティブコントロール（プラスチド形質転換ベクターを鋳型として得られたＰＣＲ産物）を流したレーンである。

［実施例２］
＜１＞ イネプラスチドへの遺伝子導入及び形質転換細胞の選抜
イネ品種日本晴とイネ品種コシヒカリのプラスチドへＰＳＲ１遺伝子を導入し、亜硝酸ナトリウムを用いて形質転換体を選抜した。具体的には以下の通りに行った。なお、再分化培地として用いたＭＳ−ＮＫ培地（Nishimura et al., Nature Protocols, 2006, Vol.1, p.2796-2802）は、元々、硝酸態窒素を含有している。イネ品種日本晴の野生型は、亜硝酸ナトリウム濃度を４００ｍｇ／Ｌ含有させたＭＳ−ＮＫ培地中でも再分化可能であったが、イネ品種コシヒカリの野生型は、亜硝酸還元酵素が弱く、亜硝酸ナトリウムを添加していないＭＳ−ＮＫ培地でも再分化できなかった。

イネの完熟種子培養による胚盤由来カルスを定法により誘導作製した。得られた２ｍｍ程度のカルスをＮ６Ｄ培地（Nishimura et al., Nature Protocols, 2006, Vol.1, p. 2796-2802）の中央部に直径約３５ｍｍの円状に並べ導入材料とした。前記実施例１＜５＞のスイッチグラスと同様にしてＤＮＡ−金粒子溶液を調製し、カルスに導入した。導入処理後のカルスは、数枚のＮ６Ｄ培地に広げて２９．５℃暗所で３〜９日間培養した。その後、イネ品種日本晴由来カルスは８００〜１０００ｍｇ／Ｌの亜硝酸ナトリウムを含むＭＳ−ＮＫ培地に、イネ品種コシヒカリ由来カルスは０〜４００ｍｇ／Ｌの亜硝酸ナトリウムを含むＭＳ−ＮＫ培地にそれぞれ移植し、２９．５℃明所で植物体の再分化を誘導した。得られた再生個体から２ｍｍ程度の組織片をサンプリングし、スイッチグラスと同様にＰＣＲにより目的のＤＮＡ断片の導入を確認した。

表４に、導入実験を行った平板培地のプレート数と形質転換ベクターの導入が確認された形質転換体の系統数を示す。いずれの品種においても、スイッチグラスよりも高効率で遺伝子導入された。

Claims (6)

1. （ａ）植物組織に、亜硝酸の毒性を消去するタンパク質をコードする遺伝子を導入する工程と、
   （ｂ）前記工程（ａ）において前記遺伝子が導入された植物組織を、野生型の植物細胞は増殖又は植物体再生が抑制される濃度の亜硝酸態窒素を含有する培地で培養し、プラスチドゲノムに前記遺伝子が導入されたプラスチド形質転換体を選抜する工程と、
   を有し、
   前記遺伝子が亜硝酸還元酵素遺伝子であることを特徴とする、プラスチド形質転換体の製造方法。
2. 前記プラスチドが、葉緑体、白色体、アミロプラスト、エチオプラスト、エライオプラスト、プロテイノプラスト、又は原色素体（プロプラスチド）である、請求項１に記載のプラスチド形質転換体の製造方法。
3. 前記工程（ａ）において、前記植物組織に、さらに１種又は２種以上のその他の外来遺伝子を導入する、請求項１又は２に記載のプラスチド形質転換体の製造方法。
4. 前記工程（ｂ）において選抜されたプラスチド形質転換体から、植物体を形成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプラスチド形質転換体の製造方法。
5. 請求項３に記載のプラスチド形質転換体の製造方法を行い、製造されたプラスチド形質転換体又は前記プラスチド形質転換体から形成された植物体から、前記外来遺伝子がコードするタンパク質を回収することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
6. 亜硝酸還元酵素遺伝子がプラスチドゲノムに導入された、プラスチド形質転換体を、亜硝酸含有培地で培養する、プラスチド形質転換体の培養方法。