JP2021510069A - 遺伝子改変された植物体の再生 - Google Patents
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Abstract
Description
(a1)
(i)少なくとも1つの対象ヌクレオチド配列;および
(ii)GRF5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、GRF5ポリペプチドをコードする(複数の)mRNAもしくはGRF5ポリペプチドを含む発現カセットを植物細胞内に導入し、ここで、(i)および(ii)は、同時にまたは任意の順序で(in parallel or sequentially)連続して導入することができるステップ、または
(a2)少なくとも1つの対象ヌクレオチド配列を植物細胞内に導入し、前記植物細胞内で、GRF5ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の増強された発現レベルを同時にまたは連続して誘導するステップと、
(b)任意選択的に、(a1)もしくは(a2)の植物細胞または(a1)もしくは(a2)の植物細胞に由来する植物細胞を培養するステップであって、ここで、植物細胞内で、GRF5ポリペプチドが、発現カセットから発現される条件、GRF5ポリペプチドが、導入された(複数の)mRNAから翻訳される条件、(複数の)GRF5ポリペプチドが、内因性遺伝子から発現増強/増加される条件、または(複数の)GRF5ポリペプチドが存在する条件、好ましくは、GRF5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、GRF5ポリペプチドをコードする(複数の)mRNAもしくは(複数の)GRF5ポリペプチドを含む発現カセットが、ステップ(a1)に従って導入されていないか、もしくはGRF5ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の発現レベルの増強が、ステップ(a2)に従って誘導されていない野生型植物細胞もしくは植物細胞における量と比較して増強された量で存在する条件下で培養するステップと
を含む、植物細胞を形質転換する方法を提供する。
(i)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、105、107、109、111、207、208または210を含むヌクレオチド配列;
(ii)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、105、107、109、111、207、208または210を含むヌクレオチド配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%が同一である配列を含むヌクレオチド配列;
(iii)上記で定義されるGRF5ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、もしくは遺伝暗号の縮重の範囲内で(i)および/もしくは(ii)によってコードされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(iv)(i)、(ii)もしくは(iii)のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列;および/または
(v)(iv)のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
を含む。
(a1)GRF5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、GRF5ポリペプチドをコードする(複数の)mRNA((複数の)pre−mRNAを含む)もしくは(複数の)GRF5ポリペプチドを含む発現カセットを植物細胞内に導入するステップ;または
(a2)GRF5ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の増強された発現レベルを植物細胞内に誘導するステップと、
(b)(a1)もしくは(a2)の植物細胞または(a1)もしくは(a2)の植物細胞に由来する植物細胞を培養するステップであって、ここで、植物細胞内で、GRF5ポリペプチドが、発現カセットから発現される条件、GRF5ポリペプチドが、導入された(複数の)mRNAから翻訳される条件、(複数の)GRF5ポリペプチドが、内因性遺伝子から発現増強/増加される条件、または(複数の)GRF5ポリペプチドが存在する条件、好ましくは、GRF5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、GRF5ポリペプチドをコードする(複数の)mRNAもしくは(複数の)GRF5ポリペプチドを含む発現カセットが、ステップ(a1)に従って導入されていない、もしくはGRF5ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の発現レベルの増強が、ステップ(a2)に従って誘導されていない野生型植物細胞もしくは植物細胞における量と比較して増強された量で存在する条件下で培養するステップと、
(c)好ましくは前記細胞のゲノム内の所定の部位を認識する二本鎖DNA切断(DSB)誘導酵素と、任意選択的に修復核酸分子とを用いて、(b)の植物細胞のゲノムを改変するステップと
を含み、ここで、前記所定の部位における前記ゲノムの改変は、
i.少なくとも1つのヌクレオチドの置換;
ii.少なくとも1つのヌクレオチドの欠失;
iii.少なくとも1つのヌクレオチドの挿入;または
iv.i.〜iii.の任意の組合せ
から選択され、かつ
ステップ(c)は、ステップ(a1)/(a2)および/もしくは(b)と同時に、ステップ(a1)/(a2)の前に、ステップ(a1)/(a2)と(b)との間に、またはステップ(b)の後に行われる、
植物細胞のゲノムを改変する方法である。
(a)上記に記載される植物細胞を形質転換するステップと、
(b)(a)の植物細胞または(a)の植物細胞に由来する植物細胞から、少なくとも1つの対象ヌクレオチド配列を導入遺伝子として含む少なくとも1つの植物細胞を含む植物体を再生するステップと
を含むトランスジェニック植物体を作製する方法を提供する。
(a)上記に記載される植物細胞のゲノムを改変するステップと、
(b)(a)の植物細胞または(a)の植物細胞に由来する植物細胞から、少なくとも1つの細胞内にゲノムの改変または改変された植物細胞を含む植物体を再生するステップと
を含む、遺伝子改変された植物体を作製する方法を提供する。
(a1)GRF5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、GRF5ポリペプチドをコードする(複数の)mRNAもしくは(複数の)GRF5ポリペプチドを含む発現カセットを未成熟な雄性配偶体内もしくは小胞子内に導入するステップ;または
(a2)GRF5ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の増強された発現レベルを未成熟な雄性配偶体内もしくは小胞子内に誘導するステップと、
(b)(a)の未成熟な雄性配偶体もしくは小胞子を培養するステップであって、ここで、未成熟な雄性配偶体もしくは小胞子内で、GRF5ポリペプチドが、発現カセットから発現される条件、GRF5ポリペプチドが、導入された(複数の)mRNAから翻訳される条件、GRF5ポリペプチドが、内因性遺伝子から発現増強/増加される条件、または(複数の)GRF5ポリペプチドが存在する条件、好ましくは、GRF5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、GRF5ポリペプチドをコードする(複数の)mRNAもしくはGRF5ポリペプチドを含む発現カセットが、ステップ(a1)に従って導入されていない、もしくはGRF5ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の発現レベルの増強が、ステップ(a2)に従って誘導されていない野生型植物細胞もしくは植物細胞における量と比較して増強された量で存在する条件下で培養するステップと、
(c)ステップ(b)の未成熟な雄性配偶体もしくは小胞子に由来する半数体植物胚を選抜するステップと
を含む、半数体植物胚を作製する方法である。
1.サトウダイコン(Beta vulgaris)の実験
バイナリープラスミドの作製:
バイナリーベクターpZFN−nptII−GRF5を、標準的なクローニング手順に従って作製した。このベクターのT−DNA内に、GRF5(At3g13960)をコードするcDNAを、GRF5タンパク質の高い異所性発現レベルを確保するための二重CaMV35Sプロモーターとノパリン合成酵素(NOS)ターミネーターとの間でクローニングした。T−DNAはまた、カナマイシンまたはパロモマイシンなどのアミノグリコシド系抗生物質の範囲に対して耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(nptII)遺伝子を含み、トランスジェニック植物細胞および組織の選抜に使用した。NOSプロモーターとpAG7ターミネーターとがnptII遺伝子に隣接する。バイナリーベクターのバックボーンは、大腸菌およびアグロバクテリウム−ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)におけるプラスミド複製のためのcolE1およびpVS1それぞれの起点;ならびに細菌選抜のためのストレプトマイシン/スペクチノマイシン耐性を付与するaadA遺伝子を含む。pZFN−nptII−GRF5プラスミドを、標準的な手順でAGL−1 アグロバクテリウム株に形質転換した。
テンサイのシュートを異なる方法で形質転換した:
a)Kischenko et al.,2005 Cell Biology Internationalに基づくアグロバクテリウム媒介形質転換:
1.遺伝子型S706のマイクロプロパゲーションされたシュートを出発原料として使用した。30g/lのスクロースおよび0.25mg/lのベンジルアデニン(BAP)を補充したMS塩中でシュートを増殖させた。
2.砕けやすいカルスを誘導するために、15g/lのスクロースおよび2mg/lのBAPを含むMS塩中で数週間にわたり約30℃で培養した。
3.砕けやすいカルスを収穫した。
4.ベクターpZFN−nptII−GRF5を含むアグロバクテリウムAGL−1を、適切な抗生物質を補充した適切な培地中で増殖させた。
5.カルスにアグロバクテリウム懸濁液を接種した。カルス組織とアグロバクテリウムとの共培養は、440mg/lのCaCl2・2H2O、170mg/lのKH2PO4、1900mg/lのKNO3、370mg/lのMgSO4、1650mg/lのNH4NO3、2mg/lのBAP、40μg/lのアセトシリンゴン、20g/lのスクロースおよび2g/lのグルコースを含む培地中で少なくとも2日間行った。
6.カルスを、30g/lのスクロース、1mg/lのGA3、1mg/lのTDZおよび500mg/lのチメンチンを補充したMS塩に継代培養し、暗所で約1週間インキュベートした。
7.トランスジェニック細胞の選抜のために、カルスを、100mg/lのパロマイシンを補充したステップ6の培地に移し、明所で数週間インキュベートした。
8.トランスジェニックカルスを選抜し、同じ培地および条件で数回継代培養した。
9.再生シュートを単離し、30g/lのスクロース、0.25mg/lのBAPおよび100mg/lのカナマイシンを含むMS塩中で増殖させた。
10.緑色のシュートを、30g/lのスクロース、0.1mg/lのBAP、250mg/lのチメンチンおよび200mg/lのパロマイシンを補充したMS塩に移して選抜段階を終了し、この培地中で数回定期的に繁殖させた。
11.DNA抽出およびPCR解析のために、緑色に生長するシュートから葉を単離し、想定される形質転換系統の確認を行った。
12.選抜されたシュートを、0.5mg/lのIBA、100mg/lのセフォタキシムおよび10mg/lのPPTを補充したMS塩で発根させ、種子作製のために温室に移した。
1.2.1の方法の箇所で先に記載したように、砕けやすいカルスを作製した。
2.浸透圧処理を数時間行った。
3.金粒子の調製およびDNAコーティングを、PDS−1000/He取扱説明書に記載されているように、標準的な手順で行った。プラスミドpZFN−nptII−GRF5およびpUbi4−tDT(赤色蛍光レポーターを含む)を金粒子と共沈させた。対照として、金粒子をpUbi4tDTおよびpABM70STurboYFP(黄色蛍光レポーターを含む)でコーティングした。
4.カルスを、1ショットあたり500ngのDNAでコーティングされた30ngの金粒子を用いて、PDS−1000/Heユニット(Bio−Rad社)により弾丸導入した。
5.シュート再生頻度におけるGRF5の一過性発現の影響を評価するために、弾丸導入されたカルスを、30g/lのスクロース、1mg/lのGA3および1mg/lのチジアズロンを補充したMS塩中で約2週間にわたり光条件においてインキュベートした。シュート数は標準的な双眼鏡を用いてスコア化した。
コンストラクトpZFN−nptII−GRF5を用いたテンサイのマイクロプロパゲーションされたシュートに由来するカルスのアグロバクテリウム−ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)媒介形質転換は、選抜ステップの終了時における再生されたシュートの本数を有意に増加させる(表2)。対照として、赤色蛍光レポーターを含むコンストラクトpZFN−tdT−nptII(対照)を使用した。5つの独立した実験は、5.0%から33.9%への平均的な形質転換頻度の増加を示す。さらに、PCRで確認されたトランスジェニックイベントの数は、1回の形質転換実験当たり平均4.8のイベントから25.4のイベントへと増加した。
バイナリープラスミドで使用したコンストラクト:
バイナリーベクターは、標準的なクローニング手順で作製した。このベクターのT−DNA内に、GRF5(At3g13960)をコードするcDNAを、イネにおけるGRF5タンパク質の十分な異所性発現レベルを確保するための適切なプロモーターとターミネーターとの間でクローニングした(=単一コンストラクト)。T−DNAには、トランスジェニック植物細胞および組織の選抜に使用したGFP遺伝子も含まれている。さらに、イネにおけるGRF5タンパク質の十分な異所性発現レベルを確保する適切なプロモーターとターミネーターとを含むGRF5(At3g13960)をコードするcDNAに加えて、プロモーターおよびターミネーターの制御下にある更なる対象遺伝子を運ぶバイナリーベクターを作製した(=二重(スタック)コンストラクト)。
野生型の緑色の種子を70%エタノール中でインキュベートし、約1分間振とうした。エタノールの除去後、種子を滅菌mQ水で1回洗浄した。次に、30mlの6%次亜塩素酸ナトリウム溶液を加え、種子を40〜60分間振とうした。次亜塩素酸ナトリウム溶液の除去後、種子を滅菌mQで3〜5回洗浄した。
外植片の準備のために、形質転換に適した野生型種子からの膨らんだ胚(胚盤に由来するカルス)を選抜し、植物細胞に1.5分間組み込んだプラスミドで形質転換されたアグロバクテリウム−ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を含む液体感染培地(R002)に移し、次いで共培養プレート(R003)に移した。プレートを暗所で25℃にて3日間インキュベートした。
共培養から3日後、カルスを種子から取り出し、滅菌mQ水で数回洗浄し、250mg/lのセフォタキシムを含む滅菌mQ水で1回洗浄し、R004選抜培地に移した。インキュベーションは、32℃の連続光(3000ルクス)の下で2週間にわたり行った。
滅菌鉗子を使用して、マイクロカルスをR005に移し、32℃の連続光(3000ルクス)の下で1週間にわたりインキュベートした。その後、選抜マーカーとして使用したGFPを暗室で確認した。GFP陽性の健康なカルスをR006に移し、さらに32℃の連続光(3000ルクス)の下で1週間にわたりインキュベーションした。連続的な再生のために、カルスをR007に移し、32℃の連続光(3000ルクス)の下で3週間にわたりインキュベーションした。滅菌鉗子を用いて、健康な苗木を引き出し、R008に移し、32℃の連続光(3000ルクス)の下で2週間にわたりインキュベーションしてから、苗木を温室に搬入した。
GRF5を含む異なるコンストラクトを有するイネの未成熟胚に由来するアグロバクテリウム−ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)媒介形質転換は、平均形質転換頻度の有意な増加につながる。対照として、または比較として、GRF5なしのランダムに選抜された28の他のコンストラクトについて観察された形質転換効率は、63%の平均形質転換効率を示すものを使用した。「単一」コンストラクトの場合、形質転換効率は平均して63%から78%へと増加し、「二重」コンストラクトの場合でも63%から84%へと増加し得た(表5)。
バイナープラスミド内で使用したコンストラクト:
バイナリーベクターは、標準的なクローニング手順で作製した。これらのベクターのT−DNA内に、a)AtGRF5をコードするcDNA(配列番号1)、b)ZmGRF5(バージョンA)をコードする合成DNA(配列番号208)、およびc)ZmGRF5(バージョンB)をコードする合成DNA(配列番号210)を、トウモロコシにおけるGRF5タンパク質の十分な異所性発現レベルを確保する適切なプロモーター(例えば、BdEF1プロモーター)とターミネーターとの間でクローニングした。対照として、ZmUbiイントロンを有する70Sプロモーターの制御下にあるtDTレポーター遺伝子を含むコンストラクトを使用した。
アグロバクテリウム−ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)媒介形質転換は、未成熟胚の胚盤を使用することによって単子葉植物体を形質転換する標準的な方法で行われてきた(例えば、国際公開第95/067222号)。
図10に示されるように、アラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)に由来するGRFを含むコンストラクトを有する未成熟胚のアグロバクテリウム−ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)媒介形質転換は、8%から14%への平均形質転換頻度の有意な増加につながる。これに対して、異なるトウモロコシ(Zea mays)遺伝子型に由来するZmGRF5の両方のバージョンを使用することで、形質転換効率はより強力に増大した。バージョンAのZmGRF5では8%から52%へと、バージョンBのZmGRF5では8%から48%へと形質転換効率が増加した。
ダイズの形質転換:
Glycine max(ダイズ)の形質転換を、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)を用いて、栽培品種「Jake」のダイズ実生の一次節に位置する上胚軸の腋芽分裂組織細胞にT−DNAを送達するために行った(Olhoft P.M.,Bernal L.M.,Grist L.B.,Hill D.S.,Mankin S.L.,Shen Y.,Kalogerakis M.,Wiley H.,Toren E.,Song H.-S.,Hillebrand H.,and Jones T.2007,A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings,In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 43:536-549;米国特許出願公開第2014237688号明細書、国際公開第2006024509号、国際公開第2005121345号に記載)。
3つのバイナリープラスミドを、標準的なクローニング手順に従うことで作製した。第1のバイナリープラスミドは、実験に使用した対照プラスミド(DsRed対照と呼ばれる)であり、他のベクターに使用したベースベクターである。このプラスミドには、T−DNA内に、トランスジェニック植物細胞および組織の表現型スコアリングに使用したDsRed遺伝子と、トランスジェニック細胞の優先的選抜に使用したAtAHAS遺伝子とが含まれる。両方の遺伝子を、上述の目的を果たすのに十分な異所性発現レベルを確保する適切なプロモーターおよびターミネーターでクローニングした。第2のバイナリープラスミドには、ダイズにおけるGRF5タンパク質の十分な異所性発現レベルを確保する適切なプロモーターとターミネーターとの間でクローニングされたAtGRF5をコードするcDNA(配列番号2)を有するベースベクターが含まれる。第3のバイナリープラスミドには、ダイズにおけるGRF5タンパク質の十分な異所性発現レベルを確保する適切なプロモーターとターミネーターとの間でクローニングされたGmGRF5をコードするcDNA(配列番号106)を有するベースベクターが含まれる。
「Jake」栽培品種のダイズ種子を、100mlの漂白剤に3.5mlの12N HClを添加して生成された塩素ガスを用いてチャンバー内で滅菌した。滅菌後、約65粒の種子を、PlantCons(商標)の固体発芽培地(1xB5塩類およびビタミン類、2%スクロース、0.8%ノーブル寒天(A5431 Sigma−Aldrich(登録商標));pH5.8)に置床した。この実生を26℃の光(150μm−2s−2)で7日間にわたり発芽させ、形質転換のための外植材として使用した。
アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)(国際公開第2006024509号)を、以下を含むベクターのうちの1つを用いて形質転換した:(1)対照としてのpSUPER:DsRedおよびpPcUBI:AHAS選別可能マーカー、または対照ベクターに(2)pPcUbi−AtGRF5もしくは(3)pPcUBI−GmGRF5のいずれかを加えたもの。アグロバクテリウム・リゾゲネス(A.rhizogenes)を増殖させ、50mlの液体接種培地(1/10thB5塩類(G768 Phytotech社製)、3%スクロース、20mM MES、1xガンボーグビタミン類、200μMアセトシリンゴン、1.44μMジベレリン酸、5.0μMカイネチン;pH5.4)にファルコンチューブ内でOD600が1.5になるまで再懸濁させた。次いで、アグロバクテリウム懸濁液を、調製された外植片を回収するための深型ペトリ皿に入れた。
実生外植片を、8日齢の実生から、根および胚軸の大部分、子葉1枚、子葉節の腋芽組織の生長、およびすべての事前に形成された葉を含む一次節の上の上胚軸を取り出すことによって調製した。外植片を調製した後、約45〜50個の外植片をペトリ皿のアグロバクテリウム懸濁液と一緒に30分間インキュベートした。次いで、外植片を、共培養培地(1/10thB5塩類(G768 Phytotech社製)、3%スクロース、20mM MES、0.5%ノーブル寒天(A5431 Sigma−Aldrich(登録商標))、1xガンボーグビタミン類、200μMアセトシリンゴン、1.44μMジベレリン酸、5.0μMカイネチン、4.1mM L−システイン、0.5mMジチオトレイトール、0.5mMチオ硫酸ナトリウム;pH5.4)を含むペトリ皿内の湿ったろ紙に置き、室温で5日間容器に封入した。
5日後、外植片を選抜培地(1xB5塩類およびビタミン類(G398 Phytotech社製)、3%スクロース、3mM MES、1μM6−ベンジルアミノプリン、5μMカイネチン、250mg/lチメンチンSTK、3μMイマザピル、0.8%ノーブル寒天(A5431 Sigma−Aldrich(登録商標));pH5.6)にプレート1つあたり5つを移し、26℃で培養した。外植片は、選抜の16日後に一次節の腋芽分裂組織で有意な生長を示し、最初にシュート発育(再生)のスコア化を行った。選抜の22日後(選抜終了後)に、外植片を固体培地から取り出し、Oasis(登録商標)培地に置床した後、(1)シュート形成の品質および(2)一次節で発育するシュートのDsRed蛍光についてスコア化を行った。
4人の研究員と3つのコンストラクトを対象に1つの実験を行った(表6)。ダイズ一次節腋芽分裂組織を、DsRed対照、AtGRF5およびGmGRF5を用いて形質転換した。計524個の実生外植片を形質転換し、選抜の16日後(形質転換後21日目)と選抜の22日後(形質転換後27日目)にスコア化した。選抜の16日後のシュートは、一次節で急速に生長し、小さくてコンパクトなシュートパッドと、より大きく伸長したシュートとが組み合わさったものであった(図11)。標的組織である一次節での再生率[(シュートを有する外植片の数)/全外植片×100]は、すべてのコンストラクトで80〜100%であり、選抜の16日間固定していた。16日目〜22日目の間、外植片のシュートは急速に生長し続けていた。両方の時点で、発根したトランスジェニック植物体の形成が成功したことを予測する形態(「良好」)を有する、健康的で伸長したシュート生長の存在について主観的にスコア化した(図12)。特にAtGRF5およびGmGRF5を用いて形質転換された外植片では、2つの時点から3つのコンストラクトすべてを用いて形質転換された外植片の「良好な」シュート形成が増加していた。4回の複製にわたり、GRF5のいずれかの形態で形質転換された外植片は、DsRed対照と比較して、より高度なシュート形成(より大きなシュート、より伸長したシュート)を示す傾向が見られた(図13)。
キャノーラの形質転換:
セイヨウアブラナ(Brassica napus)の形質転換を、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)を使用して、遺伝子型BNS3のセイヨウアブラナ(B.napus)実生の胚軸切片にT−DNAを送達するために行った。
種子を、50mLのファルコンチューブ内の70%エタノール中に200〜300個の種子を2分間入れて表面滅菌した。2分間穏やかに振とうした後、エタノールを除去し、40〜50mlの30%クロロックス漂白剤を1滴のTweenとともに加えた。種子を時折混合しながら10分間インキュベートした。液体を除去し、次いで種子を滅菌水で3回すすいだ後、種子をPlantConボックス内の発芽培地(1/2xMS塩類/ビタミン類、10gl−1スクロース、Phyto寒天(Phyto Agar)7gl−1;pH5.8)上に置床した。ボックスは、23℃の暗所で4〜5日間チャンバー内に入れた。
アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)を、以下のベクターのうちの1つを用いて形質転換した:(1)対照としてのpSUPER:DsRedおよびPcUBI:AHAS選別可能マーカー、または対照ベクターに(2)PcUbi−AtGRF5もしくは(3)PcUBI−GmGRF5(配列番号108)のいずれかを加えたもの。アグロバクテリウム・リゾゲネス(A.rhizogenes)をOD600が1.0になるまで増殖させ、その後、液体接種培地(1xMS塩類/ビタミン類、30gl−1スクロース;pH5.8)を用いて0.1になるまで希釈した。次いで、アグロバクテリウム懸濁液を、調製された胚軸外植片を回収するための皿に入れた。
胚軸外植片を、4〜5日齢の黄化実生から調製するにあたり、発芽ボックスから取り出し、アグロバクテリウムを含まない感染培地で湿らせた滅菌ろ紙上に置いて、実生が膨れた状態を保った。根、子葉および上胚軸を取り出した後、長さ7〜10mmの胚軸切片を調製した。切断後、この外植片をアグロバクテリウム懸濁液に浸漬し、乾燥した滅菌ろ紙にブロッティングし、最後にプレート中の共培養培地(1xMS塩類/ビタミン類、30gl−1スクロース、0.6gl−1MES、18gl−1マンニトール、7gl−1Phyto寒天(Phyto Agar)、1mgl−12,4−D、100mgl−1アセトシリンゴン、200mgl−1L−システイン;pH5.6)の上のろ紙に置いた。約50個の外植片をプレーティングしたら、プレートをマイクロポアテープで密封し、23℃の光の中で16時間の明期/8時間の暗期の光周期にて3日間培養した。
3日後、すべての外植片を回収培地(1xMS塩類/ビタミン類、30gl−1スクロース、0.6gl−1MES、18gl−1マンニトール、7gl−1Phyto寒天(Phyto Agar)、1mgl−12,4−D、300mgl−1チメンチン;pH5.6)に移し、マイクロポアテープで密封し、23℃で7日間培養した。外植片を選抜培地#1(1xMS塩類/ビタミン類、30gl−1スクロース、0.5gl−1MES、7gl−1Phyto寒天(Phyto Agar)、3mgl−1BAP、0.1mgl−1NAA、0.1mgl−1GA3、2.5mgl−1AgNO3、100nMイマゼタピル、300mgl−1チメンチン;pH5.8)に1週間後に移し、23℃で16時間の明期/8時間の暗期の光周期にて14日間培養した。2週間の選抜後、外植片を選抜培地2(1xMS塩類/ビタミン類、30gl−1スクロース、0.5gl−1MES、7gl−1Phyto寒天(Phyto Agar)、0.5mgl−1BAP、0.1mgl−1GA3、2.5mgl−1AgNO3、100nMイマゼタピル、300mgl−1チメンチン;pH5.8)に移した。
時間をかけて5つの実験を、3人の研究員を対象に、研究員1人につき最低1回の複製を伴って行った(表のキャノーラ−1)。実験1では、セイヨウアブラナ(Brassica napus)の胚軸を、実験1の場合に限られるDsRed対照およびBnGRF5コンストラクトを用いて形質転換した;他の実験では、外植片を、DsRed対照、AtGRF5およびBnGRF5コンストラクトを用いて形質転換した。計3,156個の外植片を接種し、16日〜22日後にDsRed蛍光のスコア化を行った。この時点で、特に胚軸の切断端において、外植片は急速にカルスを発育させていた。外植片は、単一外植片の大きさ、強度および頻度に関係なく、外植片のDsRed蛍光の有無についてスコア化した。DsRedを発現するセクターの頻度は、処置に対する形質転換効率の初期の指標である。
Claims (15)
- 植物細胞を形質転換する方法であって、
(a1)
i.少なくとも1つの対象ヌクレオチド配列;および
ii.GRF5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、GRF5ポリペプチドをコードするmRNAもしくはGRF5ポリペプチドを含む発現カセット
を植物細胞内に同時にまたは連続して導入するステップ、または
(a2)少なくとも1つの対象ヌクレオチド配列を植物細胞内に導入し、前記植物細胞内で、GRF5ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の増強された発現レベルを同時にまたは連続して誘導するステップと、
(b)任意選択的に、(a1)もしくは(a2)の前記植物細胞または(a1)もしくは(a2)の前記植物細胞に由来する植物細胞を培養するステップであって、ここで、前記植物細胞内で、前記GRF5ポリペプチドが、前記発現カセットから発現される条件、GRF5ポリペプチドが、導入されたmRNAから翻訳される条件、GRF5ポリペプチドが、前記内因性遺伝子から発現増強される条件、またはGRF5ポリペプチドが存在する条件下で培養するステップと
を含む、方法。 - 植物細胞のゲノムを改変する方法であって、
(a1)GRF5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、GRF5ポリペプチドをコードするmRNAもしくはGRF5ポリペプチドを含む発現カセットを植物細胞内に導入するステップ;または
(a2)GRF5ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の増強された発現レベルを植物細胞内に誘導するステップと、
(b)(a1)もしくは(a2)の前記植物細胞または(a1)もしくは(a2)の前記植物細胞に由来する植物細胞を培養するステップであって、ここで、前記植物細胞内で、前記GRF5ポリペプチドが、前記発現カセットから発現される条件、GRF5ポリペプチドが、導入されたmRNAから翻訳される条件、GRF5ポリペプチドが、前記内因性遺伝子から発現増強される条件、またはGRF5ポリペプチドが存在する条件下で培養するステップと、
(c)好ましくは前記細胞のゲノム内の所定の部位を認識する二本鎖DNA切断(DSB)誘導酵素と、任意選択的に修復核酸分子とを用いて、(b)の前記植物細胞のゲノムを改変するステップと
を含み、ここで、前記所定の部位における前記ゲノムの改変は、
i.少なくとも1つのヌクレオチドの置換;
ii.少なくとも1つのヌクレオチドの欠失;
iii.少なくとも1つのヌクレオチドの挿入;または
iv.i.〜iii.の任意の組合せ
から選択され、かつ
ステップ(c)は、ステップ(a1)/(a2)および/もしくは(b)と同時に、ステップ(a1)/(a2)の前に、ステップ(a1)/(a2)と(b)との間に、またはステップ(b)の後に実施される、方法。 - トランスジェニック植物体を作製する方法であって、
(a)請求項1において記載される植物細胞を形質転換するステップと、
(b)(a)の前記植物細胞または(a)の前記植物細胞に由来する植物細胞から、少なくとも1つの対象ヌクレオチド配列を導入遺伝子として含む少なくとも1つの細胞を含む植物体を再生するステップと
を含む、方法。 - 遺伝子改変された植物体を作製する方法であって、
(a)請求項2において記載される植物細胞のゲノムを改変するステップと、
(b)(a)の前記植物細胞または(a)の前記植物細胞に由来する植物細胞から、少なくとも1つの細胞内にゲノムの改変を含む植物体を再生するステップと
を含む、方法。 - 半数体植物胚を作製する方法であって、
(a1)GRF5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、GRF5ポリペプチドをコードするmRNAもしくはGRF5ポリペプチドを含む発現カセットを未成熟な雄性配偶体内もしくは小胞子内に導入するステップ;または
(a2)GRF5ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の増強された発現レベルを未成熟な雄性配偶体内もしくは小胞子内に誘導するステップと、
(b)(a)の未成熟な雄性配偶体もしくは小胞子を培養するステップであって、ここで、未成熟な雄性配偶体もしくは小胞子内で、前記GRF5ポリペプチドが、前記発現カセットから発現される条件、GRF5ポリペプチドが、導入されたmRNAから翻訳される条件、GRF5ポリペプチドが、前記内因性遺伝子から発現増強される条件、またはGRF5ポリペプチドが存在する条件下で培養するステップと、
(c)ステップ(b)の未成熟な雄性配偶体もしくは小胞子に由来する半数体植物胚を選抜するステップと
を含む、方法。 - 前記GRF5ポリペプチドが、PFAMドメインPF08880およびPFAMドメインPF08879を含み、好ましくは、ここで、前記PFAMドメインPF08880は、前記GRF5ポリペプチドのN末端またはその近傍で、少なくとも90%のカバレッジのマッチが見られ、前記PFAMドメインPF08879は、前記GRF5ポリペプチドの前記PFAMドメインPF08880に対してC末端側の位置で、少なくとも90%のカバレッジのマッチが見られる、請求項1から5までのいずれか1項記載の方法。
- 両方のマッチするアミノ酸ストレッチが、前記GRF5ポリペプチドのN末端側の半分に位置しており、好ましくは、前記マッチするアミノ酸ストレッチPFAMドメインPF08880が、前記GRF5ポリペプチドのN末端側の4分の1に位置している、請求項6記載の方法。
- 前記GRF5ポリペプチドが、モチーフ:[D]−[PL]−[E]−[P]−[G]−[R]−[C]−[R]−[R]−[T]−[D]−[G]−[K]−[K]−[W]−[R]−[C]−[SA]−[RK]−[ED]−[A]−[YH]−[P]−[D]−[S]−[K]−[Y]−[C]−[E]−[KR]−[H]−[M]−[H]−[R]−[G]−[RK]−[N]−[R](配列番号177)を最大3個のミスマッチ数とともに含み、ここで、好ましくは、前記モチーフは、アミノ酸配列の配列番号41〜配列番号104または配列番号113〜配列番号176のいずれかからなり、かつ/または好ましくは、前記モチーフは、マッチするアミノ酸ストレッチPFAMドメインPF08879のサブ領域を含む、請求項1から7までのいずれか1項記載の方法。
- 前記GRF5ポリペプチドが、
(i)配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、106、108、110、112もしくは209を含むアミノ酸配列;または
(ii)(i)の前記アミノ酸と少なくとも70%が同一である配列を含むアミノ酸配列
を含む、請求項1から8までのいずれか1項記載の方法。 - 前記GRF5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、
(i)配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、105、107、109、111、207、208または210を含むヌクレオチド配列;
(ii)(i)の前記ヌクレオチド配列と少なくとも70%が同一である配列を含むヌクレオチド配列;
(iii)遺伝暗号の縮重の範囲内で(i)もしくは(ii)によってコードされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(iv)(i)、(ii)もしくは(iii)のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列;または
(v)(iv)のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
を含む、請求項1から9までのいずれか1項記載の方法。 - GRF5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む前記発現カセットを植物体細胞内に導入することにより、前記植物細胞のゲノム内に安定的に組み込まれるか、またはGRF5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、GRF5ポリペプチドをコードするmRNA、もしくはGRF5ポリペプチドを含む前記発現カセットを植物細胞内に導入することにより、もしくはGRF5ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の増強された発現レベルを植物細胞内に誘導することにより、前記植物細胞内もしくはその子孫細胞内でGRF5ポリペプチドの一過性の出現がもたらされる、請求項1から10までのいずれか1項記載の方法。
- 前記GRF5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、前記植物細胞内での前記GRF5ポリペプチドの発現に適した少なくとも1つの調節配列に操作可能に連結されている、請求項1から11までのいずれか1項記載の方法。
- ステップ(a1)または(a2)の前記植物細胞が、体細胞組織、カルス組織、分裂組織もしくは胚組織の細胞、またはプロトプラストである、請求項1から4までのいずれか1項記載の方法。
- 請求項3または4記載の方法によって得られるかもしくは得ることができる植物、またはその子孫植物。
- 請求項14記載の植物細胞または種子であって、前記植物細胞または前記種子が、少なくとも1つの対象ヌクレオチド配列を導入遺伝子として含むか、またはゲノム内に改変を含む、請求項14記載の植物細胞または種子。
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EP3757219A1 (en) * | 2019-06-28 | 2020-12-30 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Enhanced plant regeneration and transformation by using grf1 booster gene |
EP3997111A4 (en) * | 2019-07-11 | 2023-07-26 | The Regents Of The University Of California | METHODS FOR ENHANCED REGENERATION OF TRANSGENIC PLANTS USING GROWTH REGULATORY FACTOR (GRF), GRF INTERACTION FACTOR (GIF), OR GIF-GRF CHIMERIC GENES AND PROTEINS |
US20240018535A1 (en) * | 2020-03-19 | 2024-01-18 | Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences | Method for improving plant genetic transformation and gene editing efficiency |
CN114672513B (zh) * | 2022-04-12 | 2024-04-02 | 北京大学现代农业研究院 | 一种基因编辑系统及其应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010538670A (ja) * | 2007-09-21 | 2010-12-16 | ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー | 増強された収穫高関連形質を有する植物およびその作製方法 |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5436150A (en) | 1992-04-03 | 1995-07-25 | The Johns Hopkins University | Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease |
WO1994018313A1 (en) | 1993-02-12 | 1994-08-18 | The Johns-Hopkins University | Functional domains in flavobacterium okeanokoites (foki) restriction endonuclease |
ES2220913T3 (es) | 1993-09-03 | 2004-12-16 | Japan Tobacco Inc. | Procedimiento para la transformacion de monocotiledonas utilizando el escutelo de un embrio inmaduro. |
US7262055B2 (en) | 1998-08-25 | 2007-08-28 | Gendaq Limited | Regulated gene expression in plants |
DE10131786A1 (de) | 2001-07-04 | 2003-01-16 | Sungene Gmbh & Co Kgaa | Rekombinationssysteme und Verfahren zum Entfernen von Nukleinsäuresequenzen aus dem Genom eukaryotischer Organismen |
WO2003080809A2 (en) | 2002-03-21 | 2003-10-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination |
BRPI0511857A (pt) | 2004-06-07 | 2008-01-22 | Basf Plant Science Gmbh | método para produzir uma planta de soja transgênica |
BRPI0514832B1 (pt) | 2004-09-02 | 2022-05-24 | Basf Plant Science Gmbh | Métodos para produzir uma célula vegetal e uma planta transgênica, variante de plasmídeo não patogênica, e, variante de cepa não patogênica |
RU2503721C2 (ru) * | 2007-09-14 | 2014-01-10 | Басф Плант Сайенс Гмбх | Растения, имеющие усиленные признаки, связанные с урожайностью, и способ их получения |
US20110239315A1 (en) | 2009-01-12 | 2011-09-29 | Ulla Bonas | Modular dna-binding domains and methods of use |
EP2206723A1 (en) | 2009-01-12 | 2010-07-14 | Bonas, Ulla | Modular DNA-binding domains |
DK2816112T3 (en) | 2009-12-10 | 2018-11-19 | Univ Minnesota | TAL effector-mediated DNA modification |
EP3156062A1 (en) | 2010-05-17 | 2017-04-19 | Sangamo BioSciences, Inc. | Novel dna-binding proteins and uses thereof |
EP2392208B1 (en) | 2010-06-07 | 2016-05-04 | Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Fusion proteins comprising a DNA-binding domain of a Tal effector protein and a non-specific cleavage domain of a restriction nuclease and their use |
US20130196320A1 (en) | 2010-06-15 | 2013-08-01 | Cellectis | Method for improving cleavage of dna by endonuclease sensitive to methylation |
WO2012093833A2 (en) | 2011-01-03 | 2012-07-12 | Toolgen Incorporation | Genome engineering via designed tal effector nucleases |
ES2728436T3 (es) | 2011-04-05 | 2019-10-24 | Cellectis | Método para la generación de TALE-nucleasas compactas y usos de la mismas |
US20120278929A1 (en) * | 2011-04-28 | 2012-11-01 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | miRNA396 AND GROWTH REGULATING FACTORS FOR CYST NEMATODE TOLERANCE IN PLANTS |
EP2718443B1 (en) * | 2011-06-06 | 2017-11-29 | Bayer CropScience NV | Methods and means to modify a plant genome at a preselected site |
CA2840550A1 (en) | 2011-07-22 | 2013-01-31 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plant transformation method |
CN106922154B (zh) | 2014-08-06 | 2022-01-07 | 基因工具股份有限公司 | 使用空肠弯曲杆菌crispr/cas系统衍生的rna引导的工程化核酸酶的基因编辑 |
US10087458B2 (en) * | 2014-09-25 | 2018-10-02 | Noble Research Institute, Llc | Manipulating BS1 for plant seed yield |
EP3508581A1 (en) * | 2018-01-03 | 2019-07-10 | Kws Saat Se | Regeneration of genetically modified plants |
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