BRPI0514832B1 - Métodos para produzir uma célula vegetal e uma planta transgênica, variante de plasmídeo não patogênica, e, variante de cepa não patogênica - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA CÉLULA VEGETAL TRANSGÊNICA, SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO, VARIANTE DE PLASMÍDEO NÃO PATOGÊNICO, T-DNA TRANSGÊNICO, VETOR TRANSGÊNICO, CÉLULA OU ORGANISMO NÃO HUMANO, VARIANTE DE CEPA NÃO PATOGÊNICA, E, POLIPEPTÍDEO. A presente invenção diz respeito a variantes de cepas "desarmadas" da cepas de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659), variantes de plasmídeos "desarmados" do plasmídeo Ri pRi2659 e seus derivados e métodos que utilizam estas cepas e plasmideos na transformação de plantas.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção diz respeito uma cepa “desarmada” variantes da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659), plasmídeo “desarmado” variantes do plasmídeo Ri pRi2659 e seus derivados e métodos que utilizam estas cepas e plasmídeos na transformação vegetal.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] O gênero Agrobacterium (para uma revisão recente ver Gelvin 2003) foi dividido em diversas espécies. Entretanto, esta divisão refletiu, na maior parte, a sintomologia da doença e variação hospedeira. A. radiobacter é uma espécie “avirulenta”, A. tumefaciens causa a doença de escoriação da coroa, A. rhizogenes causa doença da raiz capilar, A. rubi causa doença cane gall e A. vitis causa escoriações em videiras e em algumas outras espécies de plantas (Otten 1984; Smith and Townsend 1907; Hildebrand 1934; para revisão em A. rhizogenes ver Nilsson and Olsson, 1997). Embora o Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology ainda reflita esta nomenclatura, a classificação é complexa e confusa. A sintomologia da doença é grandemente devida à transferência, integração e expressão no genoma celular vegetal do DNA (T-DNA) que se originam de plasmídeos grandes denominados Ti (indutores de tumor) e plasmídeos Ri (indutores de raiz) (Van Laerebeke 1974; Chilton 1977, 1982; Moore 1979; White 1982; Tepfer 1983; Nester 1984). A cura de um plasmídeo particular e a substituição deste plasmídeo por um outro tipo de plasmídeo tumorigênico pode alterar os sintomas da doença. Por exemplo, a infecção de plantas por A. tumefaciens C58, contendo o plasmídeo Ti do tipo nopalina pTiC58, resulta na formação de teratomas de escoriação da coroa. Quando este plasmídeo é curado, a cepa torna-se não patogênica. A introdução de plasmídeos Ri na cepa curada “converte” a bactéria em uma cepa rizogênica (Lam 1984, White 1980). Além disso, pode- se introduzir um plasmídeo Ti (indutor de tumor) de A. tumefaciens em A. rhizogenes; a cepa resultante incita tumores de morfologia alterada em plantas Kalanchoe (Costantino 1980). Desta maneira, pelo motivo do A. tumefaciens poder ser “convertido” em A. rhizogenes simplesmente substituindo-se um tipo de plasmídeo oncogênico por um outro, o termo “espécie” torna-se sem significado. Desta maneira, em anos recentes o método de distinguir as cepas bacterianas por seu fenótipo de escoriação de coroa ou raiz capilar não pareceu ser mais apropriado, visto que estas características são ligadas apenas ao plasmídeo extra-cromossômico. A análise do DNA genômico revelou que algumas cepas anteriormente classificadas como A. rhizogenes são mais relacionadas com A. tumefaciens e vice versa.

[0003] Um sistema de classificação mais significativo divide o gênero Agrobacterium em “biovars” com base no desenvolvimento e características metabólicas (Keane 1970). Usando-se este sistema, a maioria das cepas de A. tumefaciens e de A. rubi (Tighe 2000) pertencem ao biovar I, as cepas de A. rhizogenes que adaptam-se ao biovar II e ao biovar III são representadas pelas cepas A. vitis. Mais recentemente, ainda, um outro sistema de classificação taxonômico para o gênero Agrobacterium foi proposto (Young 2001). A finalização recente da seqüência de DNA de todo o genoma de A. tumefaciens C58 (que é composto de um cromossomo linear e de um circular, um plasmídeo Ti e um outro plasmídeo grande (Goodner 1999, 2001; Wirawan 1996) podem fornecer um ponto de partida para a reclassificação de “cepas” de Agrobacterium em “espécies” verdadeiras. Uma classificação recente com base em RAPD (DNA polimórfico amplificado aleatório) reflete as diferenças genômicas e está fornecendo uma árvore “família” para diversas cepas de Agrobacterium (Llop 2003). Um esquema de classificação modificado foi proposto por Sawada (Sawada 1993).

[0004] Embora o fundamento genético de Agrobacteria seja pouco explorado, conhecimento extensivo já existe sobre a funcionalidade de seus plasmídeos Ti ou Ri na infecção de plantas. A mobilização do T-DNA requer que os produtos dos genes localizados em qualquer lugar do plasmídeo Ti ou Ri, denominado coletivamente nos genes vir, que são ativados por certos eliciadores das células vegetais não feridas em trans para sintetizar e transferir uma cópia de filamento simples do T-DNA (o filamento T) para a célula vegetal (Zambryski 1992; Zupan 1995). A seqüência de T-DNA no plasmídeo Ti é flanqueado por repetições diretas de 24-bp curtas (Yadav 1982), que são requeridas para o reconhecimento do T-DNA (Wang 1984). As seqüências imediatamente circundantes destas fronteiras parecem estar envolvias na polaridade da síntese do filamento T, que inicia na fronteira direita (Wang 1987). O DNA estranho flanqueado por seqüências de fronteira de T-DNA podem ser transferidos em células vegetais usando-se A. tumefaciens como o vetor (Hernalsteens 1980). A inativação ou remoção dos genes de T-DNA nativos envolvidos na síntese hormonal tornaria o A. tumefaciens incapaz de produzir os sintomas da doença de escoriação da coroa. Este processo de inativar ou remover os genes responsáveis pelos sintomas da doença é denominado “desarmamento”. Os primeiros métodos de projeto de A. tumefaciens envolveram o desarmamento e a introdução simultâneos do gene desejado, visto que o gene introduzido substituiu diretamente os genes no T- DNA. Por um método denominado “homogenotização” (Matzke and Chilton, 1981), o T-DNA natural do plasmídeo Ti foi substituído por um gene desejado para a transformação. Uma outra estratégia desenvolvida para o projeto de A. tumefaciens envolveu a clonagem do gene desejado em um vetor intermediário cointegrador, que conteve uma região simples de homologia de T-DNA e uma seqüência de fronteira simples. Neste sistema, as seqüências são recombinadas por um evento de passagem simples (Horsch 1985), que resultou no vetor todo, incluindo o gene de interesse sendo integrado. Os pares de sistemas co-integrativos em regiões de homologia entre a região de T-DNA do plasmídeo Ti e a seqüência de DNA no vetor integrativo introduzido. Um exemplo de um plasmídeo co-integrativo útil é o pGV3850, um plasmídeo Ti de uma cepa de nopalina (C58), a partir da qual a região de T-DNA total entre as fronteiras foi substituída por pBR322, desta maneira oferecendo um local de recombinação para qualquer construção de gene contendo homologia pBR322 (Zambryski 1983).

[0005] Na descoberta de que o T-DNA não deve estar no mesmo plasmídeo como os genes vir (de Framond 1983; Hoekema 1983, 1985), o vetor binário foi desenvolvido. Um vetor binário é mantido no A. tumefaciens separado do plasmídeo Ti, e contém o gene de interesse e um gene marcador selecionável vegetal entre as seqüências de fronteira de T-DNA. Estes vetores oferecem um grande grau de flexibilidade, visto que estes não requerem um plasmídeo Ti especificamente projetado com um local de recombinação homólogo. Por aquela razão, qualquer cepa de A. tumefaciens desarmada pode ser usada para a transferência dos genes para qualquer vetor binário. Devido à sua versatilidade, os vetores binários são, correntemente os vetores intermediários preferidos para os genes de clonagem destinados para transformação mediada por Agrobacterium em plantas. Entretanto, qualquer cepa de A. tumefaciens a ser usada com vetores binários pode ter seu próprio plasmídeo Ti desarmado, especificamente se as espécies vegetais alvo forem ineficazmente transformadas por intermédio do A. tumefaciens. De outra maneira, o gene desejado do vetor binário será co-transformado com os genes de fito-hormônio oncogênicos do T-DNA natural das bactérias, desse modo reduzindo a eficiência de transformação do gene desejado e também, produzindo os sintomas das doenças tumorigênicas em muitas das células alvo e desse modo, evitando a diferenciação destas células em plantas normais.

[0006] O desarmamento das cepas de A. tumefaciens do tipo selvagem para o uso geral com vetores binários envolveu, em alguns casos, uma forma de homogenotização. Uma construção intermediária contendo um gene marcador flanqueado pelas seqüências de plasmídeo Ti que são homólogos às regiões que estão fora do T-DNA, é introduzido no A. tumefaciens do tipo selvagem por conjugação bacteriana (Hood 1986, 1993). Considerando que as cepas de A. tumefaciens têm, tipicamente suas seqüências de T-DNA totais removidas, também foi demonstrado que a mobilização de T-DNA pode ser inativada pela remoção da seqüência de fronteira direita: relatos do trabalho com as cepas do tipo nopalina de A. tumefaciens mostram que a fronteira direita de T-DNA é necessária para a transferência de gene, considerando que a fronteira esquerda não é (Joos 1983; Peralto and Ream 985; Shaw 1984; Wang 1984). Agrobacterium tumefaciens tem uma variação hospedeira de dicot diversa e, adicionalmente, algumas famílias de monocot (De Cleene 1976; Smith 1995). Existem diversas cepas diferentes de A. tumefaciens, cada uma classificada no tipo octopina, tipo nopalina e tipo L,L-succinamopina, denominado após o tipo de opina sintetizado nas células vegetais que este infecta. Estas cepas têm variações hospedeiras comparáveis, embora não idênticas, e versões desarmadas de muitos tipos de A. tumefaciens foram usados de maneira bem sucedida para a transferência de gene em uma variedade de espécies vegetais (van Wordragen 1992; Hood 1993).

[0007] As cepas de Agrobacterium rhizogenes são classificadas do mesmo modo que as cepas A. tumefaciens são. Tipicamente, estes são classificados pela opina que estes produzem. As cepas mais comuns são as cepas do tipo agropina (por exemplo, caracterizado por plasmídeo Ri pRi A4), cepas do tipo manopina (por exemplo, caracterizado pelo plasmídeo Ri pRi8196) e cepas do tipo cucumopina (por exemplo, caracterizado pelo plasmídeo Ri pRi2659). Algumas outras cepas são do tipo miquimopina (por exemplo, caracterizado pelo plasmídeo Ri pRi1724). A miquimopina e cucumopina são isômeros estéreis mas nenhuma homologia foi observada entre estes no nível de nucleotídeo (Suzuki 2001).

[0008] A soja (Glycine max L. Merr.) mostrou ser muito difícil e transformar com A. tumefaciens, pelo menos em parte porque é refratária à infecção pelo A. tumefaciens do tipo selvagem. Os estudos comparativos com diversos cultivares de soja e as cepas de A. tumefaciens sugerem que a suscetibilidade da soja à A. tumefaciens é limitada e é uma cepa tanto de cultivar quanto bacteriana dependente (Bush 1991; Byrne 1987; Hood 1987). Os problemas com a recalcitrância da soja ao A. tumefaciens ainda são complicados pela dificuldade de se trabalhar com a soja na cultura de tecido. A despeito de alguns avanços até hoje, entretanto, a transformação mediada por Agrobacterium na soja permanece ineficaz e trabalho intensivo e métodos para melhorar aquela eficiência estão sendo continuamente procurados.

[0009] Como mencionado anteriormente, algumas cepas de A. tumefaciens infectam a soja mais facilmente do que outras. Uma cepa, A281, é um A. tumefaciens do tipo L,L-succinamopina de variação de hospedeiro ampla supervirulento, com uma base cromossômica C58 tipo nopalina, contendo o plasmídeo Ti do tipo L,L-succinamopina, pTiBo542 (Hood 1987). O desarmamento desta cepa produziu EHA101 e EHA105, as cepas agora amplamente usadas em conjunção com a transformação de soja (Hood 1986, 1987). Várias outras cepas de Agrobacterium desarmadas são descritas (A208, US 5,416,011; LBA 4404, WO 94/02620). Hood et al. (1993) divulgam o desarmamento de três plasmídeos Tis: cada uma dos tipo octopina, nopalina e L,L-succinamopina. As cepas Agrobacterium tumefaciens A281 e EHA101 são divulgadas como capazes de transformar a soja. O derivado de desarmamento de plasmídeo pTiBo542 da cepa A281 é divulgado e projetado pEHA105.

[0010] As plantas transformadas por Agrobacterium rhizogenes Ri de diversas espécies vegetais tem um fenótipo característico, com internodos encurtados, folhas enrugadas e uma massa de raiz abundante com ramificação lateral extensiva (Tepfer 1984). Os genes rol genes em Ri T-DNA induzem mudanças na sensibilidade aos hormônios vegetais e/ou no metabolismo dos hormônios vegetais (Maurel 1994; Moritz and Schmülling 1998; Nilsson 1997; Shen 1988). Além disso, a transformação dos tecidos vegetais por infecção com A. rhizogenes aumenta a produção de certos metabólitos (Ermayanti 1994; Mano 1986; Sim 1994).

[0011] O Agrobacterium rhizogenes K599 (pRi2659) “armado” natural é capaz de induzir formação de raiz peluda em uma variedade de cultivares de soja incluindo Jack, Williams 82, Cartter, Fayette, Hartwig, Mandarin, Lee 68, Peking e PI437654 (Cho 2000).

[0012] No caso de A. rhizogenes, o plasmídeo Ri de nanopina da cepa 8196 possui uma região T simples que não divide homologia com qualquer um dos oncogenes de pTi T-DNA (Lahners 1984). Esta observação sugere que um novo mecanismo, diferente daquele devido à expressão de tms em mutantes Ti de tmr, é responsável pela indução de raiz por esta cepa. No caso das cepas de agropina, tais como A4, duas regiões distintas do plasmídeo Ri são transferidas ao genoma vegetal: a região TL e a região TR (Huffman 1984; Jouanin 1984; White 1985). O tamanho do TL-DNA encontrado nas plantas transformadas pela cepa A4 é muito constante, enquanto o comprimento do TR-DNA é mais variável. As hibridizações com as regiões T de A. tumefaciens revelaram homologia na região pRi TR com os genes do TR-DNA de plasmídeos Ti de octopina que estão envolvidos na síntese de agropina. Entre os oncogenes de pTi comuns, homologia foi observada apenas nos locais fm (Willmitzer 1982; Huffman 1984; Jouanin 1984), sugerindo um papel possível para a síntese de auxina direcionada por TR-DNA na indução de raiz, mesmo se os genes semelhantes a tms não forem observados no genoma de todas as plantas regeneradas (Taylor 1985; Jouanin 1986a). A região TL, pelo contrário, não se hibridiza com os genes de pTi T-DNA (Jouanin 1984). A seqüência de TL-DNA estabelecida por Slightom et al. (1986) confirma esta ausência de homologia no nível de nucleotídeo. Entretanto, o TL-DNA é altamente homólogo com relação à região T simples da manopina pRi8196 e, portanto, deve ser capaz de induzir raízes transformadas.

[0013] Vilaine et al. (Vilaine 1987) demonstrou que a transferência de TL-DNA sozinha, bem como a transferência de TR-DNA sozinha, não leva à indução de raiz em fragmentos vegetais infectados, sugerindo a existência de dois mecanismos moleculares independentes para a indução de raiz em plasmídeos Ri do tipo agropina. Vilaine et al. ainda descreveram o desarmamento da cepa de Agrobacterium rhizogenes A4RS do tipo agropina pela anulação do TL, TR ou ambas as regiões TL e TR do plasmídeo Ri pRiA4 resultante na cepa A. rhizogenes RS (pRiB278b). é descrita a conjugação dos plasmídeos Ri desarmados com cosmídeos que carregam a região TL ou TR desse modo “resgatando” o fenótipo de raiz peluda. Nenhum uso para a transferência de gene da dita cepa de A. rhizogenes desarmada é divulgado.

[0014] Enquanto a transformação vegetal mediada por Agrobacterium tumefaciens tornou-se um padrão na indústria de biotecnologia vegetal para muitas espécies vegetais, o uso de Agrobacterium rhizogenes é apenas raramente feito. Até hoje, apenas cepas de Agrobacterium rhizogenes “armado” natural foram utilizadas para a incorporação de genes externos em plantas (por exemplo, Narayanan 1999; Kouchi 1999). Visto que o A. rhizogenes também pode transferir o T-DNA dos vetor binários 'in trans', o plasmídeo Ri foi usado como um vetor para a introdução de DNA externo em espécies de plantas dicotiledôneas (Bevan 1984; Simpson 1986; Hamill 1991). Entretanto, as cepas de Agrobacterium rhizogenes utilizadas neste são “armadas” (pelo qual compreende seus plasmídeos Ri naturais) e ainda são capazes de causar o fenótipo de raiz peluda (ver, por exemplo, Narayanan 1999).

[0015] Embora alguns dos problemas ligados à transformação vegetal tenham sido superados pelos métodos descritos na técnica, ainda existe uma necessidade significante de procedimento de melhora e alternativo. Embora avanços significantes tenham sido feitos no campo dos métodos de transformação mediados por Agrobacterium, continua a existir uma necessidade quanto a métodos melhorados facilitar a tranqüilidade, velocidade e eficiência de tais métodos, especialmente também para a transformação de plantas monocotiledôneas e plantas dicotiledôneas que são recalcitrantes à transformação com as cepas de A. tumefaciens pararão. Portanto, foi o objetivo da presente invenção fornecer um método alternativo que oferece uma eficiência de transformação melhorada quanto a uma variedade ampla de espécies vegetais. Este objetivo é resolvido pela presente invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0016] Esta invenção usa cepas “desarmadas” variantes da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659) para a liberação de T-DNA em células vegetais. A seguir, a classificação prévia como uma cepa de “A. rhizogenes” não é utilizada, porque além dos fenótipos indutores de raiz peluda (que é um resultado do plasmídeo Ri mas não o genoma bacteriano), a cepa parece estar apenas remotamente relacionada com as outras cepas de A. rhizogenes com base em uma análise de comparação de seqüências de rDNA riobossômicas. Desta maneira, a cepa é considerada ser um espécime único sendo, de maneira não ambígua um tipo A. tumefaciens ou A. rhizogenes de cepa.

[0017] Uma primeira forma de realização da invenção diz respeito a um método para produzir uma célula vegetal transgênica que compreende as etapas de: a) fornecer bactéria de uma cepa não patogênica transgênica variante da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659) ou de um derivado da dita cepa, em que a dita cepa variante é capaz de infectar as células vegetais mas é desprovida do fenótipo de raiz peluda que induz propriedades e em que a dita cepa variante ainda que compreende um T-DNA transgênico e b) co-cultivar uma célula vegetal com as ditas bactérias e c) isolar ou selecionar as células vegetais que compreendem estavelmente integrado em seu genoma o dito T-DNA transgênico.

[0018] Uma outra forma de realização da invenção diz respeito a um método para produzir uma planta transgênica que compreende as etapas de: a) fornecer bactéria de uma cepa não patogênica transgênica variante da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659) ou de um derivado da dita cepa, em que a dita cepa variante é capaz de infectar as células vegetais mas é desprovida do fenótipo de raiz peluda que induz propriedades e em que a dita cepa variante ainda que compreende um T-DNA transgênico e b) co-cultivar uma planta, célula vegetal ou tecido vegetal com as ditas bactérias e c) isolar ou selecionar e - opcionalmente - regenerar plantas que compreendem estavelmente integrado em seu genoma o dito T- DNA transgênico.

[0019] Os métodos da invenção podem ser usados para a transformação virtual de todo o tipo de plantas, preferivelmente célula vegetal, tecido vegetal ou planta derivada de uma planta selecionada do grupo de plantas monocotiledôneas, plantas dicotiledôneas e plantas gimnospermas. Mais preferivelmente, a planta é de um gênero selecionado do grupo que consiste de Medicago, Lycopersicon, mostarda, maxixe, juá, nogueira, algodoeiro, malus, Vitis, boca de leão, álamo, morangueiro, Arabidopsis, Picea, pimenta, Chenopodium, Dendranthema, Pharbitis, pinheiro, ervilha, oriza, teosinte, Triticum, Triticale, centeio, azevem, cevada, Glycine, Pseudotsuga, calancoe, Beta, Helianthus e Nicotiana.

[0020] Em uma forma de realização preferida da invenção o T-DNA transgênico compreende pelo menos um gene marcador selecionável expressável em planta.

[0021] Uma outra forma de realização da invenção está relacionada com uma cepa não patogênica variante da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659) ou de um derivado da dita cepa (a seguir cepa “desarmada” variante), em que a dita cepa variante é capaz de infectar as células vegetais mas é desprovida das propriedades que induzem o fenótipo de raiz peluda. Uma outra forma de realização da invenção está relacionada com a cepa não patogênica transgênica variante da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659) ou de um derivado da dita cepa, em que a dita cepa variante é capaz de infectar as células vegetais mas é desprovida do fenótipo de raiz peluda que induz propriedades e em que a dita cepa variante ainda compreende um T- DNA transgênico.

[0022] Em uma forma de realização preferida da invenção, a dita cepa não patogênica variante da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659) (ou de um derivado da dita cepa) é capaz de infectar as células vegetais, para mediar a transferência de T-DNA em células vegetais e mediar inserção de T- DNA no genoma vegetal, mas é desprovida do fenótipo de raiz peluda que induz propriedades. Mais preferivelmente, isto é atingido pela presença de um plasmídeo não patogênico variante do plasmídeo Ri pRi2659 (o plasmídeo Ri natural na cepa de Agrobacterium K599; NCPPB 2659) ou um derivado deste. O dito plasmídeo não patogênico variante preferivelmente fornece todas as funções requeridas para infecção e transformação de célula vegetal mas é desprovido de seqüências que causam o fenótipo de raiz peluda.

[0023] O derivado da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB2659) é preferivelmente uma bactéria patogênica vegetal transportada no solo, caracterizada por uma seqüência intergênica de 16S-23S rRNA que compreende pelo menos um motivo de seqüência selecionado do grupo que consiste de motivos e seqüência descritos por SEQ ID N°: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 e 14. A cepa não patogênica variante ainda pode compreender uma ou mais características selecionadas do grupo que consiste da presença de genes virA ou virG mutantes ou quiméricos ou presença de plasmídeos super- virulentos. A cepa não patogênica variante da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB2659) pode compreender um plasmídeo não patogênico variante do plasmídeo pRI2659 (como definido abaixo).

[0024] Ainda, uma outra forma de realização da invenção está relacionada com um plasmídeo não patogênico variante de pRi2659 (o plasmídeo Ri natural na cepa de Agrobacterium K599; NCPPB 2659) ou um derivado deste, dito plasmídeo variante fornece as funções requerido para infecção e transformação de célula vegetal, mas desprovido de seqüências que causam o fenótipo de raiz peluda (a seguir plasmídeo “desarmado” variante). Preferivelmente - especialmente quando usado em combinação com um T- DNA transgênico compreendido de um vetor (binário) separado - o dito plasmídeo “desarmado” variante é o que não compreende elementos (tais como, por exemplo, elementos de T-DNA) que podem ser transferidos no genoma vegetal. Existem vários meios de se fornecer um tal plasmídeo “desarmado” variante. Isto pode ser realizado tornando-se as fronteiras do T- DNA disfuncionais (por exemplo, pela mutagênese) ou - preferivelmente - anulando-se o T-DNA total do plasmídeo Ri.

[0025] Em uma forma de realização especialmente preferida da invenção o dito plasmídeo não patogênico variante é o que compreende pelo menos uma seqüência selecionada do grupo de seqüências descritas por a) seqüências que compreendem uma seqüência descrita por SEQ ID N°:25 ou uma seqüência de pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos da seqüência descrita por SEQ ID N°: 24 e b) seqüências tendo uma identidade de seqüência de pelo menos 90% a uma seqüência como descrita por SEQ ID N°: 24 ou uma seqüência de pelo menos 1000 nucleotídeos consecutivos da seqüência descrita por SEQ ID N°: 24 e c) seqüências que hibridizam-se sob condições equivalentes à ligação ou hibridização a 68° C em uma solução que consiste de 5 x de SSPE, 1% de SDS, 5 x do reagente de Denhardt e 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado seguido pela lavagem em uma solução que compreende 0,1 x de SSPE e 0,1% de SDS a 68° C a uma sonda que consiste de pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência como descrita por SEQ ID N°: 24 ou a sua seqüência complementar.

[0026] A seqüência isolada da versão desarmada do plasmídeo pRI2659 é fornecida neste. Desta maneira, uma forma de realização preferida da invenção diz respeito a uma seqüência de nucleotídeo isolada selecionada do grupo de seqüências descritas por a) seqüências que compreendem uma seqüência descrita por SEQ ID N°: 24 ou uma seqüência de pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos da seqüência descrita por SEQ ID N°: 24 e b) seqüências tendo uma identidade de seqüência de pelo menos 90% a uma seqüência como descrita por SEQ ID N°: 24 ou uma seqüência de pelo menos 1000 nucleotídeos consecutivos da seqüência descrita por SEQ ID N°: 24 e c) seqüências que hibridizam-se sob condições equivalentes à ligação ou hibridização a 68° C em uma solução que consiste de 5 x de SSPE, 1% de SDS, 5x do reagente de Denhardt e 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado seguido pela lavagem em uma solução que compreende 0,1 x de SSPE e 0,1% de SDS a 68° C a uma sonda que consiste de pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência como descrita por SEQ ID N°: 24 ou a sua seqüência complementar.

[0027] Mais preferivelmente, o dito plasmídeo não patogênico variante é descrito por uma seqüência de nucleotídeo que descreve o plasmídeo pRi2659 desarmado ou um derivado acima (como definido acima). Ainda mais preferivelmente ou alternativamente, o derivado está codificando uma proteína virD2 tendo uma identidade de seqüência de aminoácido de pelo menos 85% com a seqüência descrita por SEQ ID N°: 112. A dita proteína virD2 é esperada ser um fator chave para o desempenho intensificado na transformação do plasmídeo pRI2659 desarmado. Desta maneira, uma outra forma de realização da invenção diz respeito a um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido selecionado do grupo que consiste de: a) a seqüência como descrita por SEQ ID N°: 112 ou seqüências de pelo menos 200 aminoácidos consecutivos destes, b) seqüências tendo uma identidade de seqüência de pelo menos 85% (preferivelmente pelo menos 90% ou 92%, mais preferivelmente pelo menos 95% ou 98%, mais preferivelmente pelo menos 99%) com as seqüências descritas por SEQ ID N°: 112.

[0028] Entretanto, também, as outras proteínas codificadas para o plasmídeo pRI2659 desarmado são consideradas serem úteis para a otimização de processos de transformação, desta maneira uma outra forma de realização da invenção diz respeito a um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido selecionado do grupo que consiste de: a) a seqüência como descrita por qualquer um da SEQ ID N°: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186 ou 187 ou seqüências de pelo menos 200 aminoácidos consecutivos (preferivelmente pelo menos 300 aminoácidos consecutivos, mais preferivelmente pelo menos 400 aminoácidos consecutivos, preferivelmente todos os aminoácidos consecutivos) destes, b) seqüências tendo uma identidade de seqüência de pelo menos 85% (preferivelmente pelo menos 90% ou 92%, mais preferivelmente pelo menos 95% ou 98%, mais preferivelmente pelo menos 99%) com uma seqüência descrita por qualquer um da SEQ ID N°: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186 ou 187.

[0029] Ainda, uma outra forma de realização da invenção diz respeito à seqüências de ácido nucléico isoladas que codificam os ditos polipeptídeos. Estas seqüências podem ser as seqüências naturais isoladas (como compreendido no plasmídeo pRI2659) ou outras seqüências derivadas com base na degeneração do código genético.

[0030] Conseqüentemente, uma forma de realização preferida da invenção diz respeito a um plasmídeo não patogênico variante de pRi2659 ou um derivado deste, em que o dito plasmídeo variante é aquele que compreende as seqüências requeridas para a infecção e transformação de célula vegetal do pRi2659 patogênico natural ou seu derivado mas é desprovida do T-DNA, preferivelmente a região descrita para a seqüência em torno da base 538 até em torno da base 15519 da seqüência caracterizada por GenBank Acc.-N° AJ271050 (SEQ ID N°: 4) ou em torno da base 3644 até em torno da base 18577 da seqüência caracterizada por SEQ ID N°: 26. Esta seqüência corresponde ao T-DNA do plasmídeo Ri pRi2659 patogênico original como fornecido na cepa patogênica de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659). Mais preferivelmente o dito plasmídeo não patogênico variante é uma seqüência que se hibridiza sob condições de estringência alta (por exemplo, equivalentes à ligação ou hibridização a 68° C em uma solução que consiste de 5 x de SSPE, 1% de SDS, 5 x do reagente de Denhardt e 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado seguido pela lavagem em uma solução que compreende 0,1 x de SSPE e 0,1% de SDS a 68° C) com o plasmídeo Ri pRi2659 patogênico original como fornecido na cepa de Agrobacterium K599 patogênica (NCPPB 2659), mas que não hibridiza-se sob condições de estringência alta com a seqüência em torno da base 538 até em torno da base 15519 da seqüência caracterizada por GenBank Acc.-N° AJ271050 (SEQ ID N°: 4) ou em torno da base 3644 até em torno da base 18577 da seqüência caracterizada por SEQ ID N°: 26.

[0031] Mais preferivelmente, o derivado de pRi2659 é um plasmídeo capaz de mediar a transferência de T-DNA a partir de uma bactéria transportada no solo em uma célula vegetal ainda caracterizada por a) ter uma homologia de pelo menos 90% com o DNA que codifica o plasmídeo pRi2659 natural (como compreendido na cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB2659) ou b) hibridização sob condições de alta estringência equivalentes à ligação ou hibridização a 68° C em uma solução que consiste de 5 x de SSPE, 1% de SDS, 5 x do reagente de Denhardt e 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado seguido pela lavagem em uma solução que compreende 0,1 x de SSPE e 0,1% de SDS a 68° C com o plasmídeo pRi2659 natural.

[0032] Preferivelmente, o T-DNA na dita cepa não patogênica transgênica variante da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659) ou seu derivado é compreendido de um plasmídeo de vetor binário separado do plasmídeo que fornece as características requeridas para a infecção vegetal (tal como um plasmídeo Ti ou Ri desprovido de suas propriedades neoplásticas ou indutores de raiz peluda). Preferivelmente, o T-DNA é flanqueado pelo menos pela seqüência de fronteira direita (mais preferivelmente pela seqüência de fronteira direita e esquerda). São preferidas as fronteiras Ti e/ou Ri. Em uma forma de realização preferida o dito T-DNA transgênico é o que compreende pelo menos um cassete de expressão para conferir à dita planta um traço agricolamente valioso. Em uma outra forma de realização preferida dita T-DNA is adicionalmente que compreende pelo menos um gene marcador, que permite a seleção e/ou identificação de plantas transformadas, células ou tecidos vegetais.

[0033] As fronteiras de T-DNA do plasmídeo de Agrobacterium rhizogenes pRi2659 foram demonstradas para ser especificamente eficiente em transferência de T-DNA e assim gerar plantas transgênicas (especialmente plantas de soja transgênica). Assim, uma outra forma de realização da invenção refere-se a T-DNA transgênico flanqueado por pelo menos uma fronteira de T-DNA do plasmídeo de Agrobacterium rhizogenes pRi2659, o dito T-DNA transgênico que não compreende seqüências que causam um fenótipo de raiz peluda. Preferivelmente pelo menos uma das ditas seqüências de fronteira é descrita por SEQ ID N°: 18 ou 19. Mais preferivelmente o dito T-DNA transgênico compreende pelo menos um cassete de expressão para conferir à dita planta um traço agricolamente valioso ou pelo menos um gene marcador, que permite a seleção e/ou identificação de plantas transformadas, células ou tecidos vegetais. Um outro objetivo da invenção diz respeito a um vetor transgênico que compreende o dito T-DNA transgênico da invenção.

[0034] Outras formas de realização da invenção dizem respeito a células ou organismos não humanos que compreendem uma seqüência de nucleotídeo, um plasmídeo não patogênico variante ou um T-DNA transgênico da invenção. Preferivelmente, as ditas células ou organismos não humanos são selecionados do grupo que consiste de bactérias, leveduras, plantas, mamíferos e insetos. Em uma forma de realização preferida a dita célula ou organismo é uma bactéria transportada no solo do gênero Rhizobiaceae. Em uma outra forma de realização preferida dita célula ou organismo é célula vegetal ou organismo vegetal, mais preferivelmente selecionados do grupo de plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas.

[0035] Outros objetivos, vantagens e características da presente invenção tornarão-se evidentes a partir da seguinte especificação.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0036] Fig. 1A Dendrograma que demonstra a relação de cepas de Agrobacteria como determinado por RAPD (DNA polimórfico amplificado aleatório) (figura 2 de Llob 2003). Para a descrição das várias cepas ver a Tabela 1 abaixo. A cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659) sob estas condições aglomeram-se em um grupo distinto de cultivares separados das cepas de “Agrobacterium tumefaciens” tradicionais, tais como C58 ou Ach5 mas também de outras cepas de “Agrobacterium rhizogenes” tais como NCPPB 8196 ou ATCC 15834.

[0037] Fig. 1B Dendrograma que demonstra uma relação das cepas de Agrobacterium como determinado pela comparação de 16S rRNA. As seqüências são compiladas usando-se o programa Clustal W (Saitou 1987). As cepas são descritas para o GenBank Acc.-N° de seu 16S rRNA respectivo. As seguintes cepas são determinadas:

[0038] Fig. 1C Dendrograma que demonstra uma relação das cepas de Agrobacterium como determinado pela comparação da seqüência de aminoácido virD2. As seqüências são compiladas usando-se o programa Clustal W (Saitou 1987). As cepas são descritas para o GenBank Acc.-N° de suas proteínas virD2 res' pectivas. As seguintes cepas são determinadas:

[0039] Fig. 2: Mapa da restrição física da região de T-DNA de plasmídeo de Agrobacterium pRi2659. As setas indicam as regiões de fronteira direita e esquerda (de: Combard 1987).

[0040] Fig. 3 Expressão de GUS transitória em soja (5 dias) de explantes de meristema axilar da folha após 2 dias de co-cultivo com AGL1 (pBPSMM192b) (I) ou SHA016 (pBPSMM192b) (II). O SHA016/pBPSMM192b é uma cepa de Agrobacterium K599 variante desarmada, transgênica. O AGL1/pBPSMM192b é uma cepa de controle. As cepas de Agrobacterium SHA001 e SHA016 são cepas funcionalmente equivalentes da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659) (pRi2659Δtet), isto é, que compreende o plasmídeo pRi2659Δtet desarmado.

[0041] Fig. 4 Expressão de GUS estável em soja 35 dias após a infecção usando-se explantes de meristema axilar da folha infectados com Agrobacterium SHA001 (pBPSEW008) (I, II, III: exemplos para vários explantes). SHA001 (pBPSEW008) é uma cepa de Agrobacterium K599 variante desarmada transgênica (pRi2659Δtet).

[0042] Fig. 5 As mudas transgênicas de tomate (A) usando-se SHA001 recombinante contendo pBPSMM192b e expressão de GUS nas folhas transgênicas (B). SHA001 (pBPSMM192b) é uma cepa variante de Agrobacterium K599 desarmada transgênica (pRi2659Δtet).

[0043] Fig. 6 A hibridização de Southern de tetraciclina desarmada marcada K599 (pRi2659Δtet). A perda de uma faixa de hibridização em eventos de passagem dupla, quando sondado com a fronteira direita indica a anulação da região de T-DNA de pRi2659 (Southern inferior). A faixa de hibridização e o Southern superior indica a presença do DNA de flanqueamento fora da anulação de T-DNA. RF = hibridização com sonda do flanco direito RB = hibridização com sonda do flanco esquerdo WT = tipo selvagem S = clone resultante da recombinação de passagem livre resultante e uma inserção que compreende tanto o T-DNA do tipo selvagem quanto o T-DNA de anulação CS = clone simples confirmado resultante da passagem simples com tamanho de faixa calculado de combinação padrão (produto intermediário) D = clone resultante da recombinação de passagem dupla resultante da anulação de T-DNA pretendida (produto final pretendido)

[0044] Fig. 7 Ensaio de Raiz Cabeluda em cotilédones de soja [a] Infecção com K599 desarmado não causa raízes peludas. [b] Infecção com K599 do tipo selvagem causa raízes peludas.

[0045] Fig. 8 Expressão de GUS transitória em células vegetais (para construir a descrição ver os exemplos abaixo). A: Transformação do embrião de milho. SHA001 é uma cepa variante de Agrobacterium K599 desarmada. LBA4404 é uma cepa de controle. B: transformação de outros tecidos vegetais com SHA001 em combinação com vários vetores binários (indicados abaixo nas figuras; descrição, ver exemplos). I: Nodos axilares de soja em mudas; II: Calo organogênico de soja; III: Cotilédones de tomate

[0046] Fig. 9: Arabidopsis transgênica estável T1 selecionada com AHAS. A transformação foi realizada com as cepas Agrobacterium MP90 (cepa de controle 1), cepa de Agrobacterium K599 do tipo selvagem (cepa de controle 2) e cepa de Agrobacterium K599 (SHA001), cada uma das quais compreende plasmídeo binário pBPSEW008 ou pBPSMM192b, respectivamente.

[0047] Fig. 10: Manchamento por GUS de Arabidopsis transgênica estável T1. Arabidopsis transgênica estável T1 selecionada por AHAS. A transformação foi realizada com as cepas de Agrobacterium MP90 (cepa de controle 1), cepa do tipo selvagem de Agrobacterium K599 (cepa de controle 2) e cepa desarmada de Agrobacterium K599 (SHA001), cada uma compreendendo plasmídeo binário pBPSEW008 ou pBPSMM192b, respectivamente.

[0048] Fig. 11: Mapa da região de T-DNA de plasmídeo pRi2659 incluindo as regiões de flanqueamento direita e esquerda.

[0049] Fig. 12: Mapa de fluxo que detalha as etapas usadas para a construção dos cassetes de anulação usados para desarmar a cepa K599.

[0050] Fig. 13: A: Mapas de plasmídeo de vetor pBPSMM192b e pBPSMM232 B: Mapa de plasmídeo de vetor pBPSEW008

[0051] Fig. 14: A-E: Alinhamento de várias seqüências intergênicas de regiões de 16S-23S rRNA de bactérias transportadas no solo. K599: cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659) AE008980: Agrobacterium tumefaciens C58 AE009348: Agrobacterium tumefaciens C58 AE008265: Agrobacterium tumefaciens C58 AE007948: Agrobacterium tumefaciens C58 AE009201: Agrobacterium tumefaciens C58 U45329: Agrobacterium vitis. NCPPB3554 AE102735: Agrobacterium tumefaciens (Rhizobium radiobacter) MAFF301001

[0052] A cepa de Agrobacterium C58 tem operons de 4 rRNA. Estes são os mais próximos conhecidos com relação à seqüência intergênica de 16S-23S rRNA de K599. Outra seqüência intergênica de 16S-23S rRNA de outras cepas de Agrobacterium têm homologia baixa e não acumulam-se bem. Isto mostra que esta região apresenta variabilidade suficiente para ser usada com o uma seqüência de assinatura para diferenciar a cepa de Agrobacterium K599 de outras proximamente relacionadas. A seqüência intergênica de 16S-23S rRNA é uma região entre o 16S e 23S rRNA que usualmente codifica quanto ao tRNA (tal como, por exemplo, Ile, Ala, Asp, Trp).

[0053] Fig. 15 A hibridização de Southern de plantas T1 e T0 de soja transformadas com a cepa de Agrobacterium K599 desarmada (pRi2659Δ). O DNA genômico foi digerido com HindIII e sondado com um gene gusINT. Um local de HindIII simples está presente no T-DNA. M = marcador de 1 kb; wt = DNA genômico não transformado; linhas 1 a 7, linhas T1 individuais; linha 8, planta T0.

[0054] Fig. 16 Alinhamento de várias seqüências de aminoácidos virD2 de espécies Agrobacterium. As mutações únicas distinguem a proteína virD2 codificada por pRI2659 (SEQ ID N°: 112) sobre seus homólogos conhecidos são marcadas com asteriscos (*). TiAB2/73: Agrobacterium tumefaciens TiA6: Agrobacterium tumefaciens Ti-SUKURA: Agrobacterium tumefaciens RiA4: Agrobacterium rhizogenes Ri1724: Agrobacterium rhizogenes Ri2659: cepa de Agrobacterium K599

DEFINIÇÕES GERAIS

[0055] Abreviações: BAP - 6-benzilaminopurina; 2,4-D - ácido 2,4- diclorofenoxiacético; MS - meio Mura-shige e Skoog; NAA - ácido 1- naftalenoacético; MES, ácido 2-(N-morfolino-etanossulfônico, IAA ácido indol acético; Kan: sulfato de canamicina; GA3 - ácido Gibberélico; TimentinTM: ticarcilina dissódica/clavulanato potássico.

[0056] Deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia particular, protocolos, linhas celulares, espécies ou gêneros vegetais, construções e reagentes descritos como tais. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste é para o propósito de descrever as formas de realização particulares apenas e não pretendidos para limitar o escopo da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. Deve ser observado que, como usado neste e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “e” e “o” incluem referência plurais a não ser que o contexto indique claramente o contrário. Desta maneira, por exemplo, referência a “um vetor” é uma referência a um ou mais vetores e inclui equivalentes destes conhecidos por aqueles habilitados na técnica e assim por diante.

[0057] O termo “cerca de” é usado neste para significar aproximadamente, em orno ou na região de. Quando o termo “cerca de” é usado em conjunção com uma faixa numérica, este modifica aquela faixa estendendo as fronteiras acima e abaixo de valores numéricos apresentados. No geral, o termo “cerca de” é usado neste para modificar um valor numérico acima e abaixo do valor estabelecido por uma variação de 20 por cento, preferivelmente 10 por cento, acima e abaixo (mais alto ou mais baixo).

[0058] Como usado neste, a palavra “ou” significa qualquer membro de uma lista particular e também inclui qualquer combinação de membros daquela lista.

[0059] “Traço agricolamente valioso “ inclui qualquer fenótipo em um organismo vegetal que é útil ou vantajoso para a produção de alimentos ou produtos alimentícios, incluindo partes de plantas e produtos de plantas. Produtos agrícolas que não alimentícios, tais como papel, etc. também estão incluídos. Uma lista parcial de traços agricolamente valiosos incluem resistência à praga, vigor, tempo de desenvolvimento (tempo para a colheita), teor de nutriente intensificado, novos padrões de desenvolvimento, sabores ou cores, sal, calor, tolerância à seca ou frio e outros. Preferivelmente, traços agricolamente valiosos não incluem genes marcadores selecionáveis (por exemplo, genes que codificam herbicidas ou resistência antibiótica usada apenas para facilitar a detecção ou seleção de células transformadas), genes de biossíntese de hormônio que levam à produção de um hormônio vegetal (por exemplo, auxinas, giberlinas, citoquininas, ácido abscísico e etileno que são usados apenas para seleção) ou genes repórteres (por exemplo, luciferase, glucuronidase, cloranfenicol acetil transferase (CAT, etc.). Tais traços importantes agricolamente valiosos podem incluir melhora de resistência à pragas (por exemplo, Melchers 2000), vigor, tempo de desenvolvimento (tempo para a colheita), teor de nutriente intensificado, novos padrões de desenvolvimento, sabores ou cores, sal, calor, tolerância à seca ou frio (por exemplo, Sakamoto 2000; Saijo 2000; Yeo 2000; Cushman 2000) e outros. Aqueles habilitados reconhecerão que existem polinucleotídeos numerosos cuja escolha confere estes e outros traços agricolamente valiosos.

[0060] O termo “ácido nucléico” refere-se aos desoxiribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros ou híbridos destes na forma sentido ou anti- sentido de filamento simples ou duplo. A não ser que indicado de outra maneira, uma seqüência de ácido nucléico particular, também abrange implicitamente as variantes conservativamente modificadas destes (por exemplo, degeneram as substituições de códon) e as seqüências complementares, bem como a seqüência explicitamente indicada. O termo “ácido nucléico” é usado de maneira intercambeável aqui com “gene”, “cDNA, “mRNA”, “oligonucleotídeo” e “polinucleotídeo”.

[0061] A frase “seqüência de ácido nucléico” refere-se a um polímero de filamento simples ou duplo de leitura de bases de desoxiribonucleotídeo ou ribonucleotídeo dos terminais 5'- ao 3'-. Isto inclui o DNA cromossômico, plasmídeo auto-replicantes, polímeros infecciosos de polímeros de DNA ou RNA e de DNA ou RNA que desempenham um primariamente estrutural. “Seqüência de ácido nucléico” também refere-se a uma lista consecutiva de abreviações, letras, caracteres ou palavras que representam nucleotídeos. Em uma forma de realização, um ácido nucléico pode ser uma “sonda” que é um ácido nucléico relativamente curto, usualmente menor do que 100 nucleotídeos de comprimento. Freqüentemente uma sonda de ácido nucléico é de cerca de 50 nucleotídeos de comprimento a cerca de 10 nucleotídeos de comprimento. Uma “região alvo” de um ácido nucléico é uma porção de um ácido nucléico que é identificado ser de interesse. uma “região codificadora” de um ácido nucléico é a porção do ácido nucléico que é transcrita e traduzida de uma maneira específica de seqüência para a produção em um polipeptídeo ou proteína particulares quando colocados sob o controle de seqüências reguladoras apropriadas. A região codificadora é dita codificar um tal polipeptídeo ou proteína.

[0062] O termo “seqüência de nucleotídeo de interesse” refere-se a qualquer seqüência de nucleotídeo, cuja manipulação pode ser considerada desejável por qualquer razão (por exemplo, confere qualidades melhoradas), por uma pessoa habilitada na técnica. Tais seqüências de nucleotídeo incluem, mas não são limitadas à, seqüências codificadoras de genes estruturais (por exemplo, genes repórteres, genes marcadores de seleção, genes de resistência de medicamentos, Fatores de desenvolvimento, etc.), e seqüências reguladoras não codificadoras que não codificam um mRNA ou produto de proteína, (por exemplo, seqüência promotora, seqüência de poliadenilação, seqüência de terminação, seqüência intensificadora, etc.). Uma seqüência de ácido nucléico de interesse pode preferivelmente codificar um traço agricolamente valioso.

[0063] O termo “anti-sentido” é entendido significar um ácido nucléico tendo uma seqüência complementar a uma seqüência alvo, por exemplo, uma seqüência de RNA mensageiro (mRNA) para o bloqueio daquela expressão pretendida ser iniciada pela hibridização com a seqüência alvo.

[0064] O termo “sentido” é entendido significar um ácido nucléico tendo uma seqüência que é homóloga ou idêntica a uma seqüência alvo, por exemplo, uma seqüência que liga-se a um fator de transcrição de proteína e que está envolvida na expressão de um dado gene. de acordo com uma forma de realização preferida, o ácido nucléico compreende um gene de interesse e elementos que permitem a expressão do dito gene de interesse.

[0065] O termo “gene” refere-se a uma região codificadora operacionalmene ligada às seqüências reguladoras apropriadas capazes de regular a expressão do polipeptídeo de alguma maneira. Um gene inclui regiões reguladoras não traduzidas de DNA (por exemplo, promoteres, intensificadores, repressores, etc.) precedentes (a montante) e seguintes (a jusante) a região codificadora (estrutura de leitura aberta, ORF) bem como, quando aplicável, seqüência intervenientes (isto é, íntrons) entre as regiões codificadoras individuais (isto é, éxons). O termo “eno estrutural” como usado neste é pretendido significar uma seqüência de DNA que é transcrita em mRNA, que é então traduzida em uma seqüência de aminoácido característicos de um polipeptídeo específico.

[0066] O termo “genoma” ou “DNA genômico” refere-se à informação genética hereditária de um organismo hospedeiro. O dito DNA genômico compreende o DNA do núcleo (também referido como DNA cromossômico) mas também, o DNA dos plastídeos (por exemplo, cloroplastos) e outras organelas celulares (por exemplo, mitocôndria). Preferivelmente, os termos genoma ou DNA genômico está referindo-se ao DNA cromossômico do núcleo.

[0067] O termo “DNA cromossômico” ou “seqüência de DNAcromossômico” deve ser entendido como o DNA genômico do núcleo celular independente do estado do ciclo celular. O DNA cromossômico, portanto, deve ser organizado em cromosomos e cromatídeos, estes devem ser condensado ou não enrolados. Uma inserção no DNA cromossômico pode ser demonstrada e analisada por vários métodos conhecidos na técnica como, por exemplo, análise de reação em cadeia da polimerase (PCR), A análise Southern blot, hibridização por fluorescência in situ (FISH) e PCR in situ.

[0068] Como usado neste o termo “região codificadora” quando usado em referência a um gene estrutural refere-se às seqüências de nucleotídeo que codificam os aminoácidos observados os polipeptídeo nascentes como um resultado da tradução de uma molécula de mRNA. A região codificadora é ligada, em eucariotas, na extremidade 5' pelo nucleotídeo tripleto “ATG” que codifica a metionina iniciadora e na extremidade 3' por um dos três tripletos, que especifica os códons de interrupção (isto é, TAA, TAG, TGA). Além de conter íntrons, as formas genômicas de um gene também podem incluir as seqüências localizadas tanto na extremidade 5' quanto na 3' das seqüências que estão presentes na transcrição de RNA. Estas seqüências são referidas como seqüências ou regiões de “flanqueamento” (estas seqüências de flanqueamento estão localizadas 5' ou 3' com relação às seqüências não traduzidas presentes na transcrição de mRNA). A região de flanqueamento 5' pode conter seqüências reguladoras, tais como promotores e intensificadores, que controlam ou influenciam a transcrição do gene. A região de flanqueamento 3' pode conter seqüências, que direcionam a terminação da transcrição, clivagem pós-transcricional e poliadenilação.

[0069] Como usado neste, o termo “seqüência de aminoácido” refere-se a uma lisa de abreviações, letras, caracteres ou palavras que representam os resíduos de aminoácido. Os aminoácidos podem ser referidos neste, por seu símbolo de três letras comumente conhecido ou pelos símbolos de uma letra recomendados pelo IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Os nucleotídeos, do mesmo modo, podem ser referidos por seus códigos de letra simples comumente aceitos.

[0070] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo”, “oligopeptídeo”, “polipeptídeo”, “produto de gene”, “produto de expressão” e “proteína” são usados neste, de maneira intercambeável, para referir-se a um polímero ou oligômero de resíduos de aminoácidos consecutivos.

[0071] O termo “isolado” como usado neste significa que um material foi removido de seu ambiente original. Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo de ocorrência natural presente em um animal vivo não é isolado, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo, separados de alguns ou de todos os materiais coexistentes no sistema natural, é isolado. Tais polinucleotídeos podem ser parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeos ou polipeptídeos podem ser parte de uma composição e devem ser isolados em que um tal vetor ou composição farmacêutica não é parte de seu ambiente original. Preferivelmente, o termo “isolado” quando usado com relação a um ácido nucléico, como em “uma seqüência de ácido nucléico isolada” refere-se a uma seqüência de ácido nucléico que é identificada e separada a partir de pelo menos um ácido nucléico contaminante com o qual está comumente associado em sua fonte natural. O ácido nucléico isolado é o ácido nucléico presente em uma forma ou ajuste que é diferente daquele em que é encontrado na natureza. Pelo contrário, os ácidos nucléicos não isolados são ácidos nucléicos, tais como DNA e RNA que são observados no estado que estes existem na natureza. Por exemplo, uma dada seqüência de DNA (por exemplo, um gene) é observada no cromossomo da célula hospedeira na proximidade dos genes vizinhos; as seqüências de RNA, tais como uma seqüência de mRNA específica que codifica uma proteína específica, são observados nas células como uma mistura com numerosos outros mRNAs, que codificam uma multitude de proteínas. Entretanto, uma seqüência de ácido nucléico isolada que compreende, por exemplo, SEQ ID N°: 18 inclui, por meio de exemplo, tais seqüências de ácido nucléico nas células que contém, comumente a SEQ ID N°:18 onde a seqüência de ácido nucléico está em uma localização cromossômica ou extracromossômica diferente daquela das células naturais ou é, de outra maneira flanqueada por uma seqüência de ácido nucléico diferente do que aquela encontrada na natureza. A seqüência de ácido nucléico isolada pode estar presente na forma de filamento simples ou de filamento duplo. Quando uma seqüência de ácido nucléico isolada é utilizada para expressar a proteína, a seqüência de ácido nucléico conterá, no mínimo pelo menos uma porção do filamento sentido ou codificador (isto é, a seqüência de ácido nucléico pode ser de filamento simples). Alternativamente, este pode conter tanto os filamento sentido quanto anti- sentido (isto é, a seqüência de ácido nucléico pode ser de filamento duplo).

[0072] Como usado neste, o termo “purificado” refere-se à moléculas, nucléicas ou seqüência de aminoácidos, que são removidos de seu ambiente natural, isolados ou separados. Uma “seqüência de ácido nucléico isolada” é, portanto, uma seqüência de ácido nucléico purificada. As moléculas “substancialmente purificadas” são pelo menos 60% livres, preferivelmente pelo menos 75% livres e mais preferivelmente pelo menos 90% livres de outros componentes com os quais estes são naturalmente associados.

[0073] O termo “tipo selvagem”, “natural” ou de “origem natural” significa com respeito a um organismo, polipeptídeo ou seqüência de ácido nucléico, que o dito organismo é de ocorrência natural ou disponível em pelo menos um organismo de ocorrência natural que não é mudado, mutado ou, de outra maneira manipulado pelo homem.

[0074] uma “construção de polinucleotídeo” refere-se a um ácido nucléico pelo menos parcialmente criado por métodos recombinantes. O termo “construção de DNA” está referindo-se a uma construção de polinucleotídeo que consiste de desoxiribonucleotídeos. A construção pode ser de filamento simples ou, preferivelmente duplo. A construção pode ser circular ou linear. O trabalhador habilitado está familiarizado com uma variedade de maneiras para obter um de uma construção de DNA. As construções podem ser preparadas por meio da recombinação de costume e técnicas de clonagem como são descritas, por exemplo, em Maniatis 1989, Silhavy 1984 e Ausubel 1987.

[0075] Como usado neste, os termos “complementar” ou “complementaridade” são usados em referência à seqüências de nucleotídeo relacionadas pelas regras de formação de pares de base. Por exemplo, a seqüência 5'-AGT-3' é complementar a uma seqüência 5'-ACT-3'. A complementaridade pode ser “parcial” ou “total.” A complementaridade “parcial” está onde uma ou mais bases de ácido nucléico não são unidas de acordo com as regras de formação de pares de base. A complementaridade “total” ou “completa” entre os ácido nucléicos está onde cada um e cada base de ácido nucléico é unida com uma outra base sob as regras de formação de pares de base. O grau de complementaridade entre os filamentos de ácido nucléico têm efeitos significantes na eficácia e força de hibridização entre os filamentos de ácido nucléico. Um “complemento” de uma seqüência de ácido nucléico como usado neste refere-se a uma seqüência de nucleotídeo cujos ácidos nucléicos mostram complementaridade total aos ácidos nucléicos da seqüência de ácido nucléico.

[0076] Os termos “homologia” ou “identidade” quando usados com relação aos ácidos nucléicos refere-se a um grau de complementaridade. A homologia ou identidade entre dois ácidos nucléicos é entendido como significando a identidade da seqüência de ácido nucléico sobre, em cada caso, o comprimento total da seqüência, que é calculada pela comparação com o auxílio do algoritmo do programa GAP (Wisconsin Package Versão 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) com os parâmetros sendo ajustados como segue: Valor da abertura: 12 Valor do comprimento: 4 Igualdade média: 2.912 Desigualdade média: 2.003

[0077] Por exemplo, uma seqüência com pelo menos 95% de homologia (ou identidade) a uma seqüência SEQ ID N°: 20 no nível de ácido nucléico é entendido como significando uma seqüência que, na comparação com a seqüência SEQ ID N°: 20 pelo algoritmo do programa acima com o ajuste de parâmetro acima, tem pelo menos 95% de homologia. Existe homologia parcial (isto é, identidade parcial de menos do que 100%) ou homologia completa (isto é, identidade completa de 100%).

[0078] Alternativamente, uma seqüência parcialmente complementar é entendida ser uma que iniba, pelo menos parcialmente uma seqüência completamente complementar de hibridização a um ácido nucléico alvo e é referido ao uso do termo funcional “substancialmente homólogo”. A inibição da hibridização da seqüência completamente complementar à seqüência alvo pode ser examinada usando-se o ensaio de hibridização (Southern ou Northern blot, hibridização de solução e outros) sob condições de baixa estringência. Uma seqüência ou sonda substancialmente homólogas (isto é, um oligonucleotídeo que é capaz que é capaz de se hibridizar a um outro oligonucleotídeo de interesse) competirá com e inibirá a ligação (isto é, a hibridização) de uma seqüência completamente homóloga a um alvo sob condições de baixa estringência. Isto não quer dizer que as condições de baixa estringência sejam tais que a ligação não específica seja permitida; as condições de baixa estringência requerem que a ligação de duas seqüências a uma outra seja uma interação específica (isto é, seletiva). A ausência de ligação não específica pode ser testada pelo uso de um segundo alvo que necessite mesmo de um grau parcial de complementaridade (por exemplo, menos do que cerca de 30% de identidade); na ausência de ligação não específica, a sonda não se hibridizará ao segundo alvo não complementar.

[0079] Quando em referência a uma seqüência de ácido nucléico de filamento duplo, tal como um cDNA ou clone genômico, o termo “substancialmente homólogo” refere-se a qualquer sonda que possa se hibridizar a ou ambos os filamentos da seqüência de ácido nucléico de filamento duplo sob condições de baixa estringência como descrito infra. Quando usado em referência a uma seqüência de ácido nucléico de filamento duplo, o termo “substancialmente homólogo” refere-se a qualquer sonda que possa hibridizar-se à seqüência de ácido nucléico de filamento simples sob condições de baixa estringência como descrito infra.

[0080] O termo “hibridização” como usado neste inclui “qualquer processo pelo qual uma cepa de ácido nucléico une-se com um filamento complementar através da formação de pares de base” (Coombs 1994). A hibridização e a força de hibridização (isto é, a força da associação entre os ácidos nucléicos) são impactadas por tais fatores com o grau de complementaridade entre os ácidos nucléicos, estringência das condições envolvidas, o Tm do híbrido formado, e a razão G:C dentro dos ácidos nucléicos.

[0081] Como usado neste, o termo “Tm” é usado em referência à “temperatura de fusão”. A temperatura de fusão é a temperatura em que uma população de moléculas de ácido nucléico de filamento duplo torna-se metade dissociado em filamento simples. A equação para calcular o Tm de ácidos nucléicos é bem conhecida na técnica. Como indicado pelas referências padrão, uma estimativa simples do valor Tm pode ser calculado pela equação: Tm = 81,5 + 0,41 (% G + C), quando um ácido nucléico está em uma solução aquosa em 1 M de NaCl [ver, por exemplo, Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)]. Outras referências incluem computações mais sofisticadas que tornam-se estruturais, bem como as características de seqüência em consideração ao cálculo de Tm.

[0082] As condições de baixa estringência quando usados em referência com a hibridização de ácido nucléico compreende as condições equivalentes à ligação ou hibridização a 68° C. Em uma solução que consiste de 5x SSPE (43,8 g/l de NaCl, 6,9 g/l de NaH2PO4.H2O e 1,85 g/L de EDTA, pH ajustado a 7,4 com NaOH), 1% de SDS, 5 x do reagente de Denhardt [50 x Denhardt contém o seguinte por 500 ml: 5 g de Ficoll (Tipe 400, Pharmacia), 5 g de BSA (Fraction V; Sigma)] e 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado seguido pela lavagem em uma solução que compreende 0,2 x SSPE e 0,1% de SDS em temperatura ambiente quando uma sonda de DNA de cerca de 100 a cerca de 1.000 nucleotídeos de comprimento é utilizado.

[0083] As condições de alta estringência quando usadas em referência à hibridização de ácido nucléico compreendem condições equivalentes à ligação ou hibridização a 68° C. Em uma solução que consiste de 5 x SSPE, 1% de SDS, 5 x do reagente de Denhardt e 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado seguido pela lavagem em uma solução que compreende 0,1 x de SSPE e 0,1% de SDS a 68° C. quando uma sonda de cerca de 100 a cerca de 1.000 nucleotídeos de comprimento é utilizado.

[0084] O termo “equivalente” quando feito em referência a uma condição de hibridização como este relaciona-se com uma condição de hibridização de interesse significa que uma condição de hibridização e uma condição de hibridização de interesse resulta na hibridização das seqüências de ácido nucléico que tem a mesma faixa de porcentagem de homologia (%). Por exemplo, se uma condição de hibridização de interesse resultar na hibridização de uma primeira seqüência de ácido nucléico com outras seqüências de ácido nucléico que têm de 80% a 90% de homologia com a primeira seqüência de ácido nucléico, então, uma outra condição de hibridização é dita ser equivalente a uma condição de hibridização de interesse se esta outra condição de hibridização também resultar na hibridização da primeira seqüência de ácido nucléico com a seqüência de ácidos nucléicos que têm de 80% a 90% de homologia com a primeira seqüência de ácido nucléico.

[0085] Quando usadas em referência à hibridização de ácido nucléico a técnica conhece bem que condições equivalente numerosas podem ser utilizadas para compreender condições de estringência baixa ou alta; fatores tais como o comprimento e a natureza (DNA, RNA, composição de base) da sonda e natureza do alvo (DNA, RNA, composição de base, presente na solução ou imobilizado, etc.) e a concentração dos sais e outros componentes (por exemplo, a presença ou ausência de formamida, sulfato de dextrano, polietileno glicol) são considerados e uma solução de hibridização pode ser variada para gerar condições de hibridização de estringência baixa ou alta diferente de, mas equivalente às condições listadas acima. Aqueles habilitados na técnica conhecem que considerando que as estringências mais altas podem ser preferidas para reduzir ou eliminar a ligação não específica, as estringências mais baixas podem ser preferidas para detectar um grande número de seqüências para detectar um grande número de seqüências de ácido nucléico tendo homologias diferentes.

[0086] “Transgene”, “transgênico” ou “recombinante” refere-se a um polinucleotídeo manipulado por um homem ou uma cópia ou complemento de polinucleotídeo manipulado pelo homem. Por exemplo, um cassete de expressão transgênico que compreende um promotor operacionalmente ligado a um segundo polinucleotídeo pode incluir um promotor que é heterólogo ao segundo polinucleotídeo como o resultado da manipulação pelo homem (por exemplo, pelos métodos descritos em Sambrook 1989 ou Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1998)) de um ácido nucléico isolado que compreende o cassete de expressão. Em um outro exemplo, um cassete de expressão recombinante pode compreender polinucleotídeos combinados de uma tal maneira que os polinucleotídeos são extremamente improváveis de serem observados na natureza. Por exemplo, os locais de restrição ou seqüências de vetores de plasmídeo manipuladas pelo homem podem flanquear ou separar o promotor a partir do segundo polinucleotídeo. Uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá eu os polinucleotídeos podem ser manipulados de muitas maneiras e não são limitados aos exemplos acima.

[0087] O termo “transgênico” ou “recombinante” como usado neste (por exemplo, com respeito a uma célula vegetal ou planta) é pretendido referir-se a células e/ou plantas que contém um transgene ou cujo genoma tenha sido alterado pela introdução de um transgene ou que tenha incorporado genes exógenos ou seqüências de DNA, que incluem mas não são limitadas aos ou seqüências de DNA que talvez não estejam normalmente presentes, os genes não normalmente descritos e traduzidos (“expressados”) em um dado tipo celular ou quaisquer outros genes ou seqüências de DNA que é deseja-se introduzir na célula não transformada e/ou vegetal, tais como os genes que possam estar normalmente presentes na célula e/ou planta não transformadas mas que deseja-se Ter a expressão alterada. Preferivelmente, o termo “recombinante” com respeito aos ácidos nucléicos como usados neste significa que o ácido nucléico está covalentemente unido e adjacente a um ácido nucléico ao qual este não é adjacente em seu ambiente natural. As células, tecidos e plantas transgênicos podem ser produzidos por diversos métodos que incluem a introdução de um “transgene” que compreende ácido nucléico (usualmente DNA) em uma célula alvo ou integração do transgene em um cromossomo de uma célula alvo por meio da intervenção humana, tal como pelos métodos descritos neste.

[0088] O termo “transgene” como usado neste refere-se a qualquer seqüência de ácido nucléico que é introduzida no genoma de uma célula por manipulações experimentais. Um transgene pode ser uma “seqüência de DNA endógena” ou uma “seqüência de DNA heteróloga” (isto é, “DNA exterior”). O termo “seqüência de DNA endógena” refere-se a uma seqüência de nucleotídeo que é naturalmente observada na célula em que este é introduzido de modo que este não contenha alguma modificação (por exemplo, uma mutação de ponto, a presença de um gene marcador selecionável, etc.) com relação à seqüência de ocorrência natural.

[0089] O termo “transgene” ou “transgênico” com respeito a, por exemplo, uma seqüência de ácido nucléico (ou um organismo, construção de expressão ou vetor que compreende a dita seqüência de ácido nucléico) refere-se a todas aquelas construções que se originam pelas manipulações experimentais em que a) a dita seqüência de ácido nucléico ou b) uma seqüência de controle genético operacionalmente ligado à dita seqüência de ácido nucléico a), por exemplo, um promotor, ou c) (a) e (b) não está localizado em seu ambiente genético natural ou foi modificado pelas manipulações experimentais, um exemplo de uma modificação sendo uma substituição, adição, anulação, inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeo. O ambiente genético natural refere-se ao local cromossômico natural no organismo de origem, ou a presença em uma biblioteca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da seqüência de ácido nucléico é preferivelmente retida, pelo menos em parte. O ambiente flanqueia a seqüência de ácido nucléico pelo menos em um lado e tem uma seqüência de pelo menos 50 bp, preferivelmente pelo menos 500 bp, especialmente preferível de pelo menos 1.000 bp, muito especialmente preferível de 5.000 bp, de comprimento. Uma construção de expressão de ocorrência natural - por exemplo, a combinação de ocorrência natural de um promotor com o gene correspondente - torna-se uma construção de expressão transgênica quando esta é modificada pelos métodos “artificiais” sintéticos não naturais, tais como, por exemplo, mutagenização. Tais métodos foram descritos (US 5.565.350; WO 00/15815).

[0090] Os termos “seqüência heteróloga de ácido nucléico” ou “DNA heterólogo” são usados de maneira intercambeável para referir-se a uma seqüência de nucleotídeo, que é ligada a ou é manipulada para tornar-se ligada à seqüência de ácido nucléico à qual não está ligada na natureza ou à qual está ligada m uma localização diferente na natureza. O DNA heterólogo não é endógeno à célula em que este é introduzido, mas foi obtido a partir de uma outra célula. O DNA heterólogo também inclui uma seqüência de DNA endógena, que contém alguma modificação. No geral, embora não necessariamente, o DNA heterólogo codifica o RNA e as proteínas que não são normalmente produzidas pela célula em que este é expressado. Os exemplo de DNA heterólogo incluem os genes repórteres, seqüências reguladoras transcricionais e de tradução, proteínas marcadoras selecionáveis (por exemplo, proteínas que conferem resistência ao medicamento), etc. Preferivelmente, o termo “transgênico” ou “recombinante” com respeito a uma seqüência reguladora (por exemplo, um promotor da invenção) significa que a dita seqüência reguladora está covalentemente unida e adjacente a um ácido nucléico ao qual esta não é adjacente em seu ambiente natural.

[0091] O termo “gene exterior” refere-se a qualquer ácido nucléico (por exemplo, seqüência genética) que é introduzida no genoma de uma célula pelas manipulações experimentais e pode incluir as seqüências genéticas observadas naquela célula de modo que o gene introduzido contenha alguma modificação (por exemplo, um ponto de mutação, a presença de um gene marcador selecionável, etc.) com relação ao gene de ocorrência natural.

[0092] Os polipeptídeos ou proteínas recombinantes referem-se a polipeptídeos ou proteínas produzidas pelas técnicas de DNA recombinantes, isto é, produzidos a partir de células transformadas por uma construção de DNA recombinante exógeno que codifica o polipeptídeo ou proteína desejados. Os ácidos nucléicos e os polipeptídeos recombinantes também podem compreender moléculas, que, como tais, não existem na natureza mas são modificados, mudados, mutados, ou, de outra maneira manipulados pelo homem. Preferivelmente, um “polipeptídeo recombinante” é um polipeptídeo que não ocorre de maneira natural que difere em seqüência de um polipeptídeo que ocorre de maneira natural por, pelo menos um resíduo de aminoácido. Os métodos preferidos para a produção do dito polipeptídeo recombinante e/ou ácido nucléico pode compreender a mutagênese direcionada ou não direcionada, mistura de DNA ou outros métodos de recombinação recursiva.

[0093] O termo “organismo geneticamente modificado” ou “GMO” refere-se a qualquer organismo que compreenda o DNA transgene. Os organismos exemplares incluem plantas, animais e microorganismos.

[0094] O termo “célula” ou “célula vegetal” como usado neste refere-se a uma célula simples. O termo “células” refere-se a uma população de células. a população pode ser uma população pura que compreende um tipo de célula. Da mesma maneira, a população pode compreender mais do que um tipo de célula. Na presente invenção, não existe limita no número de tipos celulares que uma população celular pode compreender. As células podem ser sincronizadas ou não sincronizadas. Uma célula vegetal dentro do significado desta invenção pode ser isolada (por exemplo, na cultura de suspensão) ou compreendida em um tecido vegetal, órgão vegetal ou planta em qualquer estágio de desenvolvimento.

[0095] O termo “órgão” com respeito a uma planta (ou “órgão vegetal”) significa parte de uma planta e pode incluir (mas não deve limitar-se a) por exemplo, raízes, frutas, brotos, caule, folhas, anteras, sépalas, pétalas, pólen, sementes, etc.

[0096] O termo “tecido” com respeito a uma planta (ou “tecido vegetal”) significa a disposição de células vegetais múltiplas que incluem tecidos diferenciados e tecidos não diferenciados de plantas. Os tecidos vegetais podem constituir parte e um órgão vegetal (por exemplo, a epiderme de uma folha vegetal) mas também pode constituir tecidos tumorais (por exemplo, tecido de calo) e vários tipos de células em cultura (por exemplo, células simples, protoplastos, embriões, calos, corpos semelhantes a protocormo, etc.). o tecido vegetal pode estar in planta, na cultura de órgão, cultura de tecido ou cultura celular.

[0097] O termo “planta” como usado neste refere-se a uma pluralidade de células vegetais, que são grandemente diferenciadas em uma estrutura que está presente em qualquer estágio de desenvolvimento de uma planta. Tais estruturas incluem um ou mais órgão vegetais que incluem, mas não limitam- se a, fruto, broto, caule, folha, flôr, pétala, etc. Preferivelmente, o termo “planta” todas as plantas, órgão/estruturas vegetativos do broto (por exemplo, folhas, caules e tubérculos), raízes, flores e órgão/estruturas florais (por exemplo, brácteas, sépalas, pétalas, estames, carpelos, anteras e óvulos), sementes (incluindo embriões, endosperma e revestimento de semente) e frutas (o ovário maduro), tecidos vegetais (por exemplo, tecido vascular, tecido do solo e outros) e células (por exemplo, células de proteção, células de germe, tricomas e outros), e progênie do mesmo. A classe de plantas que podem ser usadas no método da invenção é, no geral, tão ampla quanto a classe de plantas superiores e inferiores sensíveis às técnicas de transformação, incluindo angiospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas), gimnospermas, samambaias e algas multicelulares. Isto inclui plantas de uma variedade de níveis de plóide, incluindo aneuplóide, poliplóide, diplóide, haplóide e hemizigoto. Estão incluídos dentro do escopo da invenção todos os gêneros e espécies de plantas superiores e inferiores do reino vegetal. Além disso, estão incluídas as plantas maduras, sementes e mudas e partes, material de propagação (por exemplo, sementes e frutas) e culturas, por exemplo, culturas celulares, derivadas destes. São preferidas plantas e materiais vegetais das seguintes famílias de plantas: Amaranthaceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, Tetragoniaceae.

[0098] Plantas anuais, perenes, monocotiledôneas e dicotiledôneas são organismos hospedeiros preferidos para a geração de plantas transgênicas. O uso do sistema de recombinação ou o método de acordo com a invenção ainda é vantajoso em todas as plantas ornamentais, silvicultura, árvores frutíferas ou ornamentais, flores, flores cortadas, arbustos ou gramados. A dita planta pode incluir - mas não devem ser limitadas a - briófitas, tais como, por exemplo, Hepaticae (hepáticas) e Musci (musgos); pteridófitas, tais como samambaias, cavalinha e clubmosses; gimnospermas, tais como coníferas, cicádeas, ginkgo e Gnetaeae; algas, tais como Clorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae (diatomas) e Euglenophyceae.

[0099] As plantas para os propósitos da invenção podem compreender as famílias Rosaceae, tais como rosa, Ericaceae, tais como rododendro e azaléias, Euphorbiaceae, tais como poinsetias e cróton, Caryophyllaceae, tais como cravos, Solanaceae, tais como petúnias, Gesneriaceae, tais como violeta africana, Balsaminaceae, tais como não-me-toque, Orchidaceae, tais como orquídeas, Iridaceae, tais como gladíolos, íris, frésia e açafrão, Compositae, tais como tagetes, Geraniaceae, tais como gerânios, Liliaceae, tais como Drachaena, Moraceae, tais como fícus, Araceae, tais como filodêndro e muitos outros.

[00100] As plantas transgênicas de acordo com a invenção são, além disso, selecionadas, em particular, dentre as plantas de lavoura dicotiledôneas,tais como, por exemplo, das famílias das Leguminosae, tais como ervilha, alfafa e soja; da família das Umbelliferae, particularmente o gênero Daucus (muito particularmente as espécies carota (cenoura)) e Apium (muito particularmente as espécies graveolens var. dulce (aipo)) e muitos outros; a família das Solanaceae, particularmente o gênero Lycopersicon, muito particularmente as espécies esculentum (tomate) e o gênero Solanum, muito particularmente as espécies tuberosum (batata) e melongena (aubergina), tabaco e muitos outros e o gênero Capsicum, muito particularmente as espécies annum (pimenta) e muitos outros; a família das Leguminosae, particularmente o gênero Glycine, muito particularmente as espécies max (soja) e muitas outras e a família das Cruciferae, particularmente o gênero Brassica, muito particularmente as espécies napus (óleo de semente de colza), campestris (beterraba), oleracea cv Tastie (repolho), oleracea cv Snowball Y (couve-flor) e oleracea cv Emperor (brócoli) e o gênero Arabidopsis, muito particularmente as espécies thaliana e muitas outras; a família das Compositae, particularmente o gênero Lactuca, muito particularmente as espécies sativa (alface) e muitas outras.

[00101] As plantas transgênicas de acordo coma invenção são selecionadas, em particular, dentre as plantas de lavoura monocotiledôneas, tais como, por exemplo, cereais tais como trigo, cevada, sorgo e painço, centeio, triticale, milho, arroz ou aveias e cana de açúcar. Ainda são preferidas as árvores, tais como maçã, pêra, marmelo, ameixa, cereja, pêssego, nectarina, damasco, papaia, manga e outras espécies lenhosas incluindo árvores coníferas e decíduas, tais como álamo, pinheiro, sequóia, cedro, carvalho, etc. especialmente preferidas são Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, óleo de semente de colza, soja, milho, trigo, linhaça, batata e tagetes.

[00102] A “eficiência de transformação” ou “freqüência de transformação” como usado neste podem ser medidas pelo número de células transformadas (ou organismo transgênicos que se desenvolvem a partir de células transformadas individuais) que são recuperadas sob condições experimentais padrão (isto é, padronizadas ou normalizadas com respeito à quantidade de células contatadas com o DNA exterior, quantidade de DNA liberado, tipo e condições da liberação de DNA, condições de cultura geral etc.). Por exemplo, quando os pecíolos isolados são usados como o material de partida para a transformação, a freqüência de transformação pode ser expressada como o número de brotos transgênicos (ou linhas de plantas férteis resultantes) obtidas por pecíolo transformado.

[00103] O termo “expressão” refere-se à biossíntese de um produto de gene. Por exemplo, no caso de um gene estrutural, a expressão envolve a transcrição do gene estrutural em mRNA e - opcionalmente - a tradução subseqüente de mRNA em um ou mais polipeptídeos.

[00104] O termo “cassete de expressão” ou “construção de expressão” como usado neste é pretendido significar a combinação de qualquer seqüência de ácido nucléico a ser expressada em ligação operável com uma seqüência de promotor e - opcionalmente - elementos adicionais (como, por exemplo, seqüências terminadoras e/ou de poliadenilação) que facilitam a expressão da dita seqüência de ácido nucléico.

[00105] O termo “promotor,” “elemento promotor” ou “seqüência promotora” como usado neste, refere-se a uma seqüência de DNA que quando ligada a uma seqüência de nucleotídeo de interesse é capaz de controlar a transcrição da seqüência de interesse no mRNA. Um promotor está tipicamente, embora não necessariamente, localizado 5' (isto é, a montante) de uma seqüência de nucleotídeo de interesse (por exemplo, próximo ao local de início de transcrição de um gene estrutural) cuja transcrição em mRNA este controla e fornece um local para a ligação específica pela polimerase de RNA e outros fatores de transcrição para a iniciação de transcrição. Uma seqüência de polinucleotídeo “heteróloga a” um organismo ou uma segunda seqüência de polinucleotídeo se esta originar-se de uma espécie externa ou se for da mesma espécie, é modificada a partir de sua forma original. Por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a uma seqüência codificadora heteróloga refere-se a uma seqüência codificadora a partir de uma espécie diferente daquela cujo promotor foi derivado ou se as mesmas espécies, uma seqüência codificadora que não está estruturalmente associada com o promotor (por exemplo, uma seqüência codificadora geneticamente projetada ou um alelo de um ecotipo ou variedade diferente). Os promotores adequados podem ser derivados de plantas ou de patógenos vegetais como, por exemplo, vírus vegetais.

[00106] Se um promotor for um promotor indutível, então, a razão de transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Em contraste, a razão de transcrição não é regulada por uma gente indutor se o promotor for um agente constitutivo. Também, o promotor pode ser regulado e um maneira específica de tecido ou preferida de tecido tal que este seja ativo apenas na transcrição da região codificadora associada em tipos específicos de tecidos nas folhas, raízes e meristema. O termo “específico de tecido” como aplica-se a um promotor refere-se a um promotor que é capaz de direcionar a expressão seletiva de uma seqüência de nucleotídeo de interesse a um tipo específico de tecido (por exemplo, pétalas) na ausência relativa de expressão da mesma seqüência de nucleotídeo em um tipo diferente de tecido (por exemplo, raízes). A especificidade do tecido de um promotor pode ser avaliado, por exemplo, ligando-se operacionalmente um gene repórter à seqüência promotora para gerar uma construção repórter, introduzindo-se a construção repórter ao genoma de uma planta, tal que a construção repórter seja integrada em cada tecido da planta transgênica resultante e detectando-se a expressão do gene repórter (por exemplo, detectando-se mRNA, proteína ou a atividade de uma proteína codificada para o gene repórter) em tecidos diferentes da planta transgênica. A detecção de um nível maior de expressão do gene repórter em um ou mais tecidos com relação ao nível de expressão do gene repórter em outros tecidos mostra que o promotor é específico para os tecidos em que os níveis maiores de expressão são detectados. O termo “específico do tipo celular” como aplicado a um promotor refere-se a um promoter que é capaz de direcionar a expressão seletiva de uma seqüência de nucleotídeo de interesse em um tipo específico de célula na ausência relativa de expressão da mesma seqüência de nucleotídeo de interesse em um tipo diferente de célula dentro do mesmo tecido. O termo “específico do tipo celular” quando aplicado a um promotor também significa um promotor capaz de promover a expressão seletiva de uma seqüência de nucleotídeo de interesse em uma região dentro de um tecido simples. A especificidade do tipo celular de um promotor pode ser estimada usando-se os métodos em conhecidos na técnica, por exemplo, manchamento por atividade de GUS (como descrito, por exemplo, no Exemplo 7) ou manchamento imuno-histoquímico. Resumidamente, as seções de tecido são fixadas em parafina e as seções de parafina são reagidas com um anticorpo primário que é específico para o produto de polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeo de interesse cuja expressão é controlada pelo promotor. Um anticorpo secundário rotulado (por exemplo, peroxidase conjugada), que é específico para o anticorpo primário, é deixado ligar-se ao tecido seccionado e a ligação específica detectada (por exemplo, com avidina/biotina) por microscopia. Os promotores podem ser constitutivos ou reguláveis. O termo “constitutivo” quando feito em referência a um promotor significa que o promotor é capaz de direcionar a transcrição de uma seqüência de ácido nucléico operacionalmente ligada na ausência de um estímulo (por exemplo, choque por calor, produtos químicos, luz, etc.). Tipicamente, os promotores constitutivos são capazes de direcionar a expressão de um transgene substancialmente em qualquer célula e em qualquer tecido. Em contraste, um promotor “regulável” é um que é capaz de direcionar um nível de transcrição de uma seqüência de ácido nucléico ligada na presença de um estímulo (por exemplo, choque por calor, produtos químicos, luz, etc.) que é diferente do nível de transcrição da seqüência de ácido nucléico operacionalmente ligada na ausência dos estímulos.

[00107] Quando a expressão de um gene em todos os tecidos de uma planta transgênica ou outro organismo ou desejado, pode se usar um promotor “constitutivo”, que é, no geral, sob condições e estados mais ambientais de desenvolvimento ou de diferenciação celular (Benfey 1989). Os promotores úteis para plantas também incluem aqueles obtidos de plasmídeos Ti ou Ri, a partir de células vegetais, vírus vegetais ou outros organismos cujos promotores são observados serem funcionais em plantas. Os promotores bacterianos que funcionam em plantas e, desta maneira são adequados para o uso nos métodos da invenção incluem o promotor de octopina sintase, o promotor de nopalina sintase e o promotor de manopina sintetase. O promotor que controla a expressão do gene traço e/ou o marcador de seleção podem ser constitutivos. Os promotores constitutivos adequados para o uso em plantas incluem, por exemplo o vírus mosaico da couve-flor, (CaMV) região de iniciação de transcrição 35S (Franck 1980; Odell 1985; Shewmaker 1985; Gardner 1986), a região de início de transcrição 19S (US 5.352.605 e WO 84/02913) e promotores da região VI, o promotor 1' ou 2' derivado de T- DNA de Agrobacterium tumefaciens e outros promotores ativos em células vegetais que são conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Outros promotores adequados incluem o promotor transcrito de comprimento total do vírus mosaico de Escrofulária, promotores de actina (por exemplo, o promotor de actina do arroz; McElroy 1990), promotores de histona, promotores de tubulina ou o promotor de manopina sintase (MAS). Outros promotores vegetais constitutivos incluem vários promotores de ubiquitina ou poli- ubiquitina (Sun 1997; Christensen 1989, 1992; Bruce 1989; Holtorf 1995), os promotores mas, Mac ou DoubleMac (US 5.106.739; Comai 1990), o promotor de ubiquitina (Holtorf 1995), promotor de subunidade pequena Rubisco (SSU) (US 4.962.028), o promotor de legumina B (GenBank Acc. N° X03677), o promotor da nopalina sintase (NOS) de Agrobacterium, o promotor duplo TR, o promotor de octopina sintase (OCS) de Agrobacterium, o promotor Smas, o promotor de desidrogenase do álcool cinamílico (US 5,683,439), os promotores das subunidades de ATPase vacuolares, o promotor pEMU (Last 1991); o promotor MAS (Velten 1984), o promotor de H3 histona do milho (Lepetit 1992; Atanassova 1992), o promotor de α- conglicinina, o promotor de faseolina, o promotor de ADH e o promotores de estoque de calor, o promotor de nitrilase de Arabidopsis thaliana (WO 03/008596; GenBank Acc. N°: U38846, nucleotídeos 3.862 a 5.325 ou ainda 5342), o promotor de uma proteína rica em prolina do trigo (WO 91/13991), o promotor do gene ptxA de Pisum sativum e outras regiões de iniciação de transcrição de vários genes vegetais conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

[00108] É claro, os promotores podem regular a expressão o tempo todo apenas em um ou em alguns tecidos. Alternativamente, um promotor pode regular a expressão em todos os tecidos mas apenas em um ponto de tempo de desenvolvimento específico. Como observado acima, o promotor de excisão (isto é, o promotor que está ligado ao polnucleotídeo de clivagem de DNA específico de seqüência) é, no geral, não constitutivo, mas em vez disso é constitutivo para apenas parte do ciclo de vida ou pelo menos um tecido do organismo transgênico. Pode-se usar um promotor que direciona a expressão de um gene de interesse em um tecido específico ou está, de outra maneira sob controle ambiental ou de desenvolvimento preciso. Os exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores indutíveis incluem ataque de patogênio, condições anaeróbicas, etileno ou a presença de luz. Os promotores sob o controle do de desenvolvimento incluem os promotores que iniciam a transcrição apenas em certos tecidos ou órgãos, tais como folhas, raízes, frutas, sementes ou flores ou partes estes. A operação de um promotor também pode variar dependendo de sua localização no genoma. Desta maneira, um promotor indutível pode tornar-se total ou parcialmente constitutivo em certos locais. Os exemplos de promotores vegetais específicos de tecido sob o controle de desenvolvimento incluem os promotores que iniciam a transcrição apenas em certos tecidos, tais como frutas, sementes, flores, anteras, ovários, pólen, meristema, flores, folhas, caules, raízes e sementes. O promotor ES específico de tecido do tomate é particularmente útil para direcionar a expressão de gene de modo que um produto de gene esteja localizado nas frutas (ver, por exemplo, Lincoln 1988; Deikman 1988, 1992). Outros promotores específicos de semente adequados incluem aqueles derivados dos seguintes genes: MAC1 do milho (Sheridan 1996), Cat3 do milho (GenBank N° L05934, Abler 1993), o gene que codifica oleosina 18kD do milho (GenBank N° J05212, Lee 1994) viviparo-1 de Arabidopsis (Genbank Acc.-N° U93215), o gene que codifica oleosina de Arabidopsis (Genbank Acc.-N° Z17657), Atmycl dem Arabidopsis (Urao 1996), a família do gene de armazenagem de semente 2S de Arabidopsis (Conceicao 1994) o gene que codifica oleosina 20kD de Brassica napus (GenBank N° M63985), napina de Brassica napus (GenBank N° J02798, Josefsson 1987), a família do gene de napina (por exemplo, de Brassica napus; Sjodahl 1995), US 5,608,152; Stalberg 1996), o gene que codifica a proteína de armazenamento 2S de Brassica napus (Dasgupta 1993), os genes que codificam oleosina A (Genbank Acc.-N° U09118) e oleosina B (Genbank N° U09119) de soja, o gene que codifica proteína rica em enxofre de peso molecular baixo da soja (Choi 1995), o gene de faseolina (US 5,504,200, Bustos 1989; Murai 1983; Sengupta-Gopalan 1985), o ene de albumina 2S (Joseffson 1987), o gene de legumina (Shirsat 1989), o gene USP (proteína de semente desconhecida) (Baumlein 1991), o gene de proteína de ligação de sacarose (WO 00/26388), o gene de legumina B4 (LeB4; Baumlein 1991a,b; 1992; Fiedler 1995), o gene de oleosina de Arabidopsis (WO 98/45461), o gene Bce4 de Brassica (WO 91/13980), genes que codificam a “glutenina de peso molecular alto” (HMWG), gliadina, enzima de ramificação, pirofosfato de ADP-glicose (AGPase) ou sintase de amido. Além disso, os promotores preferidos são aqueles que permitem a expressão específica de semente em monocotiledôneas, tais como milho, cevada, trigo, centeio, arroz e outros. Os promotores que podem ser vantajosamente utilizados são o promotor do gene lpt2 ou lpt1 (WO 95/15389, WO 95/23230) ou os promotores descritos em WO 99/16890 (os promotores do gene de hordeína, o gene de glutelina, o gene de orizina, o gene de prolamina, o gene de gliadina, o gene de zeína, o gene de casirina ou o gene de secalina). Além disso, são preferidos um promotor específico de folha e induzido por luz, tal como aquele de cab ou Rubisco (Simpson 1985; Timko 1985); um promotor específico de antera, tal como aquele de LAT52 (Twell 1989b); um promotor específico de pólen, tal como aquele de Zml3 (Guerrero 1993) e um promotor preferido de microsporo, tais como aqueles de apg (Twell 1993). Outros promotores adequados são, por exemplo, promotores específicos de tubérculos, raízes de armazenamento ou raízes, tais como, por exemplo, o promotor de patatina de classe I (B33), o promotor do inibidor de catepsina D de batata, o promotor de amido sintase (GBSS1) ou o promotor de esporamina e os promotores específiocos de fruta, tais como, por exemplo, o promotor específico de fruta de tomate (EP-A 409 625).

[00109] Os promotores que, além disso são adequados são aqueles que garantem a expressão específica de folha. Os promotores que podem ser mencionados são o promotor FBPase citosólico de batata (WO 98/18940), o promotor Rubisco (ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase) SSU (subunidade pequena) ou o promotor ST-LSI de batata (Stockhaus 1989). Outros promotores preferidos são aqueles que determinam a expressão em sementes e embriões vegetais.

[00110] Além disso, os promotores adequados são, por exemplo, os promotores específicos da maturação de fruta, tais como, por exemplo, o promotor específico da maturação da fruta do tomate (WO 94/21794), promotores específicos de flores tais como, por exemplo, o promotor da fitoeno sintase (WO 92/16635) ou o promotor do gene P1-rr (WO 98/22593) ou um outro promotor não específico de nodo como descrito no EP-A 249676 podem ser usados vantajosamente. O promotor também pode ser um promotor específico de pith, tal como o promotor isolado de um gene TrpA vegetal como descrito no WO 93/07278. Um promotor regulado pelo desenvolvimento é, inter alia, descrito (Baerson 1993).

[00111] Um cassete de expressão também pode conter um promotor quimicamente indutível (artigo de revisão: Gatz 1997), por meio do qual a expressão do gene exógeno na planta pode ser controlado em um ponto particular de tempo. Tais promotores, tais como, por exemplo, o promotor PRP1 (Ward 1993), um promotor indutível por ácido salicílico (WO 95/19443), um promotor indutível por benzenosulfonamida (EP 0 388 186), um promotor indutível por tetraciclina (Gatz 1991, 1992), um promotor indutível por ácido abscísico EP 0 335 528) ou um promotor indutível por etanol-ciclo-hexanona (WO 93/21334) também podem ser usados. Também é usado o promotor do gene de glutationa-S transferase isoforma II (GST-II- 27), que pode ser ativado por protetores aplicado de maneira exógena, tais como, por exemplo, N,N-dialil-2,2-dicloroacetamida (WO 93/01294) e que é operável em um número grande de tecidos tanto de monocotiledônea e dicotiledônea. Os promotores indutíveis exemplares que podem ser utilizados na presente invenção incluem aqueles do sistema ACE1 que responde ao cobre (Mett 1993) ou o promotor de milho In2 que responde aos protetores de herbicida de benzenossulfonamida (Hershey 1991; Gatz 1994). Um promotor que responde a um agente indutor ao qual as plantas não respondem normalmente podem ser utilizados. Um promotor indutível exemplar é o promotor indutível de um gene de hormônio esteróide, cuja atividade de transcrição é induzida por um hormônio de glicocoticóide (Schena 1991). Outros promotores preferidos são promotores induzidos pela tensão biótica ou abiótica, tais como, por exemplo, o promotor indutível por patógeno do gene PRP1 (Ward 1993), o promotor hsp80 indutível por calor de tomate (US 5.187.267), o promotor de alfa-amilase indutíva por frio de batata (WO 96/12814) ou o promotor de pinII induzido por ferimento (EP-A1 0 375 091).

[00112] Os promotores também abrangem outros promotores, elementos promotores ou promotores mínimos capazes de modificar as características específicas de expressão. Esta maneira, por exemplo, a expressão específica de tecido pode acontecer além de uma função de certos fatores de tensão, devido às seqüências de controle genético. Tais elementos são, por exemplo, descritos para tensão de água, ácido abscísico (Lam 1991) e tensão por calor (Schoffl 1989).

[00113] O termo “ligação operável” ou “operacionalmente ligado” deve ser entendido como significando, por exemplo, a disposição seqüencial de um elemento regulador (por exemplo, um promotor) com uma seqüência de ácido nucléico a ser expressado, se apropriado, elementos reguladores adicionais (tais como, por exemplo, um terminador) de uma tal maneira que cada um dos elementos reguladores podem satisfazer sua função pretendida para permitir, modificar, facilitar ou de outra maneira influenciar a expressão da dita seqüência de ácido nucléico. A expressão pode resultar dependendo da disposição da seqüência de ácido nucléicos em relação ao RNA sentido ou anti-sentido. Para este fim, a ligação direta no sentido químico não é necessariamente requerido. As seqüências de controle genético, tais como, por exemplo, seqüências intensificadoras, também podem exercer sua função na seqüência alvo das posições que ainda estão além ou de fato, de outras moléculas de DNA. As disposições preferidas são aquelas em que a seqüência de ácido nucléico a serem expressadas e maneira recombinante está posicionada atrás da seqüência que atua como promotor, de modo que as duas seqüências estejam covalentemente ligadas uma à outra. A distância entre a seqüência de promotor e a seqüência de ácido nucléico a ser expressada de maneira recombinante preferivelmente menos do que 200 pares de base, especialmente preferível menos do que 100 pares de base, muito especialmente preferível menos do que 50 pares de base. A ligação operável e uma construção de expressão podem ser geradas por meio de recombinação de costume e técnicas de clonagem como descrito (por exemplo, em Maniatis 1989; Silhavy 1984; Ausubel 1987; Gelvin 1990). Entretanto, seqüências adicionais que, por exemplo, atuam como um ligador com locais de clivagem específicos para enzimas de restrição, ou como um peptídeo sinalizador, também podem estar posicionadas entre as duas seqüências. As inserção das seqüências também pode levar à expressão de proteínas de fusão. Preferivelmente, a construção de expressão, que consiste de uma ligação de promotor e seqüência de ácido nucléico a ser expressada, pode existir em uma forma integrada de vetor e ser inserida em um genoma vegetal, por exemplo, por transformação.

[00114] O termo “transformação” como usado neste refere-se à introdução de material genético (por exemplo, um transgene) em uma célula. A transformação de uma célula pode ser estável ou transitória. O termo “transformação transitória” ou “transitoriamente transformado” refere-se à introdução de um ou mais transgenes em uma célula na ausência de integração do transgene no genoma da célula hospedeira. A transformação transitória pode ser selecionada, por exemplo, pelo ensaio imunoabsorvente ligado por enzima (ELISA) que detecta a presença de um polipeptídeo codificado por um ou mais dos transgenes. Alternativamente, a transformação transitória pode ser detectada pela detecção da atividade da proteína (por exemplo, β-glucuronidase) codificada para o transgene (por exemplo, o gene uid A) como demonstrado nesse [por exemplo, ensaio histoquímico da atividade da enzima GUS manchando-se com X-gluc que dá um precipitado azul na presença da enzima GUS e um ensaio quimioluminescente da atividade da enzima GUS usando-se o kit GUS-Light (Tropix)]. O termo “transformante transitório” refere-se a uma célula que tem incorporado transitoriamente um ou mais trangenes. Em cotnraste, o termo “transformação estável” ou “estavelmente transformado” refere-se à introfdução e integração de um ou mais trangenes o genoma de uma célula, preferivelmente resultando na integração cromossômica e através da hereditariedade estável através da meiose. A transformação estável de uma célula pode ser detectada pela hibridização de Southern blot do DNAgenômico da célula com seqüências de ácido nucléico que são capazes de ligar-se a um ou mais dos transgenes. Alternativamente, a transformação estável de uma célula também pode ser detectada pela reação da cadeia de polimerase do DNA genômico DNA da célula para amplificar as seqüências de transgene. O termo “transformante estável” refere-se a uma célula que tem, estavelmente integrado um ou mais transgenes no DNA genômico. Desta maneira, um transformante estável é distinguido a partir de um transformante transitório em que, por meio do qual o DNA genômico do transformante estável contém um ou mais transgenes, o DNA genômico do transformante transitório não contém um transgene. A transformação também inclui a introdução do material genético nas células vegetais na forma de vetores virais vegetais que envolvem a replicação epicromossômica e a expressão genética que pode apresentar propriedades variáveis com respeito à estabilidade meiótica.

[00115] Os termos “infectar” e “infecção” por uma bactéria refere-se à co-incubação de uma amostra biológica alvo, (por exemplo, célula, tecido, etc.) com a bactéria sob condições tais que as seqüências de ácido nucléico contidas dentro da bactéria sejam introduzidas em uma ou mais células da amostra biológica alvo.

[00116] Os termos “meristema” ou “células meristemáticas” ou “tecido meristêmico” podem ser usados de maneira intercambiável e são pretendidos significar tecido vegetal não diferenciado, que divide-se continuamente, formando novas células, como aquelas observadas na ponta de um caule ou raiz.

[00117] O termo “nodo” é pretendido significar o ponto em um caule onde uma folha é ligada ou tenha sido ligada. O termo “internodo” é pretendido significar a seção ou a parte entre os dois nodos em um caule.

[00118] O termo “pecíolo” é pretendido significar a haste pela qual uma folha está ligada a um caule, também denominada uma haste de folha.

[00119] O termo “botão axilar” é pretendido significar uma pequena protuberância ou ramificação ao longo de um caule, algumas vezes fechado em escamas protetoras e contendo um broto não desenvolvido, olha ou flor, também denominado um botão lateral.

[00120] O termo “hipocotil” é pretendido significar a parte do caule entre as folhas das sementes (os cotilédones) e a raiz. O termo “axila da folha” é pretendido significar o ângulo entre a folha e o caule em que esta se sustenta. O broto axilar ocorre na axila da folha.

[00121] O termo “cotilédone” é pretendido significar uma folha do embrião da semente vegetal, que na germinação permanece na semente ou emerge, aumenta e torna-se verde; também denominada como uma folha e semente. A semente de soja consiste de duas metades de semente, que são cotilédones ou folhas de semente. Os dois cotilédones contém reservas de alimento e de nutrientes que alimentam a semente até esta tornar-se estabelecida. A cor do cotilédone é verde no desenvolvimento de vagem mas em variedades de grãos presentes, este torna-se amarela como as plantas maduras. O eixo do embrião está localizado entre os cotilédones está ligado a estes perto da extremidade mais próxima à micrópila.

[00122] O termo “Agrobacterium” como usado neste refere-se a uma bactéria fitopatogênica da forma de bastão de Gram-negativo transportada no solo. Agrobacterium junto com Rhizobium, Sinorhizobium e Allorhizobium são gêneros dentro da família bacteriana Rhizobiaceae (Kersters and De Ley. 1984) que foi incluída dentro da sub-classe alfa-2 de Proteobactérias na base de características ribossômicas (Willems and Collins. 1993). Os membros desta família são aeróbicos, Gram-negativo. As células são, normalmente da forma de bastão (0,6 a 1,0 μm por 1,5 a 3,0 μm), ocorrem de maneira única ou em pares, sem endosporo e são movidas por um a seis flagelos peritrichous. O muco de polissacarídeo extracelular considerável é usualmente produzido durante o desenvolvimento em meio contendo carboidrato. As espécies de Agrobacterium, Agrobacterium tumefaciens (syn. Agrobacterium radiobacter), Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi e Agrobacterium vitis, junto com Allorhizobium undicola, formam um grupo monofilético com todas as espécies Rhizobium, com base em análises de 16S rDNA comparativas (Sawada 1993, Young 2003). O Agrobacterium é um gênero artificial que compreende espécies patogênicas de plantas. A natureza monofiçética de Agrobacterium, Allorhizobium e Rhizobium e seu suporte de circunscrição genérica fenotípica comum suportam a sua amalgamação em um gênero simples, Rhizobium. A classificação e a caracterização das cepas de Agrobacterium incluindo a diferenciação de Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes e suas classes tipo opina é uma prática bem conhecida na técnica (ver, por exemplo, Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria, 3° edição. (2001) N. W. Schaad, J. B. Jones e W. Chun (eds.) ISBN 0890542635; por exemplo, o artigo de Moore et al. publicado neste).

[00123] Análises recentes demonstram que a classificação por suas propriedades patogênicas vegetais não é justificada. Conseqüentemente, os métodos mais avançados com base na análise e na comparação de genoma (tais como sequenciamento de 16S rRNA; RFLP, Rep-PCR, etc.) são utilizados para elucidar a relação das várias cepas (ver por exemplo, Young 2003, Farrand 2003, de Bruijn 1996, Vinuesa 1998). A Agrobacteria podem ser diferenciadas, em pelo menos três biovars, correspondendo a divisões de espécies com base em testes bioquímicos e fisiológicos diferenciais. As cepas patogênicas de Agrobacterium dividem uma característica comum; estes contêm pelo menos um plasmídeo grande, o plasmídeo indutor de tumor ou raiz (Ti e Ri, respectivamente). A virulência é determinada por regiões diferentes do plasmídeo que inclui o DNA transferido (T-DNA) e os genes de virulência (vir). Os genes de virulência medeiam a transferência de T-DNA em células vegetais infectadas, usando integra-se no DNA de planta. De acordo com a classificação “tradicional”, Agrobacteria inclui, mas não limita- se a, cepas de Agrobacterium tumefaciens, (que por seu plasmídeo Ti natural, “armado” tipicamente causa crown gall em plantas infectadas) e Agrobacterium rhizogenes (que por seu plasmídeo Ri natural, “armado” causa a doença da raiz capilar em plantas hospedeiras infectadas), Agrobacterium rubi (que em sua forma natural, “armada” causa escoriação da cana em Rubus), Agrobacterium vitis e Agrobacterium radiobacter (agrupamento da Agrobacteria não patogênica).

[00124] As relações filogenéticas dos membros do gênero Agrobacterium por dois métodos que demonstram a relação das cepas de Agrobacterium K599 são representadas na Fig. 1A (com base em RAPD (DNA polimórfico amplificado aleatório); adquirido do Llob 2003; figura 2) e 1B (com base do sequenciamento de 16S rRNA). Tabela 1: cepas de Agrobacterium (do Llob 2003; Tabela 1)

ATCC: American Type Culture Collection, USA; CFRP: Collection Francaise des Bacteries Phytopatogènes, França; IVIA: Instituto Valenciano de lnvestigaciones Agrarias, Espanha; NCIB: National Collection of Industrial Bacteria, UK: NCPPB: National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, UK; ND: Não Determinado.

[00125] O termo Ti-plasmid como usado neste refere-se a um plasmídeo que é replicável em Agrobacterium e está em sua forma natural, “armada” mediando a escoriação da coroa em plantas infectadas por Agrobacterium. A infecção de uma célula vegetal com uma forma natural, “armada” de um plasmídeo Ti de Agrobacterium, no geral, resulta na produção de opinas (por exemplo, nopalina, agropina, octopina etc.) pelas células infetadas. Desta maneira, as cepas de Agrobacterium que causam a produção de nopalina (por exemplo, cepa LBA4301, C58, A208) são referidas como Agrobacteria “tipo nopalina”; cepas de Agrobacterium que causam a produção (por exemplo, cepa LBA4404, Ach5, B6) são referidos como Agrobacteria “tipo octopina” e as cepas de Agrobacterium que causam a produção de agropina (por exemplo, cpa EHA105, EHA101, A281) são referidos como Agrobacteria “tipo agropina”. Um plasmídeo Ti desarmado é entendido como um plasmídeo Ti que precisa de suas propriedades que medeia a escoriação de coroa mas, de outra maneira, fornece as funções para a infecção da planta. Preferivelmente, a região de T-DNA do dito plasmídeo “desarmado” foi modificado de uma maneira que além das seqüências de fronteira nenhuma seqüência Ti interna funcional pode ser transferida no genoma vegetal. Em uma forma de realização preferida - quando usado com um sistema de vetor binário - a região de T-DNA total (incluindo as fronteiras de T-DNA) é anulada.

[00126] O termo plasmídeo Ri como usado neste está referindo-se a um plasmídeo, que é replicável em Agrobacterium e está em sua forma natural “armada” para mediar a doença de raiz peluda em plantas infectadas por Agrobacterium. A infecção de uma célula vegetal com uma forma natural “armada” de um plasmídeo Ri de Agrobacterium No geral, resulta na produção de opinas (derivados de amino açúcar específicos produzidos em células vegetais transformadas, tais como, por exemplo, agropina, cucumopina, octopina, micimopina etc.) pela célula infectada. As cepas de Agrobacterium rhizogenes são, tradicionalmente distinguidas em subclasses da mesma maneira que as cepas de A. tumefaciens são. As cepas mais comuns são as cepas tipo agropina (por exemplo, caracterizado pelo plasmídeo Ri pRi-A4), cepas tipo manopina (por exemplo, caracterizado pelo plasmídeo Ri pRi8196) e cepas do tipo cucumopina (por exemplo, caracterizado pelo plasmídeo Ri pRi2659). Algumas outras cepas são do tipo miquimopina (por exemplo, caracterizado pelo plasmídeo Ri pRi1724). A miquimopina e a cucumopina são estereoisômeros mas nenhuma homologia foi observada entre os plasmídeos pRi no nível de nucleotídeo (Suzuki 2001). Um plasmídeo Ri desarmado é entendido como um plasmídeo Ri que carece de suas propriedades mediadoras da doença da raiz capilar mas, de outra maneira, fornece as funções para a infecção vegetal. Preferivelmente, a região de T- DNA do dito plasmídeo Ri “desarmado” foi modificado de uma maneira, que além das seqüências de fronteira nenhuma seqüência Ri interna funcional pode ser transferida no genoma vegetal. Em uma forma de realização preferida - quando usado com um sistema de vetor binário - a região de T- DNA total (incluindo as fronteiras de T-DNA) é anulada.

[00127] Embora os plasmídeos Ti e Ri variem consideravelmente entre as cepas, estes carregam genes vir similares.

[00128] O termo “seqüência intergênica de 16S-23S rRNA” como usado neste é pretendido significar a região de DNA genômico localizado entre as seqüências que codificam o 16S rRNA e o 23S rRNA. A dita seqüência intergênica pode se sobrepor com as seqüências que codificam o 16S rRNA e o 23S rRNA.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00129] Esta invenção usa cepas “desarmadas” variantes da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659) para a liberação de T-DNA em células vegetais. A seguir a classificação prévia da cepa K599 como uma cepa de “A. rhizogenes” não é utilizada, porque além dos fenótipos indutores de raiz peluda (que é um resultado do plasmídeo Ri mas não o genoma bacteriano) as cepas parecem estar apenas remotamente relacionadas com as outras cepas de A. rhizogenes com base em uma análise de comparação de seqüências de rDNA ribossômico. Desta maneira, a cepa é considerada ser um espécime único nem sendo de maneira não ambígua um tipo A. tumefaciens ou A. rhizogenes da cepa.

[00130] Uma primeira forma de realização da invenção diz respeito a um método para produzir uma célula vegetal transgênica que compreende as etapas de: a) fornecer bactéria de uma cepa não patogênica transgênica variante da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659) ou de um derivado da dita cepa, em que a dita cepa variante é capaz de infectar as células vegetais mas é desprovida do fenótipo de raiz peluda que induz propriedades e em que a dita cepa variante ainda que compreende um T-DNA transgênico e b) co-cultivar uma célula vegetal com as ditas bactérias e c) isolar ou selecionar as células vegetais que compreende estavelmente integrado em seu genoma o dito T-DNA transgênico.

[00131] Uma outra forma de realização da invenção diz respeito a um método para produzir uma planta trangênica que compreende as etapas de: a) fornecer bactéria de uma cepa não patogênica transgênica variante da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659) ou de um derivado da dita cepa, em que a dita cepa variante é capaz de infectar as células vegetais mas é desprovida do fenótipo de raiz peluda que induz propriedades e em que a dita cepa variante ainda que compreende um T-DNA transgênico e b) co-cultivar uma planta, célula vegetal ou tecido vegetal com as ditas bactérias e c) isolar ou selecionar e - opcionalmente - regenerar plantas que compreendem, estavelmente integrado em seu genoma, o dito T- DNA transgênico.

[00132] O método da invenção tem uma ou mais das seguintes vantagens sobre a técnica anterior: a) Esta é muito eficiente para a transformação de espécies vegetais recalcitrantes à transformação mediada pelas cepas de Agrobacterium tumefaciens conhecidas na técnica, especialmente sojas e árvores como álamo e castanheiras. Surpreendentemente, o derivado desarmado de Agrobacterium rhizogenes K599 (pRi2659Δ e pRi2659Δtet, respectivamente) fornecido neste demonstra uma taxa de infecção alta para a soja e fornece uma melhora sobre as cepas convencionais de Agrobacterium para a transformação vegetal. b) Por causa de suas propriedades infecciosas vigorosas este pode ser utilizado em uma concentração muito menor do que o Agrobacterium tumefaciens. Isto permite que os tecidos alvo que são muito sensíveis à co-ativação de Agrobacterium tumefaciens normal (tal como, por exemplo, zigotos ou embriões imaturos de plantas como o trigo). c) Adicionalmente a fronteira de T-DNA do plasmídeo de pRi2659 é usada para a criação de um novo vetor binário. Estes seqüências de fronteira oferecem uma vantagem sobre a seqüência de fronteira convencionalmente usada, especialmente em combinação com a cepa desarmada variante Agrobacterium rhizogenes K599 (pRi2659D). d) Finalmente, o método da invenção é compatível com outros sistemas de transformação vegetal com base em Agrobacterium.

[00133] Os métodos da invenção podem ser usados para transformar visualmente todos os tipos e planta. As plantas preferidas estão listadas acima na seção DEFINIÇÃO GERAL. São preferidas as células vegetais, tecido vegetal ou planta derivada de uma planta selecionada do grupo de plantas monocotiledôneas, plantas dicotiledôneas e plantas gimnospermas. Mais preferivelmente a planta é de um gênero selecionado do grupo que consiste de Medicago, Lycopersicon, Brassica, Cucumis, Solanum, Juglans, Gossypium, Malus, Vitis, Antirrhinum, Populus, Fragaria, Arabidopsis, Picea, Capsicum, Chenopodium, Dendranthema, Pharbitis, Pinus, Pisum, Oryza, Zea, Triticum, Triticale, Secale, Lolium, Hordeum, Glycine, Pseudotsuga, Kalanchoe, Beta, Helianthus e Nicotiana.

[00134] Em uma forma de realização preferida da invenção o T-DNA transgênico compreende pelo menos um cassete de expressão para conferir à dita planta um traço agricolamente valioso ou pelo menos um gene marcador, que permite a seleção e/ou identificação de plantas transformadas, células ou tecidos vegetais. os genes marcadores preferidos são descritos abaixo. 1. A cepa “desarmada” de Agrobacterium K599 (NCPPB2659)

[00135] Uma outra forma de realização da invenção está relacionada com uma cepa não patogênica variante da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659) ou de um derivado da dita cepa (a seguir cepa “desarmada” variante), em que a dita cepa variante é capaz de infectar as células vegetais mas é desprovida das propriedades que induzem o fenótipo de raiz peluda.

[00136] O termo “derivado” quando refere-se à cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB2659) é pretendido significar uma bactéria patogênica vegetal transportada no solo, caracterizada por uma seqüência intergênica de 16S-23S rRNA que compreende pelo menos um motivo de seqüência selecionado do grupo que consiste de: 1. 5’-AATCGTCGATGCGAATTGTTG-3’ (Motivo M1, SEQ ID N°: 5) 2. 5’-GTTTTGTCCTGACGCTGTCGCGA-3’ (Motivo M2, SEQ ID N°: 6) 3. 5’-TCTAACGATCGCTGCGCTCCGGA-3’ (Motivo M3, SEQ ID N°: 7) 4. 5’-CGCCACGAGGCGCGACGGA-3’ (Motivo M4, SEQ ID N°: 8) 5. 5’-TTATGGGCGAATTGATCTGA-3’ (Motivo M5, SEQ ID N°: 9) 6. 5’-GTCCTGCTAAGGATTGATGCCT-3’ (Motivo M6, SEQ ID N°: 10) 7. 5’-AGACCAGTCCTTGTGAAACC-3’ (Motivo M7, SEQ ID N°: 11) 8. 5’-CCTGGGCATTTTTGTTGTTGG-3’ (Motivo M8, SEQ ID N°: 12) 9. 5’-AATGGTATGGCTTCGAGGTG-3’ (Motivo M9, SEQ ID N°: 13) 10. 5’-CTCAAAGAAGACCGTACCGACA-3’ (Motivo M10, SEQ ID N°: 14)

[00137] Preferivelmente, o derivado da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB2659) é caracterizado por uma seqüência intergênica de 16S-23S rRNA que compreende pelo menos dois ou três motivos, preferivelmente pelo menos quatro ou cinco motivos, mais preferivelmente pelo menos seis ou sete motivos, mais preferivelmente pelo menos oito, nove ou dez motivos selecionados do grupo de motivos descritos pela SEQ ID N°: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 e 14.

[00138] Os motivos de seqüência característicos adicionais podem ser identificados a partir do alinhamento múltiplo de seqüências intergênicas conhecidas de regiões variáveis de 16S-23S rRNA (o mais similar ao Agrobacterium K599 são comparados na Fig. 14A-E). Preferivelmente, um derivado de Agrobacterium K599 é caracterizado por uma seqüência intergênica de 16S-23S rRNA que compreende uma seqüência com uma identidade de pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 98% com a seqüência como descrita por par de base SEQ ID N°: 20 ou o seu complemento. Especialmente preferidas são as cepas que ainda são caracterizadas por uma seqüência de 16S rRNA como descrito pela SEQ ID N°: 21.

[00139] A cepa não patogênica variante ainda pode compreender uma ou mais características selecionadas do grupo que consiste da presença de genes virA ou virG mutantes ou quiméricos ou presença de plasmídeos super- virulentos. A cepa não patogênica variante da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB2659) pode compreender um plasmídeo não patogênico variante do plasmídeo pRI2659 (como definido abaixo).

[00140] Uma outra forma de realização da invenção está relacionada com a cepa não patogênica transgênica variante da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659) ou de um derivado da dita cepa, em que a dita cepa variante é capaz de infectar as células vegetais mas é desprovida do fenótipo de raiz peluda que induz propriedades e em que a dita cepa variante ainda que compreende um T-DNA transgênico. Em uma forma de realização preferida da invenção o T-DNA transgênico compreende pelo menos um cassete de expressão para conferir à dita planta um traço agricolamente valioso ou pelo menos um gene marcador, que permite a seleção e/ou identificação de plantas transformadas, células ou tecidos vegetais. Os genes marcadores preferidos são descritos neste abaixo. Os T-DNAs preferidos são descritos neste abaixo.

[00141] Em uma forma de realização preferida da invenção, dita cepa não patogênica variante da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659) (ou de um derivado da dita cepa) é capaz de infectar as células vegetais, para mediar a transferência de T-DNA em células vegetais e mediar inserção de T-DNA no genoma vegetal, mas é desprovida das propriedades que induzem o fenótipo de raiz peluda. Mais preferivelmente, isto é atingido pela presença de um plasmídeo não patogênico variante do plasmídeo Ri pRi2659 (o plasmídeo Ri natural na cepa de Agrobacterium K599; NCPPB 2659) ou um derivado deste (como definido abaixo). O dito plasmídeo não patogênico variante preferivelmente fornece todas as funções requeridas para a infecção e transformação de célula vegetal mas é desprovida de seqüências que causam o fenótipo de raiz peluda. Os plasmídeos não patogênicos preferidos variantes do plasmídeo Ri pRi2659 são descritos neste abaixo.

[00142] Em uma outra forma de realização preferida da invenção, as cepas não patogênicas de Agrobacterium da invenção ainda são modificadas para aumentar a eficácia de transformação, tal como pela alteração da expressão do gene vir e/ou indução deste. Isto pode ser realizado, por exemplo, pela presença de genes virA ou virG mutantes ou quiméricos (por exemplo, como descrito para Agrobacterium tumefaciens em Hansen 1994; Chen and Winans 1991; Scheeren-Groot et al., 1994). Ainda são possíveis combinações com os plasmídeos super-virulentos (por exemplo, vetores com base em pTOK246; Ishida 1996) para a geração das denominadas cepas supervirulentas. As cepas super-virulentas variantes também podem ser geradas utilizando-se os vetores derivados de plasmídeo de super virulência pSB1 (Komari 1996).

2. O plasmídeo pRi2659 “desarmado”

[00143] A seqüência isolada da versão desarmada do plasmídeo pRI2659 é fornecida neste. Esta seqüência e uma informação de seqüência é útil em sua totalidade mas também em parte. O plasmíceo na expressão de proteínas numerosas (ver Tabela 4), dos quais diversos são novos sobre a técnica e mais provavelmente envolvida no desempenho de transformação superior do plasmídeo pRI2659. A seqüência e a informação de seqüência também permitem vários usos que incluem mas não limitam-se a a) entendimento aumentado do desempenho superior do plasmídeo, b) utilização das características isoladas (por exemplo, proteínas) do plasmídeo para intensificar o desempenho de outros métodos de transformação vegetal (por exemplo, com base em transformações fundamentadas em Agrobacterium tumefaciens padrão) e c) mudanças e otimização direcionadas do dito plasmídeo.

[00144] Desta maneira, uma forma de realização preferida da invenção diz respeito a uma seqüência de nucleotídeo isolada selecionada do grupo de seqüências descritas por a) seqüências que compreendem uma seqüência descrita por SEQ ID N°: 24 ou uma seqüência de pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos (preferivelmente pelo menos 250 ou 500 nucleotídeos consecutivos, mais preferivelmente pelo menos 1000 ou 2500 nucleotídeos consecutivos, ainda mais preferivelmente pelo menos 5000 ou 10000 nucleotídeos consecutivos, mais preferivelmente todos nucleotídeos consecutivos) da seqüência descrita por SEQ ID N°: 24 e b) seqüências tendo uma identidade de seqüência de pelo menos 90% (preferivelmente pelo menos 92% ou 95%, mais preferivelmente pelo menos 97% ou 98%, mais preferivelmente pelo menos 99%) a uma seqüência como descrita por SEQ ID N°: 24 ou uma seqüência de pelo menos 1000 nucleotídeos consecutivos (preferivelmente pelo menos 2000 ou 4000 nucleotídeos consecutivos, mais preferivelmente pelo menos 5000 ou 10000 nucleotídeos consecutivos, ainda mais preferivelmente pelo menos 20000 ou 50000 nucleotídeos consecutivos, mais preferivelmente todos nucleotídeos consecutivos) da seqüência descrita por SEQ ID N°: 24 e c) seqüências que hibridizam-se sob condições equivalentes à ligação ou hibridização a 68° C em uma solução que consiste de 5 x de SSPE, 1% de SDS, 5 x do reagente de Denhardt e 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado seguido pela lavagem em uma solução que compreende 0,1 x de SSPE e 0,1% de SDS a 68° C a uma sonda que consiste de pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos (preferivelmente pelo menos 250 ou 500 nucleotídeos consecutivos, mais preferivelmente pelo menos 1000 ou 2500 nucleotídeos consecutivos, ainda mais preferivelmente pelo menos 5000 ou 10000 nucleotídeos consecutivos, mais preferivelmente todos nucleotídeos consecutivos) de uma seqüência como descrito por SEQ ID N°: 24 ou a sua seqüência complementar.

[00145] Uma outra forma de realização da invenção está relacionada com um plasmídeo não patogênico (“desarmado”) variante de pRi2659 (o plasmídeo Ri natural na cepa de Agrobacterium K599; NCPPB 2659) ou um derivado deste, dito plasmídeo variante fornece as funções requeridas para infecção e transformação de célula vegetal, mas desprovido de seqüências que causam o fenótipo de raiz peluda (a seguir plasmídeo “desarmado” variante). Preferivelmente, o dito plasmídeo não patogênico variante é o que compreende as seqüências requeridas para infecção e transformação de célula vegetal do pRi2659 patogênico natural ou seu derivado mas é desprovido de seqüências do T-DNA mediando o fenótipo de raiz peluda.

[00146] Preferivelmente o plasmídeo não patogênico variante de pRi2659 ou de seu derivado é que não compreende elementos (tais como, por exemplo, elementos de T-DNA) que podem ser transferidos no genoma vegetal. É especialmente vantajoso quando combinado com um T-DNA transgênico compreendido de um vetor binário. Existem vários meios para fornecer um tal plasmídeo “desarmado” variante. Por meio de exemplo isto pode ser realizado por: 1. Formar as fronteiras do T-DNA disfuncional (por exemplo, por mutagênese) ou 2. Anular o T-DNA total do plasmídeo Ri ou 3. Avaliar quanto a anulação natural ou mutantes não patogênicos ou 4. Mutagênese de anulação (por exemplo, que utilizam acetosiringona) induzindo cortes e excisão de DNA do T-DNA ou 5. Mutagênese de Transposon e avaliação quanto a um mutante não- patogênico ou 6. Anulação direcionada e específica de genes relevantes usando-se por exemplo estratégia de substituição de gene. substituindo-se as cópias do tipo selvagem de genes entre o RB e LB com uma substituição anulada, um é capaz de excisar exatamente os genes que necessitam ser anulados.

[00147] Em uma forma de realização especialmente preferida da invenção, o dito plasmídeo não patogênico variante é que compreende pelo menos uma seqüência selecionada do grupo de seqüências descritas por a) seqüências que compreendem uma seqüência descrita por SEQ ID N°: 24 ou uma seqüência de pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos (preferivelmente pelo menos 250 ou 500 nucleotídeos consecutivos, mais preferivelmente pelo menos 1000 ou 2500 nucleotídeos consecutivos, ainda mais preferivelmente pelo menos 5000 ou 10000 nucleotídeos consecutivos, mais preferivelmente todos nucleotídeos consecutivos) da seqüência descrita por SEQ ID N°: 24 e b) seqüências tendo uma identidade de seqüência de pelo menos 90% (preferivelmente pelo menos 92% ou 95%, mais preferivelmente pelo menos 97% ou 98%, mais preferivelmente pelo menos 99%) a uma seqüência como descrita por SEQ ID N°: 24 ou uma seqüência de pelo menos 1000 nucleotídeos consecutivos (preferivelmente pelo menos 2000 ou 4000 nucleotídeos consecutivos, mais preferivelmente pelo menos 5000 ou 10000 nucleotídeos consecutivos, ainda mais preferivelmente pelo menos 20000 ou 50000 nucleotídeos consecutivos, mais preferivelmente todos nucleotídeos consecutivos) da seqüência descrita por SEQ ID N°: 24, e, c) seqüências que hibridizam-se sob condições equivalentes à ligação ou hibridização a 68° C em uma solução que consiste de 5 x SSPE, 1% de SDS, 5 x do reagente de Denhardt e 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado seguido pela lavagem em uma solução que compreende 0,1 x de SSPE e 0,1% de SDS a 68° C a uma sonda que consiste de pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos (preferivelmente pelo menos 250 ou 500 nucleotídeos consecutivos, mais preferivelmente pelo menos 1000 ou 2500 nucleotídeos consecutivos, ainda mais preferivelmente pelo menos 5000 ou 10000 nucleotídeos consecutivos, mais preferivelmente todos nucleotídeos consecutivos) de uma seqüência como descrita por SEQ ID N°: 24 ou a sua seqüência complementar.

[00148] Mais preferivelmente, o dito plasmídeo não patogênico variante é descrita por uma seqüência de nucleotídeo que descreve o plasmídeo pRi2659 desarmado ou um derivado acima (como definido acima). Ainda mais preferível ou alternativamente, o derivado está codificando uma proteína virD2 tendo uma identidade de seqüência de aminoácido de pelo menos 85% (preferivelmente pelo menos 90% ou 92%, mais preferivelmente pelo menos 95% ou 98%, mais preferivelmente pelo menos 99%) com a seqüência descrita por SEQ ID NO 112.

[00149] A dita proteína virD2 é esperada ser um fator chave para o desempenho intensificado na transformação do plasmídeo pRI2659 desarmado. Desta maneira, uma outra forma de realização da invenção diz respeito a um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido selecionado do grupo que consiste de: a) uma seqüência como descrita por SEQ ID N°: 112 ou seqüências de pelo menos 200 aminoácidos consecutivos (preferivelmente pelo menos 300 aminoácidos consecutivos, mais preferivelmente pelo menos 400 aminoácidos consecutivos, preferivelmente todos aminoácidos consecutivos) desta, b) seqüências tendo uma identidade de seqüência de pelo menos 85% (preferivelmente pelo menos 90% ou 92%, mais preferivelmente pelo menos 95% ou 98%, mais preferivelmente pelo menos 99%) com as seqüências descritas por SEQ ID N°: 112.

[00150] Entretanto, também as outras proteínas codificadas pelo plasmídeo pRI2659 desarmados são considerados serem úteis para a otimização dos processos de transformação, desta maneira, uma outra forma de realização da invenção diz respeito a um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de: a) uma seqüência como descrita por qualquer um da SEQ ID N°: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186 ou 187 ou seqüências de pelo menos 200 aminoácidos consecutivos (preferivelmente pelo menos 300 aminoácidos consecutivos, mais preferivelmente pelo menos 400 aminoácidos consecutivos, preferivelmente todos aminoácidos consecutivos) desta, b) seqüências tendo uma identidade de seqüência de pelo menos 85% (preferivelmente pelo menos 90% ou 92%, mais preferivelmente pelo menos 95% ou 98%, mais preferivelmente pelo menos 99%) com uma seqüência descrita por qualquer um da SEQ ID N°: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186 ou 187.

[00151] Ainda, uma outra forma de realização da invenção diz respeito a seqüências de ácido nucléico isoladas que codificam os ditos polipeptídeos. Estas seqüências podem ser as seqüências naturais isoladas (como compreendido no plasmídeo pRI2659) ou outras seqüências derivadas com base na degeneração do código genético.

[00152] Mais preferivelmente, estas seqüências derivadas da proteína virD2 fornecidas neste são as que compreende pelo menos um único resíduo de aminoácido da proteína virD2 como especificado na Fig. 16 (pelos asteriscos (*)).

[00153] Preferivelmente, o plasmídeo não patogênico variante é obtido pela anulação do T-DNA total incluindo as fronteiras do plasmídeo natural. Mais preferivelmente, para o plasmídeo não patogênico variante da invenção, o T-DNA anulado corresponde à seqüência descrita para a seqüência em torno da base 538 até em torno da base 15.519 da SEQ ID N°: 4 ou em torno da base 3644 até em torno da base 18577 da SEQ ID N°: 26.

[00154] Preferivelmente, o T-DNA total é anulado do plasmídeo Ri (mais preferivelmente incluindo a fronteira direita e esquerda total). A anulação do T-DNA total incluindo o RB e LB total do plasmídeo Ri (por exemplo, pRi2659) é preferido, visto que em casos passados de plasmídeos Ti desarmados quando uma porção da fronteira foi deixada intacta no plasmídeo Ti, houve a possibilidade de integração do DNA atrás de sua fronteira e do plasmídeo binário. O método utilizado na forma de realização preferida desta invenção elimina a possibilidade de integração de DNA estranho. Conseqüentemente, uma forma de realização preferida diz respeito a um plasmídeo não patogênico variante de pRi2659 ou um derivado deste, em que o dito plasmídeo variante é o que compreende as seqüências requeridas para infecção e transformação de célula vegetal do pRi2659 patogênico natural ou seu derivado mas é desprovida do T-DNA, preferivelmente a região descrita para a seqüência em torno da base 538 até em torno da base 15.519 da seqüência caracterizada por GenBank Acc.-N° AJ271050 (SEQ ID N°: 4) ou em torno da base 3644 até em torno da base 18577 da seqüência caracterizada por SEQ ID N°: 26. Esta seqüência corresponde ao T-DNA do plasmídeo Ri pRi2659 patogênico original como fornecidos na cepa de Agrobacterium K599 patogênica (NCPPB 2659). Mais preferivelmente, o dito plasmídeo não patogênico variante é uma seqüência que se hiridiza sob as condições de estringência alta (por exemplo, equivalentes à ligação ou hibridização a 68° C em uma solução que consiste de 5 x SSPE, 1% de SDS, 5 x do reagente de Denhardt e 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado seguido pela lavagem em uma solução que compreende 0,1 x de SSPE e 0,1% de SDS a 68° C) com o plasmídeo Ri pRi2659 original (natural), patogênico como fornecido na cepa de Agrobacterium K599 patogênica (NCPPB 2659), mas que não hibridiza-se sob as ditas condições de estringência alta com a seqüência em torno da base 538 até em torno da base 15.519 da seqüência caracterizada por GenBank Acc.-N° AJ271050 (SEQ ID N°: 4) ou em torno da base 3644 até em torno da base 18577 da seqüência caracterizada por SEQ ID N°: 26.

[00155] Mais preferivelmente, o derivado de pRi2659 é um plasmídeo capaz de mediar a transferência de T-DNA de uma bactéria transportada no solo em uma célula vegetal caracterizada por a) ter uma identidade de seqüência de pelo menos 90% (preferivelmente pelo menos 91% ou 92%, mais preferivelmente pelo menos 95% ou 98%, mais preferivelmente pelo menos 99%) com o DNA que codifica o plasmídeo pRi2659 natural (como compreendido na cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB2659) ou b) hibridização sob condições de alta estringência (por exemplo, equivalentes à ligação ou hibridização a 68° C em uma solução que consiste de 5 x SSPE, 1% de SDS, 5 x do reagente de Denhardt e 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado seguido pela lavagem em uma solução que compreende 0,1 x de SSPE e 0,1% de SDS a 68° C) com o plasmídeo pRi2659 natural (como descrita por SEQ ID N°: 111).

[00156] Em uma forma de realização preferida, o plasmídeo não patogênico variante da invenção hibridiza-se sob as condições de estringência alta com o plasmídeo patogênico, nativo, total Ri pRi2659 da cepa patogênica de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659), mas não hibridiza-se sob condições de estringência alta com a seqüência em torno da base 538 até em torno da base 15.519 da seqüência caracterizada por SEQ ID N°: 4 ou em torno da base 3644 até em torno da base 18577 da seqüência caracterizada por SEQ ID N°: 26.

[00157] O termo “derivado” quando refere-se ao pRi2659 é pretendido significar um plasmídeo capaz de mediar a transferência de T-DNA de uma bactéria transportada no solo em uma célula vegetal ainda caracterizada por a) ter uma identidade de seqüência de pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 98% com o DNA que codifica o plasmídeo pRi2659 natural (como compreendido na cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB2659 ) ou b) hibridização sob condições de alta estringência (como definido acima) com o plasmídeo pRi2659 natural.

[00158] Mais preferivelmente, tal derivado de pRi2659 em sua forma patogênica natural está mediando um fenótipo do tipo cucumopina da síntese de opina.

3. O T-DNA transgênico

[00159] Preferivelmente, o T-DNA na dita cepa não patogênica transgênica variante da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659) ou seu derivado é compreendido de um plasmídeo de vetor binário separado do plasmídeo que fornece as características requeridas para a infecção de planta (tal como um plasmídeo Ti ou Ri que necessita de suas propriedades de neoplásticas ou indutoras de raiz peluda). Desta maneira, uma outra forma de realização da invenção diz respeito a um T-DNA transgênico flanqueado por pelo menos uma fronteira de T-DNA do plasmídeo de Agrobacterium rhizogenes pRi2659, o dito T-DNA transgênico que não compreende nenhuma seqüência que causa um fenótipo de raiz peluda.

[00160] Preferivelmente, o T-DNA é flanqueado, pelo menos, pela seqüência da fronteira direita (mais preferivelmente pela seqüência da fronteira direita e a esquerda). São preferidas as fronteiras de Ti e/ou Ri. As fronteiras de T-DNA são repetições de cerca de 25 bp, bem definidas como descrito na técnica (Zupan 2000). Pela ação combinada dos denominados genes vir (parte dos plasmídeos Ti ou Ri originais) as fronteiras medeiam a transferência de T-DNA.

[00161] Em uma forma de realização preferida o dito T-DNA transgênico é o que compreende pelo menos um cassete de expressão para conferir à dita planta um traço agricolamente valioso. Em uma outra forma de realização preferida o dito T-DNA ainda é o que compreende pelo menos um gene marcador, que permite a seleção e/ou identificação de plantas transformadas, células ou tecidos vegetais.

[00162] As fronteiras de T-DNA de plasmídeo pRI2659 demonstrou ser especialmente eficiente na transferência de T-DNA e, desta maneira na geração de plantas transgênicas (especialmente plantas transgênicas de soja). Desta maneira, preferivelmente, o T-DNA compreende as fronteiras de T- DNA do plasmídeo pRi2659 (por exemplo, incorporado em um vetor binário). A fronteira direita tem 16 repetições de uma seqüência de 8 bp que é funcionalmente equivalente a uma multiplicação (Hansen 1992). Estas seqüências de fronteira oferecem uma vantagem sobre a seqüência de fronteira convencionalmente usada. Especialmente preferida é uma combinação da variante da cepa desarmada ou derivado da cepa de Agrobacterium K599 (BCPPB2659) com um T-DNA transgênico que compreende as fronteiras de um plasmídeo Ri, mais preferivelmente o plasmídeo pRi2659, cuja combinação contribui com uma eficiência de transformação alta por exemplo, para soja. São especialmente preferidas as seqüências de fronteira esquerda que compreendem uma seqüência descrita por SEQ ID N°: 18 representando a base de 538 a 561 da SEQ ID N°: 4 (região de T-DNA de pRi2659): 5’-tggcaggata tattgtggtg taaa-3’ (SEQ ID N°: 18)

[00163] Especialmente preferidas são as seqüências de fronteira direita que compreendem uma seqüência descrita por SEQ ID N°: 19 que representa a base 15.496 a 15.519 da SEQ ID N°: 4 (região de T-DNA de pRi2659): 5’-tgacaggata tatccccttg tcta-3’ (SEQ ID N°: 19)

[00164] 'Desta maneira, uma outra forma de realização da invenção diz respeito a um vetor de plasmídeo que compreende um T-DNA transgênico flanqueado por pelo menos uma fronteira de T-DNA do plasmídeo pRi2659 de Agrobacterium rhizogenes. Preferivelmente, estas fronteiras são descritas por SEQ ID N°: 18 ou 19. Mais preferivelmente, o plasmídeo é aquele que compreende a fronteira direita que compreende uma seqüência como descrita pela SEQ ID N°: 19. Mais preferivelmente, o plasmídeo é o que compreende ambas as seqüências de fronteira, que compreende uma seqüência como descrito pela SEQ ID N°: 18 e 19, respectivamente. Preferivelmente, o dito plasmídeo é aquele que não compreende nenhuma seqüência que causa um fenótipo de raiz peluda, mais preferivelmente o dito plasmídeo é o que não compreende nenhuma seqüência codificadora de proteína de T-DNA interno, mais preferivelmente o dito plasmídeo é o que substancialmente não compreende nenhuma seqüência de T-DNA interna. O termo “interno” neste contexto significa o DNA flanqueado por (mas excluindo as fronteiras de T- DNA). As fronteiras de T-DNA são entendidas como seqüências que pelo menos compreendem as seqüências como descritas pela SEQ ID N°: 18 e 19, respectivamente. O termo “substancialmente” é pretendido significar que algumas seqüências internas que não estão ligadas a um fenótipo patogênico podem estar incluídos, preferivelmente, estas seqüências não são maiores do que 200 pares de base, preferivelmente não maiores do que 100 pares de base, mais preferivelmente não maiores do que 50 pares de base e são preferivelmente diretamente consecutivas às seqüências de fronteira.

[00165] O T-DNA a ser incorporado no genoma vegetal por meio da cepa não patogênica variante pode ser fornecido de várias formas. O T-DNA pode ser fornecido como uma construção de DNA, preferivelmente, integrado nos plasmídeo específicos, em um vetor oscilante ou intermediário ou em um vetor binário. O fornecimento pode ocorrer, por exemplo, (mas não limitado) pelos seguintes meios: a) O T-DNA pode ser incorporado no DNA cromossômico da cepa não patogênica variante. b) O T-DNA pode ser incorporado no DNA de plasmídeo Ri desarmado na cepa não patogênica variante. c) O T-DNA pode estar compreendido na cepa não patogênica variante na forma de plasmídeo separado do plasmídeo Ri desarmado.

[00166] Preferivelmente, o T-DNA na dita cepa não patogênica variante é compreendida de um plasmídeo de vetor binário separado do plasmídeo Ri desarmado.

[00167] Em uma outra forma de realização preferida o dito T-DNA ainda compreende pelo menos um gene marcador, que permite a seleção e/ou identificação de plantas transformadas, células ou tecidos vegetais.

[00168] Outras formas de realização da dizem respeito a células ou organismos não humanos que compreendem uma seqüência de nucleotídeo, um plasmídeo não patogênico variante ou um T-DNA transgênico da invenção. Preferivelmente, as ditas células ou organismos não humanos são selecionados do grupo que consiste de bactérias, leveduras, plantas, mamíferos e insetos. Em uma forma de realização preferida, a dita célula ou organismo é uma bactéria transportada no solo do gênero Rhizobiaceae. Em uma outra forma de realização preferida dita célula ou organismo é célula vegetal ou organismo vegetal, mais preferivelmente selecionada do grupo de plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas. Mais preferidas são as plantas selecionadas do grupo que consiste de soja, milho, trigo, semente de colza (canola), tagetes, batata, arroz, cevada e tomate.

[00169] Uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a um vetor transgênico que compreende um T-DNA transgênico da invenção. Preferivelmente, o T-DNA é fornecido na forma de um vetor binário. Nos denominados “sistemas de vetor binário”, o T-DNA é fisicamente separado dos outros elementos funcionais do plasmídeo Ri (por exemplo, os genes vir), sendo incorporados em um vetor oscilante, que deixou o manuseio mais fácil (para a descrição do plasmídeo Ti com base em sistemas binários ver EP-A 120 516; US 4.940.838). Estes vetores binários compreendem (além do T- DNA desarmado com suas seqüências de fronteira), as seqüências procarióticas para a replicação tanto de um Agrobacterium quanto de um E. coli. No presente caso, a cepa de Agrobacterium rhizogenes desarmada utilizada para a transformação compreende, além de seu plasmídeo Ri desarmado, um plasmídeo binário com o T-DNA a ser transformado, que, preferivelmente, compreende um gene para a seleção das células de Agrobacterium transformadas (no geral, fora do T-DNA), um marcador para a seleção de células vegetais transformadas e a seqüência de ácido nucléico de interesse a ser transferida (os últimos dois, no geral, compreendidos dentro do T-DNA). O plasmídeo binário pode ser transferido na cepa de Agrobacterium rhizogenes desarmada, por exemplo, pela eletroporação ou outros métodos de transformação (Mozo 1991). Os vetores binários são capazes de replicação tanto em E. coli quanto em Agrobacterium. Estes podem ser transformados diretamente em Agrobacteria (por exemplo, como descrito Holsters 1978). O Agrobacterium, que atua como organismo hospedeiro neste caso, já deve conter um plasmídeo com a região vir. O último é requerido para a transferência ao T-DNA da célula vegetal. Um Agrobacterium desta maneira transformado pode ser usado para a transformação das células vegetais. Um marcador de seleção que permite a seleção de Agrobacteria transformada é, por exemplo, o gene nptI ou nptII que confere resistência contra canamicina, ou o gene aadA que confere resistência contra estreptomicina, espectinomucina. Vários marcadores (marcador de seleção e genes repórteres) são adequados para a identificação e/ou seleção ou células vegetais, tecidos e plantas transformados (ver abaixo quanto aos detalhes). A descrição de sistemas de vetor de Agrobacterium e métodos para a transformação mediada por Agrobacterium são conhecidos na técnica (Miki 1993; Gruber 1993; Moloney 1989). Vários vetores binários são conhecidos, alguns dos quais estão comercialmente disponíveis, tais como, por exemplo, pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA). Todos os vetores adequados para a transformação com base em Agrobacterium tumefaciens também podem ser utilizados para o método da invenção. Os vetores binários comuns estão fundamentados em plasmídeos de “faixa de hospedeiro ampla” como pRK252 (Bevan 1984) ou pTJS75 (Watson 1985) derivado do plasmídeo do tipo P RK2. Maioria destes vetores são derivados de pBIN19 (Bevan 1984). Vários vetores binários são conhecidos, alguns dos quais são comercialmente disponíveis, tais como, por exemplo, pBI101.2 ou pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA). Os vetores adicionais foram melhorados com respeito ao tamanho e manuseio (por exemplo, pPZP; Hajdukiewicz 1994). Os sistemas de vetores melhorados também são descritos no WO 02/00900. Um vetor binário ou qualquer outro vetor pode ser modificado pelas técnicas de recombinação de DNA, multiplicados em E. coli e introduzidos em Agrobacterium, por exemplo, pela eletroporação ou outras técnicas de transformação (Mozo 1991).

[00170] Desta maneira, uma outra forma de realização da invenção com relação à uma célula ou organismo não humano que compreende um plasmídeo não patogênico variante da invenção (como especificado acima) ou um T-DNA transgênico ou vetor que compreende o dito T-DNA da invenção. Preferivelmente, a dita célula ou organismo não humano é selecionado do grupo que consiste de bactérias, leveduras, plantas, mamíferos e insetos. Mais preferivelmente, a dita célula ou organismo não humano é uma bactéria transportada no solo do gênero Rhizobiaceae. Especialmente preferidas são bactérias transportadas no solo, tais como Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium medicae, Sinorhizobium fredii, Rhizobium sp. NGR234, Rhizobium sp. BR816, Rhizobium sp. N33, Rhizobium sp. GRH2, Sinorhizobium saheli, Sinorhizobium terangae, Rhizobium leguminosarum biovar trifolii, Rhizobium leguminosarum biovar viciae, Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli, Rhizobium tropici, Rhizobium etli, Rhizobium galegae, Rhizobium gallicum, Rhizobium giardinii, Rhizobium hainanense, Rhizobium mongolense, Rhizobium lupini, Mesorhizobium loti, Mesorhizobium huakuii, Mesorhizobium ciceri, Mesorhizobium mediterraneium, Mesorhizobium tianshanense, Bradyrhizobium elkanni, Bradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium liaoningense, Azorhizobium caulinodans, Allobacterium undicola, Phyllobacterium myrsinacearum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium vitis e Agrobacterium rubi.

[00171] Em uma forma de realização preferida da invenção o T-DNA a ser integrado no genoma vegetal por meio da cepa de Agrobacterium rhizogenes da invenção, que compreende pelo menos um cassete de expressão para conferir à dita planta um traço agricolamente valioso. Em uma outra forma de realização o dito T-DNA preferido ainda compreende pelo menos um gene marcador, que permite a seleção e/ou identificação de plantas transformadas, células ou tecidos vegetais. Desta maneira, o T-DNA inserido no genoma da planta alvo compreende pelo menos um cassete de expressão, que pode - por exemplo - facilitar a expressão do gene marcador de seleção, genes traço, RNA anti-sentido ou RNA de filamento duplo. Preferivelmente, os ditos cassetes de expressão compreendem uma seqüência de promotor funcional em células vegetais operativamente ligadas a uma seqüência de ácido nucléico que - na expressão - confere um fenótipo vantajoso à planta transformada desta maneira. A pessoa habilitada na técnica está ciente de numerosas seqüências que podem ser utilizadas neste contexto, por exemplo, para aumentar a qualidade de alimento e nutrição, para a produção de produtos químicos, produtos químicos finos ou produtos farmacêuticos (por exemplo, vitaminas, óleos, carboidratos; Dunwell 2000), que conferem resistência a herbicidas ou que confere esterilidade masculina. Além disso, desenvolvimento, rendimento e resistência contra os fatores de tensão abióticos e bióticos (como, por exemplo, fungos, vírus ou insetos) podem ser intensificados. As propriedades vantajosas podem ser conferidas pela super- expressão de proteínas ou diminuindo a expressão de proteínas endógenas, por exemplo, pela expressão de um RNA anti-sentido (Sheehy 1988; US 4.801.340; Mol 1990) ou de filamento duplo (Matzke 2000; Fire 1998; Waterhouse 1998; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364) correspondentes.

[00172] Para a expressão em plantas, os promotores específicos de planta são preferidos. O termo “promotor específico de planta” é entendido como significando, em princípio, qualquer promotor que seja capaz de administrar a expressão de genes, em particular, genes externos, em plantas ou partes de plantas, células vegetais, tecidos vegetais ou culturas vegetais. Neste contexto, a expressão pode ser, por exemplo, constitutiva, indutível ou dependente do desenvolvimento (como definido ou especificado acima).

[00173] O componente genético e/ou o cassete de expressão podem compreender outras seqüências de controle genético além disso um promotor. O termo “seqüências de controle genético” deve ser entendido no sentido mais amplo e refere-se a todas aquelas seqüências que afetam a fabricação ou função da construção de DNA para a invenção ou um cassete de expressão compreendido dessa maneira. Por exemplo, as seqüências de controle genético modificam a transcrição e tradução em organismos procarióticos ou eucarióticos. Preferivelmente, os cassetes de expressão de acordo com a invenção abrangem um promotor funcional nas plantas 5’ a montante da seqüência de ácido nucléico em questão a ser expressada recombinantemente, e 3’ a jusante uma seqüência terminadora como seqüência de controle genético adicional e, se apropriado, outros elementos reguladores habituais, em cada caso ligado operavelmente à seqüência de ácido nucléico a ser expressada recombinantemente.

[00174] As seqüências de controle genético são descritas, por exemplo, em “Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)” ou “Gruber e Crosby, em: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Flórida, eds.: Glick e Thompson, Capítulo 7, 89-108” e as referências aí citadas.

[00175] Os exemplos de tais seqüências de controle são seqüências às quais indutores ou repressores se ligam e assim regulam a expressão do ácido nucléico. As seqüências de controle genético além disso também abrangem a região 5’ não traduzida, introns ou a região 3’ não codificadora de genes, tais como, por exemplo, o intron a actina-1, ou os introns Adh1-S 1, 2 e 6 (referência geral: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling e Walbot, Eds., Springer, Nova Iorque (1994)). Foi demonstrado que estes desempenham um papel significante na regulagem da expressão de gene. Assim, foi demonstrado que as seqüências não traduzidas 5’ são capazes de realçar a expressão transitória de genes heterólogos. Os exemplos de realçadores de tradução que podem ser mencionados são a seqüência líder 5’ do vírus mosaico do tabaco (Gallie 1987) e outros. Além disso, estes podem promover a especificidade de tecido (Rouster 1998). Além disso, estes podem promover a especificidade de tecido (Rouster 1998). Ao contrário, a região não traduzida 5’ do gene opaque-2 suprime a expressão. A deleção da região em questão leva a uma atividade de gene aumentada (Lohmer 1993). As seqüências de controle genético também podem abranger as seqüências de ligação de ribossoma para iniciar a tradução. É preferido em particular quando a seqüência de ácido nucléico a ser expressada não forneça seqüências adequadas ou quando elas não sejam compatíveis com o sistema de expressão.

[00176] O cassete de expressão pode compreender vantajosamente uma ou mais seqüências realçadoras, ligadas operavelmente ao promotor, que torna possível uma expressão recombinante aumentada da seqüência de ácido nucléico. As seqüências vantajosas adicionais, tais como outros elementos regulatórios ou terminadores, também podem ser inseridos na extremidade 3’ das seqüências de ácido nucléico a serem expressadas recombinantemente. Os sinais de poliadenilação que são adequados como seqüências de controle são sinais de poliadenilação vegetal, preferivelmente aquelas que essencialmente correspondem aos sinais de poliadenilação de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, em particular o terminador da octopina sintase (OCS) e o terminador da nopalina sintase (NOS).

[00177] Uma ou mais cópias das seqüências de ácido nucléico a serem recombinantemente expressadas podem estar presentes na construção de gene. As seqüências de controle genético são além disso entendidas como significando seqüências que codificam as proteínas de fusão consistindo de uma seqüência de peptídeo de sinal.

[00178] As seqüências de controle além disso devem ser entendidas como aquelas que permitem a remoção das seqüências inseridas a partir do genoma. Os métodos com base no cre/lox (Sauer B 1998; Odell 1990; Dale 1991), FLP/FRT (Lysnik 1993), ou sistema Ac/Ds (Wader 1987; US 5.225.341; Baker 1987; Lawson 1994) permite uma remoção - se apropriado específico e/ou indutível de tecido - de uma seqüência de DNA específica do genoma do organismo hospedeiro. As seqüências de controle podem neste contexto significar as seqüências flanqueadoras específicas (por exemplo, as seqüências lox), que mais tarde permitem a remoção (por exemplo, por meio da cre recombinase).

[00179] O componente genético e/ou o cassete de expressão da invenção pode compreender outros elementos funcionais. O termo elemento funcional deve ser entendido no sentido mais amplo e refere-se a todos aqueles elementos que têm um efeito sobre a geração, amplificação ou função do componente genético, cassetes de expressão ou organismos recombinantes de acordo com a invenção. Os elementos funcionais podem incluir por exemplo (mas não deve ser limitado a):

1. Genes Marcadores Selecionáveis

[00180] os genes marcadores selecionáveis são úteis para selecionar e separar com êxito células transformadas ou recombinadas homólogas. Preferivelmente, dentro do método da invenção um marcador pode ser utilizado para a seleção em um hospedeiro procariótico, enquanto um outro marcador pode ser utilizado para a seleção em um hospedeiro eucariótico, particularmente a espécie vegetal hospedeira. Os marcadores podem ser proteção contra um biocida, tal como antibióticos, toxinas, metais pesados, ou semelhante, ou pode funcionar pela complementação, comunicando prototrofia a um hospedeiro auxotrófico. Os genes marcadores selecionáveis preferidos para plantas podem incluir mas não são limitados aos seguintes: 1.1 Marcadores de seleção negativos

[00181] Os marcadores de seleção negativa conferem uma resistência a um composto biocida tal como um inibidor metabólico (por exemplo, 2- desoxiglicose-6-fosfato, WO 98/45456), antibióticos (por exemplo, canamicina, G418, bleomicina ou higromicina) ou herbicidas (por exemplo, fosfinotricina ou glifosato). Os marcadores de seleção negativa especialmente preferidos são aqueles que conferem resistência aos herbicidas. Os exemplos que podem ser mencionados são: - Fosfinotricina acetiltransferases (PAT; também denominados resistência a Bialophos; bar; De Block 1987; EP 0 333 033; US 4.975.374) - 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS; US 5.633.435) ou o gene da glifosato oxidorreductase (US 5.463.175) que confere resistência ao Glifosato (N-fosfonometil glicina) (Shah 1986) - Enzimas que degradam glifosato (Glifosato oxidorreductase; gox), - desalogenases que inativam Dalapon (deh) - acetolactase que desativa sulfoniluréia e imidazolinona (por exemplo variantes ALS mutadas, por exemplo, com a mutação S4 e/ou Hra - nitrilases que degradam bromoxinil (bxn) - Genes de resistência à canamicina ou G418 (NPTII; NPTI) que codificam por exemplo, as neomicina fosfotransferases (Fraley 1983), que expressa uma enzima que confere resistência ao antibiótico canamicina e os antibióticos relacionados neomicina, paromomicina, gentamicina, e G418, - 2-Desoxiglicose-6-fosfato fosfatase (Produto de gene DOGR1; WO 98/45456; EP 0 807 836) que confere resistência contra a 2- desoxiglicose (Randez-Gil 1995) - Higromicina fosfotransferase (HPT), que medeia a resistência à higromicina (Vanden Elzen 1985). - Diidrofoliato reductase (Eichholtz 1987) os genes marcadores selecionáveis negativos adicionais de origem bacteriana que conferem resistência aos antibióticos incluem o gene aadA, que confere resistência aos antibióticos espectinomicina, gentamicina acetil transferase, estreptomicina fosfotransferase (SPT), aminoglicosídeo-3- adenil transferase e o determinante de resistência bleomicina (Hayford 1988; Jones 1987; Svab 1990; Hille 1986).

[00182] São especialmente preferidos os marcadores de seleção negativos que conferem resistência contra os efeitos tóxicos impostos pelos D- aminoácidos como por exemplo, D-alanina e D-serina (WO 03/060133). Especialmente preferidos como marcadores de seleção negativo neste contexto são o gene daol (EC: 1.4. 3.3: GenBank Acc.-N°: U60066) da levedura Rhodotorula gracilis (Rhodosporidium toruloides) e do gene da E. coli dsdA (D-serina desidratase (D-serine desaminase) [EC: 4.3.1.18; GenBank Acc. N°: J01603). 1.2) Marcadores de seleção positivos

[00183] Os marcadores de seleção positivos são que conferem uma vantagem de crescimento a uma planta transformada em comparação com a não transformada. Genes como a isopentenil transferase de Agrobacterium tumefaciens (cepa: PO22; Genbank Acc. N°: AB025109) podem - como uma enzima chave da biossíntese da citocinina- facilitar a regeneração de plantas transformadas (por exemplo, pela seleção em meio isento de citoquinina). Os métodos de seleção correspondentes são descritos (Ebinuma 2000a,b). Os marcadores de seleção positivos adicionais, que conferem uma vantagem de crescimento a uma planta transformada em comparação com uma não transformada, são descritos por exemplo, na EP-A 0 601 092. Os marcadores de seleção de estimulação do crescimento podem incluir (mas não devem ser limitados a) β-Glicuronidase (em combinação por exemplo, com citoquinina glicuronida), manose-6-fosfato isomerase (em combinação com manose), UDP-galactose-4-epimerase (em combinação com por exemplo, galactose), em que a manose-6-fosfato isomerase em combinação com manose é especialmente preferida. 1.3) Marcadores de contra seleção

[00184] Os marcadores de contra seleção são especialmente adequados para selecionar organismos com seqüências deletadas definidas que compreendem o dito marcador (Koprek 1999). Os exemplos quanto a marcador de seleção negativo compreende as timidina cinases (TK), citosina desaminases (Gleave 1999; Perera 1993; Stougaard 1993), proteína de citocromo P450 (Koprek 1999), haloalcano desalogenases (Naested 1999), produtos de gene iaaH (Sundaresan 1995), citosina desaminase codA (Schlaman & Hooykaas 1997), ou produtos de gene tms2 (Fedoroff & Smith 1993). 2) Genes repórter

[00185] Os genes repórter codificam proteínas facilmente quantificáveis e, por intermédio da sua cor ou atividade enzimática, torna possível uma avaliação da eficácia de transformação, o sítio de expressão ou o tempo de expressão. Muito especialmente preferido neste contexto são genes que codificam proteínas repórter (Schenborn 1999) tais como a proteína fluorescente verde (GFP) (Sheen 1995; Haseloff 1997; Reichel 1996; Tian 1997; WO 97/41228; Chui 1996; Leffel 1997), cloranfenicol transferase, uma luciferase (Ow 1986; Millar 1992), o gene da aequorina (Prasher 1985), β- galactosidase, gene do local R (que codifica uma proteína que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecido vegetal e assim torna possível a análise direta da atividade promotora sem a adição de outras substâncias auxiliares ou substratos cromogênicos (Dellaporta 1988; Ludwig 1990), com β-glicuronidase (GUS) sendo muito especialmente preferida (Jefferson 1987a,b). A expressão da β-glicuronidase (GUS) é detectada por uma cor azul na incubação do tecido com o ácido 5-bromo-4- cloro-3-indolil-β-D-glicur0nico, a expressão de luciferase bacteriana (LUX) é detectada pela emissão de luz; a expressão da luciferase de vagalume (LUC) é detectada pela emissão de luz depois da incubação com luciferina; e a expressão da galactosidase é detectada pela cor azul brilhante depois que o tecido foi manchado com 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosida. Os genes repórter também podem ser usados como marcadores contáveis como alternativas aos marcadores de resistência a antibióticos. Tais marcadores são usados para detectar a presença ou para medir o nível de expressão do gene transferido. O uso de marcadores contáveis em plantas para identificar ou rotular células geneticamente modificadas funcionam bem apenas quando a eficiência da modificação da célula é alto. 3) Origens de replicação, que garantem a amplificação dos cassetes de expressão ou vetores de acordo com a invenção, por exemplo, em E. coli. Os exemplos que podem ser mencionados são ORI (origem da replicação de DNA), a pBR322 ori ou a P15A ori (Maniatis 1989). Os exemplos adicionais para os sistemas de replicação funcionais na E. coli, são ColE1, pSC101, pACYC184, ou semelhante. Além disso ou no lugar do sistema de replicação da E. coli, um sistema de replicação de faixa de hospedeiro amplo pode ser utilizado, tal como os sistemas de replicação dos plasmídeos de incompatibilidade P-1; por exemplo, pRK290. Estes plasmídeos são particularmente eficazes com plasmídeos Ti armados e desarmados para a transferência de T-DNA para o hospedeiro vegetal. 4) Elementos que são necessários para a transformação mediada por Agrobacterium, tal como, por exemplo, a borda direita e/ou - opcionalmente - a esquerda do T-DNA ou a região vir. 5) Sítios de clonagem múltiplos (MCS) para possibilitar e facilitar a inserção de uma ou mais seqüências de ácido nucléico.

[00186] Tipicamente, construções que compreendam um T-DNA (ou qualquer outra construção de DNA utilizada dentro do escopo da presente invenção) são preparadas usando técnicas de expressão de transgene. As técnicas de expressão recombinantes envolvem a construção de ácidos nucléicos recombinantes e a expressão de genes em células transfectadas. As técnicas de clonagem molecular para se obter estas extremidades são conhecidas na técnica. Uma ampla variedade de métodos de clonagem e amplificação in vitro adequados para a construção de ácidos nucléicos recombinantes são bem conhecidos pelas pessoas de habilidade. Os exemplos destas técnicas e instruções suficiente para direcionar pessoas de habilidade através de muitos exercícios de clonagem são encontrados em Berger e Kimmel (1987), Maniatis 1989, Silhavy 1984, Ausubel 1998). Preferivelmente, a construção de DNA de acordo com a invenção é gerada pela junção dos constituintes essenciais supracitados da construção de DNA juntos na seqüência supracitada usando as técnicas de recombinação e clonagem com as quais o trabalhador habilitado está familiarizado.

[00187] A construção de construções de polinucleotídeo no geral requer o uso de vetores capazes de replicar em bactérias. Uma superabundância de kits são comercialmente disponíveis para a purificação de plasmídeos a partir de bactérias. Para o seu uso apropriado, seguir as instruções do fabricante (ver, por exemplo, EasyPrep®, FlexiPrep®, tanto da Pharmacia Biotech; StrataClean®, da Stratagene; e, QIAexpress® Expression System, Qiagen). Os plasmídeos isolados e purificados podem ser depois manipulados ainda para produzir outros plasmídeos, usados para transfectar células ou incorporados em Agrobacterium tumefaciens para infectar e transformar plantas. Onde Agrobacterium é o meio de transformação, vetores transportadores são construídos. 4. O procedimento de transformação

[00188] Os métodos da invenção são úteis para a obtenção de plantas transgênicas, ou células, partes, tecidos, material colhível derivados destas.

[00189] Conseqüentemente, uma outra questão objetiva da invenção diz respeito às plantas transgênicas ou células vegetais que compreendam no seu genoma, preferivelmente no seu DNA nuclear, cromossômico, a construção de DNA de acordo com a invenção (por exemplo, o T-DNA que compreende as bordas do plasmídeo Ri pRi2659), e às células, culturas de célula, tecidos, partes ou material de propagação - tais como, por exemplo, no caso de organismos vegetais folhas, raízes, sementes, frutas, pólen e outros - derivados de tais plantas. Outros aspectos importantes da invenção incluem a progênie das plantas transgênicas preparadas pelos métodos divulgados, assim como às células derivadas de tal progênie, e as sementes obtidas de tal progênie.

[00190] Variedades de planta podem ser excluídas, particularmente variedades de planta registráveis de acordo com o Plant Breeders Rights. É mencionado que uma planta não necessita ser considerada uma “variedade de planta” simplesmente porque ela contém estavelmente dentro do seu genoma um transgene, introduzido em uma célula da planta ou um precursor desta. Além de uma planta, a presente invenção fornece qualquer clone de uma tal planta, semente, progênie autopolinizada ou híbrida e descendentes, e qualquer parte ou propágulo de qualquer um destes, tais como cortes ou semente, que podem ser usados na reprodução ou propagação, sexual ou assexual. Também abrangido pela invenção é uma planta que é uma progênie sexual ou assexualmente propagada, clone ou descendente de uma tal planta, ou qualquer parte ou propágulo da dita planta, progênie, clone ou descendente. As plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção que podem ser consumidas pelos seres humanos ou animais também podem ser usadas como alimento ou gêneros alimentícios, por exemplo direta ou a seguir de processamento conhecido na técnica.

[00191] O método da invenção pode ser virtualmente utilizado em todas as variedades de plantas, incluindo variedades de plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas (como definido e especificado acima). Surpreendentemente, a cepa de Agrobacterium rhizogenes desarmada da invenção resultou em alta eficiência de transformação para as plantas monocotiledôneas como por exemplo, milho (Zea mays). Existem vários métodos para a transformação de planta monocotiledônea. O bombardeamento de partícula é freqüentemente favorecido, por causa da sua eficiência e nenhuma limitação de faixa de hospedeiro (Christou 1995; Jahne 1995). Entretanto, a estrutura irregular e o número de eventos de transformação (por exemplo, cópias múltiplas ou fragmentadas) requer triagem e análise detalhada de um alto número dos transgênicos resultantes (Hadi 1996; Trick 1997). Por outro lado, o estabelecimento de um sistema para a transformação de plantas monocotiledôneas mediada pela Agrobacterium foi considerado difícil, visto que a infecção de plantas monocotiledôneas pela Agrobacterium é um evento muito raro e eficiência razoável pôde ser apenas obtida usando cepas de A. tumefaciens ‘super-virulentas’ e/ou acetossiringona, um composto fenólico que induz a expressão de genes vir no plasmídeo Ti (Belarmino 2000; Eady 2000; Hiei 1994; Smith e Hood 1995; Wilmink 1992). Entretanto, não existe nenhum relato anterior à presente invenção de transformação de monocotilédones mediada por uma cepa de A. rhizogenes desarmada.

[00192] Também numerosas culturas de explantes, tecidos vegetais, ou células vegetais podem ser utilizadas como o material alvo para o processo de co-cultivo. Uma pessoa de habilidade reconhecerá que depois que a construção de DNA é estavelmente incorporada em plantas transgênicas e confirmada ser operável, a mesma pode ser introduzida em outras plantas pelo cruzamento sexual. Qualquer uma de várias técnicas de procriação padrão pode ser usada, dependendo das espécies a serem cruzadas.

[00193] Para transferir o DNA à célula vegetal, explantes vegetais são co- cultivados com a Agrobacterium rhizogenes desarmada da invenção que compreende o T-DNA transgênico. Partindo de material vegetal infectado (por exemplo seções de folha, raiz ou talo, mas também protoplastos ou suspensões de células vegetais), plantas intactas podem ser regeneradas usando um meio adequado que pode conter, por exemplo, antibióticos ou biocidas para selecionar as células transformadas. As plantas obtidas podem ser depois triadas na presença do DNA introduzido, neste caso a construção de DNA de acordo com a invenção. Tão logo o DNA tenha se integrado no genoma hospedeiro, o genótipo em questão é, como uma regra, estável e a inserção em questão também é encontrada nas gerações subsequentes. Preferivelmente a planta estavelmente transformada é selecionada utilizando um marcador de seleção compreendido no T-DNA transgênico. As plantas obtidas podem ser cultivadas e hibridizadas na maneira habitual. Duas ou mais gerações devem ser cultivadas de modo a garantir que a integração genômica seja estável e hereditária.

[00194] Vários tecidos são adequados como material de partida (explante) para o processo de transformação mediado por Agrobacterium incluindo mas não limitado a calo (US 5.591.616; EP-A1 604 662), embriões imaturos (EP-A1 672 752), pólen (US 54.929.300), ápice de broto (US 5.164.310), ou transformação in planta (US 5.994.624). O método e material aqui descritos podem ser combinados virtualmente com todos os métodos de transformação mediados por Agrobacterium conhecidos na técnica. As combinações preferidas incluem - mas não são limitadas - aos seguintes materiais de partida e métodos:

[00195] A eficiência de transformação com Agrobacterium pode ser realçada por numerosos outros métodos conhecidos na técnica como por exemplo ferimento, infiltração de vácuo (WO 00/58484), choque por calor e/ou centrifugação, adição de nitrato de prata, sonificação etc. Em uma forma de realização preferida da invenção, o material de explante é ferido antes da inoculação (co-cultivo) com Agrobacterium. Muitos métodos de ferir podem ser usados, incluindo, por exemplo, cortar, raspar, perfurar, picagem, penetração com partículas finas ou fluidos pressurizados, ferimento com plasma, aplicação de pressão hiperbárica, ou sonificação. O ferimento pode ser realizado usando objetos tais como, mas não limitado a, bisturis, tesouras, agulhas, objetos abrasivos, aerógrafo, partículas, pistolas de gene elétricas, ou ondas sonoras. Uma outra alternativa é a infiltração a vácuo (EP-A1 1.141.356; EP-A1 1.171.618). Outros métodos para aumentar a eficiência de transformação de Agrobacterium conhecidos na técnica podem ser combinados, incluindo mas não limitados à sonificação (EP-A1 904.362) ou redução de peso do tecido alvo (EP-A1 1.137.790).

[00196] As bactérias de Agrobacteria rhizogenes desarmadas da invenção são cultivadas e usadas de uma maneira como conhecida na técnica. O vetor que compreende a cepa de Agrobacterium, por exemplo, pode ser cultivada por 3 dias em meio YEB (ver o Exemplo 2.6) suplementado com os antibióticos apropriados (por exemplo, 50 mg/L de espectinomicina). As bactérias são coletadas com uma alça do meio sólido e recolocadas em suspensão. Em uma forma de realização preferida da invenção, as culturas de Agrobacterium são iniciadas pelo uso de alíquotas congeladas a -80° C. Para o tratamento com Agrobacterium de pecíolos isolados, as bactérias são recolocadas em suspensão no meio usado para a cultura de pecíolo.

[00197] A concentração de Agrobacterium usada para a infecção e co- cultivo pode necessitar ser variada. Assim, uma faixa de concentração de Agrobacterium de 105 a 1010 cfu/ml e uma faixa de períodos de co-cultivo de umas poucas horas a 7 dias pode ser usada. O co-cultivo de Agrobacterium com os pecíolos isolados é no geral realizado por 1 a 5, preferivelmente 2 a 4 dias.

[00198] Os explantes são depois inoculados com a cultura de Agrobacterium por uns poucos minutos a umas poucas horas, tipicamente de cerca de 10 minutos a 3 horas, preferivelmente de cerca de 0,5 horas a 1 hora. O meio em excesso é drenado e a Agrobacterium é permitida co-cultivar com o tecido alvo por vários dias, tipicamente três dias no escuro. Durante esta etapa, a Agrobacterium transfere a construção genética estranha em algumas células do tecido alvo. Normalmente nenhum agente de seleção está presente durante esta etapa.

[00199] É possível, embora não necessário, utilizar um ou mais compostos fenólicos no meio antes ou durante o co-cultivo de Agrobacterium. “Composto fenólicos vegetais” ou “fenólicos vegetais” adequados dentro do escopo da invenção são aquelas moléculas fenólicas substituídas isoladas que são capazes de induzir uma resposta quimiotática positiva, particularmente aquelas que são capazes de induzir a expressão do gene vir aumentada em um plasmídeo Ri contendo Agrobacterium sp. Preferido é acetossiringona. Além disso, certos compostos, tais como osmoprotetores (por exemplo, L-prolina preferivelmente em uma concentração de cerca de 700 mg/L ou betaína), fitoormônios (inter alia NAA), opinas, ou açúcares, são esperados atuar sinergisticamente quando adicionados em combinação com compostos fenólicos vegetais. O composto fenólico vegetal, particularmente acetossiringona, pode ser adicionado ao meio antes de contatar os pecíolos isolados com Agrobactérias (por exemplo, por várias horas a um dia). As concentrações possíveis de compostos fenólicos vegetais no meio varia de cerca de 25 μM a 700 μM. Entretanto, para os métodos da invenção preferivelmente nenhuma acetossiringona é utilizada. Condições de indução particularmente adaptadas para a Agrobacterium tumefaciens foram descritas por Vernade et al. (1988).

[00200] A suplementação do meio de co-cultivo com antioxidantes (por exemplo, ditiotreitol), ou compostos de tiol (por exemplo, L-cisteína, Olhoft 2001) que podem diminuir a necrose de tecido devido às respostas de defesa da planta (como a oxidação fenólica) podem melhorar ainda mais a eficiência da transformação mediada pela Agrobacterium.

[00201] Depois as etapas de co-cultivo podem ser incluídas para remover, suprimir o crescimento ou matar a Agrobacterium rhizogenes. Estas etapas podem incluir uma ou mais etapas de lavagem. O meio utilizado depois da etapa de co-cultivo preferivelmente contém um bacteriocida (antibióticos). Esta etapa é intencionada a terminar ou pelo menos retardar o crescimento das células não transformadas e matar as células de Agrobacterium remanescentes. Os antibióticos preferidos a serem utilizados são por exemplo, carbenicilina (500 mg/L) ou Timentin® (GlaxoSmithKline; uma mistura de ticarcilin dissódico e clavulanato potássico; 0,8 g de Timentin® contém 50 mg de ácido clavulânico com 750 mg de ticarcilina. Quimicamente, a ticarcilina dissódica é o sal dissódico do ácido N-(2-Carbóxi-3,3-dimetil-7-oxo-4-tia-1- azabiciclo[3,2,0]hept-6-il)-3-tio-fenemalonâmico. Quimicamente, o clavulanato potássico é (Z)-(2R, 5R)-3-(2-hidroxietilideno)-7-oxo-4-oxa-1- azabiciclo[3,2,0]heptano-2-carboxilato de potássio).

[00202] Depois da etapa de co-cultivo os explantes co-cultivados são preferivelmente incubados em um meio de regeneração que compreende pelo menos um fator de crescimento vegetal. Os meios utilizados podem conter ainda pelo menos um composto, que em combinação com o gene marcador selecionável permite a identificação e/ou seleção de células vegetais (por exemplo, um agente seletivo) podem ser aplicados. Entretanto, é preferido que os explantes sejam incubados por um certo tempo, preferivelmente de 5 a 14 dias, depois da etapa de co-cultivo no meio que carece de um composto de seleção. O estabelecimento de um nível de resistência confiável contra o dito composto de seleção necessita de algum tempo para prevenir o dano não intencionado pelo composto de seleção mesmo para as células e tecidos transformadores.

[00203] As células transformadas, i.e. aquelas que compreendem o DNA integrado no DNA da célula hospedeira, podem ser selecionadas a partir de células não transformadas preferivelmente usando o método de seleção da invenção. Tão logo uma célula de planta transformada tenha sido gerada, uma planta inteira pode ser obtida usando métodos conhecidos pelo técnico habilitado. Por exemplo, as culturas de calo são usadas como material de partida. A formação de brotos e raízes pode ser induzida nesta biomassa de célula até agora não diferenciada na maneira conhecida. Os brotos obtidos podem ser plantados e cultivados.

[00204] As técnicas mediadas pela Agrobacterium tipicamente podem resultar na liberação de gene em um número limitado de células no tecido alvo. Portanto, em uma forma de realização preferida da invenção, um agente seletivo é aplicado após a transformação para matar todas as células nos tecidos alvejados que não são transformadas ou para identificar as células transformadas através de uma vantagem seletiva. O comprimento da cultura depende, em parte, da toxicidade do agente de seleção para as células não transformadas. O gene marcador selecionável e o composto de seleção correspondente usado para a dita seleção ou triagem podem ser qualquer um de uma variedade de compostos de seleção bem conhecidos, tais como antibióticos, herbicidas, ou D-aminoácidos (ver abaixo para detalhes). A duração desta etapa de cultura é variável (dependendo do composto de seleção e da sua concentração, o gene marcador selecionável), estendendo-se de um dia a 120 dias. A inserção de um gene marcador selecionável e/ou triável está compreendida dentro do escopo do método da invenção. Isto pode ser vantajoso por exemplo, para o uso posterior como um traço de resistência a herbicida.

[00205] Por exemplo, com o gene de resistência à canamicina (neomicina fosfotransferase, NPTII) como o marcador seletivo, a canamicina em uma concentração de cerca de 3 a 200 mg/L pode ser incluída no meio. As concentrações típicas para a seleção são de 5 a 50 mg/L. O tecido é cultivado neste meio por um período de 1 a 3 semanas, preferivelmente de cerca de 7 dias até que os brotos tenham se desenvolvidos.

[00206] Por exemplo, com o gene de resistência à fosfinotricina (bar) como o marcador seletivo, a fosfinotricina em uma concentração de cerca de 3 a 200 mg/L podem ser incluídos no meio. As concentrações típicas para a seleção são 5 a 50 mg/L. O tecido é cultivado neste meio por um período de 1 a 3 semanas, preferivelmente de cerca de 7 dias até que os brotos tenham se desenvolvido.

[00207] Por exemplo, com o gene dao1 como o marcador seletivo, D- serina ou D-alanina em uma concentração de cerca de 3 a 100 mg/L pode ser incluída no meio. As concentrações típicas para a seleção são de 20 a 40 mg/L. O tecido é cultivado neste meio por um período de 1 a 3 semanas, preferivelmente de cerca de 7 dias até que os brotos tenham se desenvolvido.

[00208] As células vegetais transformadas, derivadas por qualquer uma das técnicas de transformação acima, podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possua o genótipo transformado e assim o fenótipo desejado. Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de certos fito-hormônios em um meio de crescimento de cultura de tecido, tipicamente contando com um marcador biocida e/ou herbicida que foi introduzido junto com as seqüências de nucleotídeo desejadas. A regeneração de plantas a partir de protoplastos cultivados é descrita (Evans 1983; Binding, 1985). A regeneração também pode ser obtida a partir de calo, explantes, embriões somáticos (Dandekar 1989; McGranahan 1990), órgãos vegetais, ou partes destes. Tais técnicas de regeneração são descritas (no geral em Klee 1987). Outras técnicas de regeneração disponíveis são descritas (Vasil 1984; Weissbach 1989).

[00209] Os meios como utilizados durante o método da invenção para a regeneração e/ou seleção podem ser opcionalmente ainda suplementados com um ou mais reguladores de crescimento vegetal, como por exemplo, compostos de citoquinina (por exemplo, 6-benzilaminopurina) e/ou compostos de auxina (por exemplo, 2,4-D). O termo “regulador de crescimento vegetal” (PGR) como usado neste significa compostos que ocorrem naturalmente ou sintéticos (que não ocorrem naturalmente) que podem regular o crescimento e desenvolvimento vegetal. Os PGRs podem atuar isoladamente ou em associação com um outro ou com outros compostos (por exemplo, açúcares, aminoácidos). Os termos “auxina” ou “compostos de auxina” compreendem compostos que estimulam o alongamento e divisão celular, diferenciação de tecido vascular, desenvolvimento de fruta, formação de raízes adventícias, produção de etileno, e - em concentrações altas - induzem a desdiferenciação (formação de calo). A auxina que ocorre naturalmente mais comum é o ácido indolacético (IAA), que é transportado de modo polar em raízes e hastes. As auxinas sintéticas são usadas extensivamente na agricultura moderna. Os compostos de auxina compreendem o ácido indol-3-butírico (IBA), ácido naftilacético (NAA), e ácido 2,4-diclorfenoxiacético (2,4-D). Os compostos que induzem a formação de broto incluem, mas não são limitados a, IAA, NAA, IBA, citoquininas, auxinas, cinetinas, glifosato, e tiadiazorun.

[00210] O termo “citoquinina” ou “composto de citoquinina” compreende compostos que estimulam a divisão celular, a expansão de cotilédones, e crescimento de brotos laterais. Estes retardam a senescência de folhas destacadas e, em combinação com auxinas (por exemplo, IAA), podem influenciar a formação de raízes e brotos. Os compostos de citoquinina compreendem, por exemplo, 6-isopenteniladenina (IPA) e 6-benziladenina/6- benzilaminopurina (BAP).

[00211] Descendentes podem ser gerados pela propagação sexual ou não sexual. A propagação não sexual pode ser realizada pela introdução de embriogênese somática pelas técnicas bem conhecidas no ramo. Preferivelmente, os descendentes são gerados pela propagação/fertilização sexual. A fertilização pode ser realizada por auto-polinização ou cruzando com outras plantas transgênicas ou não transgênicas. A planta transgênica da invenção pode funcionar aqui como planta materna ou paterna. Os descendentes podem compreender uma ou mais cópias do gene de traço agronomicamente valioso. Preferivelmente, os descendentes são isolados de modo que compreendam apenas uma cópia do dito gene de traço.

[00212] Todas as composições e métodos aqui divulgados e reivindicados podem ser fabricados e executados sem experimentação indevida considerando-se a presente divulgação. Embora as composições e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de formas de realização preferidas, estará evidente àqueles de habilidade na técnica que variações podem ser aplicadas à composição, métodos e nas etapas ou em uma seqüência de etapas do método aqui descrito sem divergir do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, estará evidente que certos agentes que são tanto química quanto fisiologicamente relacionados podem ser substituídos no lugar dos agentes aqui descritos embora os mesmos resultados ou similares sejam obtidos. Todos de tais substitutos e modificações similares evidentes àqueles habilitados na técnica são considerados como estando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definido nas reivindicações anexas. Todas as publicações e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são indicativos do nível de habilidade daqueles habilitados na técnica à qual esta invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados por referência ao mesmo grau como se cada publicação ou pedido de patente individuais fossem específica e individualmente indicados como sendo incorporados por referência. Certos aspectos e formas de realização da invenção serão agora ilustrados por via de exemplo e com referência à figura descrita abaixo. SEQÜÊNCIAS 1. SEQ ID N°: 1: Seqüência de ácido nucléico que codifica a seqüência do flanco direito de pRI2659 2. SEQ ID N°: 2: Seqüência de ácido nucléico que codifica seqüência do flanco esquerdo de pRI2659 Petição 870210026712, de 22/03/2021, pág. 108/185 100 / 167 3. SEQ ID N°: 3: Seqüência de ácido nucléico de vetor de clonagem pRL278 (GenBank Acc.-N°: L05083) 4. SEQ ID N°: 4: Seqüência de ácido nucléico que codifica a região de T-DNA de pRI2659 (GenBank Acc.-N° AJ271050). 5. SEQ ID N°: 5: motivo da seqüência intergênica de K599 16S-23S rRNA da cepa de Agrobacterium M1: 5’- AATCGTCGATGCGAATTGTTG-3’ 6. SEQ ID N°: 6: motivo da seqüência intergênica de K599 16S-23S rRNA da cepa de Agrobacterium M2: 5’- GTTTTGTCCTGACGCTGTCGCGA-3’ 7. SEQ ID N°: 7: motivo da seqüência intergênica de K599 16S-23S rRNA da cepa de Agrobacterium M3: 5’- TCTAACGATCGCTGCGCTCCGGA-3’ 8. SEQ ID N°: 8: motivo da seqüência intergênica de K599 16S-23S rRNA da cepa de Agrobacterium M4: 5’- CGCCACGAGGCGCGACGGA-3’ 9. SEQ ID N°: 9: motivo da seqüência intergênica de K599 16S-23S rRNA da cepa de Agrobacterium M5: 5’- TTATGGGCGAATTGATCTGA-3’ 10. SEQ ID N°: 10 motivo da seqüência intergênica de K599 16S-23S rRNA da cepa de Agrobacterium M6: 5’- GTCCTGCTAAGGATTGATGCCT-3’ 11. SEQ ID N°: 11 motivo da seqüência intergênica de K599 16S-23S rRNA da cepa de Agrobacterium M7: 5’- AGACCAGTCCTTGTGAAACC-3’ 12. SEQ ID N°: 12 motivo da seqüência intergênica de K599 16S-23S rRNA da cepa de Agrobacterium M8: 5’- CCTGGGCATTTTTGTTGTTGG-3’ 13. SEQ ID N°: 13 motivo da seqüência intergênica de K599 16S-23S rRNA da cepa de Agrobacterium M9: 5’- AATGGTATGGCTTCGAGGTG-3’ 14. SEQ ID N°: 14 motivo da seqüência intergênica de K599 16S-23S rRNA da cepa de Agrobacterium M10: 5’- CTCAAAGAAGACCGTACCGACA-3’ 15. SEQ ID N°: 15 Vetor binário pBPSEW008 [p-NOS::c-bar::t-NOS pPcUBI::c-gusINT::t-NOS] 16. SEQ ID N°: 16 Vetor binário pBPSMM192b [p-AtAhas::c-csr1-2::tAtAHAS t-NOS::c-gusINT::p-SUPER] 17. SEQ ID N°: 17 JT-Vetor binário pBPSMM232 [p-ZmUbi1::cZmAHASL/Xi12::t-ZmAHAS t-NOS::c-gusINT::pZmUbi1] pBPSMM232 é um vetor que como taç não é replicável em Agrobacterium mas apenas em E.coli. A transformação em Agrobacterium que compreende plasmídeo superbinário pSB1 resulta em um plasmídeo quimérico (pSB1/pBPSMM232) pela fusão mediada por seleção entre pBPSMM232 e pSB1; Komari 1996) 18. SEQ ID N°: 18 Seqüência de fronteira esquerda de pRi2659 5-TGGCAGGATA TATTGTGGTG TAAA-3’ 19. SEQ ID N°: 19 Seqüência de fronteira direita de pRi2659 5’-TGACAGGATA TATCCCCTTG TCTA-3’ 20. SEQ ID N°: 20 seqüência intergênica de 16S-23S rRNA de cepa de Agrobacterium K599 21. SEQ ID N°: 21 16S rRNA que codifica o DNA genômico da cepa de Agrobacterium K599 22. SEQ ID N°: 22 vetor de anulação pBPSSH009 23. SEQ ID N°: 23 vetor de anulação pRL278 LF/RF (também denominado pBPSSH009b) 24. SEQ ID N°: 24 Seqüência de ácido nucléico que codifica pRI2659∆ (que não compreende marcador de seleção de tetraciclina (tet)) 25. SEQ ID N°: 25: seqüência de aminoácido codificada por rcorf1, similar à mll6374, integrase/recombinase [Mesorhizobium loti MAFF303099] 26. SEQ ID N°: 26 seqüência de aminoácido codificada por rcorf13, fracamente similar à riorf22 em pRi1724, similar à proteína hipotética Bcep02000337 [Burkholderia fungorum LB400] 27. SEQ ID N°: 27 seqüência de aminoácido codificada por rcorf14, gene transportador de cucumbopina provável, similar à riorf37 em pRi1724, um transportador de miquimopina provável 28. SEQ ID N°: 28 seqüência de aminoácido codificada por rcorf16, similar à SMa2205 Sinorhizobium meliloti 1021 (cepa: 1021), um sistema de transporte de espermedina/putrescina do tipo COG1176 [E] ABC, componente de permease I 29. SEQ ID N°: 29 seqüência de aminoácido codificada por rcorf19, similar à hutI, imidazolona-5-propionato hidrolase [Agrobacterium tumefaciens str. C58], menos similar à riorf39 em pRi1724, caminho KEGG: metabolismo de histidina 00340. 30. SEQ ID N°: 30 seqüência de aminoácido codificada por rcorf20, similar à riorf41 em pRi1724, uma proteína hipotética 31. SEQ ID N°: 31 seqüência de aminoácido codificada por rcorf21, similar à riorf42 em pRi1724, um gene homólogo de huTU, uma urocanase, número EC 4.2.1.49 32. SEQ ID N°: 32 seqüência de aminoácido codificada por rcorf22, similar à proteína de função desconhecida DUF886 [Mesorhizobium sp. BNC1] e menos similar à riorf43 em pRi1724, similar ao gene deconhecido seguinte ao gene hutR em Pseudomonas putida 33. SEQ ID N°: 33 seqüência de aminoácido codificada por rcorf23, termo C similar, similar à Família transporase IS30 34. SEQ ID N°: 34 seqüência de aminoácido codificada por rcorf32, similar à riorf60 em pRi1724, similar ao gene gatA- 1 [Glutamil-tRNA amidotransferase, subunidade A (gatA-1) Sulfolobus solfataricus P2] 35. SEQ ID N°: 35 seqüência de aminoácido codificada por rcorf34, similar à riorf62 em pRi1724, gene transportador ABC hipotético similar à gene agaB, ácido agropínico permease, pfam00528: BPD_transp_1; Componente da membrana interna do sistema de transporte dependente da proteína de ligação 36. SEQ ID N°: 36 seqüência de aminoácido codificada por rcorf35, similar à riorf63 em pRi1724, gene transportador ABC hipotético similar ao gene dppC, pfam00528: BPD_transp_1; Componente da membrana interna do sistema de transporte dependente da proteína de ligação 37. SEQ ID N°: 37 seqüência de aminoácido codificada por rcorf36, similar à riorf64 em pRi1724, gene transportador ABC hipotético similar ao gene moaD, ácido manopínico permease, COG1123: componentes de ATPase de vários sistemas de transporte do tipo ABC. 38. SEQ ID N°: 38 seqüência de aminoácido codificada por rcorf37, similar à riorf66 em pRi1724, similar ao gene amaB, N-carbamoil-beta-alanina amidoidrolase 39. SEQ ID N°: 39 seqüência de aminoácido codificada por rcorf39, similar à riorf68 em pRi1724, fracamente similar ao gene pck, pfam01633: colina_cinase; colina/etanolamina cinase 40. SEQ ID N°: 40 seqüência de aminoácido codificada por rcorf40, similar à riorf69 em pRi1724, similar à MLCB1779.29 (gene de monofosfatase provável) em Mycobacterium leprae, cd01641: Bacterial_IMPase_like_1; família predominantemente bacteriana de fosfatases dependentes de Mg++, com relação à inositol monofosfatases 41. SEQ ID N°: 41 seqüência de aminoácido codificada por rcorf41, similar à riorf71 em pRi1724, gene quimio-receptor hipotético similar ao gene orf2 em pTi15955 42. SEQ ID N°: 42 seqüência de aminoácido codificada por rcorf44, similar à riorf74, similar ao gene teuB (proteína de ligação super-periplástica), COG1879: RbsB; sistema de transporte de açúcar do tipo ABC, componente periplásmico [transporte e metabolismo de carboidrato]. 43. SEQ ID N°: 43 seqüência de aminoácido codificada por rcorf45, similar à riorf75 em pRi1724, similar ao agente teuA (transportador ABC de açúcar de ligação de ATP), gene transportador ABC hipotético, COG1129: MglA; sistema de transporte de açúcar do tipo ABC, componente de ATPase [transporte e metabolismo de carboidrato]. 44. SEQ ID N°: 44 seqüência de aminoácido codificada por rcorf46, similar à riorf76 em pRi1724, similar ao gene teuC1 (transportador ABC de açúcar-permease), um gene transportador ABC hipotético, pfam02653: BPD_transp_2; sistema de transporte de aminoácido de cadeia ramificada/componente de permease. 45. SEQ ID N°: 45 seqüência de aminoácido codificada por rcorf47, similar à riorf77 em pRi1724, similar ao gene teuC2 (transportador ABC de açúcar-permease), um gene transportador ABC hipotético, pfam02653: BPD_transp_2; sistema de transporte de aminoácido de cadeia ramificada/componente de permease. 46. SEQ ID N°: 46 seqüência de aminoácido codificada por rcorf48, similar à riorf78 em pRi1724, um COG2755 [E] Lisofosfolipase L1 e esterases relacionadas. 47. SEQ ID N°: 47 seqüência de aminoácido codificada por rcorf50, similar à riorf80 de pRi1724, um homólogo do gene glpD, glicerol-3-fosfato desidrogense [Agrobacterium tumefaciens str. C58] 48. SEQ ID N°: 48 seqüência de aminoácido codificada por rcorf51, similar à riorf81 em pRi1724, um homólogo do gene acs(acetil-CoA sintetase), EC 6.2.1.1. 49. SEQ ID N°: 49 seqüência de aminoácido codificada por rcorf52, similar à riorf82 de pRi1724, um homólogo do gene adk, pfam00406: ADK; Adenylate cinase, EC 2.7.4.3. 50. SEQ ID N°: 50 seqüência de aminoácido codificada por rcorf53, similar à riorf83 em pRi1724, um gene quimioreceptor hipotético similar ao gene orf2 em pTi15955 51. SEQ ID N°: 51 seqüência de aminoácido codificada por rcorf54, similar à riorf84, um homólogo do gene cbbF, um cd00354: FBPase; Frutose-1,6-bisfosfatase, uma enzima que catalisa a hidrólise de frutose-1,6- bifosfato na frutose-6-fosfato e é crítica no caminho da glicogênese. 52. SEQ ID N°: 52 seqüência de aminoácido codificada por rcorf55, homólogo do gene cbbA, um cd00947: TBP_aldolase_IIB; Tagatose-1,6-bisfosfato (TBP) aldolase e aldolases Tipo B Classe II relacionadas 53. SEQ ID N°: 53 seqüência de aminoácido codificada por rcorf56, similar à Cadeia A de pdb, Levedura Triosefosfato Isomerase (tri1) 54. SEQ ID N°: 54 seqüência de aminoácido codificada por rcorf57, similar à riorf88 em pRi1724 ao gene phrR, proteína de ligação de DNA, família XRE helix-turn-helix. 55. SEQ ID N°: 55 seqüência de aminoácido codificada por rcorf58, similar à riorf89 em pRi1724 e o gene thcR, domínio conservado, HTH_ARAC; helix_turn_helix, proteína de controle de óperon de arabinose 56. SEQ ID N°: 56 seqüência de aminoácido codificada por rcorf59, similar à riorf90 em pRi1724 e Atu6096 em pTiC58, conservado em espécies Mesorhizobium e Agrobacterium species. 57. SEQ ID N°: 57 seqüência de aminoácido codificada por rcorf60, similar à riorf91 em pRI1724, também similar à diversas proteínas hipotéticas em espécies Agrobacterium, Mesorhizobium e Nitrobacter. 58. SEQ ID N°: 58 seqüência de aminoácido codificada por rcorf61, similar à riorf92 em pRi1724, proteína hipotética conservado em diversas cepas de Agrobacterium e Mesorhizobium. 59. SEQ ID N°: 59 seqüência de aminoácido codificada por rcorf62, similar à riorf93, similar ao gene jhp0928 em Helicobacter pylori, um COG0827; metilase de DNA específica de Adenina [replicação, recombinação e reparo de DNA]. 60. SEQ ID N°: 60 seqüência de aminoácido codificada por rcorf63, similar à proteína de divisão de AGR_pTi_191 Agrobacterium tumefaciens str. C58, proteína de divisão, COG1475 [K] reguladores transcricionais preditos. 61. SEQ ID N°: 61 seqüência de aminoácido codificada por rcorf64, similar à proteína hipotética MesoDRAFT_1041 [Mesorhizobium sp. BNC1], conservado em espécies Agrobacterium, Mesorhizobium e Nitrobacter. 62. SEQ ID N°: 62 seqüência de aminoácido codificada por rcorf66, similar à proteína hipotética MesoDRAFT_1043 [Mesorhizobium sp. BNC1], conservado em espécies Agrobacterium, Mesorhizobium e Nitrobacter. 63. SEQ ID N°: 63 seqüência de aminoácido codificada por rcorf67, similar à riorf96 em pRi1724, uma proteína hipotética fracamente similar à região ajusante do gene hydL em Thiocapsa roseopersicina. 64. SEQ ID N°: 64 seqüência de aminoácido codificada por rcorf68, similar à AGR_pTi_204 [Agrobacterium tumefaciens str. C58] e argG, argininosucinato sintase, do Streptomyces clavuligerus. 65. SEQ ID N°: 65 seqüência de aminoácido codificada por rcorf69, similar à riorf100 em pRi1724, similar ao gene ardC em pSa(plasmídeo IncW) COG4227, proteína de transferência conjugal provável (proteína antirestrição). 66. SEQ ID N°: 66 seqüência de aminoácido codificada por rcorf70, similar à riorf101 em pRI1724, similar à mll9093 aspartato 1-descarboxilase [Mesorhizobium loti MAFF303099] e gene pgi em Xanthomonas citri, COG0853 [H] Aspartato 1-descarboxilase. 67. SEQ ID N°: 67 seqüência de aminoácido codificada por rcorf71, similar à similar à riorf106 em pRi1724, similar a um gene teuB gene em pRtrCFN299a, um COG1879: RbsB; sistema de transporte de açúcar do tipo ABC, componente periplásmico [transporte e metabolismo de carboidrato]. 68. SEQ ID N°: 68 seqüência de aminoácido codificada por rcorf72, similar à riorf107 em pRi1724, similar ao gene mcpC (gene mcpC gene Rhizobium) em Rhizobium leguminosarum, um smart00283: MA; domínios semelhantes à quimiotaxia que aceitam metila (transdutor sensorial à quimiotaxia). 69. SEQ ID N°: 69 seqüência de aminoácido codificada por rcorf77, gene traA provável, similar à riorf112 em pRi1724, COG0507: RecD; exoDNAse dependente de ATP (exonuclease V), subunidade alfa - membro da superfamília de helicase I [replicação, recombinação e reparo de DNA]. 70. SEQ ID N°: 70 seqüência de aminoácido codificada por rcorf79, provável traB gene, similar à riorf114 em pRi1724. 71. SEQ ID N°: 71 seqüência de aminoácido codificada por rcorf80, similar à riorf115 em pRi1724, uma proteína hipotética de Agrobacterium rhizogenes (cepa: MAFF03-01724) 72. SEQ ID N°: 72 seqüência de aminoácido codificada por rcorf82, gene traM provável similar à riorf118 em pRi1724, antagonista de TraR. 73. SEQ ID N°: 73 seqüência de aminoácido codificada por rcorf96, gene repA provável similar à riorf132 Agrobacterium rhizogenes (cepa: MAFF03-01724), um cd00550: ArsA_ATPase; ATPase de translocação de Oxiânion (ArsA) e cd00592: HTH_MERR; regulador de transcrição Helix-voltahelix MERR, domínio de terminal N. 74. SEQ ID N°: 74 seqüência de aminoácido codificada por rcorf97, gene repB provável similar à riorf133 em pRi1724, um smart00470: ParB; proteína do domínio de nuclease semelhante à ParB. 75. SEQ ID N°: 75 seqüência de aminoácido codificada por rcorf98, gene repC provável à riorf134 em pRi1724, essencial para replicação vegetativa. 76. SEQ ID N°: 76 seqüência de aminoácido codificada por rcorf99, similar à riorf135 em pRi1724, fracamente similar ao gene y4aO em pNGR234a. 77. SEQ ID N°: 77 seqüência de aminoácido codificada por rcorf103, similar ao gene riorf137 em pRi1724 e gene orf4 em pTiA6NC. 78. SEQ ID N°: 78 seqüência de aminoácido codificada por rcorf105, similar à riorf139 em pRi1724, similar à região não caracterizda entre os genes y4jF e y4jG em pNGR234a. 79. SEQ ID N°: 79 seqüência de aminoácido codificada por rcorf106, similar riorf140 em pRi1724 e ao gene orf300 em Escherichia coli, um pfam00004: AAA; Família ATPase associadas com várias atividades celulares (AAA). 80. SEQ ID N°: 80 seqüência de aminoácido codificada por rcorf107, similar ao Termo N de riorf141 em pRi1724, uma proteína hipotética. 81. SEQ ID N°: 81 seqüência de aminoácido codificada por rcorf109, fracamente similar à SERP1653 Staphylococcus epidermidis RP62A (cepa: RP62A), uma proteína hipotética. 82. SEQ ID N°: 82 seqüência de aminoácido codificada por rcorf110, similar à riorf142 em pRi1724, similar ao gene para o éxon de proteína de ligação luminal 6 em Arabidopsis thaliana. 83. SEQ ID N°: 83 seqüência de aminoácido codificada por rcorf111, similar à riorf143 em pRi1724 e ao gene spdB3 em pSG5. 84. SEQ ID N°: 84 seqüência de aminoácido codificada por rcorf112, similar à riorf144 em pRi1724. 85. SEQ ID N°: 85 seqüência de aminoácido codificada por rcorf114, gene virF putativo, similar à riorf146 em pRI1724 e tiorf133 em pTiSAKURA. 86. SEQ ID N°: 86 seqüência de aminoácido codificada por rcorf117, similar à riorf149 em pRi1724, similar ao termo N. aatA (atu2196) aspartato aminotransferase A [Agrobacterium tumefaciens str. C58]. 87. SEQ ID N°: 87 seqüência de aminoácido codificada por rcorf119, virH provável, similar à riorf151 em pRi1724, oxidase tipo citocromo P450, semelhante à proteína secretada tipo IV por intermédio de virB/D4. 88. SEQ ID N°: 88 seqüência de aminoácido codificada por rcorf120, virA provável, similar à riorf152 em pRi1724, receptor em sistema regulador virA/G de dois componentes. 89. SEQ ID N°: 89 seqüência de aminoácido codificada por rcorf121, provável virB1, similar à riorf153 em pRi1724, sistema de secreção do tipo IV requerido para a transferência do complexo T. 90. SEQ ID N°: 90 seqüência de aminoácido codificada por rcorf123, provável virB3, similar à riorf155 em pRi1724, sistema de secreção do tipo IV requerido para a transferência do complexo T. 91. SEQ ID N°: 91 seqüência de aminoácido codificada por rcorf125, provável virB5, similar à riorf157 em pRi1724, sistema de secreção do tipo IV requerido para a transferência do complexo T. 92. SEQ ID N°: 92 seqüência de aminoácido codificada por rcorf126, provável virB6, similar à riorf158 em pRi1724, sistema de secreção do tipo IV requerido para a transferência do complexo T. 93. SEQ ID N°: 93 seqüência de aminoácido codificada por rcorf127, provável virB7, similar à riorf159 em pRi1724, sistema de secreção do tipo IV requerido para a transferência do complexo T. 94. SEQ ID N°: 94 seqüência de aminoácido codificada por rcorf129, provável virB9, similar à riorf161 em pRi1724, sistema de secreção do tipo IV requerido para a transferência do complexo T. 95. SEQ ID N°: 95 seqüência de aminoácido codificada por rcorf131, provável virB11, similar à riorf163 em pRi1724, sistema de secreção do tipo IV requerido para a transferência do complexo T. 96. SEQ ID N°: 96 seqüência de aminoácido codificada por rcorf132, provável virG, similar à riorf164 em pRi1724, ativador em sistema de regulador virA/G de dois componentes. 97. SEQ ID N°: 97 seqüência de aminoácido codificada por rcorf133, proteína hipotética, similar à aa1-103 pf ISBm1 transposase orfB [Brucella suis 1330] (NP 697552). 98. SEQ ID N°: 98 seqüência de aminoácido codificada por rcorf137, provável virD1, similar à riorf167 em pRi1724, uma proteína auxiliar de endonuclease de fronteira de TDNA regulada por virA/G. 99. SEQ ID N°: 99 seqüência de aminoácido codificada por rcorf138, provável virD2, similar à riorf168 em pRi1724, a endonuclease de fronteira de T-DNA regulada por virA/G. 100. SEQ ID N°: 100 seqüência de aminoácido codificada por rcorf140, virD4 provável, similar à riorf170 em pRi1724, componente regulado por virA/G de sistema de secreção do tipo IV virB/D4. 101. SEQ ID N°: 101 seqüência de aminoácido codificada por rcorf142, virF provável, similar à riorf172 em pRi1724 e menos similar à tiorf133 em pTi-SAKURA, uma proteína de secreção do tipo IV por intermédio do complexo virb/D4. 102. SEQ ID N°: 102 seqüência de aminoácido codificada por rcorf143, provável virE3, similar à riorf173 em pRi1724 e virE3 em pRiA6NC, interage com virE2 e IMPA1 (AtKAP-alfa) em A. tumefaciens, proteína secretada virB/D4 tipo IV. 103. SEQ ID N°: 103 seqüência de aminoácido codificada por rcorf144, similar à Mesorhizobium loti MAFF303099 mlr1626, manose-6-fosfato isomerase predita. 104. SEQ ID N°: 104 seqüência de aminoácido codificada por rcorf145, similar à fago integrase 105. SEQ ID N°: 105 Seqüência de ácido nucléico que codifica região RF::tet::LF de pRi2659Dtet (que compreende marcador de seleção de tetraciclina (tet)) 106. SEQ ID N°: 106 Seqüência de ácido nucléico que codifica pRi2659 107. SEQ ID N°: 107 iniciador de PCR dentro de virG CDS 5’-TACTTCCTCC TCACGCACTC-3’ 108. SEQ ID N°: 108 iniciador de PCR dentro de virB operon 5’-GCCAGCAATG ATCAAGAATT TGTTT-3’ 109. SEQ ID N°: 109 PCR G109 iniciador avançado 5’-TTGGTGCGAC AACTCCTCGG CG-3’ 110. SEQ ID N°: 110 PCR G112 iniciador reverso 5’-GGTGAGCTCG ATCAGCTTCG GC-3’ 111. SEQ ID N°: 111 Seqüência de ácido nucléico que codifica virD2 do pRi2659 112. SEQ ID N°: 112 seqüência de aminoácido para a proteína virD2 a partir do pRi2659, também conhecido como rcorf138 113. SEQ ID N°: 113 seqüência complementar de ácido nucléico de pRi2659 contendo rcorf2 através de rcorf12 114. SEQ ID N°: 114 seqüência de aminoácido codificada por rcorf12, fracamente similar à riorf20 em pRi1724, similar à proteína hipotética Bcep02000338 [Burkholderia fungorum LB400]. 115. SEQ ID N°: 115 seqüência de aminoácido codificada por rcorf11, similar à riorf40 em pRi1724, um homólogo do gene huTH, um cd01441: HAL; Histidina amônia-liase (HAL) catalisa a primeira etapa na degradação de histidina ao glutamato 116. SEQ ID N°: 116 seqüência de aminoácido codificada por rcorf10, similar à proteína reguladora transcricional [Bradyrhizobium japonicum USDA 110], repressor transcricional de operon de gliconato helix_volta_helix 117. SEQ ID N°: 117 seqüência de aminoácido codificada por rcorf9, similar à A. tumefaciens proteína de utilização de hidantoína C58 hyuA 118. SEQ ID N°: 118 seqüência de aminoácido codificada por rcorf8, similar à A. tumefaciens C58 proteína de utilização de hidantoína hyuB 119. SEQ ID N°: 119 seqüência de aminoácido codificada por rcorf7, similar à COG0834 Burkholderia fungorum LB400 COG0834, similar à STH1060, proteína de ligação do substrato do transportador de glutamina ABC [Symbiobacterium thermophilum IAM 14863] 120. SEQ ID N°: 120 seqüência de aminoácido codificada por rcorf6, similar à COG0765 [Burkholderia fungorum LB400], similar à PSPTO5181, transportador de cistina ABC, proteína de permease, putativo [Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000] 121. SEQ ID N°: 121 seqüência de aminoácido codificada por rcorf5, similar à Bcep02000339 [Burkholderia fungorum LB400], similar à blr3310, COG0765: proteína de permease transportadora de ABC [Bradyrhizobium japonicum USDA 110] 122. SEQ ID N°: 122 seqüência de aminoácido codificada por rcorf4, termo N similar à STH1062, similar à proteína de ligação de ATP do transportador de glutamina ABC [Symbiobacterium thermophilum IAM 14863]; termo C similar à bll6362, proteína hipotética em Bradyrhizobium japonicum USDA 110, COG2079 [R] proteína não caracterizada envolvida no catabolismo de propionato 123. SEQ ID N°: 123 seqüência de aminoácido codificada por rcorf3, fracamente similar à mlr6097, proteína de controle da assimilação de nitrogênio [Mesorhizobium loti MAFF303099], COG0583 [K] regulador transcricional 124. SEQ ID N°: 124 seqüência de aminoácido codificada por rcorf2, similar à riorf1 em pRi1724, homólogo do gene orf3 em IS66 125. SEQ ID N°: 125 seqüência complementar de ácido nucléico de pRi2659 contendo rcorf18 126. SEQ ID N°: 126 seqüência de aminoácido codificada por rcorf18, similar à AGR_L_1821 proteína hipotética [Agrobacterium tumefaciens str. C58], um homólogo do gene sdeB, cd01298: ATZ_TRZ_semelhante; a família TRZ/ATZ contém enzimas do caminho de degradação de atrazina e hidrolases relacionadas 127. SEQ ID N°: 127 seqüência complementar de ácido nucléico de pRi2659 contendo rcorf24 através de rcorf31 128. SEQ ID N°: 128 seqüência de aminoácido codificada por rcorf31, similar riorf59 em pRi1724, similar ao gene orf3 em Methylobacterium extorquens, COG3931 [E] glutamato de N-formila predito 129. SEQ ID N°: 129 seqüência de aminoácido codificada por rcorf30, similar à riorf58 em pRi1724, um homólogo de eutB, cadeia pesada de etanolamino amônia-liase 130. SEQ ID N°: 130 seqüência de aminoácido codificada por rcorf28, gene GALLS provável, similar à riorf55 em pRi1724, complementos de virE2, mecanismo desconhecido, requerido para transformação vegetal estável eficiente. 131. SEQ ID N°: 131 seqüência de aminoácido codificada por rcorf27, trans-zeatina sintase provável, similar à riorf54 em pRi1724, EC 2.5.1.-. 132. SEQ ID N°: 132 seqüência de aminoácido codificada por rcorf26, gene idi provável, similar à riorf53 em pRi1724, similar à idi, isopentenil-difosfato delta-isomerase [Mycobacterium tuberculosis CDC1551] EC 5.3.3.2. 133. SEQ ID N°: 133 seqüência de aminoácido codificada por rcorf25, similar à riorf52 em pRi1724, proteína da família MCA2182 descarboxilase similar [Methylococcus capsulatus str. Bath] 134. SEQ ID N°: 134 seqüência de aminoácido codificada por rcorf24, similar à riorf51 em pRi1724, fracamente similar ao gene mtrR da família reguladora bacteriana tetR. 135. SEQ ID N°: 135 seqüência complementar de ácido nucléico de pRi2659 contendo rcorf42 através de rcorf43 136. SEQ ID N°: 136 seqüência de aminoácido codificada por rcorf43, similar à riorf73 em pRI1724, similar à SMa2002 [Sinorhizobium meliloti 1021], COG2755 [E] Lisofosfolipase L1 e esterases relacionadas. 137. SEQ ID N°: 137 seqüência de aminoácido codificada por rcorf42, similar à riorf73 em pRi1724, gene repressor hipotético, similar à SMa2004 [Sinorhizobium meliloti 1021], regulador transcricional da família ROK putativo. 138. SEQ ID N°: 138 seqüência complementar de ácido nucléico de pRi2659 contendo rcorf74 através de rcorf76 139. SEQ ID N°: 139 seqüência de aminoácido codificada por rcorf76, gene traC provável, processamento de DNA conjugal de plasmídeo Ti, similar à riorf111 em pRi1724. 140. SEQ ID N°: 140 seqüência de aminoácido codificada por rcorf74, gene traG provável, similar à riorf109 em pRi1724, um cd01126: TraG_VirD4; a família TraG/TraD/VirD4 são proteínas de conjugação bacteriana. 141. SEQ ID N°: 141 seqüência complementar de ácido nucléico de pRi2659 contendo rcorf83 até rcorf95 142. SEQ ID N°: 142 seqüência de aminoácido codificada por rcorf95, gene traI provável similar à riorf131 em pRi1724, um regulador sensibilizador de quorum do tipo LuxI, sintetiza 3-oxooctanoilomoserina lactone, um pfam00765: Autoind_synth; Autoindutor sintetase. 143. SEQ ID N°: 143 seqüência de aminoácido codificada por rcorf94, gene trbB provável similar à riorf130 em pRi1724, sistema de transferência do tipo IV requerido para conjunção de plasmídeo Ri/Ti. 144. SEQ ID N°: 144 seqüência de aminoácido codificada por rcorf93, gene trbC provável similar à riorf129 em pRi1724, sistema de transferência do tipo IV requerido para Ri/Ti. 145. SEQ ID N°: 145 seqüência de aminoácido codificada por rcorf91, gene trbE provável similar à riorf127 em pRi1724, sistema de transferência do tipo IV requerido para conjugação de conjugação do plasmídeo Ri/Ti. 146. SEQ ID N°: 146 seqüência de aminoácido codificada por rcorf89, homólogo gene trbK similar à riorf125 em pRi1724, sistema de transferência do tipo IV requerido para conjugação do plasmídeo Ri/Ti. 147. SEQ ID N°: 147 seqüência de aminoácido codificada por rcorf88, gene trbF provável similar à riorf123 em pRi1724, sistema de transferência do tipo IV requerido para conjugação do plasmídeo Ri/Ti. 148. SEQ ID N°: 148 seqüência de aminoácido codificada por rcorf87, ene trbF provável similar à riorf123 em pRi1724, sistema de transferência do tipo IV requerido para conjugação do plasmídeo Ri/Ti. 149. SEQ ID N°: 149 seqüência de aminoácido codificada por rcorf86, gene trbG provável similar à riorf122 em pRi1724, sistema de transferência do tipo IV requerido para conjugação do plasmídeo Ri/Ti. 150. SEQ ID N°: 150 seqüência de aminoácido codificada por rcorf85, gene trbH provável similar à riorf121 em pRi1724, sistema de transferência do tipo IV requerido para conjugação do plasmídeo Ri/Ti. 151. SEQ ID N°: 151 seqüência de aminoácido codificada por rcorf84, gene trbI provável similar à riorf120 em pRi1724, um pfam03743: TrbI; proteína semelhante a TrbI de conjugaçaõ bacteriana. 152. SEQ ID N°: 152 seqüência de aminoácido codificada por rcorf83, gene traR provável similar à riorf119 em pRi1724 and traR/AGR pTi 249 in pTiC58. 153. SEQ ID N°: 153 seqüência complementar de ácido nucléico de pRi2659 contendo rcorf100 até rcorf102 154. SEQ ID N°: 154 seqüência de aminoácido codificada por rcorf102, similar à gene de integrase hipotético orf2 (similar ao gene semelhante à Pseudomonas integrase) em pTiA6NC. 155. SEQ ID N°: 155 seqüência de aminoácido codificada por rcorf101, similar ao termo N. fragmento de pAT 22 Agrobacterium tumefaciens str. C58 (cepa: C58, isolado: Cereon), uma proteína COG0582 [L] Integrase. 156. SEQ ID N°: 156 seqüência de aminoácido codificada por rcorf100, similarao termo Cof pAT 22 Agrobacterium tumefaciens str. C58 (cepa: C58, isolado: Cereon), uma proteína COG0582 [L] Integrase. 157. SEQ ID N°: 157 seqüência complementar de ácido nucléico de pRi2659 contendo rcorf115 até rcorf116 158. SEQ ID N°: 158 seqüência de aminoácido codificada por rcorf116, proteína de entrada de potássio provável, similar à Atu0711 iAgrobacterium tumefaciens str. C58 e riorf148 em pRi1724 e ao gene kup, um pfam02705: K_trans; proteína transportadora de potássio K+. 159. SEQ ID N°: 159 seqüência de aminoácido codificada por rcorf115, similar à riorf147 em pRi1724 e gene y4mC em homólogo de pNGR234a, um gene induzido por vir. 160. SEQ ID N°: 160 seqüência complementar de ácido nucléico de pRi2659 contendo rcorf134 até rcorf136 161. SEQ ID N°: 161 seqüência de aminoácido codificada por rcorf136, provável virC1, similar à riorf166 em pRi1724, proteína regulada por virulência virA/G, AGR_pTi_18p; VirC1; liga-se à seqüência multiplicadora adjacente à fronteira direita de TDNA; aumenta o nível de processamento de TDNA. 162. SEQ ID N°: 162 seqüência de aminoácido codificada por rcorf135, virC2 provável, similar à riorf165 em pRi1724, proteína regulada por virulência virA/G de processamento de T-DNA. 163. SEQ ID N°: 163 seqüência de aminoácido codificada por rcorf134, proteína hipotética, similar à aa4-122/142 de ISBm1 transposase orfA [Brucella suis 1330] (NP 697551). 164. SEQ ID N°: 164 seqüência de aminoácido codificada por rcorf15, similar à SMa2207, um transportador ABC putativo, proteína de ligação de ATP [Sinorhizobium meliloti 1021], um COG3842: PotA; espermidina do tipo ABC/sistemas transportadores de putrescina, componentes de ATPase [transporte e metabolismo de aminoácido] 165. SEQ ID N°: 165 seqüência de aminoácido codificada por rcorf17, transportador de cucumbopina provável, similar à riorf34, uma proteína hipotética [Agrobacterium rhizogenes] o gene transportador de miquimopina provável 166. SEQ ID N°: 166 seqüência de aminoácido codificada por rcorf29, similar à riorf57 em pRi1724, um homólogo de eutC, cadeia leve de etanolamina amônia-liase 167. SEQ ID N°: 167 seqüência de aminoácido codificada por rcorf33, similar à riorf61 em pRi1724, gene transportador ABC hipotético similar à PH0807, pfam00496: SBP_bac_5; proteínas de ligação de solúvel extracelular bacteriano, família 5 168. SEQ ID N°: 168 seqüência de aminoácido codificada por rcorf38, similar à riorf67 em pRI1724, fracamente similar ao gene pck, smart00587: CHK; domínio ZnF_C4 abd HLH contendo o domínio de cinases 169. SEQ ID N°: 169 seqüência de aminoácido codificada por rcorf49, similar à riorf79 em pRi1724, um homólogo do gene glpK (glicerol cinase), EC 2.7.1.30. 170. SEQ ID N°: 170 seqüência de aminoácido codificada por rcorf65, riorf95 similar em pRI1724, similar à região ajusante do gene nylA em pOAD2. 171. SEQ ID N°: 171 seqüência de aminoácido codificada por rcorf73, similar à AGR_pTi_225 nuclease [Agrobacterium tumefaciens str. C58], homólogos de COG1525 [L] Micrococos nuclease (termonuclease). 172. SEQ ID N°: 172 seqüência de aminoácido codificada por rcorf75, gene traD provável, proteína de transferência conjugal similar à riorf110 em pRi1724. 173. SEQ ID N°: 173 seqüência de aminoácido codificada por rcorf78, gene traF provável, similar à riorf113 em pRi1724, COG4959: TraF; caminho secretor Tipo IV, protease TraF [modificação Pós-translational, rotações de proteína, chaperonas/Tráfego intracelular e secreção]. 174. SEQ ID N°: 174 seqüência de aminoácido codificada por rcorf81, similar à riorf117 em pRi1724, uma proteína hipotética ou Agrobacterium rhizogenes (cepa: MAFF03-01724), um cd00093: HTH_XRE; proteínas semelhantes à família XRE Helix-voltahelix. 175. SEQ ID N°: 175 seqüência de aminoácido codificada por rcorf90, gene trbJ provável similar à riorf126 em pRi1724, sistema de transferência do tipo IV requerido para conjugação do plasmídeo Ri/Ti, COG5314; Transferência conjugal /proteína de exclusão de entrada [tráfego intracelular e secreção]. 176. SEQ ID N°: 176 seqüência de aminoácido codificada por rcorf92, gene trbD provável similar à riorf128 em pRi1724, sistema de transferência do tipo IV requerido para conjugação do plasmídeo Ri/Ti. 177. SEQ ID N°: 177 seqüência de aminoácido codificada por rcorf104, similar à riorf138 em pRi1724 e gene gvp1 em pHH1, um pfam04079: DUF387; proteína reguladora transcripcional putativa (semelhante à Ypuh). 178. SEQ ID N°: 178 seqüência de aminoácido codificada por rcorf108, similar ao termo Cof riorf141 em pRi1724, uma proteína hipotética. 179. SEQ ID N°: 179 seqüência de aminoácido codificada por rcorf113, similar fraco sobre 79 aa a blr8180 de Bradyrhizobium japonicum USDA 110 (cepa: USDA 110), uma COG1760 [E] L-serina deaminase. 180. SEQ ID N°: 180 seqüência de aminoácido codificada por rcorf118, similar à riorf150 em pRi1724, gene aatA em homólogo de Rhizobium leguminosarum, pseudogene hipotético que é dividido pela mudança de estrutura. 181. SEQ ID N°: 181 seqüência de aminoácido codificada por rcorf122, provável virB2, similar à riorf154 em pRi1724, sistema de secreção do tipo IV requerido para a transferência do complexo T. 182. SEQ ID N°: 182 seqüência de aminoácido codificada por rcorf124, provável virB4, similar à riorf156 em pRi1724, sistema de secreção do tipo IV requerido para a transferência do complexo T. 183. SEQ ID N°: 183 seqüência de aminoácido codificada por rcorf128, provável virB8, similar à riorf160 em pRi1724, sistema de secreção do tipo IV requerido para a transferência do complexo T. 184. SEQ ID N°: 184 seqüência de aminoácido codificada por rcorf130, provável virB10, similar à riorf162 em pRi1724, sistema de secreção do tipo IV requerido para a transferência do complexo T. 185. SEQ ID N°: 185 seqüência de aminoácido codificada por rcorf139, provável virD3, similar à riorf169 em pRi1724, virA/G regulated, não requerido para virulência, possível fator de variação de hospedeiro. 186. SEQ ID N°: 186 seqüência de aminoácido codificada por rcorf141, provável virD5, similar à riorf171 em pRi1724, componente regulado por virA/G de sistema de secreção do tipo IV virB/D4. 187. SEQ ID N°: 187 seqüência de aminoácido codificada por rcorf146, similar à Y4rB Rhizobium sp. NGR234. 188. SEQ ID N°: 188 Seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de flanqueamento de T-DNA esquerda da cepa de Agrobacterium K599.

EXEMPLOS

[00213] A não ser que indicado de outra maneira, os produtos químicos e reagentes nos exemplos são obtidos da Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), as endonucleases de restrição são da New England Biolabs (Beverly, MA) ou Roche (Indianapolis, IN), os oligonucleotídeos foram sintetizados por MWG Biotech Inc. (High Point, NC) e outras enzimas de modificação ou kits com respeito a bioprodutos químicos e ensaios biológicos moleculares são da Clontech (Palo Alto, CA), Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega Corporation (Madison, WI) ou Stratagene (La Jolla, CA). Os materiais para os meios de cultura celular são obtidos da Gibco/BRL (Gaithersburg, MD) ou DIFCO (Detroit, MI). As etapas de clonagem realizadas para os propósitos da presente invenção, tais como, por exemplo, as clivagens de restrição, eletroforese em gel de agarose, purificação de fragmentos de DNA, transferência de ácidos nucléicos para nitrocelulose e membranas de náilon, fragmentos de DNA de ligação, transformação de células de E. coli, desenvolvimento de bactérias, fagos de multiplicação e análise de seqüência de DNA recombinante são realizados como descrito por Sambrook (1989). O sequenciamentio de moléculas de DNA recombinantes é realizados usando-se sequenciador de DNA de fluorescência a laser ABI seguindo o método de Sanger (Sanger 1977) a não ser que indicado de outra maneira. Os seguintes exemplos são oferecidos como meio de ilustração e não como meio de limitação.

Exemplo 1: Desarmamento da cepa de Agrobacterium K599

[00214] A cepa de Agrobacterium K599 é uma bactéria do solo que causa a doença da doença da raiz peluda em muitas plantas dicotiledôneas incluindo a soja. A cepa K599 foi observada ser altamente eficaz nas raízes de soja. A cepa de Agrobacterium K599 (depositada sob o Número de Acessão NCPPB2659 no British NCPPB stock center; www.ncppb.com National Collection of Plant Pathogenic Bacteria Central Science Laboratory, Sand Hutton, York YO41 1LZ England) foi desenvolvida em cultura de líquido (meio LB) a 28° C e protocolos de extração de DNA modificados para a purificação dos plasmídeo pRi foram realizados usando-se o kit Qiagen Large Construct catálogo N° 12462 para enriquecer a preparação de DNA para o plasmídeo pRi2659.

[00215] As hibridizações de Southern usando-se as sondas das fronteiras direita (285 bp) ou esquerda (240 bp) foram feitas para verificar a precisão do mapa da restrição física da região de T-DNA de pRi2659 (ver a Fig. 6). Foi determinado que as enzimas de restrição SphI produziram fragmentos aceitáveis (maiores do que 2 kb de flanqueamento) para o uso com as regiões homólogas para um vetor de anulação. Um banco de clone sub genômico de fragmentos de K599 pRi2659 SphI foi cosnstruído pUC19. O DNA da cepa de Agrobacterium K599 isolado enriquecido para o plasmídeo pRI2659 foi digerido com SphI e funcionou em um gel de agarose a 0,8%. As regiões de fragmento que representam um fragmento de 2905 bp contendo o DNA do flanco direito DNA e um fragmento de 7.498 bp contendo o DNA do flanco esquerdo foram excisados a parir do gel de agarose usando-se um kit de extração de gel Qiagen QIAquick catálogo N° 28706. Estes fragmentos de gel purificados foram ligados em pUC19 para gerar um banco de clone sub- genômico.

[00216] Os levantamentos de colônias do banco de clones foram sondados com os fragmentos de fronteira direita ou fronteira esquerda para identificar os clones contendo o DNA de flanqueamento. Dois clones foram identificados: um fragmento de 2.905 bp contendo o DNA do flanco direito e um fragmento de 7.498 bp contendo o DNA do flanco esquerdo. Cada um destes clones fo ainda sub-clonado e sequenciado usando-se os iniciadores dianteiros e iniciadores reversos padrão (SEQ ID N°: 1 e 2, respectivamente).

[00217] O cassete de anulação de Agrobacterium foi construído usando- se os fragmentos de 2,1 kb de cada clone de flanqueamento. As regiões homólogas fornecem espaço amplo para a recombinação homóloga dupla acontecer. Um cassete similar foi construído contendo o gene de resistência à tetraciclina entre os fragmentos RF e LF (ver Fig. 12 para o diagrama de fluxo). Estas construções foram verificadas quanto à seqüência. Os cassetes RF/LF e RF/Tet/LF foram clonados em uma versão modificada de ligador de pRL278 (SEQ ID N°: 3; Peter Wolk, Michigan State University) resultando em um vetor de plasmídeo pRL278LF/RF (SEQ ID N°: 23; sem o Tet- cassete) e o vetor de plasmídeo pBPSSH009 (SEQ ID N°: 22; com Tet- cassette), respectivamente. Estes vetores permitem a seleção eficiente de homólogos duplos pelo uso do gene sacB. A adição de sacarose ao meio de desenvolvimento contendo recombinantes homólogos simples produzem o composto tóxico. Este composto atua como uma contra seleção contra as cepas contendo o plasmídeo, forçando uma passagem dupla que resolve o fenótipo do tipo selvagem ou a anulação desejada. pBPSSH009 e pRL278LF/RF, respectivamente, foram introduzidos por electroporação na cepa K599 e selecionado usando-se canamicina 100 μg/ml. As passagens simples contendo o plasmídeo de anulação que foi integrado no plasmídeo Ri foram recuperados e a contra seleção em sacarose foi ralizada. A selção de sacarose/sacB foi realziada como segue: eventos de passagem simples confirmados (pela hibridização de Southern) contendo o vetor resistente de canamicina com sacB e construção de anulação foram desenvolvidos durante a noite sem seleção para permitir que a recombinação aconteça. Uma diluição serial da cultura foi colocada em meios de contra seleção de LB ágar contendo 5% de sacarose v/v. Após 2 dias as colônias que apareceram foram desenvolvidas e o DNA genômico foi isolado e usado para confirmar a anulação da região de T-DNA pela hibridização de Southern. As passagens duplas foram isoladas e a confirmação molecular da anulação de T-DNA foi confirmada pela hibridização de Southern (Fig. 6). A sonda usada na hibridização de Southern foi o mesmo usado acima para isolar o fragment contendo a região de flanqueamento direita de pRi2659. Este é um fragmento de 200 bp que contém a fronteira direita e a seqüência de flanqueamento tanto a montante quanto a jusante da fronteira. Para o Southern blot as amostras de DNA genômico foram digeridas com SphI e realizadas em gel de agarose a 0,8%.

[00218] As cepas obtidas foram denominadas como segue: - Cepas de Agrobacterium K599 [pRi2659Δtet]: SHA001 e SHA016 são cepas de Agrobacterium K599 desarmadas que precisam da região de T-DNA que compreende um cassete de expressão de tetraciclina (tet) (obtido usando-se pBPSSH009). As cepas de Agrobacterium SHA001 e SHA016 são amas cepasfuncionalemte equivalentes do tipo resistente à tetraciclina desarmado, isto é, que compreende o plasmídeo pRi2659Δtet. - Cepa Agrobacterium K599 [pRi2659Δ]: SHA017 é uma cepa de Agrobacterium K599 desarmada que carece de sua região de T- DNA (obtida usando-se pRL278LF/RF, também conhecido como pBPSSH009b).

[00219] Os testes funcionais quanto à síndrome da raiz peluda em cotilédones de soja (ver abaixo, Exemplo 2) confirmou a perda do fenótipo da doença. Os experimentos de transformação vegetal em soja, milho, tomate e Arabidopsis foram realizados (ver abaixo) e as propriedades de infecção da planta confirmadas da cepa desarmada. Em todas as espécies de plantas, a expressão transitória de β-glucuronidase (GUS) foi detectada. Além disso, a expressão estável de GUS foi detectada em várias espécies vegetais incluindo tecidos de soja, milho e tomate. As plantas de Arabidopsis resistentes a Pursuit™ e glufosinato estáveis também foram recuperadas. O plasmídeo pSB1 super-virulento (Komari 1996) foi mobilizado no cepa de K599 desarmada e mostrou ser eficaz na transformação do milho.

Exemplo 2: Ensaios de raiz peluda

[00220] As sementes de soja (cultivar Williams 82) foram usadas para o seguinte ensaio.1. 6 dias após a inoculação, as sementes e soja são esterilizadas. As sementes sem ferimento/quebras na superfície são colcoadas em um béquer estéril. 30 sementes de cada cepa de Agrobacterium a serem estimadas são usadas e cobertas com etanol a 95% por um minuto. O etanol é removido e as sementes são tratadas com alvejante a 10% recentemente preparado com 0,0005% de TritonX-100 por 10 minutos. O alvejante é mudado a cada 3 minutos. Posteriormente, o alvejante e vertido e as sementes são lavadas em água estéril 4 vezes. 10 sementes de cada são colocadas em uma placa com 1% de ágar selada com Parafilm™ e colocada a 25° C, 16 hora/dia com iluminação (70 a 100 μE/m2s). Inoculação de Agrobacterium para o ensaio de raiz peluda:

[00221] Antes da inoculação, as sojas germinadas são colocadas em uma tampa laminar. Uma cultura de Agrobacterium fresca durante a noite é removida do agitador e o OD650 é determinado. Uma alíquota de 1 ml é colocada em uma tubo de microfuge estéril e as Agrobacteria são precipitadas a 12.000 rpm por 3 minutos. O sobrenadante é removido e as Agrobacteria são recolocaas em suspensão com meio de infecção (1 x sais MS, 3,6% de glicose, 6,9% de sacarose, 100 mg/l de mio-inositol, 1,5 mg/l de 2,4-D, 1 mg/l de cas aminoácidos, 1 mg/l de tiamina HCl, 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de piridoxina HCl).

[00222] O OD650 é ajustado a 1,0. As Agrobacteria são incubadas em meio de infecção por 1 hora antes da infecçãopara induzir a cascata de gene vir. Apenas os cotilédones verdes são cortados, as mudas e o lado são feridos com um bisturi. Os cotilédones são colocados em placas de ágar com o lado abaxial para cima. As superífices feridas de cada cotilédone ão inoculadas com 17 a 20 μl de Agrobacteria. As placas são seladas com Parafilm e colocadas a 25° C, 16 hora/dia de condição de iluminação (70-100 μE/m2s) para o co-cultivo. Três dias após a inoculação, os cotilédones são transferidos em meio de seleção (1 x sais MS, 1 x vitaminas Gamborgs B5, 3% de sacarose, 100 mg/l de carbinicilina, pH 6,2 com KOH). As placas seladas e colocadas de volta na mesma condição de cultivo. Após duas semanas, as raízes peludas podem ser detectadas e coletadas estando em dersenvolvimento na superfície do meio (para cepas indutoras de raiz peluda). As raízes coletadas são colocadas no meio de seleção. Após a adição de duas a três semanas, as linhas de raiz que estão em desenvolvimento no meio de seleção são sub-cultivadas em meios que não compreendem o agente de seleção. Estas devem ser sub-cultivadas a cada 4 semanas. As raízes devem ser cultivadas no escuro.

Exemplo 3: Desenvolvimento e preparação de Agrobacterium para a transformação vegetal

[00223] As culturas de Agrobacterium são preparadas pelo listagem das bactérias que carregam o vetor binário deesejado no meio de desenvolvimento sólido YEP e incubadas a 25° C até as colônias aparecerem (cerca de 2 dias). Dependendo dos genes marcadores selecionáeis presentes no plasmídeo Ri, o vetor binárioe os cromossomos bacterianos, agentes selecionáveis diferentes podem ser usados para a seleção de A. tumefaciens e rhizogenes no meio sólido e líquido YEP. Após aproximadamente dois dias, uam colônia simples é isolada (com um palito de dente estéril) e inoculada em 50 de YEP líquido com os antibióticos sob agitação (175 rpm, 25° C) até um OD650 entre 0,8 e 1,0 ser atingido (aproximadamente 2 dias). Os estoques de glicerol de trabalho (15%) para a transformação são preparados e armazenados como estoques de Agrobacterium de 1 ml em tubos de Eppendorf de 1,5 ml -70° C.

[00224] Meio de desenvolvimento YEP (meio de Agrobacterium): 10 g/l de Bacto-peptona, 5g/l de extrato de levedura, 5g/l de NaCl, 12 g/l de ágar (Difco), antibióticos apropriados; pH 7,0 o dia anterior à inoculação de explante, 200 ml de YEP são inoculados com 5 μL a 3 ml de estoque de trabalho de Agrobacterium em um frasco de Erlenmeyer de 500 ml. A agitação do frasco durante a noite a 25° C até o OD650 estar entre 0,8 e 1,0. Antes de preparar os explantes de soja, as Agrobacteria são peletizadas por centrifugação por 10 minutos em 5.500 x g a 20° C. O grânulo é recolocado em suspensão em meio de CCM líquido CCM à densidade desejada (OD650 0,5 a 0,8) e colocada em temperatura ambiente pelo menos 30 mintuos antes do uso.

[00225] O meio de CCM líquido (= meio de co-cultivo): 1/10 de sais de B5, 1/10 de estoque de ferro MS, 3% de sacarose, 20 mM de MES, 1 X vitaminas B5, 200 μM de acetosiringona, 0,7 μM de ácido giberélico, 7,5 μM de 6-benzil-aminopurina; pH 5,4.

Exemplo 4: Transformação Vegetal Example 4a: Transformação de soja Muda e preparação de Agrobacterium

[00226] As sementes de soja de vários cultívares são esterilizadas por 24 a 48 horas em um gás de cloro pela adição de 3,5 ml de HCl a 100 ml de alvejante (5,25% de hipoclorito de sódio) em um dessecador com uma tampa de ajuste firme. Após a esterilização, as sementes são removidas e aproximadamente 20 sementes são colocadas em meio de germinação [1 X sais de B5 maiores, 1 X sais de B5 menores, 1 X de ferro MSIII, 2% de sacarose, 1 X de vitaminas B5, de 0 a 5 μM de BAP, 0,8% de ágar purificado (Sigma); pH 5,8] em recipientes de PlantCon. As mudas são desenvolvidas na luz (150 μm2s) até os cotilédones ficarem verdes, o revestimento da semente foi dividido e a epicotila foi expandida a aproximadamente 0,5 cm de comprimento (aproximadamente 7 dias) para explantes de folha e de 1 a 4 cm para explantes de muda.

[00227] A cepa de Agrobacterium K599 (pRi2659Δtet) desarmanda ou cepa de A. tumefaciens AGL1 que carrega o vetor binário pBPSEW008 [p- NOS::c-bar::t-NOS p-PcUBI::c-gusINT::t-NOS] (SEQ ID N°: 15) ou pBPSMM192b [pAtAhas::c-csr1-2::t-AtAHAS t-NOS::c-gusINT::p-SUPER] (SEQ ID N°: 16) foi riscado no YEP sólido [10 g/l de Bacto-peptona (Difco; Becton, Dickinson, and Co., Cockeysville, MD, USA), 5 g/l de exterato de levedura (Difco), 5 g/l de NaCl, 50 mg/l de canamicina, 1,2% de ágar granulado (Difco) sólido apenas; pH 7,0] e incubado a 25° C por 2 dias. Uma colônia simples foi selecionada com um palito de dentes estéril e colocada em 50 ml de YEP líquido com os antibióticos e agitada (175 rpm) a 25° C por 16 horas. Após atingir um OD650 de 0,8 a 1,0, estoques de trabalho de glicerol a 15% foram feitos e armazenados a menos 80° C. Um dia antes da inoculação de explante, os estoques de trabalho (dependendo da concentrção do meio e do estoque de Agrobacterium, em qualquer lugar entre 5 μl e 50 μl) da cepa de Agrobacterium mais 50 mg/l de canamicina foram adicionados ao meio líquido YEP em um frasco de Erlenmeyer. Os frascos foram então agitados durante a noite a 25° C até o OD650 atingir 0,8. Antes da preparação dos explantes de soja, o Agrobacterium foi peletizado por centrifugação durante 10 minutos em 5.500 x g a 20° C e recolocado em suspensão em meio de co- cultivo líquido [1/10 X de sais maiores de B5, 1/10 X de sais menores de B5, 1/10 X de ferro MSIII, 1 X vitaminas B5, 3% de sacarose, 20 mM de MES, 200 μM de acetosiringona, 0,72 μM de GA3, 7,5 μM de BAP; pH 5,4] até a densidade desejada (por exemplo, OD650 0,5) e incubado em temperatura ambiente 30 minutos. Preparação e inoculação de explante

[00228] Explante de folha: o cotilédone e a epicotila foram removidos da hipocotila 2 mm abaixo do noco cotiledonar. Para expor a epicotila e as folhas não foliadas, os cotilédones foram separados um do outro e então a epicotila foi removida acima do nodo cotiledonar. As folhas primárias que consistiram da lâmina, o pecíolo e as estípulas, foram removidos do nodo primário cortando-se cuidadosamente na base das estípulas, tal que as meristemas axilares foram incluídas nos explantes. O explante foi ferido cortando-se a área entre as estípulas com um bisturi afiado de 3 a 5 vezes e todos os brotos pré-formados foram removidos.

[00229] Explante de muda: o explantes são preparados removendo-se a maioria das raízes na junção hipocotila/epicotila ou acima da hipocotila (se a hipocotila for mito longa), um cotilédone e qualquer tecido axilar desenvolvido neste nodo, a epicotila logo acima do nodo primário incluindo a ponta ápica e todas as folhas pré-formadas a parir do nodo primário. O nodo primário é então danificado por atacando-se a ponta da epicotila onde os meristemas axilares aem usando-se um bisturi afiado 5 a 10 vezes.

[00230] Após a preparação de explante, os explantes foram completamente imersos na suspensão de Agrobacteria por 30 minutos. Após a incubação, os explantes de folhas foram massados em papel de filtro estéril para remover o excesso de cultura de Agrobacterium e colcoado com o lado ferido em contato com um papel de filtro de 7 cm redondo sobrepondo o meio de cultivo sólido [1/10 X de sais maiores de B5, 1/10 X de sais menores de B5, 1/10 X de ferro MSIII, 1 X vitaminas B5, 3% de Sacarose, 20 mM de MES, 200 μM de AS, 0,72 μM de GA3, 7,5 μM de BAP, (0,825 a 8,25 mM de L-cisteína, Sigma, 0 a 1 mM de ditiotrietol, 0 a 1 mM de tiossulfato de sódio), 0,5% de Ágar purificado; pH 5,4]. Os explantes de muda foram transferidos na sobreposição de papel de filtro o meio de co-cultivo sem manchar. Este papel de filtro evita o superdesenvolvimento de Agrobacterium nos explantes de soja. Cinco placas foram enroladas com Parafilm “M” (American National Can, Chicago, Illinois, USA). Os explantes de folha foram incubados por 2 dias e os explantes de semente por 5 dias no escuro a 25°C. Seleção e Regeneração de Planta

[00231] Após a incubação, o excesso de Agrobacterium foi removido lavando-se os explantes em meio de indução de broto líquido [1 X sais maiores de B5, 1 X ais menores de B5, 1 X ferro MSIII, 1 X vitaminas B5, 3% de sacarose, 3 mM de MES, 1,0 uM (explante de muda) ou 2,5 μM de BAP (explante de folha), 5 μM de cinetina, 250 mg/l de ticarcilina; pH 5,6] e os explantes de folha secados enxugando-se com mata borrão em papel de filtro estéril para evitar o dano por água, especialmente na lâmina. A seguir, aproximadamente 10 explantes de folhas e 5 explantes de mudas foram transferidos em meio de indução de broto sólido [0,8% de ágar purificado (Sigma)] sem a seleção de glifosinato por 7 dias. Os explantes de folha foram colocados no meio, tal que as folhas caem perpendiculares à superfície do meio com o pecíolo embebido no meio e a lâmina fora do meio e os explantes de semente com a epicotila toda em contato com o meio. As placas foram enroladas com fita de perfurada Scotch 394 (3M, St. Paul, Minnesota, USA) e alocado em uma câmara de desenvolvimento com uma temperatura média de 25° C sob ciclo de 18 horas de luz/6 horas de escuro em 70 a 100 μE/m2s.

[00232] Após 7 dias, os explantes de folha foram transferidos ao meio de indução de broto com 3,0 mg/l de glifosinato e os explantes de semente ao meio de indução de broto com 5,0 mg/l de glifosinato. Ao mesmo tempo, foi considerado, de novo, o desenvolvimento na base do pecíolo em explantes de folhas e na ponta da epicotila no nodo primário em explantes de mudas. Após 2 semanas em meio de indução de broto com seleção, os explantes de folhas foram transferidos ao meio de alongamento de broto [1 X de sais maiores de MS, 1 X de sais menores de MS, 1 X de ferro MSIII, 1 X de vitaminas B5, 3% de sacarose, 3 mM de MES, 0,378 mM de L-asparagina, 0,775 mM de ácido L-piroglutâmico, 0,057 μM de IAA, 1,44 μM de GA3, 2,85 μM de ribossídeo de trans-zeatina, 250 mg/l de ticarcilina, 0,8% de ágar purificado (Sigma); pH 5,6] com 3 mg/l de seleção de glifosinato para o estímulo do alongamento de broto dos primórdio do broto. Para os explantes de semente, a almofada de broto é removida do explante da ponta da epicotila e transferida ao mesmo meio de alongamento de broto. Os explantes foram então transferidos em meio SEM fresco a cada 3 semanas até os explantes morrerem ou alongar brotos saudáveis. Durante a transferência, os brotos mortos foram removidos e a base do explante onde o tecido do calo se forma foi cortada para ajudar a facilitar a transferência de nutriente e de água aos brotos acima. os brotos alongados foram então transferidos ao meio e enraizamento (V X de sais B5, V X de estoque de ferro MS, 2% de sacarose, 3 mM de MES, 5 μM de ácido indol-butírico, 250 mg/l de Timentina, 0,8% de ágar nobre; pH 5,6) até as raízes de formarem. O broto enraizado foi então transferido ao solo (1:1 (p/p) solo Carolina:Metro mix) em uma câmara de desenvolvimento de 20 horas de luz até o trifoliado expandir. As plantas foram então desenvolvidas até a maturidade em uma estufa sob um regime de 16 horas de luz/8 horas de escuro.

Ensaios histoquímicos de GUS

[00233] Os explantes de folhas foram estimados quanto à atividade de GUS colocando-se em manchamento histoquímico de GUS [80 mM de Na2HPO4 (pH 8,0), 8 mM de Na2EDTA, 0,8% (v/v) Triton-X, 1,6% (v/v) de sulfóxido de dimetila, 20% (v/v) de metanol, 0,38 mM de K4Fe(CN)6, 1 mM de sal de X-glucuro CHA (Inalco, Milan, Itália)] por 1 dia a 37° C, após o que um tecido de folha foi lavado em etanol a 70% (v/v) e purificada em etanol a 95% (Jefferson 1987; Kosugi 1990).

Projeto experimental

[00234] Par ao experimento um, 40 explantes foram preparados para a inoculação com AGL1 ou SHA016 que carrega o pBPSMM192b binário (SEQ ID N°: 16) e estimado para a expressão de GUS transitórias após o cultivo de 5 dias. Em um segundo experimento com 3 repetições, a regeneração de broto foi testada em um total de 120 explantes inoculados com concentrações diferentes (OD650: 0, 0,125, 0,25, 0,5) de Agrobacterium AGL1 ou SHA016, ambos carregando pBPSEW008 (SEQ ID N°: 15). Em um terceiro experimento, 120 explantes foram preparados pela inoculação com SHA016 ou AGL1, ambos carregando pBPSEW008 (SEQ ID N°: 15), e uma sub-série foi manchada para a expressão de GUS estável 36 dias após o co- cultivo. As freqüências de transformação putativas foram determinadas em um quarto experimento estimando-se o manchamento histológico por GUS no alongamento de brotos a partir de explantes de mudas transformados com cepa de Agrobacterium SHA017 (pSB1) ou AGL1, ambos carregando pBPSE008 (SEQ ID N°: 15). Este experimento consistiu de 5 datas de inoculação diferentes.

[00235] Em um primeiro experimento, tanto o A. tumefaciens AGL1 quanto a cepa de Agrobacterium K599 (SHA016) desarmada foram bem sucedidas na transferência do T-DNA no pecíolo do explante de folha (Fig. 3). Quarenta e dois e meio por cento dos explantes infectados com AGL1 mostraram os focos de GUS+ nas áreas alvo, enquanto SHA016 mostrou os focos de GUS+ em 10% das áreas alvo (Tabela 1). A redução na expressão transitória de GUS naqueles explantes infectados com SHA016 foi, principalmente um resultado na morte de tecido durante o co-cultivo. Tabela 1. A capacidade das cepas de Agrobacterium AGL1 e SHA016 de infectar explantes de folha.

[00236] No segundo experimento, o potencial de regeneração de explantes inoculados com concentrações diferentes de K599 desarmado não difere significantemente um do outro neste estudo. Tabela 2. Regeneração potencial de explantes inoculados com concentrações diferentes de K599 desarmado

[00237] No terceiro experimento, todos os explantes que foram sacrificados ao manchamento histoquímico GUS depois de 35 dias pós- inoculação mostrou expressão de GUS estável nos explantes de folha (Fig. 4).

[00238] Um total de 900 mudas de explantes foi preparado no quarto experimento, das quais 288 foram inoculadas com AGL1 (pBPSEW008) e 612 foram inoculadas com SHA017 (pSB1, pBPSEW008) (Tabela 3). Neste estudo, um broto de GUS+ (0,35%) foi identificado a partir de explantes inoculados com AGL e 25 brotos de GUS+ independentes (4,1%) foram identificados a partir de explantes inoculados com SHA017. Destes, dez dos brotos do tratamento de SHA017 desenvolverem-se em plantas T0 maduras. A análise Southern das dez plantas T0 confirmou que cada planta foi um evento de transformação independente com base nos padrões de integração de T-DNA no genoma da planta. A herança do T-DNA nas progênies T1 de uma linhagem, 21-2, também foi confirmada pela hibridização de Southern do DNA genômico de planta para as sondas dos genes gus e bar (Fig. 15). Tabela 3. Produção de gus+ brotos alongados e plantas de muda de explantes inoculados com cepa de Agrobacterium AGL1 ou SHA017.

Exemplo 4b: Transformação de Arabidopsis thaliana

[00239] As plantas Arabidopsis thaliana (ecotipo Col-0) foram cultivadas em solo até florescer brotos primários que foram removidos para aumentar as flores em brotos secundários. As cepas de Agrobacterium MP90 (GV3101 (pMP90); Koncz e Schell 1986), SHA001 e K599 de tipo selvagem foram transformados com as construções de interesse pBPSEW008 (SEQ ID N°: 15) e pBPSMM192b (SEQ ID N°: 16) e cultivados em 250 ml em meio de LB líquido (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCl (EM Science)) até a cultura atingir um OD650 1.2. As células bacterianas foram colhidas por centrifugação (15 minutos, 4.000xg) e recolocadas em suspensão em solução de infiltração (5% de sacarose , 0,05% de SILWET L-77 [Lehle Seeds, Cat.N° VIS-02], 0,217% de Sais de MS [Sigma M5524]) a um OD650 de 0,8 - 0,9.

[00240] As plantas A. thaliana de floração foram então transformadas pelo método de imersão floral (Clough e Bent 1998) com a cepa transgênica de Agrobacterium carregando o vetor descrito acima mergulhando-se por 10 a 20 segundos na solução de Agrobacterium. Posteriormente as plantas foram mantidas na câmara de cultura até que as sementes possam ser colhidas. As sementes transgênicas foram selecionadas pelo revestimento de sementes esterilizadas de superfície em meio de cultura (4,4 g/L de sais de MS [Sigma- Aldrich], 1 g/L de MES [Duchefa], 20 g/L de sacarose, 6 g/L de Phytagar suplementado com 5 mg/L de glifosinato para plantas que carregam o marcador de resistência bar, 100 nM de Pursuit para plantas que compreendem um cassete de expressão para o gene AtAHAS, 50 mg/L de canamicina para plantas que carregam o marcador de resistência nptII ou, 0,3 a 30 mM de D-aminoácidos (como descrito abaixo) para plantas que compreendem um cassete de expressão para o gene dao1 de Rhodotorula gracilis. As plantas sobreviventes foram transferidas ao solo e cultivadas na estufa. Uma amostra das plantas sobreviventes foi manchada usando-se solução de ensaio de GUS (Jefferson 1987) (0,4M de NaH2PO4-H2O pH 7,0, 0,5M de EDTA, 0,01% de TritonX-100, 250 mg/L de X-glicuronidase (Fermentas)) durante a noite a 37° C e observada quanto a expressão de GUS (Fig. 10).

[00241] As linhagens que contém um local de inserção de T-DNA simples são selecionadas pela análise estatística de segregação de T-DNA na população de T2 que germinou no meio que compreende o agente de seleção apropriado. As plantas com um local único de T-DNA inserido são cultivadas e auto-fertilizadas. Os estoques de semente T3 homozigota são então identificados pela análise da segregação de T-DNA em progênies T3 e confirmados expressar o gene introduzido pelas análises northern blot.

Exemplo 4c: transformação mediada por Agrobacterium de Brassica napus

[00242] A cepa de Agrobacterium K599 desarmada (pRi2659Δ) transformada com o plasmídeo de interesse (tal como pBPSMM192b) é cultivada em 50 ml de meio de v (ver Exemplo 4a) a 28° C durante a noite. A solução Agrobacterium é misturada com meio de co-cultivo líquido (sais de MSB5 concentrados, duplos (Duchefa), 30 g/L de sacarose (Duchefa), 3,75 mg/LI de BAP (6-benzilamino purina, Duchefa), 0,5 g/L de MES (Duchefa), 0,5 mg/L de GA3 (Gibberellic Acid, Duchefa); pH 5,2) até que o OD650 de 0,5 foi conseguido. Pecíolos de mudas de 4 dias de idade de Brassica napus cv. Westar que se desenvolveram em meio de cultura B (sais de MSB5 (Duchefa), 3% de sacarose (Duchefa), 0,8% de oxoidagar (Oxoid GmbH); pH 5,8)) são cortadas. Os pecíolos são mergulhados por 2 a 3 segundos na solução e posteriormente Agrobacterium colocado em meio sólido para co-cultivo (o meio de co-cultivo suplementado com 1,6% de Oxoidagar). O co-cultivo durou 3 dias (a 24° C e cerca de 50 μMol/m2s de intensidade da luz). Posteriormente, os pecíolos são transferidos ao meio de co-cultivo suplementado com o agente de seleção apropriado (18 mg/L de canamicina (Duchefa) para plantas que compreendem a canamicina de marcador nptII para plantas que carregam o marcador de resistência nptII ou, de 0,3 a 30 mM de D-aminoácidos; como descrito abaixo) para plantas que compreende um cassete de expressão para o gene dao1 de Rhodotorula gracilis) e 300 mg/L de Timentina (Duchefa).

[00243] Os pecíolos transformados são incubados no meio de seleção por quatro semanas a 24° C. Esta etapa é repetida até que os brotos apareçam. Os brotos são transferidos ao meio A6 (sais de MS (Sigma Aldrich), 20 g/L de sacarose, 100 mg/L de mio-inositol (Duchefa), 40 mg/L de sulfato de adenina (Sigma Aldrich), 500 mg/L de MES, 0,0025 mg/L de BAP (Sigma), 5 g/l de oxoidagar (Oxoid GmbH), 150 mg/L de timetina (Duchefa), 0,1 mg/l de IBA (ácido indol butírico, Duchefa); pH 5,8) suplementado com o agente de seleção apropriado (18 mg/L de canamicina (Duchefa) para plantas que compreendem a canamicina de marcador nptII para plantas que carregam o marcador de resistência nptII ou, 0,3 a 30 mM de D-aminoácidos; como descrito abaixo) até que estes sejam alongados. Os brotos alongados são cultivados em meio A7 (meio A6 sem BAP) para enraizamento. As plantas enraizadas são transferidas ao solo e cultivadas na estufa.

Exemplo 4d: Transformação mediada por Agrobacterium de tomate Germinação de semente in vitro

[00244] As sementes de tomate são esterilizadas em 10% de CloroxTM (5,25% de hipoclorito de sódio) contendo 0,1% de Tween 20 por 15 com turbilhonamento. As sementes esterilizadas são enxaguadas 4 a 5 vezes com água destilada estéril. Depois da esterilização, as sementes são transferidas ao meio de germinação [0,25X MS, 7,5 g/L de Sacarose , Ágar Purificado a 7% (Sigma), pH 5,8] em placas de Petri 25 x 100 mm. O placa de Petri, contendo sementes, é colocado no escuro por 2 a 3 dias para obter germinação uniforme e transferido à ambiente de cultura sob luz na ambiente de cultura (25° C, fotoperíodo de 16/8 horas, intensidade da luz de 70 μE/m2s). As mudas de cotiledônias de aproximadamente 8 dias de idade são usadas para transformação mediada por Agrobacterium. Preparação de Agrobacterium

[00245] A cepa desarmada de Agrobacterium K599 (SHA001) que carrega o vetor binário pBPSEW008 [p-NOS::c-bar::t-NOS p-PcUBI::c- gusINT::t-NOS] (SEQ ID N°: 15) ou pBPSMM192b [p-AtAhas::c-csr1-2::t- AtAHASpA t-NOS::c-gusINT::p-SUPER] (SEQ ID N°: 16) foi estriada no YEP sólido [10 g/L de Bacto-peptona (Difco; Becton, Dickinson, e Co., Cockeysville, MD, USA), 5 g/L de extrato de levedura (Difco), 5 g/L de NaCl, 50 mg/L de canamicina, 1,2% de ágar granulado (Difco) apenas sólido; pH 7,0] e incubada a 25° C por 2 dias. Uma colônia simples foi selecionada com um palito de dente estéril e colocada em 50 ml de YEP líquido com antibióticos e agitada (175 rpm) a 25° C por 16 h. Depois de alcançar um OD650 de 0,8 a 1,0, 15% de estoques de trabalho de glicerol foram fabricados e armazenados em menos de 80° C. Um dia antes da inoculação de explante, estoques de trabalho (dependem do desenvolvimento e concentração de estoque Agrobacterium, em qualquer lugar entre 5 μL a 50 μL) de Agrobacterium mais 50 mg/L de canamicina foram adicionados ao meio líquido YEP em um frasco de Erlenmeyer. Os frascos foram agitados durante a noite a 25° C até que o OD650 atingiu 0,8. Antes de preparar os explantes de tomate, o Agrobacterium foi peletizado pela centrifugação por 10 minutos a 5.500 xg a 20° C e recolocado em suspensão em meio de co-cultivo líquido [1/10X de sais principais B5, 1/10X de sais secundários B5, 1/10X de ferro MSIII, 1X vitaminas B5, 3% de sacarose, 20 mM de MES, 200 μM de acetosiringona, 0,72 μM de GA3, 7,5 μM de BAP; pH 5,4] para a densidade desejada (por exemplo, OD650 0,5) e incubado em temperatura ambiente por 30 minutos. Preparação de explante

[00246] As cotiledônias são removidas de mudas de aproximadamente 8 dias de idade e colocadas em placa de Petri estéril. Ambas as extremidades das cotiledônias são removidas e cortadas transversalmente na metade, transferidas em papel de filtro estéril abaixo do lado abaxial e colocadas no meio pré-cultivado [sais de MS e vitaminas, 16 g/L de glicose, 0,1 mg/L de NAA, 1 mg/L de BAP, 0,7% de ágar purificado, pH 5,8] por dois dias no escuro a 22° C. Co-cultivo

[00247] O papel de filtro com os explantes são colocados no meio de co- cultivo [sais de MS e vitaminas, 16 g/L de glicose, 0,1 mg/L de NAA, 1 mg/L de BAP, 0,7% de ágar purificado, 150 μM acetosiringona, pH 5,8] e inoculados com suspensão de Agrobacterium (0,3 - 0,5 em OD650) por dois ou três dias no escuro a 22° C.

Seleção e Regeneração de Planta

[00248] No fim do terceiro dia, os explantes são colocados abaixo do lado abaxial no meio de recuperação (1X sais de MS e vitaminas, 16 g/L de glicose, 2 mg/L de zeatina, 0,7% de ágar purificado, 200 mg/L de timentina) por uma semana a 25° C na ambiente de cultura (70 μE/m2s). Depois da recuperação, os explantes são transferidos ao meio de seleção/regeneração (1X sais de MS e vitaminas, 30 g/L de sacarose, 2 mg/L de zeatina, 0,7% de ágar purificado, 200 mg/L de timentina, 50 - 100 nM de Pursuit, pH 5,8) por 2,5 semanas. Os botões de broto nos calos são excisados a partir das cotiledônias e transferidos no meio de alongamento (1X sais de MS e vitaminas, 20 g/L de sacarose, 0,5 mg/L de zeatina ou 0,25 mg/L de IBA, 0,7% de ágar purificado, 200 mg/L de timentina e 50 -100 nM de Pursuit) por 2 a 3 semanas. O alongamento dos brotos é excisado a partir dos calos e colocados no meio de enraizamento (1X sais de MS e vitaminas, 20 g/L de sacarose, 0,25 mg/L de IBA, 0,7% de ágar purificado, 100 mg/L de timentina, 50 nM de Pursuit, pH 5,8) por 2 - 3 semanas até que as mudas estejam prontas para transplantação no solo.

Ensaios histoquímicos de GUS

[00249] Os explantes de folha foram avaliados quanto a atividade de GUS colocando-os em tintura histoquímica de GUS [80 mM de Na2HPO4 (pH 8,0), 8 mM de Na2EDTA, 0,8% (v/v) de Triton-X, 1,6% (v/v) de sulfóxido de dimetila, 20% (v/v) de metanol, 0,38 mM de K4Fe(CN)6, 1 mM de sal de X- glucuro CHA (Inalco, Milão, Itália)] por 1 dia a 37° C, depois que o tecido da folha foi lavado em 70% (v/v) de etanol e clareado em 95% de etanol (Jefferson et al. 1987, Kosugi et al. 1990).

[00250] As mudas de tomate transgênico foram obtidas usando-se cepa desarmada de Agrobacterium K599 (SHA001) contendo pBPSMM192b (SEQ ID N°: 16) (ver Fig. 5). Exemplo 4e: Transformação mediada por Agrobacterium de Zea mays

[00251] As mudas de certas linhagens naturais de milho ou linhagens híbridas de milho são germinadas, enraizadas e, ainda cultivadas em estufas. As espigas dos milhos são coletadas de 8 a 14 (média 10) dias depois da polinização (DAP) e os embriões imaturos são isolados destas. A temporização de colheita varia dependendo das condições de cultivo e variedade de milho. O comprimento ótimo de embriões imaturos para transformação é de cerca de 1 a 1,5 mm, incluindo o comprimento do escutelo. O embrião deve ser translúcido, não opaco. Os embriões excisados são coletados em meio líquido com base em MS (que compreende 1,5 mg/L de 2,4-D). Acetosiringona (50 a 100 μM) é adicionado ao meio ao mesmo tempo conforme inoculação com Agrobacterium ou logo antes do uso para infecção com Agrobacterium.

[00252] Preparação de Agrobacterium: cepa de Agrobacterium SHA017 (K599 [pRi2659Δ]) transformada com o plasmídeo de interesse (pSB1/ pBPSMM232; este plasmídeo é um plasmídeo quimérico que resulta da fusão de pBPSMM232 (SEQ ID N°: 17 [p-ZmUbi1::c-ZmAHASL/Xi12::t- ZmAHAS t-NOS::c-gusINT::p-ZmUbi1]) com pSB1 (Komari 1996) é cultivado em meio YEP. A suspensão de Agrobacterium é submetida ao turbilhonamento no meio indicado acima (que compreende 100 μM de meios de acetoseringona por preferivelmente 1 - 2 horas antes da infecção).

[00253] Inoculação/Co-cultivo: A suspensão bacteriana é adicionada ao microtubo (placa) contendo embriões imaturos pré-embebidos e deixados em temperatura ambiente (20 - 25o C) por 5 a 30 minutos. A suspensão bacteriana em excesso é removida e os embriões imaturos e as bactérias no meio residual são transferidos à placa de Petri. Os embriões imaturos são colocados no meio de co-cultivo com o lado achatado para baixo (escutelo superior). A placa é selada e, incubada no escuro a 22o C por 2 - 3 dias. (Meio de co-cultivo: base de MS, 1,5 mg/l de 2,4-D, 15 μM de AgNO3, 100 μM de acetoseringona). Alternativamente, os embriões imaturos excisados são diretamente colocados no meio de co-cultivo com o lado achatado para baixo (escutelo superior). A suspensão de célula de Agrobacterium diluída é adicionada a cada embrião imaturo. A placa é selada e, incubada no escuro a 22oC por 2 - 3 dias.

[00254] Recuperação: Depois do co-cultivo, os embriões são transferidos ao meio de recuperação (base de MS que compreende 1,5 mg/L de 2,4-D, 150 mg/L de Timentina) e, incubam as placas no escuro a 27o C por cerca de 5 a 7 dias do lado de cima do escutelo.

[00255] Seleção de calos transformados: os embriões imaturos são transferidos ao meio de seleção (meio de recuperação ainda compreendendo o agente seletivo, por exemplo, D-alanina em concentração de 0,3 a 30 mM) (escutelo acima) e incubados no escuro a 27o C por 10 - 14 dias (Primeira seleção). Todos os embriões imaturos que produzem calos variáveis são subcultivados no 2° - 3° meio de seleção. Neste estágio, qualquer raiz que for formada será removida. A incubação ocorre por 2 semanas sob as mesmas condições para a primeira seleção (Segunda seleção). Os calos regenerável é excisado a partir do escutelo (os calos regeneráveis são de cor esbranquiçada, compactos, não viscosos e podem ter algumas estruturas semelhantes ao embrião) e transferidas ao 2° - 3° meio de seleção, frescos. As placas são cobertas e incubadas no escuro a 27o C por 2 semanas (3a seleção pode não ser necessária para a maioria dos genótipos, os calos regeneráveis podem ser transferidos ao meio de Regeneração).

[00256] Regeneração de plantas transformadas: calos proliferados (esbranquiçados com formação de estruturas embriônicas) são excisados da mesma maneira como para 2a/3a seleção e transferidos ao meio de regeneração (semelhante ao meio de seleção mas sem 2,4-D). As placas são cobertas e colocadas na luz (ca. 2.000 lux) a 25 ou 27o C por 2 semanas ou, até que as estruturas semelhantes a broto sejam visíveis. Transferência aos meios de regeneração frescos se necessário. Seções de calos com brotos regenerados ou estruturas semelhantes a broto são transferidas a um Phytatray contendo meio de enraizamento e incubam por 2 semanas sob a mesma condição como na etapa acima ou, até que as mudas enraizadas tenham se desenvolvido. Depois de 2 a 4 semanas nos meios de enraizamento (meio de MM concentrado pela metade, nenhum 2,4-D, nenhum agente seletivo), calos que ainda tem regiões verdes (mas que não tem nenhuma muda regenerada) são transferido ao Phytatrays de enraizamento fresco. As mudas enraizadas são transferidas ao solo Metromix na estufa e cobertas, cada uma, com domo plástico por pelo menos 1 semana, até que as mudas tenham estabilizado. Quando as plantas alcançam os estágios de folha 3 - 4, estas são fertilizadas com Osmocote e depois pulverizadas com agente seletivo (por exemplo, D-alanina ou D- serina) e, cultivadas na estufa por outras duas semanas. As plantas não transgênicas devem desenvolver sintomas herbicidas ou morrem neste tempo. As plantas que sobreviveram são transplantadas em vasos de 10” com MetroMix e 1 colher de chá de Osmocote.

Exemplo 5: Purificação, seqüenciamento e anotação de plasmídeo pRi2569Δ

[00257] A cepa de Agrobacterium SHA017 (Agrobacterium K599 desarmada [pRi2659Δ]) foi cultivada em 5 litros de caldo de LB a 28° C durante a noite. O DNA total foi extraído de acordo com um protocolo de lise alcalina padrão seguido pela extração de fenol-clorofórmio (Sambrook et al. 1989). O DNA do plasmídeo pRi2659Δ foi isolado do DNA total usando-se eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), com um sistema CHEF-DRIII (Bio-Rad Cat.#: 170-3695). O DNA total foi carregado em um agarose certificado de campo pulsado a 1% (Bio-Rad Cat #: 162-0137) gel em 0,5 x tampão de TBE (45 mM de Tris-borato, 1 mM de EDTA) seguido por PFGE a 6 V/cm, com tempo de comutação inicial de 1 segundo e tempo de comutação final de 25 segundos a 14° C por 24 horas. Depois da eletroforese, as tiras de gel contendo a faixa do marcador molecular e a borda de faixa da amostra de ambos os lados do gel, foram excisadas, manchadas com brometo de etídio (Sigma) e submetido à formação de imagem. Uma faixa visível foi dissolvida nas tiras de gel e o restante do DNA permaneceu no reservatório. A faixa simples foi excisada e recuperada usando-se eletroelução de acordo com Fu e Dooner (2000).

[00258] O DNA recuperado foi usado como um padrão para a amplificação de PCR com iniciadores específicos de pRi para confirmar a recuperação de DNA pRi. Os iniciadores foram designados dentro de regiões de gene vir conservadas de pRi1724 (Acesso ao GenBank # AP002086). iniciador avançado virG: 5’-TACTTCCTCC TCACGCACTC-3’ (SEQ ID NO 27) iniciador reverso virB: 5’-GCCAGCAATG ATCAAGAATT TGTTT-3’ (SEQ ID NO 28)

[00259] Os fragmentos de pRi podem ser gerados por intermédio de métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica, tal como clonagem forçada. A preparação de plasmídeo Ri pode ser individualmente digerida com várias enzimas de restrição comercialmente disponíveis, tais como BamHI, SphI, EcoRI, HindIII (todas disponíveis pela New England Biolabs, Beverly, MA) e, sub-clonadas em um vetor do tipo pUC similarmente digerido, tal como pBlueScript (Stratagene, La Jolla, CA). Depois, os clones individuais podem ser seqüenciados e as seqüências individuais reunidas em contagens para gerar o mapa da seqüência total como descrito abaixo.

[00260] O pRi2659Δ purificado foi seqüenciado de acordo com Margulies et al. (2005) e Sanger (1977). A seqüência de vetor foi mascarada usando-se comparação cruzada (Green © 1994-1999) e os dados de seqüência brutos limpos foram reunidos de acordo com Margulies et al. (2005) e CAP3 (Huang e Madan 1999). A abertura da seqüência remanescente foi preenchida pela amplificação de PCR e subseqüente seqüenciamento usando-se os seguintes iniciadores: iniciador avançado PCR G109: 5’-TTGGTGCGAC AACTCCTCGG CG-3’ (SEQ ID NO 29) iniciador reverso PCR G112: 5’-GGTGAGCTCG ATCAGCTTCG GC- 3’ (SEQ ID NO 30)

[00261] As reações de seqüenciamento foram realizadas em produtos de PCR de acordo com Sanger (1977). Para um polimento final, a seqüência escolhida foi dividida em 100 fragmentos com cada fragmento tendo uma sobreposição de 50 bases estendidas ao seu fragmento de conjunção; as leituras da seqüência bruta altamente idênticas para cada fragmento foram misturadas e reunidas com CAP3 em um rigor alto. Estas seqüências de consenso reunidas a partir de cada fragmento foram reunidas com CAP3 novamente para gerar os mapas da seqüência de pRi2659Δ (SEQ ID N°: 24), pRi2659Δtet (SEQ ID N°: 25), e pRi2659 (SEQ ID N°: 26) no Vetor NTI (Invitrogen, Carlsbad CA). A nova seqüências de pRi2659 foi anotada usando-se BLASTx a e-10 (Altschul et al. 1997) e GenBank Genpept protein data release versão148. Exemplo 6: Proteínas codificadas por pRi2659Δ

[00262] A seguinte tabela (Tabela 4) lista as proteínas provavelmente codificada pelas estruturas de leitura aberta no plasmídeo pRi2659Δ (SEQ ID N°: 24). As proteínas SEQ ID NO são listadas (SINo) e uma descrição detalhada do aminoácido codificado. Tabela 4: estruturas de leitura aberta pRi2659 Δ e sua proteína SEQ ID N° (SINo)

REFERÊNCIAS

[00263] As referências listadas abaixo e todas as referências citadas enste são incorporadas neste por referência até o ponto que estes complementam, explicam, fornecem uma base para ou ensimam metodologia, técnicas e/ou composições utilizadas neste. 1. Abler et al. (1993) Plant Mol Biol 22:1031-1038. 2. Atanassova et al. (1992) Plant J 2(3): 291-300. 3. Altschul et al. (1997) Nucl. Acids Res. 1997 25: 3389-3402. 4. Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience 5. Baerson and Lamppa (1993) Plant Mol Biol 22(2):255-67 6. Baker et al. (1987) EMBO J 6: 1547-1554 7. Baumlein et al. (1992) Plant J 2(2):233-239; 8. Baumlein et al. (1991a) Mol Gen Genet 225(3):459-467 9. Baumlein et al. (1991b) Mol Gen Genet 225:121-128 10. Belarmino et al. (2000) Plant Cell. Rep. 19:435-442. 11. Benfey et al. (1989) EMBO J. 8:2195-2202 12. 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Claims (17)

1. Método para produzir uma célula vegetal transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) fornecer bactéria de uma variante de cepa não patogênica transgênica de cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659) que compreende um genoma compreendendo uma sequência intergênica 16S-23S rRNA compreendendo pelo menos uma sequência motivo selecionado do grupo que consiste de SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 e 14, em que a dita variante de cepa é capaz de infectar as células vegetais, de mediar a transferência de T-DNA para dentro das células vegetais, e de mediar a inserção de T-DNA em um genoma vegetal, mas é desprovida de propriedades indutoras de fenótipo de raiz peluda, e em que a dita variante de cepa ainda compreende um T-DNA transgênico e uma variante de plasmídeo não patogênica do plasmídeo Ri pRi2659, b) co-cultivar uma célula vegetal com as ditas bactérias e c) isolar ou selecionar as células vegetais que compreendem estavelmente integrado em seu genoma o dito T-DNA transgênico, em que a variante de plasmídeo não patogênica compreende pelo menos uma sequência tendo a SEQ ID NO: 24.

2. Método para produzir uma planta transgência, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) fornecer bactérias de uma variante de cepa transgênica não patogênica de Agrobacterium cepa K599 depositada sob o número de acesso NCPPB 2659 que compreende um genoma compreendendo uma sequência intergênica de rRNA 16S-23S compreendendo pelo menos um dos seguintes motivos de sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14, em que a referida variante da cepa é capaz de infectar células vegetais, de mediar a transferência de T-DNA para células vegetais e de mediar T-DNA inserção no genoma da planta, mas sem propriedades de indução de fenótipo de raiz peluda, e em que a referida variante de cepa compreende ainda um T-DNA transgênico e uma variante de plasmídeo não patogênico do plasmídeo Ri pRi2659, b) co-cultivar uma planta, célula vegetal ou tecido vegetal com a referida bactéria, e c) isolar ou selecionar e - opcionalmente - regenerar plantas compreendendo estavelmente integrado em seu genoma o referido T-DNA transgênico, em que a variante de plasmídeo não patogênica compreende pelo menos uma sequência tendo a SEQ ID NO: 24.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que dita célula vegetal é de uma planta monocotiledônea, planta dicotiledônea ou planta gimnosperma.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a dita planta é de um gênero selecionado do grupo que consiste de Medicago, Lycopersicon, Brassica, Cucumis, Solanum, Juglans, Gossypium, Malus, Vitis, Antirrhinum, Populus, Fragaria, Arabidopsis, Picea, Capsicum, Chenopodium, Dendranthema, Pharbitis, Pinus, Pisum, Oryza, Zea, Triticum, Triticale, Secale, Lolium, Hordeum, Glycine, Pseudotsuga, Kalanchoe, Beta, Helianthus e Nicotiana.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito T-DNA transgênico compreende pelo menos um gene marcador selecionável expressável em planta.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a dita variante não patogênica compreende: a) uma sequência compreendendo a sequência descrita por SEQ ID NO: 24, ou b) uma sequência compreendendo a sequência descrita por SEQ ID NO: 24, e compreendendo a sequência de nucleotídeos que codifica para a sequência de aminoácidos descrita por SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 30 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186 ou 187.

7. Variante de plasmídeo não patogênica que fornece funções necessárias para infecção e transformação de células vegetais, mas sem uma sequência de T-DNA causando o fenótipo de raiz peluda, caracterizado pelo fato de que a variante de plasmídeo compreende: a) sequência compreendendo a sequência descrita por SEQ ID NO: 24, b) sequência compreendendo a sequência descrita por SEQ ID NO: 24, e compreendendo a sequência de nucleotídeos que codifica para a sequência de aminoácidos descrita por SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 10 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 , 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 , 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 , 103, 104, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 139, 140 , 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 154, 155, 156, 158, 159, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169 , 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186 ou 187.

8. Variante de plasmídeo não patogênica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a variante de plasmídeo codifica ainda uma proteína virD2 possuindo uma sequência de aminoácidos descrita pela SEQ ID NO: 112.

9. Variante de plasmídeo não patogênica de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que a referida variante de plasmídeo compreende as sequências necessárias para infecção de células vegetais e transformação de pRi2659 patogênico nativo, mas não possui sequências do T-DNA que medeia o fenótipo de raiz peluda.

10. Variante de plasmídeo não patogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que a sequência de T-DNA ausente que medeia o fenótipo da raiz cabeluda corresponde a toda a sequência de T-DNA incluindo as bordas de pRi2659 patogênico.

11. Variante de plasmídeo não patogênico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizada pelo fato de que a sequência de T-DNA ausente que medeia o fenótipo de raiz peluda corresponde à sequência descrita pela sequência da base 538 à base 15519 da SEQ ID NO: 4 ou da base 3644 à base 18577 da SEQ ID NO: 26.

12. Variante de plasmídeo não patogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizada pelo fato de que a referida variante de plasmídeo hibridiza sob condições de alta estringência equivalente à ligação ou hibridização a 68°C em uma solução que consiste em 5x SSPE, 1% SDS, 5x de reagente de Denhardt e 100 μg/mL de DNA de espermatozóide desnaturado de salmão seguido por lavagem em uma solução compreendendo 0,1x SSPE e 0,1% de SDS a 68°C com todo o plasmídeo Ri patogênico nativo pRi2659 da cepa de Agrobacterium K599 patogênica depositada sob Acesso- Número NCPPB 2659, mas não hibridiza sob as referidas condições de alta estringência com a sequência da base 538 à base 15519 da sequência caracterizada pela SEQ ID NO: 4 ou da base 3644 à base 18577 da sequência caracterizada 10 pela SEQ ID NO: 26

13. Variante de plasmídeo não patogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizada pelo fato de que a variante de plasmídeo é um plasmídeo capaz de mediar a transferência de T- DNA de uma bactéria transmitida pelo solo para uma célula vegetal e em que a variante de plasmídeo compreende ainda: a) o DNA que codifica o plasmídeo pRi2659 nativo como compreendido na cepa de Agrobacterium K599 depositada sob o número de acesso NCPPB2659, ou b) hibridização sob condições de alta estringência equivalente a ligação ou hibridização em 68°C em uma solução que consiste em 5x SSPE, 1% de SDS, 5x de reagente de Denhardt e 100 μg/mL de DNA de esperma desnaturado de salmão seguido de lavagem em uma solução compreendendo 0,1x SSPE e 0,1% de SDS a 68°C com o plasmídeo pRi2659 nativo.

14. Variante não patogênica de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a variante de plasmídeo é um plasmídeo capaz de mediar a transferência de T-DNA de uma bactéria transmitida pelo solo para uma célula vegetal e em que a variante de plasmídeo é ainda por: a) o DNA que codifica o plasmídeo pRi2659 nativo como compreendido na cepa de Agrobacterium K599 depositada sob o número de acesso NCPPB2659, ou b) hibridização sob condições de alto rigor equivalente à ligação ou hibridização a 68°C em uma solução que consiste em 5x SSPE, 1% SDS, 5x 30 reagente de Denhardt e 100 μg/mL de DNA de espermatozóide de salmão desnaturado seguido por lavagem em uma solução compreendendo 0,1x SSPE e SDS a 0,1% a 68°C com o plasmídeo pRi2659 nativo, mas não hibridiza nas referidas condições de alta estringência com a sequência da base 538 à base 15519 da sequência caracterizada pela SEQ ID NO: 4 ou da base 3644 à base 18577 da sequência caracterizada pela SEQ ID NO: 26.

15. Variante de cepa não patogênica da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659), caracterizada pelo fato de que compreende um genoma compreendendo uma sequência intergênica de 16S-23S rRNA compreendendo pelo menos um dos seguintes motivos de sequência como definidos nas SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 e 14, e em que a referida variante de cepa é capaz de infectar células vegetais, de mediar a transferência de T-DNA para dentro de células vegetais, e de mediar a inserção de T-DNA no genoma vegetal, mas sem propriedades de indução de fenótipo de raiz peluda, e em que a referida variante de cepa compreende a variante de plasmídeo não patogênica conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 14.

16. Variante de cepa não patogênica transgênica da cepa de Agrobacterium K599 (NCPPB 2659), caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência intergênica de 16S-23S rRNA compreendendo pelo menos um motivo de seqüência selecionado do grupo que consiste da SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 e 14, e em que a referida variante de cepa é capaz de infectar células vegetais, de mediar a transferência de T-DNA para dentro de células vegetais, e de mediar a inserção de T-DNA no genoma vegetal, mas é desprovida do fenótipo de raiz peluda que induz propriedades, em que a dita variante de cepa ainda compreende um T-DNA transgênico e em que a referida variante de cepa compreende a variante de plasmídeo não patogênica conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 14.

17. Variante de cepa não patogênica de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma ou mais características que consistem na presença de genes virA ou virG mutantes ou quiméricos ou a presença de plasmídeos supervirulentos.

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