CN103898129B - 控制植物分枝的K599-orf3基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从发根农杆菌K599中获得控制植物分枝的K599-orf3基因，及其在控制农作物或观赏植物分枝中的应用。所述K599-orf3基因核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示，该基因开放阅读框全长1479bp，编码492个氨基酸（SEQ？ID？No.2）。构建含该基因的植物转基因表达载体，并通过转基因技术将该基因转入植物细胞并表达，能有效增加植物的分枝；因此，将该基因转入农作物和园艺植物中，能分别提高其生物学产量和观赏价值，具有很好的应用潜力。

Description

控制植物分枝的K599-orf3基因及其应用

（一）技术领域

本发明涉及从发根农杆菌K599中获得控制植物分枝的K599-orf3基因及其应用。

（二）背景技术

植物的分枝是植物的重要的形态特征。植物分枝与其适应环境、生存竞争能力及产量形成密切相关，也决定着植物的株型（陈彩艳，邹军煌，张淑英，朱立煌.独脚金内酯能抑制植物的分枝并介导植物与纵枝真菌及寄生植物间的相互作用.中国科学C辑:生命科学，2009，39:525-533。WangYH，LiJY.Branchinginrice.CurrOpinPlantBiol，2011，14:94-99）。

（三）发明内容

本发明目的是提供从发根农杆菌K599中获得控制植物分枝的K599-orf3基因，及其在控制农作物或观赏植物分枝中的应用。

本发明采用的技术方案是：

控制植物分枝的K599-orf3基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。该基因开放阅读框全长1479bp，编码492个氨基酸（SEQIDNo.2）。

本发明还涉及所述的基因在控制农作物或园艺植物分枝中的应用。

具体的所述应用为：构建含有所述K599-orf3基因的表达载体，以农杆菌介导法将其导入农作物或园艺植物中，获得分枝增加的转基因农作物或园艺植物。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了从发根农杆菌K599中获得控制植物分枝的K599-orf3基因，构建含该基因的植物转基因表达载体，并通过转基因技术将该基因转入植物细胞并表达，能有效增加植物的分枝；因此，将该基因转入农作物和园艺植物中，能分别提高其生物学产量和观赏价值，具有很好的应用潜力。

（四）附图说明

图1为扩增orf3的PCR产物电泳图。M：DS^TM2000marker；1：利用引物orf3A-P1、orf3A-P2扩增的PCR产物。

图2为重组质粒用BamHⅠ和SmaⅠ酶切结果。M：DS^TM2000marker；1-5：重组质粒被BamHⅠ和SmaⅠ酶切。

图3为植物转基因表达载体pRI101-AN-orf3的构建示意图。

图4为植物转基因表达载体pRI101-AN-orf3酶切鉴定。M：标准DNA分子量，1：pRI101-AN，2：pMD19-orf3，3：pRI101-AN-orf3。

图5为转K599-orf3基因烟草植株再生过程。A：叶片切块；B：再生芽；C：再生植株；D移栽到盆钵中成活的小苗植株；E：正常开花的植株。

图6为利用orf3基因引物对烟草再生植株进行普通PCR扩增的结果。M：DS^TM2000DNAmarker；1：质粒pRI101-AN-orf3；2：非转基因烟草；3-17：orf3基因烟草再生植株。

图7为RT-PCR鉴定结果，其中A为actin扩增出的条带约为600bp，B为orf3基因扩增出的条带约为1479bp。M：DS^TM2000marker；1：非转基因烟草；2-6：转基因烟草。

图8为转K599-orf8基因烟草和非转基因烟草的比较。左侧：非转基因；右侧：转基因。

图9为转K599-orf3基因拟南芥的筛选过程。A：拟南芥幼苗的纯性培养；B：拟南芥转基因种子萌发幼苗的筛选（绝大多数幼苗被抗生素杀死，子叶变黄发白；部分转基因幼苗的子叶保持绿色，继续生长）；C：拟南芥转化阳性植株的后代在抗生素培养基上的筛选，幼苗出现遗传分离比（绿苗：黄白苗=3:1）。

图10为转K599-orf3基因的拟南芥植株形态特征。A：非转基因；B：转基因；C：左侧为非转基因，右侧为转基因。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

一、orf3基因的克隆

1、实验材料

黄瓜碱型发根农杆菌K599由本实验室保存（theNationalCollectionofPlantPathogenicBacteriainUK购买获取）。

2、发根农杆菌K599所含质粒pRi2659的提取

利用Sangon公司质粒小量快速抽提试剂盒提取。具体步骤如下：(1)在28℃，200r/min，含有km（50mg/L）和str（50mg/L）LB液体培养基中过夜培养野生型发根农杆菌K599。(2)取1.5-4.5ml菌液，9,000r/min离心30秒，尽可能倒干上清液，收集菌体。(3)用250微升溶液S1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。(4)加250微升溶液S2，温和地上下翻转4-7次，使菌体充分裂解，室温放置4分钟。(5)加350微升溶液S3，立即温和地上下翻转4-7次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀。冰上静置3-5分钟，13,000r/min离心10分钟，小心取上清。(6)将上一步所得上清加入吸附柱中（吸附住放入收集管中）,13,000r/min离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。（7）加入500微升去蛋白液PE，13,000r/min离心30-60秒，弃废液。（8）加入700微升漂洗液PW（已加入无水乙醇），12,000r/min离心30秒，弃废液。（9）加入500微升漂洗液PW（已加入无水乙醇），12,000r/min离心30秒，弃废液。（10）将吸附住放回空收集管中，13,000r/min离心2分钟，尽量除去漂洗液。（11）取出吸附住，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50微升ddH2O，室温放置2分钟，12,000r/min离心1分钟，即得到质粒，放于-20℃冰箱备用。

3、PCR扩增

根据异黄瓜碱型发根农杆菌Ri质粒pRi1724（GenBank登陆号NC_002575）以及农杆碱型发根农杆菌Ri质粒pRiA4（GenBank登陆号K03313），通过blast比较，根据保守序列设计引物。引物由上海Sangon公司合成。并且在引物上加上限制性核酸内切酶SmaI（上游）和BamHI（下游）的位点序列。引物序列如下：orf3A-P1:5’-GACCCGGGACAATGTTTGCGTGCAAGG-3’，orf3A-P2:5’-GCGGATCCTGCTTCTGTTTTGTATCGTGCT-3’。

PCR扩增反应体系见下表1。用美国ABI公司PE9700型DNA扩增仪进行扩增。PCR反应程序如下：94℃5min使模板充分变性，然后进入扩增循环，每次循环包括：94℃45s保持模板变性，然后55℃45s复性，72℃90s延伸，完成一个循环，重复30-35次，而后72℃10min使DNA延伸完整，最后4℃条件下保存以备用。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳30-60min，溴化乙锭（EtBt）染色，用美国BIO-RAD凝胶成像系统观察并拍照。

表1：PCR反应体系

利用引物orf3A-P1和orf3A-P2对K599的pRi2659质粒进行PCR扩增，获得约1500bp左右的片段，如图1所示。

4、PCR产物回收

用Sangon公司柱式DNA胶回收试剂盒，具体步骤如下：（1）用干净的手术刀将DNA片段从琼脂糖凝胶中切除，将DNA目的片段称量后放入1.5ml离心管中。（2）按300μL/100mg琼脂糖凝胶的比例加入BindingBufferⅡ，50-60℃水浴10min，每隔2分钟摇晃一次，知道胶完全融化为止。（3）将融化的胶转移到套放在2ml收集管内的吸附住内，室温放置2分钟，1000r/min离心1分钟，倒掉收集管内的废液。（4）加入500μL洗脱液于吸附住内，吸附住放入收集管内，1000r/min离心1分钟，倒掉管底废液。（5）重复步骤4一次。（6）将吸附住放于收集管内，1000r/min离心30秒，以去除残留洗脱液。（7）将吸附住放入一根新的1.5ml离心管中，在柱子膜中央加入30-40μL水，50℃水浴2分钟后1000r/min离心1分钟洗脱DNA。（8）-20℃冰箱保存，备用。

5、PCR产物与载体的连接反应

经连接反应将回收的PCR产物与测序载体pMD19-T连接。反应条件：16℃，过夜。反应体系如下表2。

表2：PCR产物与测序载体pMD19-T的连接反应体系

6、感受态细胞的制备

用CaCl₂法制备感受态细胞，具体操作步骤如下：（1）将-80℃保存的大肠杆菌DH5α菌株在LB固体培养基上划线，置于37℃过夜培养。（2）用灭菌的牙签挑取但菌落接种于20mlLB液体培养基中，在37℃，200r/min，过夜培养12h左右。（3）按1：50的比例转移菌液于20mlLB液体培养基中，继续在37℃，200r/min，振荡培养至OD₆₀₀=0.3-0.5.（4）在无菌条件下，取1ml菌液于冰浴过的1.5mlEP管中，冰浴10min后，4℃，4000r/min，离心5min。（5）去上清，用1ml冰预冷的0.05mol/LCacl₂重悬，轻轻混匀，冰浴10min后，4℃，4000r/min，离心5min。（6）去上清，加入200μL冰预冷的含15%甘油的0.05mol/LCacl₂重悬，即为感受态细胞。（7）-80℃冰箱保存备用。

7、PCR产物与载体的连接产物的转化进入感受态细胞

采用冻融法转化感受态细胞，具体操作步骤如下：在200μL感受态细胞中加入1μL质粒，温和混匀。（2）冰浴20min后，42℃热击90s（水浴锅）,迅速冰浴2min，热击过程切勿晃动离心管。（3）加入预热至37℃的LB液体培养基500μL，在37℃，200r/min，条件下，活化1h。（4）取适量转化后的菌液涂布于LB+Amp固体培养基平板上（初次做梯度）培养，每个平板加2%X-gal，100μL，25%IPTG，20μL于37℃倒置12h-16h，筛选白色单菌落。

8、转化后的大肠杆菌质粒的提取及酶切鉴定

利用Sangon公司UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒。具体如下：（1）大肠杆菌接种于LB+Amp液体培养基中，37℃，200r/min，过夜培养12-16h。（2）取1.5ml菌液，12,000r/min离心2min收集菌体，倒掉上清。（3）在菌体沉淀中加入250μLSolutionⅠ，吸打或振荡至彻底悬浮菌体。（4）加入250μLSolutionⅡ，立即温和颠倒离心管5-10次，混匀，室温静置2-4min。（5）加入350μLSolutionIII，立即温和颠倒离心管5-10次充分混匀。（6）12,000r/min离心10min。（7）将上清全部移入吸柱，8,000r/min离心30sec。倒掉废液。（8）向吸附柱中加入500μLWashSolution，10,000r/min离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。（9）重复步骤8一次。（10）将空吸附柱和收集管放入离心机，12,000r/min离心2min。（11）将吸附柱放入干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央，加入30-50μLddH₂O。室温静置2min，10,000r/min离心1min。（12）-20℃冰箱保存，备用。

利用BamHⅠ和SmaⅠ对克隆的重组质粒进行双酶切，37℃酶切1-2h，酶切反应体系如下表3。

表3：克隆的重组质粒BamHⅠ和SmaⅠ的双酶切反应体系

将orf3的PCR产物回收纯化后连接到测序载体pMD19-T上，经过转化和蓝白斑筛选获得白色单菌落克隆，提取单克隆质粒DNA，经过BamHⅠ和SmaⅠ酶切结果如图2。

9、重组质粒的测序及序列分析

提取克隆的重组质粒DNA送交上海华诺生物技术有限公司，用ABI377型DNA测序仪测定序列。

挑选5次独立实验得到的克隆重组质粒，进行序列测定，获得K599-orf3基因序列，其编码区长为1479bp（SEQIDNO.1），编码492个氨基酸（SEQIDNO.2）。PCR扩增所用的引物在序列两端被正确测出。对测定的序列进行Blast比对分析，结果表明本次克隆的K599-orf3基因序列与pRi1724（GenBank登陆号NC_002575）中的orf3基因序列有99%相似性，编码的氨基酸有99.6%相似性；与pRiA4中的orf3基因序列有82%相似性，编码的氨基酸有46.1%相似性。

SEQIDNO.1：

ATGTTTGCGTGCAAGGCCGGATTATGTCGATGTAGACCTGCAGACCCGTTGACTTCCTATAAACACCGCCAATCATCCACCTCTCCCTTTCCAAGGTCTTGCCTTTTTTGCCTTGCTACCATGCCAGCCAGCGACGCGATGTGCGCTGCCGCGGTCGCCTTCCCGGAGGGTAACTGGAAGAGAGAACTCGCTGCGCTGCAGATTTTGCATGATCCTGTAGATGTGATTACGGCCGCTGTCGCCAGAGGTCTTAGCGGCATATGTAATGTCGTTGCTGCAATGGATGCCGAAAAAGTGACAGGCCTCGGCGACGTCATTCGGCGGATGCCTGCTCTAAATCACCGAATTGCCGTCGCCGCCGGTGAAACTCCAGTGCGAGACCTCGGAATAGGGTACCAGTGCGCAATCTGCCACCCCGACATAGCAAGTGCTATGTTAGCCACTTCCGACGGGATCAGCCATGCTGTCCGTGAAAAGATCGAGAAAGAAGTTGCTCAGGATATTGGAGAAGGTGCCATCGTATACATCTTCATTCAGCCGAGGATGAGTTCCAGCAACTCTCCGGTTTCTGTCCATTTCACCCTCCAGTTTGCGAGTTCTGGAGCTCTCGTCGAAGCCAGAATGATAGAGAGTTACAATTTTATGAAAGGCGATGGCACAGTGACTGCAGAGAAATTGAAAAGTCATTGGAAGCAGCACGGTATTCGCAGACCAAGTCCACGTCCGCCCAGGTCCAAATTTGAACTTCTTTTCGCTCCGGTCCCCGACAACAGTAAACTTGCCGCCGCCGATTTCACCCATCTCGGCTTGGTCGAGCGGGATAGAGAATTGCTTGGCAGTACGGTCTTCGGAATTGCCGCCAATAAACCTGGGACGGTAGTTTATCAGTGTGACAAGGTTCTGTGTCTGGAAGTGGATGTCGAGTCACACCGCGCGTTGGAGGTGCTTCACCGCCTTGGGGAGCAGGTATATAGGGCTGGTTGGGGCACGAGTTTCGGTCTTCACACAGGCCCTTCATCTTGTCTTAATCTTTCCGCTGCTGCACTCGCCACCTTTTTCAAACGGACTGATCTTTGTTCCGTCCCGCTGAGTGATGTTTTTTGTCTCTTCTGCGACCATGCCAGCCGTTGCTACGCCGCCAAAGAAGACGGACTTCCACTCACCGCCTTCTCCCTCGAAAATGAAAGTCAGTTTGAACTCGTCGACCCCCAGGTTGTCAGAAAATACGTTCTCGGTCTTTTCGACGCCCCGACAATGGTTGAGCCCCGCGATATCAGCAGAGCGAGCTTCTGCAGCCAATATATAACTTTCCGGGAACCACATCCCTGTAAGGAGTTCAATGAAATTGGTGTTCTGATCCTCGATGCTGCTGCTAAAATGCTCGAAAGTTATGCCGAATTCCTGGAAGACGATGGAAGCGATGATAATGAAATTGCGAGCGTTAAAGATGTATTTGGCTTAATTGATAGGACATTATGA

SEQIDNO.2：

MFACKAGLCRCRPADPLTSYKHRQSSTSPFPRSCLFCLATMPASDAMCAAAVAFPEGNWKRELAALQILHDPVDVITAAVARGLSGICNVVAAMDAEKVTGLGDVIRRMPALNHRIAVAAGETPVRDLGIGYQCAICHPDIASAMLATSDGISHAVREKIEKEVAQDIGEGAIVYIFIQPRMSSSNSPVSVHFTLQFASSGALVEARMIESYNFMKGDGTVTAEKLKSHWKQHGIRRPSPRPPRSKFELLFAPVPDNSKLAAADFTHLGLVERDRELLGSTVFGIAANKPGTVVYQCDKVLCLEVDVESHRALEVLHRLGEQVYRAGWGTSFGLHTGPSSCLNLSAAALATFFKRTDLCSVPLSDVFCLFCDHASRCYAAKEDGLPLTAFSLENESQFELVDPQVVRKYVLGLFDAPTMVEPRDISRASFCSQYITFREPHPCKEFNEIGVLILDAAAKMLESYAEFLEDDGSDDNEIASVKDVFGLIDRTL*

二、植物转基因表达载体的构建

如图3所示，质粒pMD19-orf3经BamHⅠ和SmaⅠ双酶切后回收得到的小片段；质粒pRI101-AN经BamHⅠ和SmaⅠ双酶切后回收得到的大片段。将大片段与小片段连接后转入感受态大肠杆菌。构建过程中的质粒提取，酶切，片段回收，PCR扩增与连接反应体系均同前。

即：质粒pMD19-orf3经BamHⅠ和SmaⅠ酶切后回收orf3片段与质粒pRI101-AN经BamHⅠ和SmaⅠ酶切后得到的大片段连接后获得新质粒pRI101-AN-orf3，结果见图4。

实施例2：K599-orf3基因转化烟草的植株再生及形态特征分析

1、实验材料：烟草品种：黄榆苗；含质粒pRI101-AN-orf3的根癌农杆菌GV3101。

2、烟草无菌苗的繁殖：(1)将烟草种子置于1.5ml的离心管中，无菌水清洗后，75%酒精浸泡30秒，然后将酒精用无菌枪头吸净，再用无菌水冲洗3-5次。(2)用0.1%的生汞灭菌3-5min,后无菌水冲洗3-5次，然后用无菌滤纸吸干烟草种子表面的水分，接种到MS培养基上，放于组织培养室培养(光照强度2000lux左右，光照时间每天10-12h，温度：白天25℃，夜晚18℃)，获得烟草无菌苗。

3、农杆菌的培养与活化：(1)将含有目的基因orf3的根癌农杆菌GV3101划线培养在LB+50mg/Lkm(卡那霉素)+40mg/LRif（利福平）固体培养基上，28℃，24-36h。(2)挑取单菌落，在液体培养基LB+50mg/Lkm+40mg/LRif中，28℃，200r/min,过夜培养。(3)当农杆菌的生长密度达到OD值约为0.5时，取1ml菌液加入1.5ml离心管中，4000r/min,离心5min，去上清，用MS液体培养基悬浮菌体两次，获得OD值约0.1的菌液，用作侵染液。

4、侵染和共培养：将已预培养的烟草叶片切块置于已制备好的侵染液中，室温下80-100r/min，8-10min。将烟草叶片上的菌液用无菌滤纸吸干后，继续接种在MS+0.5mg/L6-BA固体培养基上，共培养2-3d。待叶盘周围长出淡淡的菌迹后，将烟草切块放MS+0.5mg/L6-BA+500mg/LCef（头孢霉素）液体培养基中，室温下80-100r/min.摇床上振荡30min以脱菌，然后用无菌水洗3-5次。

5、筛选培养：将烟草叶片表面的水分用无菌滤纸吸干，接种在MS+0.5mg/L6-BA+80mg/LKm+500mg/LCef筛选培养基上继续培养。6、继代培养：每10-15天更换一次筛选培养基，直至长出烟草不定芽，当烟草不定芽长至1-2cm时，将其切下，接种到MS+0.1mg/L6-BA+80mg/Lkm+500mg/LCef继代培养基上；10-15天换一次继代培养基，经过3-5次继代除去农杆菌后，培养基中不在添加Cef。

7、生根、炼苗和移栽：待小苗长至2-3cm时，将其接种至MS生根培养基上，7-10d左右即可长出粗壮根系。待小苗长出粗壮根系后，将培养瓶打开，室温下炼苗2-3d，移栽于蛭石：珍珠岩：泥炭=1：3：6的营养土中，置于生命与环境科学学院二楼人工气候室中，光照/黑暗=14/10h，平均温度23℃。再生结果见图5。

8、转基因烟草的PCR鉴定

利用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的快捷植物基因组DNA提取试剂盒提取烟草基因组DNA，按照操作说明进行。将所得的DNA溶液于-20℃保存，用于后续实验。利用K599-orf3基因的引物orf3A-P1和orf3A-P2（同前），进行PCR扩增反应，扩增反应体系和扩增电泳等步骤同前，结果见图6。

9、转基因烟草的RT-PCR表达分析

利用上海Sangon公司的UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒提取烟草总RNA，具体操作按照说明书进行。将所得到的RNA溶液置于-70℃保存或用于后续实验。利用北京全式金生物技术有限公司的TransScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix合成cDNA第一链，操作按照说明书进行。以上述逆转录的cDNA作为模板，orf3基因引物同前。内参actin基因引物为：actin-P1：5’-CCTCCAATCCAGACACTGTA-3’；actin-P2：5’-GGAGAAGATCTGGCACA-3’。PCR反应体系和扩增电泳同前。

随机选取1株野生型烟草和5株PCR验证阳性的烟草T1、T2、T3、T4、T5，提取烟草叶片总RNA，逆转录成cDNA，以actin基因作为内参，利用orf3基因的扩增引物对cDNA进行RT-PCR扩增，结果见图7，其中A为actin扩增出的条带约为600bp，B为orf3基因扩增出的条带大约为1479bp，说明转入的orf3基因在烟草中能够进行正常转录。

10、转K599-orf3基因烟草表型分析

通过观察转基因烟草与野生型烟草相比，转基因烟草分枝明显增多、植株矮化，节间缩短，见图8。

实施例3：拟南芥转orf3基因及其形态分析

1、实验材料：拟南芥为Columbia（Col）生态型，含重组质粒pRI101-AN-orf3的根癌农杆菌GV3101。

2、拟南芥苗的纯性培养：(1)将拟南芥种子放于1.5mlEP管中，用70%的酒精浸泡3min，其间来回晃动，是拟南芥种子杀菌均匀；(2)吸干酒精，加入1.5ml10%的次氯酸钠，浸泡10min；(3)用无菌水清洗4-5次，每次清洗吹打1min，最后一次清洗时浸泡8min，使次氯酸钠完全溶解，然后再清洗2次；(4)剩余少量水，用1ml移液枪点在B5培养基上，每个平板80-100颗拟南芥种子；(5)4℃冰箱放置，春化2天；(6)培养室培养，在其长出两片真叶后即可移栽到土质培养基中，在植株形成大量不成熟的花簇时即可进行遗传转化。

3、农杆菌的培养、活化与侵染液的制备：(1)将含有目的基因orf3的根癌农杆菌GV3101划线培养在LB+50mg/Lkm(卡那霉素)+40mg/LRif（利福平）固体培养基上，28℃，24-36h。(2)挑取单菌落过夜培养于LB+50mg/Lkm(卡那霉素)+40mg/LRif（利福平）250ml液体培养基中，至OD值为1.2-1.6，4℃，2000r/min，离心5min。(3)250mlB5培养基(加入5%的蔗糖，0.01%的肌醇，0.02%的MES，10mg/L6-BA)悬浮菌体，重悬的菌液装到500ml的广口烧杯中，侵染前，加入50ulSilwetL-77。

4、浸花法进行拟南芥遗传转化：(1)将拟南芥的主花序浸入侵染液中30s，并轻轻搅动；(2)侵染完后用吸水纸轻轻地吸干多余的农杆菌溶液，用保鲜膜轻轻地包裹植株，用黑色塑料袋将拟南芥遮盖，放在培养室避光生长16-24h；(3)去除遮盖物后，放在长日照下正常地培养，浇灌营养液，为防止倒伏，可插入竹签，将植株绑在竹签上；(4)当角果变黄时，用信封袋收种。

5、拟南芥转基因植株的筛选：（1）将收获的T₀代的拟南芥转基因种子大量灭菌：取T₀代的拟南芥转基因种子1ml左右，倒入50ml离心管中，加入30-40ml无菌水，震荡数次，高速离心15s，将上清及漂浮的种子弃掉；向大离心管中加入40ml70%的乙醇，振荡10s，然后用无菌水清洗2次；向离心管中加入5%的次氯酸钠溶液，旋窝震荡10min，倒去上清后用无菌水清洗3次；向离心管中加入30ml无菌的液体MS培养基，震荡后，种子悬浮在液体培养基中。(2)转基因拟南芥种子的第一次筛选：将上述灭菌的拟南芥T₀代种子，吸取2-3ml悬浮的种子，喷到含MS+Km(50mg/L)固体培养基的大平板上（直径90cm）。轻轻旋转平板，使种子混匀，在无菌操作台里面开大风，吹干平板上的液体；待液体完全吹干，将平板用封口膜封严，标记清楚后，4℃冰箱，放置2天；2天后将平板放置拟南芥培养室；7d左右，绝大多数的种子被抗生素杀死，子叶变黄、发白，少数转基因种子的子叶保持绿色，继续生长，10d左右，拟南芥抗性种子，长出两片真叶，将其移栽到土壤培养基质中，适当浇灌营养液，当角果变黄时，收获T1代种子。(3)拟南芥转化阳性植株的纯合筛选。将T1代种子在含有50mg/L卡那霉素的培养基上筛选，分离比为3：1，即绿苗：黄苗=3：1，得到T2代植株，如果T2代的拟南芥种子是纯合体，则在含有50mg/L卡那霉素的培养基上筛选T2代种子时，种子均具有卡那霉素抗性，即萌发的小苗均为绿苗。

拟南芥无菌苗培养后移栽到土壤基质中，待拟南芥植株形成大量的不成熟的花簇，即可浸花法侵染拟南芥，经多次筛选获得拟南芥纯合植株。如图9所示。

6、拟南芥遗传转化的PCR鉴定和表达分析同前

7、转K599-orf3基因的拟南芥阳性植株的表型观察

将验证的转K599-orf3基因的拟南芥植株种植于营养土：蛭石：珍珠岩=3：1：1的土壤基质中，在杭州师范大学生命与环境科学学院人工气候室生长，观察植株形态特征，结果转K599-orf3基因的拟南芥植株表现出多分枝特征，见图10。

Claims (3)

1.控制植物分枝的K599-orf3基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述的植物为烟草植株或拟南芥植株。

2.如权利要求1所述的基因在控制农作物或园艺植物分枝中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：构建含有所述K599-orf3基因的表达载体，以农杆菌介导法将其导入农作物或园艺植物中，获得分枝增加的转基因农作物或园艺植物。