CN104404043A

CN104404043A - 疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子

Info

Publication number: CN104404043A
Application number: CN201410673732.7A
Authority: CN
Inventors: 李定琴; 程在全; 钟巧芳; 肖素勤; 柯学; 李维蛟; 余腾琼; 张敦宇; 付坚; 王玲仙; 陈玲; 陈越; 蒋聪; 罗红梅; 曾民; 王波; 黄兴奇
Original assignee: Biotechnology and Germplasm Resource Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Biotechnology and Germplasm Resource Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-11-19
Filing date: 2014-11-21
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2034-11-21
Also published as: CN104404043B

Abstract

本发明公开一种疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子，该启动子属于组织特异性表达启动子，该启动子能驱动GUS基因在转基因拟南芥的叶片特异表达。该启动子可以应用于水稻抗白叶枯病育种，通过驱动其它外源基因尤其是抗白叶枯病基因在转基因水稻叶片中集中特异表达，从而提高水稻对白叶枯病的抗性。同时，该启动子对于应用于水稻其它叶面病害的防治具有重要的理论及实际意义。

Description

疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子

技术领域

本发明涉及一种由疣粒野生稻中克隆的抗白叶枯病相关基因Me094启动子，属于分子生物学技术领域。

背景技术

基因的表达和调控是植物基因工程研究的重要内容之一，启动子作为一种重要的调控元件，调控着外源基因在转基因植物的特定组织、特定发育阶段和一定环境条件下的表达。利用基因工程技术将相关抗性基因导入植物，从而使植物抵御各种生物或非生物胁迫，是实现植物抗逆性改良的较好途径，而启动子的配置和外源基因的按需表达则显得非常重要。目前在植物转基因研究中最广泛采用的启动子有来源于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子(Odell JT,et al,Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus35S promoter[J].Nature,313(6005):810-812,1985)，玉米泛素基因(Ubi1)启动子(Christensen AH et al,Maize polyubiquitin gene structure thermal perturbation ofexpression and transcript splicing,and promoter activity following transfer toprotoplasts by electroporation[J].Plant Mol Biol,18(4):675-689,1992)等，它们都属于组成型启动子，即在这类启动子控制下，外源基因在转基因植株的各个组织、各个发育阶段都会持续表达。这不仅造成了能量的浪费，而且对植物的生长发育也有不利的影响。

寻找专一性启动子，使外源基因特异地表达是植物基因工程的关键环节。组织特异性启动子作为一类专一性启动子，能调控外源基因在植物发育过程中某一特定时空表达，它不仅能使目的基因的表达产物在一定空间积累，增加区域表达量，而且也避免了植物能量的不必要浪费(杨予涛等,一个光合组织特异表达强启动子的分离及功能分析[J].中国科学C辑,33(4):298-306,2003)。

叶片是水稻的主要营养器官，同时也是白叶枯病的主要发生器官。因此，在水稻白叶枯病抗性改良中，使抗病基因在叶片中特异表达，不仅避免了基因产物的浪费，同时还能提高水稻植株的抗性，进而提高水稻产量和品质。而找到能调控抗病基因在水稻叶片特异性表达的启动子，则是解决这一问题的关键。

我们在疣粒野生稻受白叶枯病菌诱导的抑制差减文库(SSH)中，克隆了一个抗白叶枯病相关基因Me094，该基因编码金属硫蛋白。金属硫蛋白是一种小分子量，富含半胱氨酸的重金属结合蛋白，参与植物中的金属代谢和过多的重金属的解毒，此外也参与植物的胁迫保护反应(Robinson NJ et al,Plantmetallothionein[J].Biochem,295:1-10,1993；Carginale V,et al,Cadmium-induceddifferential accumulation of metallothionein isofonns in the Antarctic icefish whichexhibits no basal protein but high endogenous mRNA levels[J].Biochem.J,332:475-81,1998)。通过研究发现，Me094在转基因水稻中的表达能提高水稻的抗白叶枯病能力，用RNAi干扰技术干扰Me094基因的表达后，转基因水稻的抗病能力明显减弱。这些结果表明Me094参与了疣粒野生稻抗白叶枯病过程。本发明所述的启动子即是疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子，它是一个叶片特异表达的启动子。目前，已成功克隆了多个叶片特异表达启动子，如Rbcs(1,5-二磷酸核酮糖羧化加氧酶小亚基基因)启动子，Cab(捕光叶绿素a/b结合蛋白基因)启动子等，这些启动子的利用不同程度地提高了目的基因在叶片的特异表达。

热不对称交错PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR，简称TAIL-PCR)是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术。该技术由Liu和Whitter首先研究并报道(Liu YG et al,Thermal asymmetric interlaced PCR:automatable amplification and sequencing of insert end fragment from P1and YACclones for chromosome walking[J].Genomics,25:674-681,1995)。利用该技术分离出的DNA序列可用于图位克隆、遗传图谱绘制的探针，也可以直接测序。近年来，由此形成的技术路线已成功地用于从P1、YAC和BAC克隆中分离获得插入末端的DNA序列，拟南芥的T-DNA侧翼序列及多个基因的启动子序列，并且取得了显著成效。

发明内容

本发明的目的是提供一新的疣粒野生稻中抗白叶枯病相关基因Me094的上游启动子序列，以及该启动子在驱动外源基因尤其是抗病基因在转基因植物的叶片特异表达，从而提高转基因植物抵御病害能力上的应用。

本发明针对上述研究背景，根据已克隆了的疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094序列，通过TAIL-PCR技术分离克隆了该基因的上游启动子，并采用农杆菌介导法转化拟南芥进行启动子功能研究。

本发明所提供的一种疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了上述疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子在驱动外源抗病基因在转基因植物的叶片特异表达提高转基因植物抵御病害能力上的应用。

所述的提高转基因植物抵御病害能力上的应用为提高转基因水稻抵御白叶枯病害能力上的应用。

本发明还提供了上述疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子在转基因拟南芥中驱动下游基因叶片特异表达的应用。

本发明还提供了一种扩增本发明疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子的引物，所述引物由上游引物和下游引物组成，所述上游引物由引物AD1、引物AD2、引物AD3、引物AD4和引物AD5组成，引物AD1的碱基序列如SEQID NO：2所示，引物AD2的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，引物AD3的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，引物AD4的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，引物AD5的碱基序列如SEQ ID NO：6所示，所述下游引物由引物ME094-1、引物ME094-2和引物ME094-3组成，所述引物ME094-1的碱基序列如SEQ IDNO：7所示，引物ME094-2的碱基序列如SEQ ID NO：8所示，引物ME094-3的碱基序列如SEQ ID NO：9所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明通过TAIL-PCR技术首次从疣粒野生稻中克隆获得抗白叶枯病相关基因Me094启动子，该启动子能驱动GUS基因在转基因拟南芥的叶片特异表达，属于组织特异性表达启动子。本发明发掘的疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因启动子，可以应用于水稻抗白叶枯病育种，对于驱动其它外源基因尤其是抗白叶枯病基因在转基因水稻叶片中集中特异表达，从而提高水稻对白叶枯病的的抗性具有重要的理论及实际意义。同时该启动子也可以应用于水稻其它叶面病害的防治。

序列表中SEQ ID NO：1所示的是本发明疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：2所示的是引物AD1的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：3所示的是引物AD2的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：4所示的是引物AD3的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：5所示的是引物AD4的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：6所示的是引物AD5的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：7所示的是引物ME094-1的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：8所示的是引物ME094-2的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：9所示的是引物ME094-3的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：10所示的是Me94Pr-1引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：11所示的是Me94Pr-2引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：12所示的是疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094的cDNA全长的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：13所示的是疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094编码的氨基酸序列。

序列表中SEQ ID NO：14所示的是Me094的EST序列上游引物Me094-E(+)的碱基序列。

SEQ ID NO：15所示的是Me094的EST序列下游引物Me094-E(-)的碱基序列。

SEQ ID NO：16所示的是接头引物AP的碱基序列。

SEQ ID NO：17所示的是Me094的ORF序列上游引物Me094-F(+)的碱基序列。

SEQ ID NO：18所示的是Me094的ORF序列下游引物Me094-F(-)的碱基序列。

SEQ ID NO：19所示的是Me094基因的3’端核苷酸序列。

SEQ ID NO：20所示的是Me094基因的5’端核苷酸序列。

SEQ ID NO：21所示的是疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094的EST序列。

附图说明

图1：本发明启动子序列的TAIL-PCR扩增图谱。图中M₁和M₂分别DL15000Marker和DL2000 Marker，1、3、5、7、9泳道分别为引物AD1-AD5的第2轮扩增产物，2、4、6、8、10泳道分别为引物AD1-AD5的第3轮扩增产物。

图2：本发明启动子表达载体的PCR鉴定(左)及HindⅢ和Xba Ⅰ双酶切鉴定(右)图谱。图中M为DL2000 Marker，1为非转基因植株对照，2为质粒对照，3-8为转基因阳性植株。

图3：本发明启动子表达载体转入农杆菌后的菌液PCR鉴定图谱。图中M为DL2000 Marker，1-4为4个不同的农杆菌单克隆。

图4：本发明启动子表达载体转入拟南芥后的PCR检测图谱。图中M为DL2000 Marker，1为非转基因对照，2-8为转基因植株。

图5：本发明启动子表达载体转入拟南芥后的GUS化学染色图谱。图中1为非转基因对照，2为转入空载体pBI121的对照，3-4为转基因植株。3-4中箭头所指是蓝色较深的部位。

图6：含有Me094基因的表达载体pCAMBIA1300-BI-Me094图谱。

图7：转Me094基因水稻的DNA的PCR检测阳性植株图，图中M为DL2000Marker，1为阳性对照，2为阴性对照，3-15为再生植株。

图8：Me094基因的半定量RT-PCR显示图。图中β-Acti是内参基因，CK、24h、48h、72h、96h、120h分别为接无菌水对照、白叶枯病病原菌处理24h、48h、72h、96h、120h的cDNA半定量RT-PCR的扩增结果。

具体实施方式

以下各实施例无特殊说明均为常规方法。

实验材料：疣粒野生稻(Oryza meyeriana)，白叶枯病菌C1是中国典型的致病菌株，白叶枯病菌Y8是云南省典型的致病菌株，用所述白叶枯病菌C1和白叶枯病菌Y8接种是利用其对水稻的侵染能力的共性从而导致水稻叶片形成白叶枯病病斑，因此，具有同样致病能力的各种白叶枯病菌菌株都能达到本发明的效果。以下各实施例的实验试剂等均为市售产品。

实施例1-实施例2是本发明疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子的克隆、序列分析及功能验证。实施例3-实施例7分别是疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094的表达序列标签的验证和表达分析、基因Me094全长的克隆、含目的Me094基因重组农杆菌的获得、含目的Me094基因农杆菌介导的水稻遗传转化、转目的Me094基因再生植株的分子生物学检测和抗性鉴定。

实施例1疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子的克隆及分析

(1)设计扩增Me094启动子的引物

Me094基因是本申请人前期从疣粒野生稻受白叶枯病菌诱导的SSH文库中筛选克隆出来的1个金属硫蛋白基因，已进行了功能验证，但其上游启动子序列未知，从而限制了对该基因表达调控情况的研究。根据Me094基因全长cDNA序列信息，再结合TAIL-PCR技术的原理，用生物软件Primer5.0设计引物对Me094基因启动子进行扩增，Me094基因全长cDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：12所示，设计的扩增本发明启动子(即疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子)的引物由上游引物和下游引物组成，所述上游引物由引物AD1、引物AD2、引物AD3、引物AD4和引物AD5组成(即5条随机简并上游引物)，引物AD1的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，引物AD2的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，引物AD3的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，引物AD4的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，引物AD5的碱基序列如SEQ ID NO：6所示，所述下游引物由引物ME094-1、引物ME094-2和引物ME094-3组成(即3条嵌套的特异性下游引物)，所述引物ME094-1的碱基序列如SEQ ID NO：7所示，引物ME094-2的碱基序列如SEQ ID NO：8所示，引物ME094-3的碱基序列如SEQ ID NO：9所示。

(2)以接种白叶枯病菌处理的疣粒野生稻叶片提取总DNA

对疣粒野生稻叶片用白叶枯病菌C1和Y8进行接菌处理，分别于24h、48h、72h、96h、120h 5个时期取样，然后将样品等量混合后用CTAB法提取其叶片DNA，具体如下：

1)取0.2g疣粒野生稻接菌后的混合样品加液氮研磨至粉末状，加入1ml提取缓冲液(2％CTAB，100mM Tris-cL PH8.0，20mM EDTA PH8.0，1.4M NaCl)置于65℃保温60-90min，其间不断摇匀；

2)取出后12000rpm离心10min(4℃)；

3)离心结束后将上清液转到另一干净离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，其间不断摇匀；

4)静置片刻后12000rpm离心10min(4℃)，取出上清液加入2/3体积的异丙醇置于-20℃进行沉淀约30min；

5)5000rpm离心5min(4℃)，弃去上清液，加入1ml 75％的酒精洗涤沉淀，重复二次；

6)然后将离心管在室温无菌风干至透明状，加入50μl TE(100mM Tris-clPH4.0,1mM EDTA)或ddH₂O溶解沉淀，加入2μl RNA酶；

7)取3μl上清液，琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并用分光光度计测定其浓度。

(3)疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因ME094启动子的扩增

以步骤(2)所提取的DNA作为PCR反应的模板，浓度稀释到0.1μg/μl，以步骤1中设计的引物作为PCR反应引物，即分别以3条下游引物：引物ME094-1、引物ME094-2和引物ME094-3和5条上游随机引物：引物AD1、引物AD2、引物AD3、引物AD4和引物AD5配对，做3轮TAIL-PCR扩增反应，扩增疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子。

①第1轮PCR反应，反应体系：10×LA PCR Buffer(Mg²⁺plus)2μl，dNTPMixture(2.5mM each)1.6μl，模板DNA 25ng，特异引物(Me094-1)0.2uM，随机引物(AD1-AD5)各4uM，LA Taq聚合酶1.0U，ddH₂O补足到20μl。反应条件：93℃1min,95℃1min，然后5个循环(94℃30s，60℃1min，72℃2min)，94℃30s，30℃3min，Ramping to 72℃(0.2℃/s)2min。最后15个循环(94℃30s，62℃1min，72℃2min；94℃30s，62℃1min，72℃2min；94℃30s，44℃1min，72℃2min)，72℃10min。

②第2轮PCR反应：

将第1轮PCR产物稀释50倍作为第2轮PCR的模板。反应体系同步骤(3)①，只是模板改为第1轮PCR产物稀释液1μl，特异引物改为Me094-2，随机引物改为2μM。反应条件：15个循环(94℃30s，60℃1min，72℃2min；94℃30s，60℃1min，72℃2min；94℃30s，44℃1min，72℃2min)，72℃10min。

③第3轮PCR反应:

将第2轮PCR产物稀释50倍作为第3轮PCR的模板，反应体系同步骤(3)②，模板改为第2轮PCR产物稀释液1μl，特异引物改为Me094-3。反应条件：15个循环(94℃30s，61℃1min，72℃2min；94℃30s，61℃1min，72℃2min；94℃30s，44℃1min，72℃2min)，72℃10min。

(4)Me094基因启动子片段的回收

图1为本发明启动子的PCR扩增结果，结果显示除引物AD3外，其它引物的第3轮PCR产物都有较特异的条带，将它们用1％琼脂糖凝胶电泳，然后进行凝胶回收，具体方法如下：

1)在紫外灯下将目的条带切下，尽量除去不含DNA片段的凝胶，置于1.5ml的离心管中，称重；

2)按每100mg胶块加入300μl溶胶液的比例加入溶胶液，置于50℃水浴中10min，期间不断摇动混匀；

3)胶块完全溶解后将溶胶液转移到吸附柱中，室温，8000rpm离心30s，去掉废液；

4)向吸附柱中加入500μl漂洗液，室温，9000rpm离心30s，去掉废液；

5)重复步骤4，9000rpm离心1min，倒掉废液；

6)将吸附柱移至干净的1.5ml离心管中，室温放置5min左右，使残余漂洗液中的乙醇挥发；

7)向吸附柱中央加入15-40μl提前预热至60℃的洗脱缓冲液，室温放置1-2min，9000rpm离心1min洗脱DNA，即获得疣粒野生稻受白叶枯病菌胁迫表达的基因Me094的启动子片段，即为本发明所述的疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子。

(5)本发明启动子片段的克隆测序及分析

将步骤(4)中获得的Me094基因启动子片段回收产物分别与pMD18-T载体连接，反应体系为：4μl回收产物，1μl pMD18-T，5μl solution Ⅰ，16℃连接30min或过夜，次日将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于添加了Amp、IPTG和X-gal的LB平板上，37℃倒置培养12-16h，进行蓝白斑筛选。待培养基上长出单克隆后，挑取白色单克隆于3ml液体LB中(含1mg/ml Amp)，37℃，200r/min振荡培养14h-16h，用碱裂解法提取质粒。

提取的质粒用EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切鉴定，反应体系为：10×H Buffer1μl，质粒4μl，EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ各0.5μl，补足ddH₂O至10μl。37℃反应3h，结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果Me094启动子克隆载体大多数都能切出与理论值相符的条带，将酶切鉴定正确的克隆送到上海生工测序。

对测序结果用http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/进行在线分析，结果表明本实验获得了Me094基因1761bp的启动子序列，序列如SEQID NO:1所示。该启动子序列中位于第516碱基至第565碱基，第602碱基至第651碱基，第1187碱基至第1237碱基分别为预测的基础启动子序列；位于第556碱基，第642碱基，第1228碱基分别为预测的转录起始位点；有4个TATA-box，分别位于第526碱基至第531碱基，第539碱基至第543碱基，第896碱基至第899碱基，第1417碱基至第1420碱基；有3个CAAT-box元件，分别位于第324碱基至第328碱基，第728碱基至第731碱基，第829碱基至第832碱基；位于第1535碱基至第1537碱基是翻译起始密码子ATG(详见序列表)。

说明本实验所获得的序列的确是疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因ME094的上游启动子序列。

实施例2构建本发明Me094启动子高效表达载体，转化拟南芥研究该启动子功能

1.Me094启动子表达载体的构建

在获得Me094启动子序列基础上构建该启动子表达载体，即用Me094启动子替换载体pBI121上的35S启动子(载体pBI121为市售)。根据pBI121上35S启动子两侧的酶切位点和Me094启动子的序列分析结果，用HindⅢ和Xba Ⅰ分别酶切pBI121和Me094启动子克隆载体，酶切体系为：

37℃反应3h，然后1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带，方法见凝胶回收试剂盒说明书(凝胶回收试剂盒购自上海生工)。然后用T₄连接酶连接，连接体系：10×T4DNA ligase buffer 2μl，pBI121 1μl，启动子4μl，T4 DNA连接酶1μl，补足ddH₂O至20μl，16℃连接过夜，次日全部用于转化大肠杆菌，提取的质粒用PCR鉴定，引物为Me94Pr-1引物和Me94Pr-2引物。

反应体系为：

PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性45s，52℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测。同时，质粒用HindⅢ和Xba Ⅰ双酶切鉴定，如图2所示，能酶切出目的条带的质粒则是构建成功的启动子表达载体。

2.启动子表达载体电击法转化农杆菌感受态细胞LBA4404

1)取1-2μl启动子表达载体质粒与100μl农杆菌感受态细胞于1.5ml离心管中，充分混匀，置冰上10min；

2)将上述混和液转移到经紫外线照射灭菌的电击杯中，进行电击脉冲放电(电压2.0kv，电容25μf，阻抗400Ω)；电击结束后，加入500μl液体YEP培养基，轻轻混匀后，吸出混和液到1.5ml离心管中，28℃，200rpm，培养4～6h；

3)8000rpm离心3min，吸掉部分上清，剩余200μl左右液体，抽吸混匀后涂布到含有50μg/ml卡那霉素的固体YEP培养基上，28℃倒置培养1～2d。

待转化平板上长出单克隆后，挑取单克隆于YEP液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)中振荡培养24h，取1μl菌液做模板进行菌液PCR鉴定，鉴定方法同质粒的PCR鉴定，结果如图3所示，所有克隆都能扩增出目的条带，说明启动子表达载体已成功转入农杆菌，可直接用于拟南芥的遗传转化。

3.含启动子表达载体的农杆菌对拟南芥的遗传转化

本实验用于转化的拟南芥为哥伦比亚野生型。采用椰糠+营养土(或腐殖土)+蛭石为2:2:1的混合土培养，将拟南芥种子直接播种在装有混合土的培养钵中，培养条件为16h光，22℃/8h暗，20℃。含启动子表达载体农杆菌对拟南芥的转化采用花序浸泡法，转化方法如下：

1)正在抽苔的苗，头天浇水浇透；

2)含目标载体的农杆菌先摇30ml，再取25ml加入500ml YEP(含50mg/ml卡那霉素)中，摇菌24h以上(OD₆₀₀值在1.8～2.0)；

3)4000rpm离心15min(室温)，用2倍体积(1L)转化Buffer溶解，混匀后用来转化；

4)转化Buffer:(1L)500ml MS+10μl BA(1mg/ml)+Tween-20 400μl+5％蔗糖(用KOH调PH5.8)；

5)取花序15cm左右的拟南芥植株，剪掉果荚及已开的花，整个花序轴浸入到转化溶液中10min取出；

6)用干净的纸吸掉植株上多余的菌液，让植物平躺，覆盖保鲜膜，置于黑暗中，隔天再立起。隔3-5天可再重复转化1次。约一个半月后可以收种子(培养条件22℃/20℃，16h/8h光/暗)；

7)转化植株收种后，根据转化质粒抗性筛选转基因植株，进一步种植筛选得到转基因植株纯系。

将转基因T₀代种子用10％次氯酸钠溶液消毒后播种在40μg/ml卡那霉素的1/2MS培养基上进行筛选，10-15天左右挑选出绿色的抗性苗，转到新的MS培养基上进行培养，20天左右对筛选出的抗性苗提取基因组DNA进行PCR检测。然后进行GUS化学染色分析，同时以非转基因和转空载体pBI121的拟南芥做对照。

1)染色：将拟南芥抗性苗放入2ml离心管中，加入适量新鲜配制的X-gluc溶液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0，1mmol/L X-gluc，0.1％Triton X-100，0.1mmol/L亚铁氰化钾，0.1mmol/L铁氰化钾，20％甲醇)中，37℃温育过夜；

2)脱色：分别用1ml 30％、50％、70％和100％乙醇漂洗，每次5min，继续用100％乙醇脱色至背景白色或无色为止；

3)将脱好色的材料放在70％乙醇中保存或照相。

结果分析：将含有疣粒野生稻Me094启动子表达载体的农杆菌转化拟南芥，转基因T₀代种子在含有40μg/ml卡那霉素的1/2MS培养基上筛选10-15天后，发现转化后的种子在MS平板上大部分逐渐黄化，死亡，只有少部分苗仍然是绿色，这些绿色的抗性苗可能是转基因阳性植株，进一步PCR检测表明，大部分绿色抗性苗都能扩增出约500bp的目的条带，如图4所示，表明该启动子表达载体已成功转入拟南芥中。进一步对PCR检测阳性的植株进行GUS化学染色分析，如图5所示，结果表明，非转基因对照中没有出现蓝色；而转空载体的植株整株呈现蓝色，表明该载体上35S组成型启动子驱动了GUS基因在拟南芥的所有部位都表达；转启动子载体的拟南芥在最外层较老的叶片出现比较明显的蓝色，其它叶片蓝色较弱，而根、茎等部位未见蓝色。表明该启动子驱动GUS基因只在拟南芥植株的叶片中表达，而且在较老叶片中表达量较高，说明本发明疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子是一个叶片特异表达的启动子，它能驱动外源基因主要在植株叶片中发挥作用。

试验表明：本发明疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子的获得可为其它需要在叶片特异表达的抗病基因提供特异表达启动子，也为研究疣粒野生稻中其它基因的表达情况提供理论参考。

实施例3：疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094表达序列标签的验证和表达分析

(1)材料的培养及处理

景洪疣粒野生稻(Oryza meyeriana)栽于塑料大棚温室内，直至开花期。

用NA培养基活化白叶枯病病原菌Y8，28℃培养2-3d，用无菌蒸馏水洗下菌苔，配制成OD₅₆₀处值为0.6的菌液。下午15:00以后(该时段为白叶枯病病原菌感染能力最强)以剪叶法接种于温室中的疣粒野生稻叶片，对照组用无菌水模拟接种，接菌后分别于24h、48h、72h、96h、120h等量取样，对照即无菌水剪叶的疣粒野生稻也同时等量取样，取样后立即把样品放入液氮中速冻，并放-70℃冰箱中保存。

(2)总RNA的提取、定量及检测

总RNA的抽提采用TRIzol Reagent(美国Invitrogen公司)操作方法按公司提供的试剂盒说明书进行。

抽提完后，使用Fermentas公司的DNase Ⅰ(RNase-free)去除总RNA中残留的基因组DNA。随后取5μl总RNA测定其在260nm、280nm处的光密度及OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值，估计总RNA的纯度，再通过OD₂₆₀值对疣粒野生稻叶片的总RNA进行浓度计算。取3μl总RNA在1％琼脂糖凝胶上分离总RNA，检测总RNA的完整性。

(3)半定量RT-PCR分析

取不同接菌时期的等量总RNA做反转录合成cDNA第一链，具体方法按照TIANScript cDNA第一链合成试剂盒(北京天根生物技术有限公司)说明书操作。根据Me094的EST序列设计Me094-E引物，以β-Actin基因作为内参基因进行不同时期的表达分析。

Me094的EST序列上游引物Me094-E(+)的碱基序列如序列表中SEQ IDNO：14所示，Me094的EST序列下游引物Me094-E(-)的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：15所示。

图8是Me094基因的半定量RT-PCR结果，结果显示Me094基因在疣粒野生稻中受白叶枯病菌表达，且在120h内随着接菌时间的增长表达量也随着增加，这说明Me094可能与疣粒野生稻抗白叶枯病有重要的关联。

实施例4：疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094全长的克隆

本发明中Me094基因全长的获得是通过3’RACE和5’RACE的方法。

3’RACE以实施例3中提取的总RNA为模板，设计接头引物AP代替TIANScript cDNA第一链合成试剂盒中的Oligd(T)引物，其他操作与该试剂盒的说明书相同，扩增片段回收测序，从而获得Me094基因的3’端序列。接头引物AP的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：16所示。

5’RACE的操作步骤参照大连宝生物工程有限公司5’RACE全长试剂盒进行操作，从而获得Me094基因的5’端序列。最后将Me094基因的5’端序列、3’端序列和Me094的EST序列拼接成一个完整的疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094的cDNA全长序列，如序列表中SEQ ID NO：12所示。

Me094基因的3’端序列如序列表中SEQ ID NO：19所示。

Me094基因的5’端序列如序列表中SEQ ID NO：20所示。

疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094的EST序列如序列表中SEQ ID NO：21所示。

Me094基因EST序列的获得：

疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094的的EST序列是从已构建的疣粒野生稻受白叶枯病菌诱导的抑制差减文库(SSH文库)中获得的，该SSH文库按照王天佐等人的方法构建(王天佐等，干旱胁迫下黄花苜蓿与蒺藜苜蓿两个抑制性差减杂交文库的构建及分析[J].草业学报，21(6):175-181,2012)，从构建好的SSH文库中随机挑选288条序列送到上海生工生物工程有限公司进行测序，然后得到的序列在GenBank的非冗余核酸数据库中进行Blast比对分析，得到与水稻金属硫蛋白基因同源性达到91％的EST序列Me094。

实施例5：含目的Me094基因重组农杆菌的获得

(1)Me094基因的表达载体构建

根据拼接的疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094的cDNA全长序列设计包含完整开放阅读框的Me094-F引物，设计时加入酶切位点，用于将Me094基因重组到表达载体pCAMBIA1300中。含有Me094基因的表达载体pCAMBIA1300-BI-Me094图谱见图6。Me094的ORF序列上游引物Me094-F(+)的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：17所示，Me094的ORF序列下游引物Me094-F(-)的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：18所示。

(2)转化农杆菌

取-70℃保存的LBA4404根癌农杆菌感受态，置冰上融解。取1μl含有Me094基因的表达载体pCAMBIA1300-BI-Me094的质粒加入到100μl感受态中，混匀，加入到处理好的电击杯中。设置2200V电压，点击转化。电击完成加入900μl的液体YEP培养基，28℃，200rpm摇床培养1.5h，菌液涂布在含50μg/ml卡那霉素(Kan)和100μg/ml利福平(Rif)平板上，28℃培养至形成单菌落。

(3)阳性克隆的鉴定与保存

挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50μg/ml Kan和100μg/ml Rif的液体培养基中，28℃，200rpm摇床培养16h，取1μl菌液进行PCR检测，检测引物为Me094-F(+)和Me094-F(-)。取检测结果为阳性的菌液，混合30％甘油，置于离心管中，于-70℃超低温冰箱中保存，备用。

实施例6：含目的Me094基因农杆菌介导的水稻遗传转化

本发明是利用感白叶枯病栽培稻02428(栽培稻02428为市售水稻品种)的成熟胚进行的遗传转化，具体操作过程如下：

(1)水稻愈伤的诱导和继代

取栽培稻02428成熟种子去壳后用75％乙醇消毒1-2min，无菌蒸馏水洗涤2-3次后，用20％的NaClO并加入一滴吐温20灭菌25min，消毒完之后用无菌蒸馏水漂洗5-6次，漂洗干净后用无菌蒸馏水浸泡种子2-3h。最后从无菌蒸馏水中取出种子置于无菌滤纸上吸干水分，然后接种于诱导培养基上，每皿12-15粒。28℃恒温培养箱暗培养两周后，将长出来的愈伤组织切下接种到继代培养基上，继代一周以后用于农杆菌的转化。所述的诱导培养基的配方是：MS+蔗糖30g/L+2，4—二氯苯氧乙酸(2，4-D)3.0mg/L+激动素(KT)0.4mg/L，pH＝5.8；所述的继代培养基的配方是：MS+蔗糖30g/L+2，4—二氯苯氧乙酸(2，4-D)2.0mg/L+KT 0.4mg/L,pH＝5.8。

(2)含目的Me094基因的表达载体pCAMBIA1300-BI-Me094的农杆菌悬浮菌液的制备

取出保存于-70℃的含有目的Me094基因的表达载体pCAMBIA1300-BI-Me094的根癌农杆菌LBA4404，划线接种于添加了25μg/mlRif和50μg/ml Kan的LB平板上，在28℃下倒置暗培养2-3d；从平板上挑取单菌落，接种于30ml添加了25μg/ml Rif和50μg/ml Kan YEB液体培养基中，28℃，180rpm震荡培养16-20h进行活化；活化后得到含目的Me094基因的表达载体pCAMBIA1300-BI-Me094的农杆菌悬浮菌液(以下简称：悬浮菌液)，用于浸泡栽培稻02428愈伤组织。

(3)水稻愈伤组织与农杆菌的共培养

将继代的质量较好的栽培稻02428愈伤组织切割成直径2-5mm的小块并转入共培养基，然后将悬浮菌液注射入共培养基，使菌液充分浸泡愈伤，然后将多余菌液吸出，密封。或者将愈伤组织浸入准备好的悬浮菌液中，浸染20min，期间要缓慢摇动，然后将菌液倒出，用滤纸把愈伤组织吸干，置于准备好的共培养基上。28℃恒温培养箱暗培养2-3天。所述的共培养基的配方是：MS+蔗糖30g/L+2，4-D 2.0mg/L+乙酰丁香酮(As)20mg/L，pH＝5.2。

(4)抗性水稻愈伤组织的筛选

首先将共培养的愈伤组织用无菌蒸馏水清洗5-6次，每次2-3min，再用MS液体培养基+500mg/L头孢拉定震荡清洗并过夜，待洗液清澈时，用无菌水清洗2-3次后将愈伤组织置于无菌纸上，并在超净台将其风干。接着将愈伤组织转入筛选培养基，28℃暗培养15-20d后一些褐化的愈伤组织边缘长出乳白色的新的抗性愈伤组织，将这些新长出的抗性愈伤组织转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选15-20d。所述的筛选培养基的配方是：MS+蔗糖20g/L+甘露糖10g/L+2,4-D2.0mg/L+头孢拉定250mg/L，pH＝5.8。

(5)抗性水稻愈伤组织的分化、生根及炼苗

从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有250mg/L头孢拉定的分化培养基上，放到28℃，16h/d的光照培养箱中培养，经过15-20d有绿点出现，30-40d进一步分化出小苗。

待幼苗在分化培养基长至2-3cm后，将其转入生根培养基，并使幼苗的根部深入到生根培养基的内部，放到28℃，16h/d的光照培养箱中培养，待幼苗根系比较发达苗高约10cm时进行炼苗。所述的分化培养基的配方是：MS+蔗糖30g/L+6—苄氨基腺嘌呤(6-BA)2.0mg/L+萘乙酸(NAA)0.5mg/L+KT 1.5mg/L+头孢拉定150mg/L，pH＝5.8。所述的生根培养基的配方是：MS+蔗糖15g/L+NAA0.5mg/L+头孢拉定150mg/L，pH＝5.8。

用自来水将幼苗根部琼脂清洗干净后放入(30mm×180mm)大试管中，加入少量1/2MS培养液(pH5.8-6.4)，放在光照培养架上，每2-3天换一次1/2MS培养液。在室内炼苗7-8d后移栽至温室土壤环境条件下，每2d浇一次水，水面以不淹没小苗为度，如果天晴，需要遮荫到小苗成活(以吐水为准)即得到转基因再生植株。

实施例7：转目的Me094基因再生植株的分子生物学检测和抗性鉴定

(1)PCR检测

待实施例4所获得的转基因再生植株生长旺盛时，取其嫩叶，提取叶片中的DNA，DNA的提取采用CTAB法。

1)分别取100-200mg所述的转基因再生植株的幼嫩叶片加液氮研磨成粉末状，加入1ml提取缓冲液(2％CTAB，100mM Tris-Hcl pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1.4M NaCl)，置于65℃水浴锅中保温60-90min，其间不断摇匀；

2)室温，12000rpm离心10min；

3)将上清液转移至另一干净的1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，振荡混匀；

4)静置片刻后，室温，12000rpm离心10min；

5)将上清液转移至新的1.5ml离心管中，加入2/3体积的异丙醇置于-20℃沉淀30min-1h；

6)室温，12000rpm离心5min；

7)弃去上清液，加入1ml 75％的乙醇洗涤沉淀，室温，5000rpm离心5min；

8)重复步骤7；

9)沉淀在室温中晾至透明状，加入50μl TE(100mM Tris-cl pH8.0，1mMEDTA)或ddH2O溶解沉淀，加入2μlRNA酶；

10)取3μlDNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的质量。

以提取的水稻总DNA为模板(非转基因植株为阴性对照，Me094基因的表达载体pCAMBIA1300-BI-Me094为阳性对照)，以Me094-F(+)和Me094-F(-)为引物，进行PCR检测。检测结果如图7所示，其中标记为5、6、9、11、12、14的泳道处存在与阳性对照相同大小的基因，表明这几株再生植株为阳性转基因植株。

(2)抗病性鉴定

白叶枯病菌株Y8(市售)在NA培养基斜面上28℃培养2-3天活化，配制成OD₆₀₀处值为0.6的菌液；在孕穗期使用剪叶法对PCR鉴定的阳性转基因植株接种白叶枯病菌Y8生理小种，以同期栽培的非转基因植株02428为对照(接种6株，编号为1-6)，每株剪5片完全伸展的叶子的叶尖1-3cm。接种20天后，当病斑长度明显且稳定时调查病情，对每株叶片进行测量，其中图7中的5、6、9泳道的转基因植株在表1中标记为转基因植株1、2、3，图7中的11、12、14泳道转基因植株在表1中标记为转基因植株4、5、6号，计算病斑长度并统计平均值，根据方中达提出的抗性分级标准进行如下分级：

0级(I)：病斑长度0-0.2cm；

1级(HR)：病斑长度0.2-1.5cm；

3级(MR)：病斑长度1.5-3.0cm；

5级(MS)：病斑长度3.0-5.0cm；

7级(S)：病斑长度5.0-10.0cm；

9级(HS)：病斑长度大于10.0cm。

基因Me094转化植株对白叶枯病菌的抗病性鉴定结果见表1，表明本发明疣粒野生稻抗白叶枯病基因Me094转化植株对白叶枯病菌的抗性较非转基因植株有显著提升，表明本发明基因Me094为抗白叶枯病的新基因。

表1基因Me094转化植株抗白叶枯病的抗病性鉴定结果

实施例3-实施例7表明疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094为疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因，也证明本发明启动子为疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因启动子，实施例1-2表明，本发明启动子是一个叶片特异表达的启动子，属于组织特异性表达启动子，它能驱动外源基因主要在植株叶片中发挥作用。本发明疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子可为其它需要在叶面表达的抗病基因提供特异表达启动子，可以应用于水稻抗白叶枯病育种，对提高水稻对白叶枯病的的抗性具有重要的理论及实际意义。同时该启动子也可以应用于水稻其它叶面病害的防治。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所

<120> 疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子

<130> /

<160> 21

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1761

<212> DNA

<213> 疣粒野生稻（Oryza meyeriana）

<220>

<221> CAAT_signal

<222> (324)..(328)

<223> CAAT-box

<220>

<221> misc_feature

<222> (516)..(565)

<223> 预测的基础启动子序列

<220>

<221> TATA_signal

<222> (526)..(531)

<223> TATA-box

<220>

<221> TATA_signal

<222> (539)..(543)

<223> TATA-box

<220>

<221> misc_feature

<222> (556)..(556)

<223> 预测的转录起始位点

<220>

<221> misc_feature

<222> (602)..(651)

<223> 预测的基础启动子序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (642)..(642)

<223> 预测的转录起始位点

<220>

<221> CAAT_signal

<222> (728)..(731)

<223> CAAT-box

<220>

<221> CAAT_signal

<222> (829)..(832)

<223> CAAT-box

<220>

<221> TATA_signal

<222> (896)..(899)

<223> TATA-box

<220>

<221> misc_feature

<222> (1187)..(1237)

<223> 预测的基础启动子序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1228)..(1228)

<223> 预测的转录起始位点

<220>

<221> TATA_signal

<222> (1417)..(1420)

<223> TATA-box

<220>

<221> misc_feature

<222> (1535)..(1537)

<223> 翻译起始密码子ATG

<400> 1

agtgtagtag catagggcac gtggaatccc gtgtgaatca gcaaggacca ccttgcaagg 60

ctaaatactc ctgggtgacc gatagcgaag tagtaccgtg agggaaaggt gaaaagaacc 120

cccagtgggt agtgaaatag aacgtgaaac cgtgctgagc tcccaagcag tgggagggga 180

aagtgatctc tgaccgcgtg cctgttgaag aatgagccgg cgactcatag gcagtggctt 240

ggttaaggga acggaaccca ccggagccgt agcgaaagcg agtcttcata gggcgattgt 300

cactgcttat ggacccgaac ctgggcgatc tatctatgac caggatgaag cttggatgaa 360

actaagcaga ggtccgaacc gactgatgtt gaagaatcag cggatgagtt gtggttaggg 420

gggaaatgcc actcgaaccc agagcttgct ggttctcccc gaaatgcgtt gaggcacagt 480

agttaactgg acatctaggg gtaacgcact gtttcggtgc gggttgcgcg agtggtacca 540

aatcgaggca aactctaaat actagatatg acccaaaaat aacaggggtc aaggtcggcc 600

agcgagacga tgggggataa gcttcatcgt caagagggaa acagcccgga tcaccagcta 660

aggcccctaa atgaccgctc agtgataaag gaggtggggg tgcaaagaca gccaggaggt 720

ttgcctagaa gcagccaccc tttaaagagt gtgtaatagc tcattgatcg agcgcccttg 780

cgctgaagat gaacggggct aagtgatctg ccgaagctgt gggatgtcaa aatgcatcgg 840

taggggagcg ttccgcctta gagggaagca accgcgaaag cgggggtcga cgaagcggaa 900

gcgagaacgt cggcttgagt aacgaaaaca ttggtgagaa tccaatgccc cgaaaaccca 960

aggtttcctc cgcaaggttc gtccatggag ggtgagtcag ggcctaagat caggccgaaa 1020

ggcgtagtcg atggacaaca ggtcaatatt cctgtactac cccttgttgg tacggaggga 1080

cggaggaggc taggttagcc gaaagatggt tataggttta aggacacaag gtgaccctgc 1140

tttttcaggg taagaagggg tagagaaaat gcctcgagcc gaggtccgag taccaagcgc 1200

tgcagcgctg aagtatgagc cccgtggact agccattgct tctccacgag gctcatacca 1260

ggcgctacgg cgctgaagta tgtaacccat gccatactcc caggaaaagc tcgaacgacc 1320

ttcaacaaag gggtacctgt acccgaaacc gacacaggtg ggtaggtaga gaatacctag 1380

gggcgcgaga caactctctc taaggaactc ggcaaaatag ccccgtaact tcgggagaag 1440

gggtgccccc tcgcaaaagg gggtcgcagt gaccaggccc gggcgactgt ttaccaaaaa 1500

cacaggtctc cgcaaagtcg taagaccatg tatgggggct gacgcctgcc cagtgccgga 1560

aggtcaagga agttggtgaa ctgatgacag ggaagccggc gaccgaagcc ccggcgaacg 1620

gcggccgtaa ctataacggt cctaaggtag cgaaattcct tgtcgggtaa gttccgaccc 1680

gcacgaaagg cgtaacgatc tgggcactgt ctcggagaga gactcggtga agtagacatg 1740

tctgtgaaga tgcggactac c 1761

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> AD1引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> w is a, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> w is a, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> s is g, or c

<400> 2

tgwgnagwan casaga 16

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> AD2引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> w is a, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> w is a, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> w is a, or t

<400> 3

agwgnagwan cawagg 16

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> AD3引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> w is a, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n为次黄嘌呤核苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n为次黄嘌呤核苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> s is g, or c

<400> 4

cawcgncnga nasgga 16

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> AD4引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> w is a, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> w is a, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

wgtgnagwan canaga 16

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> AD5引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> s is g, or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n为次黄嘌呤核苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n为次黄嘌呤核苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> w is a, or t

<400> 6

tcstncgnac ntwgga 16

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ME094-1引物

<400> 7

gccaatccca gggaacagta a 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ME094-2引物

<400> 8

gcttcatagg gtctttctgt cc 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ME094-3引物

<400> 9

ggtagtccgc atcttcacag 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Me94Pr-1引物

<400> 10

gaggtccgag taccaagcg 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Me94Pr-2引物

<400> 11

tccgagacag tgcccagat 19

<210> 12

<211> 1195

<212> DNA

<213> 疣粒野生稻（Oryza meyeriana）

<220>

<221> CDS

<222> (62)..(784)

<223> Me094基因编码区

<400> 12

cgcggatcca cagcctactg atgatcagtc ggtggaaagt gaaatagaca tatctgtgaa 60

g atg cgg act acc tgc acc tgg aca gaa aga ccc tat gaa gct tta ctg 109

Met Arg Thr Thr Cys Thr Trp Thr Glu Arg Pro Tyr Glu Ala Leu Leu

1 5 10 15

ttc cct ggg att ggc ttt ggg cct ttc ctg cgc agc tta ggt gga agg 157

Phe Pro Gly Ile Gly Phe Gly Pro Phe Leu Arg Ser Leu Gly Gly Arg

20 25 30

cga aga agg ccc tcg gac aag tgc ggc aac tgc gac tgc gct gac aag 205

Arg Arg Arg Pro Ser Asp Lys Cys Gly Asn Cys Asp Cys Ala Asp Lys

35 40 45

agc cag tgc gtg aag aaa gga acc agc tat ggc gtc gtc ata gtt gat 253

Ser Gln Cys Val Lys Lys Gly Thr Ser Tyr Gly Val Val Ile Val Asp

50 55 60

gcc gag aag agc cac ttc gag atg gcg gaa ggg att gca tac gag aac 301

Ala Glu Lys Ser His Phe Glu Met Ala Glu Gly Ile Ala Tyr Glu Asn

65 70 75 80

gat ggc aag tgc aag tgc gtc acc aac tgc tct tgc acc gac tac aac 349

Asp Gly Lys Cys Lys Cys Val Thr Asn Cys Ser Cys Thr Asp Tyr Asn

85 90 95

tgc ggc aag aag gca gaa ggg agc ttg act gca aga ctc acc cgt cga 397

Cys Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ser Leu Thr Ala Arg Leu Thr Arg Arg

100 105 110

gca gag acg aaa gtc ggc ctt agt gat ccg acg gtg ccg agt gga agg 445

Ala Glu Thr Lys Val Gly Leu Ser Asp Pro Thr Val Pro Ser Gly Arg

115 120 125

gcc gtc gct caa cgg ata aaa gtt act cta ggg ata aca ggc tgg tct 493

Ala Val Ala Gln Arg Ile Lys Val Thr Leu Gly Ile Thr Gly Trp Ser

130 135 140

tcc cca aga gtc cac atc gac ggg aag gtt tgg cac ctc gat gtc ggc 541

Ser Pro Arg Val His Ile Asp Gly Lys Val Trp His Leu Asp Val Gly

145 150 155 160

tct tcg cca cct gga gct gta ggt ggt tcc aag ggt tgg cac ctc gat 589

Ser Ser Pro Pro Gly Ala Val Gly Gly Ser Lys Gly Trp His Leu Asp

165 170 175

gtc ggc tct tcg cca cct gga gct gta ggt ggt tcc aag ggt tgg gct 637

Val Gly Ser Ser Pro Pro Gly Ala Val Gly Gly Ser Lys Gly Trp Ala

180 185 190

gtt cgc cca tta atg cgg ttc gcg gat cca agc tta tcg atc aaa cca 685

Val Arg Pro Leu Met Arg Phe Ala Asp Pro Ser Leu Ser Ile Lys Pro

195 200 205

cag cga aaa caa gtt gag tta atc gcc gcg aga gat ctc tca acg aca 733

Gln Arg Lys Gln Val Glu Leu Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ser Thr Thr

210 215 220

tgt cgg aca agt gcg gca act gcg act gcg ctg aca aga gcc agt gcg 781

Cys Arg Thr Ser Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Thr Arg Ala Ser Ala

225 230 235 240

tga agaaaggaac cagctatggc gtcgtcatag ttgatgccga gaagagccac 834

ttcgagatgg cagaagggat tgtatacgag aacgatggca agtgcaagtg cgtcaccaac 894

tgctcttgca ccgactacaa ctgcggcaag tgaacaagac tatgcatgtg ggccccataa 954

tccagtgtca acagttatgt ccatgcatgc atgtatgcat gcttgctaaa taatgctttg 1014

tgttgtgtgc tcgtgtgact agctatcctg cgagtcacat gtgtgtctat gtatgtatgt 1074

gttgttgccg tgatgtgatg aagtgagtcc atcgtgacat gtatcactgt ttacttatgt 1134

gttcatgaaa cttaattaat tatggtgcat ttttagaatt attaaaaaaa aaaaaaaaaa 1194

a 1195

<210> 13

<211> 240

<212> PRT

<213> 疣粒野生稻（Oryza meyeriana）

<400> 13

Met Arg Thr Thr Cys Thr Trp Thr Glu Arg Pro Tyr Glu Ala Leu Leu

1 5 10 15

Phe Pro Gly Ile Gly Phe Gly Pro Phe Leu Arg Ser Leu Gly Gly Arg

20 25 30

Arg Arg Arg Pro Ser Asp Lys Cys Gly Asn Cys Asp Cys Ala Asp Lys

35 40 45

Ser Gln Cys Val Lys Lys Gly Thr Ser Tyr Gly Val Val Ile Val Asp

50 55 60

Ala Glu Lys Ser His Phe Glu Met Ala Glu Gly Ile Ala Tyr Glu Asn

65 70 75 80

Asp Gly Lys Cys Lys Cys Val Thr Asn Cys Ser Cys Thr Asp Tyr Asn

85 90 95

Cys Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ser Leu Thr Ala Arg Leu Thr Arg Arg

100 105 110

Ala Glu Thr Lys Val Gly Leu Ser Asp Pro Thr Val Pro Ser Gly Arg

115 120 125

Ala Val Ala Gln Arg Ile Lys Val Thr Leu Gly Ile Thr Gly Trp Ser

130 135 140

Ser Pro Arg Val His Ile Asp Gly Lys Val Trp His Leu Asp Val Gly

145 150 155 160

Ser Ser Pro Pro Gly Ala Val Gly Gly Ser Lys Gly Trp His Leu Asp

165 170 175

Val Gly Ser Ser Pro Pro Gly Ala Val Gly Gly Ser Lys Gly Trp Ala

180 185 190

Val Arg Pro Leu Met Arg Phe Ala Asp Pro Ser Leu Ser Ile Lys Pro

195 200 205

Gln Arg Lys Gln Val Glu Leu Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ser Thr Thr

210 215 220

Cys Arg Thr Ser Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Thr Arg Ala Ser Ala

225 230 235 240

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Me094的EST序列上游引物Me094-E（+）

<400> 14

ctggacagaa agaccctatg aa 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Me094的EST序列下游引物Me094-E（-）

<400> 15

caacccttgg aaccacctac 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 接头引物AP

<400> 16

cgcggatcca agcttatcga 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Me094的ORF序列上游引物Me094-F（+）

<400> 17

aagggattgc atacgagaac 20

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Me094的ORF序列下游引物Me094-F（-）

<400> 18

atcacatcac ggcaacaa 18

<210> 19

<211> 585

<212> DNA

<213> 疣粒野生稻（Oryza meyeriana）

<400> 19

gctgtaggtg gttccaaggg ttgggctgtt cgcccattaa tgcggttcgc ggatccaagc 60

ttatcgatca aaccacagcg aaaacaagtt gagttaatcg ccgcgagaga tctctcaacg 120

acatgtcgga caagtgcggc aactgcgact gcgctgacaa gagccagtgc gtgaagaaag 180

gaaccagcta tggcgtcgtc atagttgatg ccgagaagag ccacttcgag atggcagaag 240

ggattgtata cgagaacgat ggcaagtgca agtgcgtcac caactgctct tgcaccgact 300

acaactgcgg caagtgaaca agactatgca tgtgggcccc ataatccagt gtcaacagtt 360

atgtccatgc atgcatgtat gcatgcttgc taaataatgc tttgtgttgt gtgctcgtgt 420

gactagctat cctgcgagtc acatgtgtgt ctatgtatgt atgtgttgtt gccgtgatgt 480

gatgaagtga gtccatcgtg acatgtatca ctgtttactt atgtgttcat gaaacttaat 540

taattatggt gcatttttag aattattaaa aaaaaaaaaa aaaaa 585

<210> 20

<211> 522

<212> DNA

<213> 疣粒野生稻（Oryza meyeriana）

<400> 20

cgcggatcca cagcctactg atgatcagtc ggtggaaagt gaaatagaca tatctgtgaa 60

gatgcggact acctgcacct ggacagaaag accctatgaa gctttactgt tccctgggat 120

tggctttggg cctttcctgc gcagcttagg tggaaggcga agaaggccct cggacaagtg 180

cggcaactgc gactgcgctg acaagagcca gtgcgtgaag aaaggaacca gctatggcgt 240

cgtcatagtt gatgccgaga agagccactt cgagatggcg gaagggattg catacgagaa 300

cgatggcaag tgcaagtgcg tcaccaactg ctcttgcacc gactacaact gcggcaagaa 360

ggcagaaggg agcttgactg caagactcac ccgtcgagca gagacgaaag tcggccttag 420

tgatccgacg gtgccgagtg gaagggccgt cgctcaacgg ataaaagtta ctctagggat 480

aacaggctgg tcttccccaa gagtccacat cgacgggaag gt 522

<210> 21

<211> 564

<212> DNA

<213> 疣粒野生稻（Oryza meyeriana）

<400> 21

gtgaaataga catgtctgtg aagatgcgga ctacctgcac ctggacagaa agaccctatg 60

aagctttact gttccctggg attggctttg ggcctttcct gcgcagctta ggtggaaggc 120

gaagaaggcc cccttccggg ggggcccgag ccatcagtga gataccactc tggaagagct 180

cggattctaa ccttgtgtca gacccgcggg ccaagggaca gtctcaggta gacagtttct 240

atggggcgta ggcctcccaa aaggtaacgg aggcgtgcaa aggtttcctc gggccagacg 300

gacattggtc ctcgagtgca aaggcagaag ggagcttgac tgcaagactc acccgtcgag 360

cagagacgaa agtcggcctt agtgatccga cggtgccgag tggaagggcc gtcgttcaac 420

ggataaaagt tactctaggg ataacaggct gatcttcccc aagagtccac atcgacggga 480

aggtttggca cctcgatgtc ggctcttcgc cacctggagc tgtaggtggt tccaagggtt 540

gggctgttcg cccattaatg cggt 564

Claims

1.疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

2.权利要求1所述的疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子在驱动外源抗病基因在转基因植物的叶片特异表达以提高转基因植物抵御病害能力上的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的提高转基因植物抵御病害能力上的应用为提高转基因水稻抵御白叶枯病害能力上的应用。

4.权利要求1所述的疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子在转基因拟南芥中驱动下游基因叶片特异表达上的应用。

5.一种扩增权利要求1所述的疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因Me094启动子的引物，所述引物由上游引物和下游引物组成，所述上游引物由引物AD1、引物AD2、引物AD3、引物AD4和引物AD5组成，引物AD1的碱基序列如SEQID NO：2所示，引物AD2的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，引物AD3的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，引物AD4的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，引物AD5的碱基序列如SEQ ID NO：6所示，所述下游引物由引物ME094-1、引物ME094-2和引物ME094-3组成，所述引物ME094-1的碱基序列如SEQ IDNO：7所示，引物ME094-2的碱基序列如SEQ ID NO：8所示，引物ME094-3的碱基序列如SEQ ID NO：9所示。