CN103805632A

CN103805632A - 一种转基因茄子的制备方法

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Publication number: CN103805632A
Application number: CN201410041131.4A
Authority: CN
Inventors: 包崇来; 杜黎明; 毛伟海; 胡天华; 朱琴妹; 胡海娇; 何群燕
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-01-28
Filing date: 2014-01-28
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2034-01-28
Also published as: CN103805632B

Abstract

本发明涉及一种转基因茄子的制备方法，包括种子消毒、载体构建、预培养、浸染、分化和生根培养，选择培养基中包括IAA，ZT，Kan和Cef。本发明所述制备方法可以把各种优良农艺性状的调控基因转导到茄子中，从而可以快速提高茄子品质，加快育种进程。通过转基因工程，可以产生积累外源蛋白。转基因茄子的制备方法不仅是品种改良的有效方法，还可以作为生物工厂，应用到代谢工程上。

Description

一种转基因茄子的制备方法

技术领域

本发明涉及转基因植物的制备的方法，特别涉及转基因茄子的制备方法。

背景技术

茄子(Solanum melongena L.，2n＝24)起源于古印度，在热带和亚热带地区广泛种植，是我国的重要果菜之一。茄子极易受黄萎病、青枯病、枯萎病、绵疫病等多种病害以及线虫和各种昆虫的侵害，尽管有少数野生种质资源为抗病材料，但是它们所拥有的天然抗性不足以完全抵抗病虫害，而且不能在育种过程中被充分利用。在传统茄子育种中，由于连锁的毒害基因存在，导致育性不兼容，若想得到可育的后代，需要花费更长时间（Pratap et al.,2011）。分子生物学和农杆菌介导的基因转化的研究进展，可将克隆的重要农艺性状及抗病调控基因被基因转导人茄子优良品种中，因此可快速改良品种，提高抗病性，加速育种进程（Mariashibu et al.,2012）。如Rotino等(Rotino et al.,1997)采用基因工程手段，在茄子子房中特异表达生长素合成基因，使生长素含量大大增加，导致子房未经受精而直接膨大发育成果实，获得了单性结实品种，并在番茄、草莓、悬钩子、葡萄等蔬菜水果上利用同样的转基因工程，均得到单性结实品种（Rotino et al.,1997,2005;Ficcadenti et al.,1999;Mezzetti et al.,2004)。

到目前为止，关于茄子转基因的研究进展，已在多个文献中被公布。如以根为外植体，含0.1mg/L TDZ，3mg/L6-BA，100mg/L Kan和500mg/L Cef的MS固体培养基上，4周后可通过愈伤组织获得不定芽（Franklin et al.,2003）。以无菌苗子叶为外植体，在含2.5mg/L6-BA，0.5mg/L IAA，100mg/L Kan和500mg/LCef的MS培养基上进行再生培养，能获得再生苗(Prabhavathi and Yadav,2002)。Arpaia等以子叶为外植体，再生培养基选择0.5mgl/L ZEA,0.3mgl/L6-BA,0.2mgl/L KIN和0.1mgl/L NAA(Arpaia et al.,1997)。张兴国等以下胚轴为外植体，确定1mg/L的ZT和1-3mg/L的BA组合时均获得70%以上的芽再生率，150mg/L的Kan浓度为最适选择压（张兴国等2001）。Singh(2010)等以茎为外植体，携带有aadA基因的pPRV111A载体通过基因枪哄击，成功获得转基因茄子。Subramanyam等用茄子种子为外植体，在3mg/L的MS液体培养基中预培养18h后，含有100μM乙酰丁香酮，0.2%Silwett L-77的MS液体农杆菌悬浮液侵染20 min后，通过500mm Hg真空导入，在MS培养基上进行培养，获得转基因苗（Kondeti Subramanyam et al.,2013）。通常一般载体利用Kan作为抗性基因，Khan等利用pMAT21载体，构建无抗性基因的载体，以子叶为外植体，通过MS培养基，获得转基因苗。

虽然这些体系都能获得转基因苗，但是材料基因型非常重要，不同基因型材料的再生能力差异很大，也影响再生的途径（金丹丹等2004）。因此尽管已有这么多成功案例被公布，但是以浙江省大面积种植的紫红线茄基因型运用这些转基因体系时，不管是根、茎、带柄子叶还是叶片，作为外植体都不能获得转基因植株。作为一种重要的经济作物，茄子转基因研究是非常重要的，如果能充分利用高效的转基因体系，可以将一些重要而优良的农艺性状调控基因转导到茄子中，从而可以快速改良品种。因此结合本地育种目标，创建适合本地育种品种的转基因体系非常重要，可以大大提升本省人民喜欢的茄子品种的品质提升。

发明内容

为了解决现有技术中存在的不足，本发明提供了一种新的最有效最适宜紫红线茄的转基因方法，包括种子消毒、载体构建、预培养、浸染、分化和生根培养，其特征在于，预培养基中包括吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，简称IAA）和玉米素（Zeatin，简称ZT），选择培养基中包括IAA，ZT，卡那霉素（Kanamycin，简称Kan）和头孢氨苄（Cefotaxime，简称Cef）。

进一步地，IAA浓度选自0.3-0.8mg/L，ZT浓度为2mg/L，Kan浓度为25mg/L，Cef为500mg/L。

进一步地，IAA浓度为0.5mg/L，ZT浓度为2mg/L，Kan浓度为25mg/L，Cef浓度为500mg/L。

进一步地，种子消毒方法包括：种子经75%乙醇处理30s，10%NaClO表面消毒15min，无菌水洗涤4～5次。

进一步地，种子消毒后在MS固体培养基中培养，所述固体培养基中添加较低浓度的Cef。

进一步地，MS固体培养基包括3%蔗糖和200mg/LCef。

进一步地，载体的构建方法包括：引物序列为SmARF8-INT-F和SmARF8-INT-R，PCR克隆后获得294bp片段，PCR产物位于SmARF8基因 1609bp-1902bp区段；2个PCR片段分别以3'-5'和5'-3'方向构建到PBS-in载体玉米NIR1基因第二个内含子片段两端后，用SacⅠ和PstⅠ进行双酶切，获得含有内含子结构及2个PCR片段的片段A；将pCAMBIA1300进行改造，CaMV35S启动子亚克隆到pCAMBIA1300载体的EcoRI和SacI酶切位点之间，豌豆RubiscoE9基因的poly(A)序列插入到HindIII和PstI酶切位点之间，成功获得PCAMBIAI35S-1300载体。酶切后的片段A，用T4DNA连接酶构建到PCAMBIAI35S-1300载体上；将含有35S启动子、片段A和poly(A)终止子的载体经EcoRⅠ和HindⅢ酶切后，构建到PCAMBIAI35s-2300载体上，成为含有NPT II抗性基因的复合表达载体PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-INT。

进一步地，预培养的方法包括：超净台下将无菌苗的外植体，接种到预培养基上；25℃，16h光照/8h黑暗的条件下生长2天。

进一步地，分化培养的方法包括：农杆菌侵染后的外植体，在选择培养基上生长，直到未经愈伤分化而直接长出不定芽，从外植体上切下不定芽后继续在选择培养基上生长获得健壮分化苗。

进一步地，选用茎作为外植体进行预培养。

本发明的有益效果是：（1）由于茄子种子较大，10%NaClO表面消毒15min，并在MS发芽培养基中添加较低浓度的Cef，可抑制污染，获得无菌苗。（2）将2个SmARF8基因294bp的PCR扩增片段分别以相反方向构建到含有玉米NIR1基因第二个内含子结构两端，然后被转导到植物体内时，能形成发夹结构，从而达到干涉内源基因SmARF8，使它们不能进行转录表达的目的。（3）无菌苗的茎外植体在含0.5mg/L IAA浓度，2mg/L ZT激素培养基上生长，茎能未经愈伤分化，而直接长出不定芽，出芽效率达到80%。并经RT-PCR，qRT-PCR和Sourthen blot分析验证，转基因效果良好，成功获得茄子转基因植株。本发明所述转基因茄子的制备方法，可以把各种优良农艺性状的调控基因转导到茄子中，从而可以快速提高茄子品质，加快育种进程。通过转基因工程，可以产生积累外源蛋白，转基因茄子的制备方法不仅是品种改良的有效方法，还可以作为生物工厂，应用到代谢工程上。

附图说明

图1：PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-INT载体构建过程框架图。A：含有玉米NIR1基因第二个内含子的PBS-in载体，SmARF8基因的294bp PCR片段分别以相反方向构建到内含子区域两端，然后用SacⅠ和PstⅠ进行酶切，被命名为片段A。B：PCAMBIAI35S-1300-SmARF8-INT载体T-DNA区域。片段A被构建到载体上，受35S启动子启动表达。C：PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-INT载体T-DNA区域。含有35S启动子和终止子的区域经EcoRⅠ和HindⅢ酶切后，重组构建到PCAMBIAI35S-2300载体上。35S启动子启动NPT II基因和片段A的表达。基因转录表达方向用箭头表示，酶切位点用直线表示。

图2：含有PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-INT载体的转基因茄子发育过程。A、B：Kan抗性分化苗在0.5mgl/L IAA，2mgl/L ZT，25mgl/L Kan和500mgl/LCef的MS选择培养基生长与发育21d和28d；C：子叶外植体在同样培养基上没有出现分化苗；D：分化苗在选择培养基上继续伸长；E：分化苗在MS培养基上生根；F：生根后转基因植株转移到塑料钵中生长；G植株在温室中生长结果。

图3：非转基因对照和PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-INT融合载体导入的转基因植株(T0)的RT-PCR，qRT-PCR和Sourthern blot验证分析。A、B：RT-PCR和qRT-PCR分析鉴定SmARF8基因的转录表达水平。M：DNA marker。1：非转基因对照植株。2-6：转基因植株cDNA被扩增。C：RT-PCR验证过的转基因植株的Southern blot杂交分析。1-2：非转基因对照植株，3-7：转基因植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。这些具体的实施例仅仅是在不违背本发明精神下的有限列举，并不排除本领域的一般技术人员把现有技术和本发明结合而产生的其他具体的实施方案。

实施例1种子消毒及无菌苗的制备

材料：紫红线茄E666、E25、E22和E673。

本发明所述的消毒方法对紫红线茄消毒，所述消毒方法包括：精选的紫红线茄种子经75%乙醇处理30s，10%NaClO表面消毒15min，无菌水洗涤4～5次，接种到含3%蔗糖的MS固体培养基上（200mg/LCef），并以不加抗生素为对照。每瓶放置20粒种子，3次重复。在25℃±1℃，黑暗中培养一个星期后，光照强度为50μmol·m-2·s-2，每天光照16h的光照培养箱内继续生长21d，培育出无菌小苗。

采用现有技术的消毒方法对紫红线茄种子消毒，所述消毒方法为：精选的种子经75%乙醇处理30s，0.1%HgCl消毒1min和0.1%HgCl消毒2min两种消毒方式分别处理，无菌水洗涤4～5次，接种到含3%蔗糖的MS固体培养基上（200mg/LCef），不加抗生素为对照。每瓶放置20粒种子，3次重复。在25℃±1℃，黑暗中培养一个星期后，光照强度为50μmol·m^-2·s^-2，每天光照16h的光照培养箱内继续生长21d，培育出无菌小苗。

比较上述三种方法的消毒效果。采用现有技术中的0.1%HgCl消毒1min和0.1%HgCl消毒2min处理过的种子，播种在不含Cef抗生素的MS固体培养基上生长发芽后，消毒2min的种子不会污染，但是发芽率只有10%；而消毒1min的种子污染率为50%，发芽率也只有50%。因此这种HgCl消毒方式不适合茄子无菌苗的获得。采用本发明所述的消毒方法，10%NaClO消毒15min处理过的种子，播种在不含Cef抗生素的MS固体培养基上时，污染率为30%，但是发芽率达到80-90%。MS固体培养基中加入200mg/LCef，就不会发生污染事件，发芽率也没有受影响。因此本发明所述的10%NaClO消毒15min的种子消毒方法，以及将消毒后的种子播种在含200mg/LCef的MS固体培养基中培养，非常适合制备茄子的无菌苗，且发芽率高，效果明显优于现有技术的方法。

实施例2载体构建

根据茄子生长素响应因子SmARF8基因（FJ597628）cDNA序列设计引物SmARF8-INT-F和SmARF8-INT-R（表1），PCR克隆获得294bp片段，PCR产物位于SmARF8基因1609bp-1902bp区段。

表1引物序列

如图1所示，2个PCR片段分别以3'-5'和5'-3'方向构建到PBS-in载体玉米NIR1基因第二个内含子片段两端后，用SacⅠ和PstⅠ进行双酶切，获得含有内含子结构及2个PCR片段的部分，被命名为片段A。将pCAMBIA1300进行改造，CaMV35S启动子亚克隆到pCAMBIA1300载体的EcoRI和SacI酶切位点之间，豌豆Rubisco E9基因的poly(A)序列插入到HindIII和PstI酶切位点之间，成功获得PCAMBIAI35S-1300载体。酶切后的片段A，用T4DNA连接酶构建到PCAMBIAI35S-1300载体上。将含有35S启动子、片段A和终止子的载体经EcoRⅠ和HindⅢ酶切后，构建到PCAMBIAI35s-2300载体上，成为含有NPT II抗性基因的复合表达载体。经测序验证后命名为PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-INT。

首先将SmARF8基因294bp的PCR扩增片段构建到含有玉米NIR1基因第二个内含子结构的PBS-in载体上，以至于当这个片段转导到植物体内时，能形成发夹结构，从而达到干涉内源基因SmARF8，使它们不能进行转录表达的目的。

一般适合于转基因的表达载体均含有GUS报告基因，但是这些报告基因的存在是不利于转基因植株在育种上的应用的。因此使用不含GUS的报告基因的载体进行转基因具有非常重大的意义的。我们选择PCAMBIAI35S-2300载体，但是该载体不含有可以利用的35S-启动子-终止子序列，不能启动外源基因的表达。因此我们将可以形成发夹结构的片段A先构建到PCAMBIAI35S-1300载体上，产生35S启动子-片段A-终止子的完整结构，再经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，连接到PCAMBIAI35S-2300载体上，从而获得融合表达载体PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-INT。

实施例3茄子预培养、侵染、分化和生根

茄子预培养的培养基选择含不同浓度IAA和ZT的MS培养基，命名为ZM2培养基，具体浓度见表2。超净台下将实施例1中的无菌苗的茎切成0.5cm长的片段作为外植体，并切下带柄子叶作为外植体做对照，分别接种在含不同浓度IAA和ZT激素的MS培养基（见表2）上进行预培养，25℃，16h光照/8h黑暗（光强为50μmol·m^-2·s^-2)的生长室内生长，预培养2天。将融合表达载体PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-INT经电击转化转入农杆菌EH105菌株中，挑取单菌落，在5ml YEP（含50mg/L的Kan和链霉素）液体培养基中28℃震荡培养过夜，倒入50ml菌液继续培养5h，直到OD值为0.4～0.7。菌液700g，离心5min后，去上清，沉淀用等体积MS液体培养基重新悬浮。无菌外植体预培养 2d后，在所述农杆菌悬浮液中浸润5min，在无菌滤纸上沥干，然后重置回预培养的瓶子中继续培养。

融合表达载体pCAMBIA35S-2300带有Kan报告基因，因此选择培养基中须加入适合浓度的Kan，并加入Cef抗生素以抵抗农杆菌。将经农杆菌侵染后的茎外植体和子叶外植体在预培养基上共培养2天后，分别转移到含有25mg/L、50mg/L、100mg/L Kan和500mg/L Cef的MS选择培养基（激素浓度同预培养基，见表2）上继续生长，直到获得不定芽。外植体经农杆菌侵染后转移到选择培养基上继续生长，当Kan浓度为50mg/L和100mg/L的时候，外植体生长7d后会褐化死亡；当Kan浓度降低到25mg/L时，外植体生长良好，因此表明低浓度的Kan，例如25mg/L浓度为较好的选择压。

采用无菌苗的茎外植体经农杆菌侵染后在各种不同激素浓度的选择培养基上生长21d后，观察各种培养基上的外植体生长。结果如图2和表3所示，在含ZM2-8激素浓度的选择培养基上的外植体，生长情况最佳，大部分茎能未经愈伤分化，而直接长出不定芽，出芽效率达到80%（图2，A-B；表3）；在含有ZM2-7和ZM2-9激素浓度的选择培养基上的外植体，其出芽率也较高，分别为32%和33.3%（如表3所示）。而选用其他的浓度培养基组合的出芽效率都低于30%，有的外植体几乎全部褐化以至死亡。外植体经茎分化和伸长后，获得不定芽。

采用带柄子叶外植体经农杆菌侵染后在各种不同激素浓度的选择培养基上生长21d后，结果显示各种浓度的培养基上都没有长出不定芽，且在培养基上生长7天后，开始呈现褐化，最后死亡。

因此本发明选择茎为外植体，并以包含IAA浓度为0.5mg/L，ZT浓度为2mg/L，Kan浓度为25mg/L，Cef浓度为500mg/L的MS培养基作为紫红线茄转基因体系的选择培养基，其效果优于采用带柄子叶外植体进行培养。

表2：加入MS培养基的玉米素（ZT）和吲哚乙酸(IAA)的不同浓度

表3：茎在不同激素浓度分化培养基分化效率

利用本发明所述方法获得80株分化苗。长到适宜大小后，尽量切除干净外植体，转移到玻璃瓶中，在选择培养基上继续延伸生长。60d后，转基因苗在不加任何激素的MS培养基上进行生根培养，能产生健壮根系，成功获得完整植株。将植株转移到含有营养土的塑料钵中，在玻璃温室中继续生长，收集获得种子。

本发明所述方法采用以茎为外植体，分化苗再生率最高能达到80%，大大提高了茄子转基因效率，优化了转基因体系。并且浙江省广泛种植的茄子品种只适用于该转基因方法。由于不用产生愈伤组织，可以直接产生不定芽，从而可以大大缩短了培养时间，能够快速获得转基因苗。

实施例6RT-PCR和qRT-PCR分析验证

为了检测转基因苗的基因干涉效果，半定量RT-PCR分析检测SmARF8基因的转录表达情况。转基因苗及对照非转基因苗的叶片，利用RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取总RNA后，用SuperScript Transcriptase III（生工生物工程公司）逆转录成第一链cDNA。以干涉载体构建引物SmARF8-INT为引物，进行PCR检测，茄子ACTINE基因为对照，设计引物，SmActin-F和SmActin-R（表1）。PCR扩增条件为：首先94℃变性2min；然后94℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，运行28循环。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

根据SmARF8基因序列设计引物SmARF8-Q-F和SmARF8-Q-R（表1），进行荧光实时定量qRT-PCR分析验证。同样以ACTIN基因为对照。根据RealMasterMix(SYBR Green)试剂盒（天根生化科技有限公司），ABI Prism STEP-ONE PLUS real-time thermal cycler仪器(Applied Biosystems,Carlsbad,CA,USA)进行qRT-PCR分析。首先94℃变性10min；然后94℃，20s,60℃，60s，运行40循环，同时进行溶解曲线分析，确保PCR产物唯一性。三次重复。

为了分析验证转基因植株的真实性及SmARF8基因RNA干涉效果，随机选择实施例5所得的20株发育良好生长健壮及外形正常的假定转基因苗，以及非转基因苗，提取总RNA，逆转录成第一链cDNA后进行PCR分析。RT-PCR结果显示，以SmARF8-INT-F和SmARF8-INT-R为引物，在对照非转基因植株中，通过PCR扩增能获得300bp左右大小的清晰条带，表明了内源基因SmARF8显著表达。而转基因植株中有15株显示SmARF8表达量显著降低，选择其中5株作图示说明，结果如图3A所示，这5株植株中的SmARF8基因表达量明显低于对照转基因植株，特别是株系4中微弱表达，而株系6几乎不表达。这个结果说明了这些转基因植株已成功导入融合表达载体PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-INT，并且RNA干涉效果较良好，以至于内源基因SmARF8表达量显著下降，或者几乎不表达。荧光定量qRT-PCR分析进一步验证了该结果（如图2B所示）。因此本发明所述的方法能成功获得茄子转基因植株。尽管没有GUS报告基因，但是随机选择的20株分化苗中，其中15株为效果较好的转基因植株，转基因植株所占比例达到75%。因此不含有报告基因的载体可以在本本发明中被应用，有利于转基因苗可以在以后的育种中直接利用，且本发明的转基因效率较高。

实施例7Southern blot分析验证

为了进行Southern blot分析转基因植株的拷贝数，根据CTAB法，以及改良的茄子DNA提取体系（杜黎明等2009），分别从转基因与非转基因植株新鲜叶片中提取基因组DNA。10μg DNA通过限制性内切酶EcoRI酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳后，转移到Hybond尼龙膜上。根据质粒上的抗性基因NPTII序列设计引物，NPTII–F和NPTII–R（表1），获得700bp PCR片段为探针，α-[³²P](New England Biolabs)进行同位素标记，根据Sambrook等（1989）方法进行杂交。室温下，将膜分别用2×SSC+0.1%SDS和1×SSC+0.2%SDS冲洗，然后65℃下，分别在0.5×SSC+0.1%SDS和0.1×SSC+0.1%SDS中漂洗30min，晾干分析结果。

经RT-PCR和qRT-PCR分析验证的5株转基因株系和2株非转基因植株DNA，EcoRⅠ酶切后，以同位素³²P标记过的NPTⅡ基因为探针，进行杂交。结果显示转基因株系中有1个条带，表明它们含有一个T-DNA插入拷贝，而非转基因株系中没有条带，说明没有T-DNA插入拷贝存在。这个实验结果进一步验证了这些转基因植株已经成功插入外源载体PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-INT。将这5株转基因株系在温室中生长，果实成熟后收集种子。

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ttcccagcaa accttttctg atatg 25

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgctttgatg atgaggacga agac 24

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctagtggtc gtacaactg 19

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cagcagtggt ggtgaacata taac 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaggctattc ggctatgact g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atcgggaggg gcgataccgt a 21

Claims

1.一种转基因茄子的制备方法，包括种子消毒、载体构建、预培养、浸染、分化和生根培养，其特征在于，预培养基中包括吲哚乙酸和玉米素，选择培养基中包括吲哚乙酸，玉米素，卡那霉素和头孢氨苄。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，吲哚乙酸浓度选自0.3-0.8mg/L，玉米素浓度为2 mg/L，卡那霉素浓度为25 mg/L，头孢氨苄浓度为500 mg/L。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，吲哚乙酸浓度为0.5mg/L，玉米素浓度为2 mg/L，卡那霉素浓度为25 mg/L，头孢氨苄浓度为500 mg/L。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，种子消毒方法包括：种子经75 % 乙醇处理30s，10 % NaClO表面消毒15 min，无菌水洗涤4～5 次。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，种子消毒后在MS固体培养基中培养，所述固体培养基中添加较低浓度的头孢氨苄。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，MS固体培养基包括3%蔗糖和200 mg/L头孢氨苄。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，载体的构建方法包括：引物序列为SmARF8-INT-F和SmARF8-INT-R， PCR克隆后获得294 bp片段，PCR产物位于SmARF8基因1609bp-1902bp区段；2个PCR片段分别以3'-5'和5'-3'方向构建到PBS-in载体玉米NIR1基因第二个内含子片段两端后，用SacⅠ和PstⅠ进行双酶切，获得含有内含子结构及2个PCR片段的片段A；将pCAMBIA1300进行改造，CaMV 35S启动子亚克隆到pCAMBIA1300载体的EcoRI和SacI酶切位点之间，豌豆Rubisco E9基因的poly (A)序列插入到HindIII 和PstI酶切位点之间，成功获得PCAMBIAI 35S-1300载体；酶切后的片段A，用T4 DNA连接酶构建到PCAMBIAI 35S-1300载体上；将含有35S启动子、片段A和poly (A)终止子的载体经EcoRⅠ和HindⅢ酶切后，构建到PCAMBIAI 35s-2300载体上，成为含有NPT II抗性基因的复合表达载体PCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，预培养的方法包括：超净台下将无菌苗的外植体，接种到预培养基上；25 ℃，16 h光照/8 h黑暗的条件下生长2天。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，分化培养的方法包括：农杆菌侵染后的外植体，在选择培养基上生长，直到未经愈伤而直接长出不定芽，从外植体上切下不定芽后继续在选择培养基上生长获得健壮分化苗。

10.根据权利要求8和9之一所述的制备方法，其特征在于，选用茎作为外植体进行预培养。