CN110283844A - 一种快速获得茄子转基因植株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速获得茄子转基因植株的方法，属于转基因植株获取方法技术领域。为解决茄子遗传转化效率低的问题，本发明提供了一种快速获得茄子转基因植株的方法，先在再生培养基上预培养茄子外植体，对携带cryIIIA基因的农杆菌进行活化，以农杆菌菌液侵染茄子外植体，经侵染的外植体在再生培养基上培养，使农杆菌能够转化外植体细胞；再将外植体转移到选择培养基上继续培养，使外植体形成不定芽，进而形成完整植株。本发明再生培养基和选择培养基中均含有噻苯隆和N6‑[异戊烯]‑腺嘌呤；其诱导效率高，可提高外植体形成不定芽的个数，再生效率的增长率可达到163％。本发明提高了转基因茄子育种的转化效率，缩短了转化周期。

Description

一种快速获得茄子转基因植株的方法
技术领域
本发明属于转基因植株获取方法技术领域，尤其涉及一种快速获得茄子转基因植株的方法。
背景技术
茄子营养丰富，含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素及钙、磷、铁等多种营养成分，是餐桌上常见的蔬菜之一。茄子在种植过程中容易受到黄萎病、青枯病、棉疫病等多种病害以及线虫和各种昆虫的侵害，造成茄子的大面积减产和质量的下降。尽管有少数野生种质资源为抗病材料，但是它们所拥有的天然抗性不足以完全抵抗病虫害，而且不能在育种过程中被充分利用。
在传统茄子育种中，由于连锁的毒害基因存在，导致育性不兼容，若想得到可育的后代，需要花费更长时间。分子生物学和农杆菌介导的基因转化的研究进展，可将克隆的重要农艺性状及抗病调控基因转导入茄子优良品种中，因此可快速改良品种，提高抗病虫害的性能，加速育种进程。
但茄子的离体再生难度较大，且体胚的诱导、成熟和萌发需要较长的时间，周期长、成本高，转化成功率较低，迄今为止，尚未有一套稳定完善的农杆菌介导的茄子遗传转化培养体系。
发明内容
为解决茄子遗传转化效率低的问题，本发明提供了一种快速获得茄子转基因植株的方法。
本发明的技术方案：
一种快速获得茄子转基因植株的方法，步骤如下：
步骤一、在再生培养基上预培养茄子外植体，所述再生培养基中含有0.1～0.5μg/mL噻苯隆和10～15μg/mLN6-[异戊烯]-腺嘌呤；
步骤二、农杆菌活化：准备一株携带有重组DNA的农杆菌，其重组DNA为cryIIIA基因和可选择标记基因，该标记基因对重组DNA转化的细胞具有卡那霉素抗性，将这株农杆菌接种于含有卡那霉素的YEB固体培养基上，一定温度下进行暗培养至长出农杆菌单菌落，挑单菌落接种于含有卡那霉素的YEB液体培养基中，一定温度下进行振荡培养，将振荡培养所得菌液转入离心管中，4000r/min离心，收集菌体后用等体积的无菌水悬浮菌液，得到农杆菌菌悬液待用；
步骤三、农杆菌侵染：将步骤一完成预培养的茄子外植体浸入步骤二备好的农杆菌菌悬液中，浸没10分钟完成农杆菌的侵染；
步骤四、将步骤三经农杆菌侵染过的茄子外植体置于再生培养基上培养，使农杆菌能够转化茄子外植体细胞；
步骤五、将经过再生培养基培养的茄子外植体转移到选择培养基上继续培养，使外植体形成不定芽，进而形成根、芽、叶俱全的，携带cryⅢA基因的抗鞘翅目昆虫的转基因茄子的完整植株。
进一步的，步骤一所述茄子外植体为茄子的叶片外植体。
进一步的，步骤一所述再生培养基的组分还包括：15～20mM NH4NO3、12～16mMKNO3、2～2.5mM CaCl2·2H2O、1～1.2mM MgSO4·7H2O、0.8～1.0mM KH2PO4、3～4μM KI、0.05～0.08mMH3BO3、0.05～0.08mM MnSO4·4H2O、20～25μM ZnSO4·7H2O、0.5～0.8μM Na2MoO4·2H2O、0.05～0.08μM CuSO4·5H2O、0.05～0.08μM CoCl2·6H2O、0.05～0.08mM EDTA，pH5.7～5.9。
进一步的，所述再生培养基的组分还包括：120～150mg/L肌醇、1.0～1.5mg/L烟酸、1.0～1.5mg/L盐酸吡哆醇、0.2～0.5mg/L盐酸硫胺素，20～50g/L蔗糖和5～8g/L琼脂。
进一步的，步骤一所述茄子外植体在再生培养基上预培养的条件为27℃温度下培养2～3天。
进一步的，步骤二所述农杆菌接种于YEB固体培养基上暗培养的条件为27℃培养48h，所述农杆菌液体培养的条件为27℃温度下以转速220r/min振荡培养至培养液中农杆菌的OD600值为0.4～0.6。
进一步的，步骤四所述侵染过的茄子外植体在再生培养基上的培养条件为27℃黑暗条件下培养1～3天。
进一步的，步骤五所述选择培养基的配方为：40～70μg/mL的卡那霉素、150～300μg/mL奥格门汀、500μg/mL头孢噻肟、0.1～0.5μg/mL噻苯隆、10～15μg/mLN6-[异戊烯]-腺嘌呤、15～20mM NH4NO3、12～16mM KNO3、2～2.5mM CaCl2·2H2O、1～1.2mM MgSO4·7H2O、0.8～1.0mM KH2PO4、3～4μM KI、0.05～0.08mMH3BO3、0.05～0.08mM MnSO4·4H2O、20～25μMZnSO4·7H2O、0.5～0.8μM Na2MoO4·2H2O、0.05～0.08μM CuSO4·5H2O、0.05～0.08μMCoCl2·6H2O、0.05～0.08mM EDTA，120～150mg/L肌醇、1.0～1.5mg/L烟酸、1.0～1.5mg/L盐酸吡哆醇、0.2～0.5mg/L盐酸硫胺素、20～50g/L蔗糖和5～8g/L琼脂、pH5.7～5.9。
进一步的，步骤五所述茄子外植体在选择培养基上的培养条件为先在27℃温度下暗培养5～8天，再将选择培养基转移至27℃、光照度2000lx、每日光照时间为12h的光照培养的条件继续培养。
进一步的，以再生茄子植株的叶片为材料提取基因组DNA，利用cryIIIA基因的序列设计特异引物对DNA进行扩增，以质粒和水为对照，在cryIIIA基因相应位置出现的扩展条带表示转基因侵染成功。
本发明的有益效果：
本发明提供的农杆菌介导的茄子遗传转化培养体系中，用于转基因茄子的再生培养基和选择培养基含有丰富的微量元素，满足植物生长的需求，在再生培养基和选择培养基中添加噻苯隆和N6-[异戊烯]-腺嘌呤不仅诱导效率高，不定芽的分化率高，而且成本低，大大节约了组培成本，在转基因茄子的选育过程中可提高外植体形成不定芽的个数，提高再生效率，其再生效率的增长率可达到163％。本发明不仅解决了现有转基因茄子育种过程中茄子不定芽再生培养基中再生效率差和再生芽质量不稳定的突出问题，还提高了转基因茄子育种的转化效率，缩短了转化周期，能够快速获得茄子转基因植株。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
本实施例提供了一种快速获得茄子转基因植株的方法，步骤如下：
步骤一、在再生培养基上预培养茄子外植体，所述再生培养基中含有0.1～0.5μg/mL噻苯隆和10～15μg/mLN6-[异戊烯]-腺嘌呤；
步骤二、农杆菌活化：准备一株携带有重组DNA的农杆菌，其重组DNA为cryIIIA基因和可选择标记基因，该标记基因对重组DNA转化的细胞具有卡那霉素抗性，将这株农杆菌接种于含有卡那霉素的YEB固体培养基上，一定温度下进行暗培养至长出农杆菌单菌落，挑单菌落接种于含有卡那霉素的YEB液体培养基中，一定温度下进行振荡培养，将振荡培养所得菌液转入离心管中，4000r/min离心，收集菌体后用等体积的无菌水悬浮菌液，得到农杆菌菌悬液待用；
步骤三、农杆菌侵染：将步骤一完成预培养的茄子外植体浸入步骤二备好的农杆菌菌悬液中，浸没10分钟完成农杆菌的侵染；
步骤四、将步骤三经农杆菌侵染过的茄子外植体置于再生培养基上培养，使农杆菌能够转化茄子外植体细胞；
步骤五、将经过再生培养基培养的茄子外植体转移到选择培养基上继续培养，使外植体形成不定芽，进而形成根、芽、叶俱全的，携带cryⅢA基因的抗鞘翅目昆虫的转基因茄子完整植株。
实施例2
本实施例提供了一种快速获得茄子转基因植株的方法，步骤如下：
步骤一、在再生培养基上预培养茄子外植体，所述再生培养基中含有0.1～0.5μg/mL噻苯隆和10～15μg/mLN6-[异戊烯]-腺嘌呤；
步骤二、农杆菌活化：准备一株携带有重组DNA的农杆菌，其重组DNA为cryIIIA基因和可选择标记基因，该标记基因对重组DNA转化的细胞具有卡那霉素抗性，将这株农杆菌接种于含有卡那霉素的YEB固体培养基上，一定温度下进行暗培养至长出农杆菌单菌落，挑单菌落接种于含有卡那霉素的YEB液体培养基中，一定温度下进行振荡培养，将振荡培养所得菌液转入离心管中，4000r/min离心，收集菌体后用等体积的无菌水悬浮菌液，得到农杆菌菌悬液待用；
步骤三、农杆菌侵染：将步骤一完成预培养的茄子外植体浸入步骤二备好的农杆菌菌悬液中，浸没10分钟完成农杆菌的侵染；
步骤四、将步骤三经农杆菌侵染过的茄子外植体置于再生培养基上培养，使农杆菌能够转化茄子外植体细胞；
步骤五、将经过再生培养基培养的茄子外植体转移到选择培养基上继续培养，使外植体形成不定芽，进而形成根、芽、叶俱全的，携带cryⅢA基因的抗鞘翅目昆虫的转基因茄子完整植株。
本实施例中的茄子外植体为茄子叶片外植体。
实施例3
本实施例提供了一种快速获得茄子转基因植株的方法，步骤如下：
步骤一、在再生培养基上预培养茄子叶片外植体，再生培养基的组分包括：0.1～0.5μg/mL噻苯隆、10～15μg/mLN6-[异戊烯]-腺嘌呤、15～20mM NH4NO3、12～16mM KNO3、2～2.5mM CaCl2·2H2O、1～1.2mM MgSO4·7H2O、0.8～1.0mM KH2PO4、3～4μM KI、0.05～0.08mMH3BO3、0.05～0.08mM MnSO4·4H2O、20～25μM ZnSO4·7H2O、0.5～0.8μM Na2MoO4·2H2O、0.05～0.08μM CuSO4·5H2O、0.05～0.08μM CoCl2·6H2O、0.05～0.08mM EDTA，pH5.7～5.9。
步骤二、农杆菌活化：准备一株携带有重组DNA的农杆菌，其重组DNA为cryIIIA基因和可选择标记基因，该标记基因对重组DNA转化的细胞具有卡那霉素抗性，将这株农杆菌接种于含有卡那霉素的YEB固体培养基上，一定温度下进行暗培养至长出农杆菌单菌落，挑单菌落接种于含有卡那霉素的YEB液体培养基中，一定温度下进行振荡培养，将振荡培养所得菌液转入离心管中，4000r/min离心，收集菌体后用等体积的无菌水悬浮菌液，得到农杆菌菌悬液待用；
步骤三、农杆菌侵染：将步骤一完成预培养的茄子叶片外植体浸入步骤二备好的农杆菌菌悬液中，浸没10分钟完成农杆菌的侵染；
步骤四、将步骤三经农杆菌侵染过的茄子叶片外植体置于再生培养基上培养，使农杆菌能够转化茄子叶片外植体细胞；
步骤五、将经过再生培养基培养的茄子外植体转移到选择培养基上继续培养，使外植体形成不定芽，进而形成根、芽、叶俱全的，携带cryⅢA基因的抗鞘翅目昆虫的转基因茄子完整植株。
实施例4
本实施例提供了一种快速获得茄子转基因植株的方法，步骤如下：
步骤一、在再生培养基上预培养茄子叶片外植体，再生培养基的组分包括：0.1～0.5μg/mL噻苯隆、10～15μg/mLN6-[异戊烯]-腺嘌呤、15～20mM NH4NO3、12～16mM KNO3、2～2.5mM CaCl2·2H2O、1～1.2mM MgSO4·7H2O、0.8～1.0mM KH2PO4、3～4μM KI、0.05～0.08mMH3BO3、0.05～0.08mM MnSO4·4H2O、20～25μM ZnSO4·7H2O、0.5～0.8μM Na2MoO4·2H2O、0.05～0.08μM CuSO4·5H2O、0.05～0.08μM CoCl2·6H2O、0.05～0.08mM EDTA、120～150mg/L肌醇、1.0～1.5mg/L烟酸、1.0～1.5mg/L盐酸吡哆醇、0.2～0.5mg/L盐酸硫胺素，20～50g/L蔗糖和5～8g/L琼脂，pH5.7～5.9。
步骤二、农杆菌活化：准备一株携带有重组DNA的农杆菌，其重组DNA为cryIIIA基因和可选择标记基因，该标记基因对重组DNA转化的细胞具有卡那霉素抗性，将这株农杆菌接种于含有卡那霉素的YEB固体培养基上，一定温度下进行暗培养至长出农杆菌单菌落，挑单菌落接种于含有卡那霉素的YEB液体培养基中，一定温度下进行振荡培养，将振荡培养所得菌液转入离心管中，4000r/min离心，收集菌体后用等体积的无菌水悬浮菌液，得到农杆菌菌悬液待用；
步骤三、农杆菌侵染：将步骤一完成预培养的茄子叶片外植体浸入步骤二备好的农杆菌菌悬液中，浸没10分钟完成农杆菌的侵染；
步骤四、将步骤三经农杆菌侵染过的茄子叶片外植体置于再生培养基上培养，使农杆菌能够转化茄子叶片外植体细胞；
步骤五、将经过再生培养基培养的茄子外植体转移到选择培养基上继续培养，使外植体形成不定芽，进而形成根、芽、叶俱全的，携带cryⅢA基因的抗鞘翅目昆虫的转基因茄子完整植株。
实施例5
本实施例提供了一种快速获得茄子转基因植株的方法，步骤如下：
步骤一、在再生培养基上以27℃温度预培养茄子叶片外植体2～3天；
再生培养基的组分包括：0.1～0.5μg/mL噻苯隆、10～15μg/mLN6-[异戊烯]-腺嘌呤、15～20mM NH4NO3、12～16mM KNO3、2～2.5mM CaCl2·2H2O、1～1.2mM MgSO4·7H2O、0.8～1.0mM KH2PO4、3～4μM KI、0.05～0.08mMH3BO3、0.05～0.08mM MnSO4·4H2O、20～25μMZnSO4·7H2O、0.5～0.8μM Na2MoO4·2H2O、0.05～0.08μM CuSO4·5H2O、0.05～0.08μMCoCl2·6H2O、0.05～0.08mM EDTA、120～150mg/L肌醇、1.0～1.5mg/L烟酸、1.0～1.5mg/L盐酸吡哆醇、0.2～0.5mg/L盐酸硫胺素，20～50g/L蔗糖和5～8g/L琼脂，pH5.7～5.9。
步骤二、农杆菌活化：准备一株携带有重组DNA的农杆菌，其重组DNA为cryIIIA基因和可选择标记基因，该标记基因对重组DNA转化的细胞具有卡那霉素抗性，将这株农杆菌接种于含有卡那霉素的YEB固体培养基上，一定温度下进行暗培养至长出农杆菌单菌落，挑单菌落接种于含有卡那霉素的YEB液体培养基中，一定温度下进行振荡培养，将振荡培养所得菌液转入离心管中，4000r/min离心，收集菌体后用等体积的无菌水悬浮菌液，得到农杆菌菌悬液待用；
步骤三、农杆菌侵染：将步骤一完成预培养的茄子叶片外植体浸入步骤二备好的农杆菌菌悬液中，浸没10分钟完成农杆菌的侵染；
步骤四、将步骤三经农杆菌侵染过的茄子叶片外植体置于再生培养基上培养，使农杆菌能够转化茄子叶片外植体细胞；
步骤五、将经过再生培养基培养的茄子外植体转移到选择培养基上继续培养，使外植体形成不定芽，进而形成根、芽、叶俱全的，携带cryⅢA基因的抗鞘翅目昆虫的转基因茄子完整植株。
本实施例将茄子叶片外植体置于再生培养基上进行预培养，是为了促进茄子叶片外植体的细胞分裂，活化外植体细胞，使其在后续农杆菌侵染过程中更易于被转化，提高转化效率。
实施例6
本实施例提供了一种快速获得茄子转基因植株的方法，步骤如下：
步骤一、在再生培养基上以27℃温度预培养茄子叶片外植体2～3天；
再生培养基的组分包括：0.1～0.5μg/mL噻苯隆、10～15μg/mLN6-[异戊烯]-腺嘌呤、15～20mM NH4NO3、12～16mM KNO3、2～2.5mM CaCl2·2H2O、1～1.2mM MgSO4·7H2O、0.8～1.0mM KH2PO4、3～4μM KI、0.05～0.08mMH3BO3、0.05～0.08mM MnSO4·4H2O、20～25μMZnSO4·7H2O、0.5～0.8μM Na2MoO4·2H2O、0.05～0.08μM CuSO4·5H2O、0.05～0.08μMCoCl2·6H2O、0.05～0.08mM EDTA、120～150mg/L肌醇、1.0～1.5mg/L烟酸、1.0～1.5mg/L盐酸吡哆醇、0.2～0.5mg/L盐酸硫胺素，20～50g/L蔗糖和5～8g/L琼脂，pH5.7～5.9。
条件为27℃温度下以转速220r/min振荡培养。步骤二所述农杆菌接种于YEB固体培养基上暗培养的条件为27℃培养48h，所述农杆菌液体培养的
步骤二、农杆菌活化：准备一株携带有重组DNA的农杆菌，其重组DNA为cryIIIA基因和可选择标记基因，该标记基因对重组DNA转化的细胞具有卡那霉素抗性，将这株农杆菌接种于含有卡那霉素的YEB固体培养基上，27℃温度下暗培养48h，长出农杆菌单菌落，挑单菌落接种于含有卡那霉素的YEB液体培养基中，27℃温度下以转速220r/min进行振荡培养，待培养液中农杆菌的OD600值为0.4～0.6，将振荡培养所得菌液转入离心管中，4000r/min离心，收集菌体后用等体积的无菌水悬浮菌液，得到农杆菌菌悬液待用；
步骤三、农杆菌侵染：将步骤一完成预培养的茄子叶片外植体浸入步骤二备好的农杆菌菌悬液中，浸没10分钟完成农杆菌的侵染；
步骤四、将步骤三经农杆菌侵染过的茄子叶片外植体置于再生培养基上培养，使农杆菌能够转化茄子叶片外植体细胞；
步骤五、将经过再生培养基培养的茄子外植体转移到选择培养基上继续培养，使外植体形成不定芽，进而形成根、芽、叶俱全的，携带cryⅢA基因的抗鞘翅目昆虫的转基因茄子完整植株。
实施例7
本实施例提供了一种快速获得茄子转基因植株的方法，步骤如下：
步骤一、在再生培养基上以27℃温度预培养茄子叶片外植体2～3天；
再生培养基的组分包括：0.1～0.5μg/mL噻苯隆、10～15μg/mLN6-[异戊烯]-腺嘌呤、15～20mM NH4NO3、12～16mM KNO3、2～2.5mM CaCl2·2H2O、1～1.2mM MgSO4·7H2O、0.8～1.0mM KH2PO4、3～4μM KI、0.05～0.08mMH3BO3、0.05～0.08mM MnSO4·4H2O、20～25μMZnSO4·7H2O、0.5～0.8μM Na2MoO4·2H2O、0.05～0.08μM CuSO4·5H2O、0.05～0.08μMCoCl2·6H2O、0.05～0.08mM EDTA、120～150mg/L肌醇、1.0～1.5mg/L烟酸、1.0～1.5mg/L盐酸吡哆醇、0.2～0.5mg/L盐酸硫胺素，20～50g/L蔗糖和5～8g/L琼脂，pH5.7～5.9。
条件为27℃温度下以转速220r/min振荡培养。步骤二所述农杆菌接种于YEB固体培养基上暗培养的条件为27℃培养48h，所述农杆菌液体培养的
步骤二、农杆菌活化：准备一株携带有重组DNA的农杆菌，其重组DNA为cryIIIA基因和可选择标记基因，该标记基因对重组DNA转化的细胞具有卡那霉素抗性，将这株农杆菌接种于含有卡那霉素的YEB固体培养基上，27℃温度下暗培养48h，长出农杆菌单菌落，挑单菌落接种于含有卡那霉素的YEB液体培养基中，27℃温度下以转速220r/min进行振荡培养，待培养液中农杆菌的OD600值为0.4～0.6，将振荡培养所得菌液转入离心管中，4000r/min离心，收集菌体后用等体积的无菌水悬浮菌液，得到农杆菌菌悬液待用；
步骤三、农杆菌侵染：将步骤一完成预培养的茄子叶片外植体浸入步骤二备好的农杆菌菌悬液中，浸没10分钟完成农杆菌的侵染；
步骤四、将步骤三经农杆菌侵染过的茄子叶片外植体置于再生培养基上27℃黑暗条件下培养1～3天，使农杆菌能够转化茄子叶片外植体细胞；
步骤五、将经过再生培养基培养的茄子外植体转移到选择培养基上继续培养，使外植体形成不定芽，进而形成根、芽、叶俱全的，携带cryⅢA基因的抗鞘翅目昆虫的转基因茄子完整植株。
实施例8
本实施例提供了一种快速获得茄子转基因植株的方法，步骤如下：
步骤一、在再生培养基上以27℃温度预培养茄子叶片外植体2～3天；
再生培养基的组分包括：0.1～0.5μg/mL噻苯隆、10～15μg/mLN6-[异戊烯]-腺嘌呤、15～20mM NH4NO3、12～16mM KNO3、2～2.5mM CaCl2·2H2O、1～1.2mM MgSO4·7H2O、0.8～1.0mM KH2PO4、3～4μM KI、0.05～0.08mMH3BO3、0.05～0.08mM MnSO4·4H2O、20～25μMZnSO4·7H2O、0.5～0.8μM Na2MoO4·2H2O、0.05～0.08μM CuSO4·5H2O、0.05～0.08μMCoCl2·6H2O、0.05～0.08mM EDTA、120～150mg/L肌醇、1.0～1.5mg/L烟酸、1.0～1.5mg/L盐酸吡哆醇、0.2～0.5mg/L盐酸硫胺素，20～50g/L蔗糖和5～8g/L琼脂，pH5.7～5.9。
条件为27℃温度下以转速220r/min振荡培养。步骤二所述农杆菌接种于YEB固体培养基上暗培养的条件为27℃培养48h，所述农杆菌液体培养的
步骤二、农杆菌活化：准备一株携带有重组DNA的农杆菌，其重组DNA为cryIIIA基因和可选择标记基因，该标记基因对重组DNA转化的细胞具有卡那霉素抗性，将这株农杆菌接种于含有卡那霉素的YEB固体培养基上，27℃温度下暗培养48h，长出农杆菌单菌落，挑单菌落接种于含有卡那霉素的YEB液体培养基中，27℃温度下以转速220r/min进行振荡培养，待培养液中农杆菌的OD600值为0.4～0.6，将振荡培养所得菌液转入离心管中，4000r/min离心，收集菌体后用等体积的无菌水悬浮菌液，得到农杆菌菌悬液待用；
步骤三、农杆菌侵染：将步骤一完成预培养的茄子叶片外植体浸入步骤二备好的农杆菌菌悬液中，浸没10分钟完成农杆菌的侵染；
步骤四、将步骤三经农杆菌侵染过的茄子叶片外植体置于再生培养基上27℃黑暗条件下培养1～3天，使农杆菌能够转化茄子叶片外植体细胞；
步骤五、将经过再生培养基培养的茄子外植体转移到选择培养基上，先在27℃温度下暗培养5～8天，再将选择培养基转移至27℃、光照度2000lx、每日光照时间为12h的光照培养的条件继续培养，使外植体形成不定芽，进而形成根、芽、叶俱全的，携带cryⅢA基因的抗鞘翅目昆虫的转基因茄子完整植株。
本实施例中选择培养基的配方为：40～70μg/mL的卡那霉素、150～300μg/mL奥格门汀、500μg/mL头孢噻肟、0.1～0.5μg/mL噻苯隆、10～15μg/mLN6-[异戊烯]-腺嘌呤、15～20mM NH4NO3、12～16mM KNO3、2～2.5mM CaCl2·2H2O、1～1.2mM MgSO4·7H2O、0.8～1.0mMKH2PO4、3～4μM KI、0.05～0.08mMH3BO3、0.05～0.08mM MnSO4·4H2O、20～25μM ZnSO4·7H2O、0.5～0.8μM Na2MoO4·2H2O、0.05～0.08μM CuSO4·5H2O、0.05～0.08μM CoCl2·6H2O、0.05～0.08mM EDTA，120～150mg/L肌醇、1.0～1.5mg/L烟酸、1.0～1.5mg/L盐酸吡哆醇、0.2～0.5mg/L盐酸硫胺素、20～50g/L蔗糖和5～8g/L琼脂、pH5.7～5.9。
以再生茄子植株的叶片为材料提取基因组DNA，利用cryIIIA基因的序列设计特异引物对DNA进行扩增，以质粒和水为对照，在cryIIIA基因相应位置出现的扩展条带表示转基因侵染成功。
对比例1
本对比例以如下配方制备的培养基按照实施例8提供的方法选育携带cryⅢA基因的抗鞘翅目昆虫的转基因茄子。
再生培养基配方为：15～20mM NH4NO3、12～16mM KNO3、2～2.5mM CaCl2·2H2O、1～1.2mM MgSO4·7H2O、0.8～1.0mM KH2PO4、3～4μM KI、0.05～0.08mMH3BO3、0.05～0.08mMMnSO4·4H2O、20～25μM ZnSO4·7H2O、0.5～0.8μM Na2MoO4·2H2O、0.05～0.08μM CuSO4·5H2O、0.05～0.08μM CoCl2·6H2O、0.05～0.08mM EDTA，20～50g/L蔗糖和5～8g/L琼脂pH5.7～5.9。
选择培养基配方为：40～70μg/mL的卡那霉素、150～300μg/mL奥格门汀、500μg/mL头孢噻肟、15～20mM NH4NO3、12～16mM KNO3、2～2.5mM CaCl2·2H2O、1～1.2mM MgSO4·7H2O、0.8～1.0mM KH2PO4、3～4μM KI、0.05～0.08mMH3BO3、0.05～0.08mM MnSO4·4H2O、20～25μM ZnSO4·7H2O、0.5～0.8μM Na2MoO4·2H2O、0.05～0.08μM CuSO4·5H2O、0.05～0.08μM CoCl2·6H2O、0.05～0.08mM EDTA，20～50g/L蔗糖和5～8g/L琼脂pH5.7～5.9。
本对比例将经农杆菌侵染过的茄子叶片外植体置于再生培养基上，27℃黑暗条件下培养1～3天，使农杆菌能够转化茄子叶片外植体细胞；将经过再生培养基培养的茄子外植体转移到选择培养基上，先在27℃温度下暗培养5～8天，再将选择培养基转移至27℃、光照度2000lx、每日光照时间为12h的光照培养的条件继续培养，使外植体形成不定芽，本对比例形成不定芽的时间明显多于实施例8；这说明实施例8提供的再生培养基能缩短转化时间，提高转基因茄子的育种效率。
通过对比实施例8和对比例1的每个外植体产生的不定芽数考察再生培养基对外植体再生不定芽的影响，结果如表1所示：
表1
测试项 每个外植体产生的不定芽数 再生效率增长率(％)
实施例8 3.57±0.21 163
对比例1 1.02±0.12 0
由表1中数据对比可以看出，实施例8提供的再生培养基中所含的噻苯隆和N6-[异戊烯]-腺嘌呤不仅诱导效率高，不定芽的分化率高，而且成本低，大大节约了组培成本，噻苯隆、N6-[异戊烯]-腺嘌呤肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇和盐酸硫胺素在转基因茄子的选育过程中可提高外植体形成不定芽的个数，提高再生效率，其再生效率的增长率可达到163％。将本发明提供的再生培养基用于转基因茄子的育种，不仅解决了现有转基因茄子育种过程中茄子不定芽再生培养基中再生效率差和再生芽质量不稳定的突出问题，还提高了转基因茄子育种的转化效率，缩短了转化周期，为转基因茄子的高效育种提供了有利准备。

Claims (10)

1.一种快速获得茄子转基因植株的方法，其特征在于，步骤如下：
步骤一、在再生培养基上预培养茄子外植体，所述再生培养基中含有0.1～0.5μg/mL噻苯隆和10～15μg/mLN6-[异戊烯]-腺嘌呤；
步骤二、农杆菌活化：准备一株携带有重组DNA的农杆菌，其重组DNA为cryIIIA基因和可选择标记基因，该标记基因对重组DNA转化的细胞具有卡那霉素抗性，将这株农杆菌接种于含有卡那霉素的YEB固体培养基上，一定温度下进行暗培养至长出农杆菌单菌落，挑单菌落接种于含有卡那霉素的YEB液体培养基中，一定温度下进行振荡培养，将振荡培养所得菌液转入离心管中，4000r/min离心，收集菌体后用等体积的无菌水悬浮菌液，得到农杆菌菌悬液待用；
步骤三、农杆菌侵染：将步骤一完成预培养的茄子外植体浸入步骤二备好的农杆菌菌悬液中，浸没10分钟完成农杆菌的侵染；
步骤四、将步骤三经农杆菌侵染过的茄子外植体置于再生培养基上培养，使农杆菌能够转化茄子外植体细胞；
步骤五、将经过再生培养基培养的茄子外植体转移到选择培养基上继续培养，使外植体形成不定芽，进而形成根、芽、叶俱全的，携带cryⅢA基因的抗鞘翅目昆虫的转基因茄子完整植株。
2.根据权利要求1所述一种快速获得茄子转基因植株的方法，其特征在于，步骤一所述茄子外植体为茄子的叶片外植体。
3.根据权利要求1或2所述一种快速获得茄子转基因植株的方法，其特征在于，步骤一所述再生培养基的组分还包括：15～20mM NH4NO3、12～16mM KNO3、2～2.5mM CaCl2·2H2O、1～1.2mM MgSO4·7H2O、0.8～1.0mM KH2PO4、3～4μM KI、0.05～0.08mMH3BO3、0.05～0.08mMMnSO4·4H2O、20～25μM ZnSO4·7H2O、0.5～0.8μM Na2MoO4·2H2O、0.05～0.08μM CuSO4·5H2O、0.05～0.08μM CoCl2·6H2O、0.05～0.08mM EDTA，pH5.7～5.9。
4.根据权利要求3所述一种快速获得茄子转基因植株的方法，其特征在于，所述再生培养基的组分还包括：120～150mg/L肌醇、1.0～1.5mg/L烟酸、1.0～1.5mg/L盐酸吡哆醇、0.2～0.5mg/L盐酸硫胺素，20～50g/L蔗糖和5～8g/L琼脂。
5.根据权利要求4所述一种快速获得茄子转基因植株的方法，其特征在于，步骤一所述茄子外植体在再生培养基上预培养的条件为27℃温度下培养2～3天。
6.根据权利要求5所述一种快速获得茄子转基因植株的方法，其特征在于，步骤二所述农杆菌接种于YEB固体培养基上暗培养的条件为27℃培养48h，所述农杆菌液体培养的条件为27℃温度下以转速220r/min振荡培养至培养液中农杆菌的OD600值为0.4～0.6。
7.根据权利要求6所述一种快速获得茄子转基因植株的方法，其特征在于，步骤四所述茄子外植体在再生培养基上培养的条件为27℃黑暗条件下培养1～3天。
8.根据权利要求7所述一种快速获得茄子转基因植株的方法，其特征在于，步骤五所述选择培养基的配方为：40～70μg/mL的卡那霉素、150～300μg/mL奥格门汀、500μg/mL头孢噻肟、0.1～0.5μg/mL噻苯隆、10～15μg/mLN6-[异戊烯]-腺嘌呤、15～20mM NH4NO3、12～16mMKNO3、2～2.5mM CaCl2·2H2O、1～1.2mM MgSO4·7H2O、0.8～1.0mM KH2PO4、3～4μM KI、0.05～0.08mMH3BO3、0.05～0.08mM MnSO4·4H2O、20～25μM ZnSO4·7H2O、0.5～0.8μM Na2MoO4·2H2O、0.05～0.08μM CuSO4·5H2O、0.05～0.08μM CoCl2·6H2O、0.05～0.08mM EDTA，120～150mg/L肌醇、1.0～1.5mg/L烟酸、1.0～1.5mg/L盐酸吡哆醇、0.2～0.5mg/L盐酸硫胺素、20～50g/L蔗糖和5～8g/L琼脂、pH5.7～5.9。
9.根据权利要求8所述一种快速获得茄子转基因植株的方法，其特征在于，步骤五所述茄子外植体在选择培养基上的培养条件为先在27℃温度下暗培养5～8天，再将选择培养基转移至27℃、光照度2000lx，每日光照时间为12h的光照培养的条件继续培养。
10.根据权利要求9所述一种快速获得茄子转基因植株的方法，其特征在于，以再生茄子植株的叶片为材料提取基因组DNA，利用cryIIIA基因的序列设计特异引物对DNA进行扩增，以质粒和水为对照，在cryIIIA基因相应位置出现的扩展条带表示转基因侵染成功。
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