CN102399812B - 凤眼莲的遗传转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了凤眼莲的遗传转化方法。该方法包括如下步骤：在授粉后的雨久花科植物雌蕊中的花粉管开始萌发之后和花粉管通道闭合之前，将含有外源基因的重组质粒的溶液或含有外源基因的重组菌的溶液滴加到授粉后的柱头上，使所述外源基因通过花粉管通道导入受精卵细胞，随着受精卵细胞的生长发育，得到转入所述外源基因的种子。实验证明，本发明方法的转化效率高，平均转化率可达1.44％，且得到的转化种子成苗率高。因此，本发明方法在凤眼莲(Eichhomia crassipes)的遗传改良领域将有广阔的应用前景。

Description

凤眼莲的遗传转化方法

技术领域

本发明涉及凤眼莲的遗传转化方法。

背景技术

凤眼莲(Eichhornia crassipes)属于种子植物门雨久花科凤眼莲属，俗称水浮莲、水葫芦。1901年，凤眼莲被作为观赏植物引入中国，上个世纪五六十年代被作为猪饲料推广，从此之后凤眼莲在中国一发不可收拾。由于凤眼莲十分喜肥，尤其是氮磷肥，因此目前广泛存在于我国滇池、巢湖、太湖等很多水体富营养化的水域中。凤眼莲具有很强的富集N/P等营养元素、多种重金属、吸收降解酚和氰等净化作用，同时凤眼莲提取物本身具有抑制藻类生长的效果。另外，凤眼莲还具有作为猪等家畜禽饲料、肥料、造纸和酿酒原料、产沼气等诸多应用潜力。然而，凤眼莲的繁殖能力极其旺盛，一旦处于适合的环境，它便无序地繁殖、成为当地的入侵杂草，抑制其他物种、破坏生态多样性，造成该区生态恶化。而且，因其繁殖力过于强盛和难以及时打捞，导致其在水中腐烂、被吸收的N、P等重新释放于水体中，达不到去除污染源的净化作用。特别是凤眼莲爆发成灾时可覆盖整个湖面和河流，堵塞河道，降低水中溶解氧浓度和水体透光度，致使水生动植物缺氧、缺光而死亡。因此，目前的凤眼莲不但没有成为消除富营养化的净化植物，反而成了生态入侵的恶性水生杂草，以及导致各地投入大量人、物和财力进行治理的对象。

凤眼莲在水体环境修复与治理工程中，至今未获得成功的关键原因在于：一是生长繁殖过盛而难以控制所导致的二次污染成灾问题；二是可回收利用的价值低、产业化难的问题。因此，通过植物基因工程手段，对凤眼莲加以遗传工程改良，介导其高附加值，提高其回收利用的经济价值，将有助于促进凤眼莲水体净化的周转频率，推进其回收应用的产业化进程。由于凤眼莲是具有特殊习性的水生植物，其外植体极易褐化，愈伤组织诱导及分化尚无法实现，人工组培凤眼莲完成生活史、并进一步开展基因工程改良也十分困难。因此，凤眼莲的基因转化一直未见获得成功的报道，在国内外尚处于空白。

目前，植物基因转化方法主要分为两种：1)介导载体系统转化(农杆菌介导法、脂质体介导法等)；2)直接遗传转化(基因枪法、PEG法、电击法、显微注射法、花粉管通道法和超声波法等)(Hamilton C M.et al.，1996；Liu Y G.et al.，1999；Ohta Y.1986；任永霞等，2005)。其中，花粉管通道法遗传转化不需要组织培养过程，操作相对简单、容易。

花粉管通道法的基本原理是：在授粉后向子房注射目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中从柱头到胚囊之间形成的花粉管通道，使外源DNA能沿着花粉管通道渗入，经过珠心进入胚囊，最终转化尚不具备完整细胞壁的合子或早期胚胎细胞，使外源DNA被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为转入外源基因的新个体，实现基因转化的目的。

然而，该方法实际包括的是一个以狭义授粉/受精为中心的过程，是一个非常复杂的生理现象，即包括花粉形成、传粉、花粉萌发、花粉管伸长以及继花粉管伸长之后的受精等过程，甚至还包括拒绝受精现象。因此，对于不同植物，需要选择的转化时期、转化方法也存在较大的差别。

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouth diseasevimse，FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性疫病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为动物卫生法典中的A类疫病之首。传统的灭活疫苗在该病的防控中起了重要作用。近年来随着生物技术的发展，因其具备诸多可食疫苗的优点而成为国内外研究的热点。国内外在口蹄疫转基因植物疫苗的研究中已取得了可喜的成果，易感动物食用该转基因植物后能够产生免疫力，达到预防口蹄疫的目的。

目前为止，用作转基因植物疫苗的免疫原基因主要是FMDV的编码结构蛋白VP1基因和编码病毒衣壳蛋白的P1基因、非结构蛋白2A、3C所共同组成的免疫原基因。1999年，Wigdorovitz A等将FMDV结构蛋白基因在苜蓿中有效表达，表达产物口服和注射都产生了免疫反应和保护。2001年，Carrillo C等将FMDV VP1基因在马铃薯中表达。

水生植物凤眼莲，繁殖力强大，生物量高，具备成为优良生物反应器的潜质。然而，由于其特殊的生理特点，很难进行转基因研究，深度开发利用受到限制。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种雨久花科植物的遗传转化方法。

本发明所提供的雨久花科植物的遗传转化方法，包括如下步骤：在授粉后的雨久花科植物雌蕊中的花粉管开始萌发之后和花粉管通道闭合之前，将含有外源基因的重组质粒的溶液或含有外源基因的重组菌的溶液滴加到授粉后的柱头上，使所述外源基因通过花粉管通道导入受精卵细胞，随着受精卵细胞的生长发育，得到转入所述外源基因的种子；所述滴加至少为一次。

上述方法中，所述在授粉后的雨久花科植物雌蕊中的花粉管开始萌发之后至花粉管通道闭合之前为自授粉时计起第2小时到第6小时，优选为第3h到第5h，具体为第3小时或第4小时或第5小时，所述授粉时为第0小时。

所述方法中，所述滴加为二次；第二次滴加的时机为自第一次滴加时计起第0.5小时后，所述第一次滴加时计为第0时；第二次滴加的方法为将含有外源基因的重组质粒的溶液或含有外源基因的重组菌的溶液滴加到授粉后的柱头上。

上述方法中，每次滴加时，所述含有外源基因的重组质粒的溶液的滴加量为3ul，所述含有外源基因的重组菌的溶液的滴加量为5ul。

上述方法中，所述授粉是人工授粉；所述人工授粉的时间为一束花序上有50％以上的花朵展开八成以上；

上述方法中，所述含有外源基因的重组质粒的溶液中重组质粒的浓度为100ng/μl-200ng/μl，具体为100ng/μl；所述含有外源基因的重组菌的溶液的OD₆₀₀值为1.0-1.2，具体为1.0。

上述方法中，所述人工授粉的时间为上午9点-11点；

上述方法中，所述含有外源基因的重组质粒的溶液由0.1×SSC缓冲液和所述含有外源基因的重组质粒组成；

上述方法中，所述含有外源基因的重组菌的溶液由蔗糖、Silvet L-77、赤霉素、6-糠基氨基嘌呤、所述含有外源基因的重组菌和水组成，蔗糖在溶液中的浓度为50g/L，Silvet L-77在溶液中的浓度为200μL/L，赤霉素在溶液中的浓度为5μg/L，6-糠基氨基嘌呤在溶液中的浓度为0.1mg/L；所述含有外源基因的重组菌的溶液的pH值为5.8。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因雨久花科植物的方法。

本发明所提供的培育转基因雨久花科植物的方法，包括如下步骤：

1)用上述任一所述方法得到转入外源基因的雨久花科植物种子；

2)搓伤种皮：将石英砂与所述转入外源基因的雨久花科植物种子混合，摩擦，搓伤种皮，得到搓伤种皮的种子；

3)将所述搓伤种皮的种子进行消毒处理，得到消毒后的种子；

4)将所述消毒后的种子进行培养，得到植物幼苗；

5)对5叶龄的植物幼苗进行抗性筛选，得到转入外源基因的雨久花科植物幼苗。

上述培育转基因雨久花科植物的方法中，所述步骤2)中，所述石英砂与所述转入外源基因的雨久花科植物种子的质量比为10～15∶1，具体为10∶1，所述摩擦的时间为5分钟～8分钟，具体为8分钟；

上述培育转基因雨久花科植物的方法中，所述步骤3)中消毒处理的方法包括如下步骤：将所述搓伤种皮的种子用无菌水清洗3次，无水乙醇浸泡1min，无菌水洗涤3次，加入10％(体积百分含量)的次氯酸钠水溶液浸泡10min，无菌水洗涤6次；

上述培育转基因雨久花科植物的方法中，所述步骤4)中，所述培养的方法包括如下步骤：将所述消毒后的种子接种于MS培养基，在光照周期为16h光照/8h黑暗、光强为100μmol/m²·s、湿度为50％、温度为25℃的条件下培养；

上述培育转基因雨久花科植物的方法中，所述步骤5)中，所述抗性筛选的方法包括如下步骤：用浓度为0.15％-0.25％(体积百分比)或0.2％(体积百分比)的草胺膦水溶液喷洒所述5叶龄的植物幼苗，自植物幼苗开始出现5叶时计起，第1周时喷洒第一次，第2周时喷洒第二次，第5周时检测幼苗是否存活，存活的幼苗即为所述转入外源基因的雨久花科植物抗性幼苗，植物幼苗开始出现5叶时计为第1周。

上述培育转基因雨久花科植物的方法中，所述含有外源基因的重组质粒是将所述外源基因插入载体pGII 0229的多克隆位点间得到的；

上述培育转基因雨久花科植物的方法中，所述含有外源基因的重组菌是将重组表达质粒导入宿主菌得到的；所述重组表达质粒是将所述外源基因插入载体pGII 0229的多克隆位点间得到的。

上述遗传转化方法中和上述培育转基因雨久花科植物的方法中，所述雨久花科植物为雨久花科凤眼莲属植物；所述雨久花科凤眼莲属植物为凤眼莲(Eichhorniacrassipes)；

上述遗传转化方法中和上述培育转基因雨久花科植物的方法中，所述外源基因为VP1基因或GFP基因，所述VP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述GFP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

上述遗传转化方法中和上述培育转基因雨久花科植物的方法中，所述宿主菌为农杆菌EHA105。

本发明首次对凤眼莲(Eichhornia crassipes)进行了遗传转化。本发明的花粉管通道法转化具有以下优点：1、首次创建了水生植物凤眼莲的花粉管通道遗传转化方法，并且获得了转化基因的阳性植株及种子，实验证明，本发明方法的转化效率高，平均可达1.44％，且得到的转化种子成苗率高。2、建立了凤眼莲在温室及室外的人工培育及繁殖技术，完成了凤眼莲从种子萌发到收获种子的完整生活周期。3、该转化方法操作简便，流程简单、成本低，周期短，易于掌握和推广应用，不需要组织培养体系及装备复杂的实验室设施，常规育种工作者即可以掌握。因此，本发明方法在凤眼莲(Eichhornia crassipes)的遗传改造领域将有广阔的应用前景。

附图说明

图1为质粒pGII 0229-VP1和pGII 0229-GFP的结构图。

图2为凤眼莲花组织发育进程及其授粉与基因转化最佳时间的细胞组织学分析。

图3为凤眼莲的花粉管通道法基因转化及其技术流程。

图4为转基因凤眼莲的除草剂抗性筛选流程(A-C)及其移植培养(D)。

图5为转化pGII 0229-VP1基因凤眼莲除草剂抗性植株的PCR验证。

图6为转化pGII 0229-GFP基因凤眼莲除草剂抗性植株的PCR及Western-blot验证。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的试剂、材料等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用表达载体的名称为pGII 0229(nos-BAR LB)，购自John InnesCentre(网站http://www.pgreen.ac.uk/a-ord-fr.htm)。

PBI121购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品目录号为MCV032。

农杆菌EHA105购自北京biovector公司(http://biovector.blog.163.com)，产品目录号为Biovec-11。

用于遗传转化的开花的凤眼莲(Eichhornia crassipes)来源：云南省石屏县城河人工湿地污水处理站。

凤眼莲(Eichhornia crassipes)的种子采集自云南省石屏县城河人工湿地污水处理站，凤眼莲幼苗可购自花鸟鱼市场，其无性繁殖技术非常成熟，取发芽的幼枝培养既可获得植株。

实施例1、向凤眼莲中转入VP1基因

一、质粒pGII 0229-VP1的构建

质粒pGII 0229-VP1的构建过程包括：人工合成序列1所示VP1基因，并使其两端带有BamHI和SacI的酶切位点序列；用BamHI和SacI酶切合成的基因和载体pBI121，将酶切产物连接，得到重组载体PBI121-VP1，其中VP1基因与启动子35S和终止子nos形成表达盒。用HindIII和EcoRI同时酶切PBI121-VP1和pGII 0229，连接，得到重组质粒，转化大肠杆菌，抗性筛选，液体培养，提取质粒，酶切和测序鉴定。结果显示，酶切结果正确；测得的VP1基因序列如序列1所示，表明构建的重组质粒正确，命名为pGII 0229-VP1(图1A)，其中35S-VP1-nos片段直接插入到pGII 0229的HindIII和EcoRI间。pGII 0229载体能够表达除草剂抗性基因，作为筛选标记，连接VP1后的重组质粒，能够有效表达免疫原基因VP1蛋白。

质粒pGII 0229-VP1的溶液：pGII 0229-VP1质粒提取采用了MN公司的NucleoBond Midi型试剂盒，从含有pGII 0229-VP 1的大肠杆菌中大量制备质粒DNA。PCR鉴定后，将质粒DNA用0.1×SSC缓冲液调制成浓度为100ng/μl-200ng/μl的转化液，冻存于-20度，备用于转化。

二、转化及培育和鉴定

(一)转化

方法I

1、花蕾选择：选择健壮、长势良好的凤眼莲花序作为转化受体。凤眼莲花序为穗状，有3-12朵两性花，每朵花有6个雄蕊，三长三短，花药成熟后自然裂开，每朵花中有一个雌蕊，花柱单一呈线形，子房呈长卵圆形。

2、人工授粉：

1)授粉时机的选择：在一束花序上有50％以上的花朵展开八成以上时进行人工授粉，选择在上午9-11点进行。由于同一花序的花朵自下而上开放，整个花序在1-2天内开闭，对于未开放的花蕾，用尖嘴镊或剪刀剥开未开放的花萼，露出雌蕊进行授粉。

2)授粉方法：

I、在露水已干，花粉尚未散落时收集不同花序上的花粉，混匀后用毛笔尖轻抹涂抹在当天开放花朵的柱头上。授粉完毕后在花序的下端挂上标牌注明授粉的时间。

3、基因转化：

(1)转化时机的摸索

对凤眼莲花组织发育进程进行细胞组织学分析，以确定最佳转化时机。如图2所示，A：为授粉后第1小时(授粉时记作第0小时)的花粉管萌发状态；凤眼莲花粉在柱头上开始萌发，并沿着花粉管通道伸长至柱头内部，B：为授粉后第6小时(授粉时记作第0小时)的花粉管萌发状态；花粉管生长、进入胚珠、完成受精后花粉管通道逐渐关闭。

在花粉管萌发后开始遗传转化操作(原则上在花粉管萌发之后到花粉管通道闭合之前的任何时间可以实施转化)，具体为从授粉时计时，在第2h到第6h之间均可以实施转化，优选时间为第3h到第5h之间，所述授粉时为第0小时。

(2)转化

自授粉时(授粉时为第0小时)计起，从第2h到第6小时之间进行转化操作，优选时间为第3h到第5h之间，本方法选择了从第4h开始进行。用微量移液器在授粉后的柱头上第一次滴入3微升质粒pGII 0229-VP1的溶液，0.5小时后(第一次滴入时计为第0时)以相同的方法第二次滴入(为提高转化率)。由于授粉后第二天花葶即弯入水中，为防止转化后的种子遗失，转化一小时后的花序及时套上40-60目的网袋，并固定于凤眼莲的茎或叶柄上。

每次滴加时，质粒pGII 0229-VP1的溶液的滴加量为3ul，质粒浓度为100ng/μl；质粒pGII 0229-VP1的溶液由0.1×SSC缓冲液和质粒pGII 0229-VP1组成；0.1×SSC缓冲液的组成：氯化钠0.15M，柠檬酸钠0.015M。

质粒pGII 0229-VP1通过花粉管通道导入受精卵细胞，随着受精卵细胞的生长发育，得到转入质粒pGII 0229-VP1的种子。

4、种子发育及收获：转化一周后，肉眼即可观察到子房开始膨大，40-50天后，蒴果呈卵形，颜色变黄褐色，表明此时种子已成熟，可采收晾干。果皮裂开散出种子，种子呈枣核形，褐色或黄褐色，存储于干燥器中，可长年保存。凤眼莲的花粉管通道法遗传转化流程见图3(A：即将开花的凤眼莲，B：凤眼莲开始开花，C：用毛笔进行人工授粉，D：向柱头上滴入外源DNA溶液，E：将转化后的花序套袋，并防止其扎入水中，F：种子成熟后的花序，G：剥出成熟的凤眼莲种子)。

(二)筛选及鉴定

质粒pGII 0229-VP1上含有除草剂抗性标记基因(BAR)，通过该抗性标记筛选转基因种子，对获得的抗性幼苗进行分子检测。

1、建立转基因凤眼莲种子的高效萌发体系。在自然界，凤眼莲主要以无性繁殖为主，兼有性生殖。由于凤眼莲种子的结实和休眠习性非常特殊，休眠期可达15年，且不经特殊处理则很难萌发成苗和实施筛选。为了对转基因种子实施大规模筛选，需要建立高效萌发成苗的技术平台。在尝试了一系列化学、物理和机械等多种方法后，最终确定如下种子萌发方法：

用石英砂搓伤种皮：将石英砂与种子以10∶1的质量比混合后包裹于软布中，轻柔摩擦8分钟，得到搓伤种皮的种子，经摩擦的种皮产生多处伤口，利于种子吸水萌发；

化学药物消毒处理：取搓伤种皮的种子放于2ml离心管中，无菌水清洗3次，无水乙醇浸泡1min，无菌水洗涤3次，加入10％(体积百分比)的次氯酸钠水溶液浸泡10min，然后再以无菌水洗涤6次即可用于播种；

催芽萌发成苗：将所述消毒后的种子接种于MS培养基，在光照周期为16h光照/8h黑暗、光强为100μmol/m²·s、湿度为50％、温度为25℃的条件下培养；

种子萌发判定标准：胚根突破种皮，扎入培养基，子叶展开。

统计种子萌发率，种子萌发率达到80％。本方法为实施转基因凤眼莲种子高通量的筛选与鉴定提供了技术保障。

2、转基因凤眼莲幼苗的除草剂抗性筛选：

(1)除草剂(BASTA)抗性筛选浓度的摸索及筛选时机的确定

凤眼莲幼苗在培养基上生长至5叶龄时，进行BASTA筛选。为了确定筛选浓度，首先以野生型为实验材料，筛选浓度(体积百分比)分别设定为0.1％、0.15％、0.2％、0.25％和0.3％。操作具体过程如下：在超净工作台中打开培养皿，采用不同浓度的BASTA溶液分别对叶面进行喷洒或涂抹，一周后重复一次。经培养3周后，检测幼苗的生长状况，以幼苗完全枯死的BASTA浓度作为实施筛选的处理浓度。实验结果(如图4A所示)显示，野生型幼苗在0.15％以上(V/V)浓度处理即可枯死，为了获得更严格的筛选结果，本方法选择了0.2％作为筛选浓度。

(2)抗性筛选方法

用浓度为0.2％的BASTA水溶液喷洒或涂抹5叶龄的植物幼苗，自植物幼苗开始出现5叶时计起，第1周时喷洒第一次，第2周时喷洒第二次，第5周时检测幼苗是否存活，正常存活的幼苗即为抗性幼苗，植物幼苗开始出现5叶时为第1周。

BASTA的化学名称为4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸，中文名称为草胺膦；购自拜耳公司，产品目录号为05936098。

结果，不具除草剂抗性苗或未转基因植株枯死而被淘汰(图4B)，有35株幼苗为BASTA抗性幼苗。

3、抗性幼苗的分子生物学检测。

分别从上述抗性筛选阳性的幼苗中提取总DNA，分别用如下引物进行PCR扩增，同时以阳性质粒pGII 0229-VP1和野生型凤眼莲为对照。

除草剂基因(BAR)引物：

ATTTCGGTGACGGGCAGGAC，

GCACCATCGTCAACCACTACATC。

猪口蹄疫病毒疫苗(VP1)基因引物：

TTTTGAATTCATGACCACCTCTGCGGGC，

GCGCCTGCAGTTACAGAAGCTGTTTTGCGGGT。

结果如图5所示(A：根据除草剂基因(BAR)序列设计引物进行PCR检测，B：根据猪口蹄疫病毒疫苗(VP1)基因序列设计引物进行PCR检测。其中：P为阳性对照，N为阴性水对照，1-35为除草剂筛选获得的抗性植株)。

在35株抗性筛选苗中，有16株幼苗对BAR和VP1两种基因的PCR检测结果均为阳性，表明16株幼苗为转化VP1基因的阳性植株(图5)。

将除草剂基因(BAR)检测阳性、且猪口蹄疫病毒疫苗(VP1)基因检测阳性的苗作为阳性苗。结果：转化效率为1.71％。转化效率的计算公式为：转化效率＝分子生物学鉴定阳性苗数/供BASTA筛选幼苗数(936株)。表明所创建的花粉管通道法转化凤眼莲技术的成功有效。

4、阳性幼苗的培育。

在超净工作台中，将筛选获得的阳性幼苗移入含MS培养基的三角瓶内，继续在光照周期为16h光照/8h黑暗、光强为100μmol/m²·s、湿度为50％、温度为25℃的条件下培养；培养2-3周的幼苗如图4C；然后进行土壤移植，移植所需的营养土必需提前浸透水分，并且为了适应凤眼莲的生活习性，营养土表面要求有3-5cm的水层，土壤培养一个月开始分蘖增殖，获得健壮繁茂的凤眼莲植株(图4D)。

统计成活率：结果，分子检测阳性苗的成活率为100％。

5、阳性株系T1代种子的收获：阳性植株发育至开花期开花时进行人工授粉，以保证结实率，于次日套入网袋中，以防花序扎入水中。待种子发育成熟后，收获晾干种子(图4D)。

方法II

(一)转化

1、花蕾选择：与实施例1中方法I相同。

2、人工授粉：

1)授粉时机的选择：与实施例1中方法I相同。

2)授粉方法：与实施例1中方法I相同。

3、基因转化：

自授粉时(授粉时为第0小时)计起，本方法选择了从第3h开始进行转化操作。

其他条件及转化方法与实施例1中方法I相同。

4、种子发育及收获：与实施例1中方法I相同。

(二)筛选及鉴定

1、建立转基因凤眼莲种子的高效萌发体系。

用石英砂搓伤种皮：与实施例1中方法I相同。

化学药物消毒处理：与实施例1中方法I相同。

催芽萌发成苗：与实施例1中方法I相同。

统计种子萌发率，结果与实施例1中方法I无显著差异。

2、转基因凤眼莲幼苗的除草剂抗性筛选：与实施例1中方法I相同。

3、抗性幼苗的分子生物学检测：与实施例1中方法I相同。

采用本方法的转化效率，结果与实施例1中方法I无显著差异。

4、阳性幼苗的培育：与实施例1中方法I相同。

采用本方法的成活率，结果与实施例1中方法I无显著差异。

5、阳性株系T1代种子的收获：与实施例1中方法I相同。

方法III

(一)转化

1、花蕾选择：与实施例1中方法I相同。

2、人工授粉：

1)授粉时机的选择：与实施例1中方法I相同。

2)授粉方法：与实施例1中方法I相同。

3、基因转化：

自授粉时(授粉时为第0小时)计起，本方法选择了从第5h开始进行转化操作。

其他条件及转化方法与实施例1中方法I相同。

4、种子发育及收获：与实施例1中方法I相同。

(二)筛选及鉴定

1、建立转基因凤眼莲种子的高效萌发体系。

用石英砂搓伤种皮：与实施例1中方法I相同。

化学药物消毒处理：与实施例1中方法I相同。

催芽萌发成苗：与实施例1中方法I相同。

统计种子萌发率，结果与实施例1中方法I无显著差异。

2、转基因凤眼莲幼苗的除草剂抗性筛选：与实施例1中方法I相同。

3、抗性幼苗的分子生物学检测：与实施例1中方法I相同。

采用本方法的转化效率，结果与实施例1中方法I无显著差异。

4、阳性幼苗的培育：与实施例1中方法I相同。

采用本方法的成活率，结果与实施例1中方法I无显著差异。

5、阳性株系T1代种子的收获：与实施例1中方法I相同。

实施实例2、植物表达质粒pGII 0229-GFP转化凤眼莲。

一、质粒pGII 0229-GFP的构建

质粒pGII 0229-GFP的构建方法：人工合成序列2所示GFP基因，并使其两端带有XbaI和SacI的酶切位点序列；用XbaI和SacI酶切合成的基因和载体pBI121，将酶切产物连接，得到重组载体PBI121-GFP，其中GFP基因与启动子35S和终止子nos形成表达盒。用HindIII和EcoRI同时酶切PBI121-GFP和pGII 0229，连接，得到重组载体，转化大肠杆菌，抗性筛选，液体培养，提取质粒，酶切和测序鉴定，结果酶切结果正确，测得的GFP基因序列如序列2所示，表明构建的重组质粒正确，命名为pGII 0229-GFP(图1B)，其中35S-GFP-nos片段直接插入到pGII 0229的HindIII和EcoRI间。pGII 0229载体能够表达除草剂抗性基因，作为筛选标记，连接GFP后的重组质粒，能够有效表达绿色荧光蛋白(GFP)。

质粒pGII 0229-GFP构建完成后，转化农杆菌EHA 105，经卡那霉素和利福平筛选、PCR鉴定后，获得含有目的质粒DNA的农杆菌菌株，于-80度保存菌种，用于下一步的植株转化。将含有pGII 0229-GFP表达质粒的农杆菌以1∶100的比例接菌于LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平)中，28℃、230rpm/h振荡培养16h，再以1∶100的比例转接于新鲜LB培养液、同样条件培养12小时(OD₆₀₀在1.5-2.0)。经离心收集菌体后，加入等体积的渗透培养基重悬至OD₆₀₀为1.0，备用于转化。

渗透培养基组成：由蔗糖、Silvet L-77、GA、KT和水组成，蔗糖在渗透培养中的浓度为50g/L，Silvet L-77在渗透培养中的浓度为200μL/L，赤霉素(GA)在渗透培养中的浓度为5μg/L，激动素(KT，6-糠基氨基嘌呤)在渗透培养中的浓度为0.1mg/L；pH值为5.8。

二、转化及培育和鉴定

(一)转化

方法I

1、花蕾选择：与实施例1中方法I相同。

2、人工授粉：

1)授粉时机的选择：与实施例1中方法I相同。

2)授粉方法：与实施例1中方法I相同。

3、基因转化：

自授粉时(授粉时为第0小时)计起，从第2h到第6h之间可以进行转化操作，优选时间为从第3h到第5h之间，本方法选择了从第4h开始进行转化。用微量移液器在授粉后的柱头上第一次滴入5微升含有质粒pGII 0229-GFP的重组菌的溶液，0.5小时后(第一次滴入时计为第0时)以相同的方法滴入第二次(为提高转化率)。由于授粉后第二天花葶即弯入水中，为防止转化后的种子遗失，转化一小时后的花序及时套上40-60目的网袋，并固定于凤眼莲的茎或叶柄上。

每次滴加时，所述含有质粒pGII 0229-GFP的重组菌的溶液的滴加量为5ul；

含有质粒pGII 0229-GFP的重组菌的溶液的OD₆₀₀值为1.0；

含有质粒pGII 0229-GFP的重组菌的溶液由蔗糖、Silvet L-77、GA、KT和所述含有外源基因的重组菌组成，蔗糖在溶液中的浓度为50g/L，Silvet L-77在溶液中的浓度为200μL/L，赤霉素(GA)在溶液中的浓度为5μg/L，激动素(KT，6-糠基氨基嘌呤)在溶液中的浓度为0.1mg/L；所述含有外源基因的重组菌的溶液的pH值为5.8。

4、种子发育及收获：转化一周后，肉眼即可观察到子房开始膨大，40-50天后，蒴果呈卵形，颜色变黄褐色，表明此时种子已成熟，可采收晾干。果皮裂开散出种子，种子呈枣核形，褐色或黄褐色，存储于干燥器中，可长年保存。

(二)筛选及鉴定

质粒pGII 0229-GFP上含有除草剂抗性标记基因(BAR)，通过该抗性标记筛选转基因种子，对获得的抗性幼苗进行分子检测。

1、种子萌发方法：

用石英砂搓伤种皮：与实施例1中方法I相同。

化学药物消毒处理：与实施例1中方法I相同。

催芽萌发成苗：与实施例1中方法I相同。

种子萌发判定标准：与实施例1中方法I相同。

统计种子萌发率：结果，与实施例1中方法I无显著差异。

2、转基因凤眼莲幼苗的除草剂抗性筛选：

所采用除草剂、抗性筛选条件及筛选方法均与实施例1中方法I相同。

抗性筛选结果，有31株幼苗为BASTA抗性幼苗。

3、抗性幼苗的分子生物学检测。

(1)PCR鉴定

分别从上述抗性筛选阳性的幼苗中提取总DNA，分别用如下引物进行PCR扩增，同时以阳性质粒pGII 0229-GFP和野生型凤眼莲为对照。

GFP基因引物：

GATGGTGATGTTAATGGGCA，GCAGATTGTGTGGACAGGTA

结果：在31株抗性幼苗中，共得到10株幼苗为PCR鉴定阳性，表明该10株幼苗为转化pGII 0229-GFP基因的阳性植株(部分结果见图6A所示：P为阳性对照，WT为野生型植株，28-33为抗性筛选植株)。

(2)Western-blot验证

分别从PCR阳性幼苗和野生型植株中提取总蛋白进行Western-blot检测，其中一抗为GFP多克隆抗体，二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体。GFP多克隆抗体购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为AB105-02。

图6B显示了Western-blot检测的部分结果，M为蛋白分子量标准，WT为野生型植株，28-33为抗性筛选植株。Western-blot验证结果显示，在转基因阳性植株29、30、31和33中检测出与GFP抗体结合的表达蛋白(箭头标注)，表明外源基因GFP在转基因凤眼莲中有效表达出GFP蛋白。

将GFP基因检测阳性，且Western-blot验证有效表达目的蛋白的植株作为阳性苗。

结果：转化效率为1.16％。转化效率的计算公式为：转化效率＝分子生物学鉴定阳性苗数/供BASTA抗性筛选幼苗数(862株)。

4、阳性幼苗的培育：与实施例1中方法I相同。

统计成活率：结果，与实施例1中方法I无显著差异。

5、阳性株系T1代种子的收获：与实施例1中方法I相同。

方法II

(一)转化

1、花蕾选择：与实施例1中方法I相同。

2、人工授粉：

1)授粉时机的选择：与实施例1中方法I相同。

2)授粉方法：与实施例1中方法I相同。

3、基因转化：

自授粉时(授粉时为第0小时)计起，本方法选择了从第3h开始进行转化操作。其他条件及转化方法与实施例2中方法I相同。

4、种子发育及收获：与实施例1中方法I相同。

(二)筛选及鉴定

1、建立转基因凤眼莲种子的高效萌发体系。

用石英砂搓伤种皮：与实施例1中方法I相同。

化学药物消毒处理：与实施例1中方法I相同。

催芽萌发成苗：与实施例1中方法I相同。

种子萌发率，结果与实施例1中方法I无显著差异。

2、转基因凤眼莲幼苗的除草剂抗性筛选：与实施例1中方法I相同。

3、抗性幼苗的分子生物学检测：与实施例2中方法I相同。

转化效率，结果与实施例2中方法I无显著差异。

4、阳性幼苗的培育：与实施例1中方法I相同。

成活率，结果与实施例1中方法I无显著差异。

5、阳性株系T1代种子的收获：与实施例1中方法I相同。

方法III

(一)转化

1、花蕾选择：与实施例1中方法I相同。

2、人工授粉：

1)授粉时机的选择：与实施例1中方法I相同。

2)授粉方法：与实施例1中方法I相同。

3、基因转化：

自授粉时(授粉时为第0小时)计起，本方法选择了从第5h开始进行转化操作。其他条件及转化方法与实施例2中方法I相同。

4、种子发育及收获：与实施例1中方法I相同。

(二)筛选及鉴定

1、建立转基因凤眼莲种子的高效萌发体系。

用石英砂搓伤种皮：与实施例1中方法I相同。

化学药物消毒处理：与实施例1中方法I相同。

催芽萌发成苗：与实施例1中方法I相同。

种子萌发率，结果与实施例1中方法I无显著差异。

2、转基因凤眼莲幼苗的除草剂抗性筛选：与实施例1中方法I相同。

3、抗性幼苗的分子生物学检测：与实施例2中方法I相同。

转化效率，结果与实施例2中方法I无显著差异。

4、阳性幼苗的培育。与实施例1中方法I相同。

成活率，结果与实施例1中方法I无显著差异。

5、阳性株系T1代种子的收获：与实施例1中方法I相同。

Claims (10)

1.一种雨久花科植物的遗传转化方法，包括如下步骤：在授粉后的雨久花科植物雌蕊中的花粉管开始萌发之后和花粉管通道闭合之前，将含有外源基因的重组质粒的溶液或含有外源基因的重组菌的溶液滴加到授粉后的柱头上，使所述外源基因通过花粉管通道导入受精卵细胞，随着受精卵细胞的生长发育，得到转入所述外源基因的种子；所述滴加至少为一次；

所述雨久花科植物为凤眼莲(Eichhornia crassipes)；

所述外源基因为VP1基因或GFP基因，所述VP1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；所述GFP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述在授粉后的雨久花科植物雌蕊中的花粉管开始萌发之后至花粉管通道闭合之前为自授粉时计起第2小时到第6小时，所述授粉时为第0小时。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述滴加为二次；第二次滴加的时机为自第一次滴加时计起第0.5小时后，所述第一次滴加时计为第0时。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：每次滴加时，所述含有外源基因的重组质粒的溶液的滴加量为3uL，所述含有外源基因的重组菌的溶液的滴加量为5uL。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述授粉是人工授粉；所述人工授粉的时间为一束花序上有50％以上的花朵展开八成以上；

所述含有外源基因的重组质粒的溶液中重组质粒的浓度为100ng/μl-200ng/μl；所述含有外源基因的重组菌的溶液的OD600值为1.0-1.2。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述人工授粉的时间为上午9点-11点；

所述含有外源基因的重组质粒的溶液由0.1×SSC缓冲液和所述含有外源基因的重组质粒组成；

所述含有外源基因的重组菌的溶液由蔗糖、Silvet L-77、赤霉素、6-糠基氨基嘌呤、所述含有外源基因的重组菌和水组成，蔗糖在溶液中的浓度为50g/L，Silvet L-77在溶液中的浓度为200μL/L，赤霉素在溶液中的浓度为5μg/L，6-糠基氨基嘌呤在溶液中的浓度为0.1mg/L；所述含有外源基因的重组菌的溶液的pH值为5.8。

7.一种培育转基因雨久花科植物的方法，包括如下步骤：

1)用权利要求1-6中任一所述方法得到转入外源基因的雨久花科植物种子；

2)搓伤种皮：将石英砂与所述转入外源基因的雨久花科植物种子混合，摩擦，搓伤种皮，得到搓伤种皮的种子；

3)将所述搓伤种皮的种子进行消毒处理，得到消毒后的种子；

4)将所述消毒后的种子进行培养，得到植物幼苗；

5)对5叶龄的植物幼苗进行抗性筛选，得到转入外源基因的雨久花科植物幼苗。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

所述步骤2)中，所述石英砂与所述转入外源基因的雨久花科植物种子的质量比为10～15∶1，所述摩擦的时间为5分钟～8分钟；

所述步骤3)中消毒处理的方法包括如下步骤：将所述搓伤种皮的种子用无菌水清洗3次，无水乙醇浸泡1min，无菌水洗涤3次，加入10％体积百分含量的次氯酸钠水溶液浸泡10min，无菌水洗涤6次；

所述步骤4)中，所述培养的方法包括如下步骤：将所述消毒后的种子接种于MS培养基，在光照周期为16h光照/8h黑暗、光强为100μmol/m².s、湿度为50％、温度为25℃的条件下培养；

所述步骤5)中，所述抗性筛选的方法包括如下步骤：用体积百分比浓度为0.15％-0.25％的草胺膦水溶液喷洒所述5叶龄的植物幼苗，自植物幼苗开始出现5叶时计起，第1周时喷洒第一次，第2周时喷洒第二次，第5周时检测幼苗是否存活，存活的幼苗即为所述转入外源基因的雨久花科植物抗性幼苗，植物幼苗开始出现5叶时计为第1周。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述含有外源基因的重组质粒是将所述外源基因插入载体pGII 0229的多克隆位点间得到的；

所述含有外源基因的重组菌是将重组表达质粒导入宿主菌得到的；所述重组表达质粒是将所述外源基因插入载体pGII 0229的多克隆位点间得到的。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述宿主菌为农杆菌EHA105。

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