CN100382679C

CN100382679C - 一种半夏脱毒组培快繁的方法

Info

Publication number: CN100382679C
Application number: CNB2005100623395A
Authority: CN
Inventors: 徐刚; 陈炯; 汪一婷; 牟豪杰; 吕永平; 陈剑平
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2005-12-30
Filing date: 2005-12-30
Publication date: 2008-04-23
Anticipated expiration: 2025-12-30
Also published as: CN1799342A

Abstract

本发明涉及一种半夏脱毒组培快繁的方法，包括如下步骤：取半夏的未成熟种子和/或成熟种子为外植体，经诱导培养、增殖培养、生根培养、移栽、病毒检测后，大量繁殖脱毒组培苗、脱毒珠芽和脱毒小块根。本发明的优点是：接种操作容易；接种污染率低、成活率高；脱毒简便、快捷、彻底；繁殖系数达5～10倍，速度快，适合工厂化育苗，可商品化生产。

Description

一种半夏脱毒组培快繁的方法

技术领域

本发明涉及植物脱毒组培快繁技术，尤其涉及一种半夏脱毒组培快繁的方法。

背景技术

半夏为天南星科多年生草本植物，多为野生，由于药用和出口需要量大，野生资源枯竭而难以满足需求，现已开始进行人工栽培。人工栽培一般采用小块茎和珠芽作为繁殖器官，但繁殖系数低，年繁殖系数只有2～3倍；同时在栽培和生产中，由于长期无性繁殖导致病毒感染和不断积累，使其产量和药用成分均下降，致使半夏的栽培生产受到很大限制，研究表明，病毒感染的半夏实际生产能力只有脱病毒半夏的30～40％。因此为了提高半夏的繁殖系数，适应大规模种植的需要和减低病毒对品质的危害，对半夏进行脱毒组培快繁研究具有重要的价值。

组培与脱毒苗生产的关键是脱毒技术，获得无病毒植株的方法有多种，例如热处理脱毒、茎尖培养脱毒和茎尖微嫁接脱毒以及组合方法。普遍采用的较好的方法是茎尖培养脱毒法，具体的步骤是：通过植物顶端分生组织切取茎尖(0.2mm以下分生组织)，诱导愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株得到脱毒苗是目前通常采用的方法。相关的技术已有许多的专利。例如，CN1031637A、CN1238122A、CN1258435A、CN1258436A披露了采用茎尖作为外植体，经茎尖培养后得到脱毒苗的方法。CN1475107A发明名称为“半夏规模化组培快繁方法”公开了在无菌条件下用解剖针剥取试管苗的茎尖(0.3～0.6mm)采用常规方法进行培养，获得大量脱毒组培苗。

但是这种茎尖分生组织脱毒法存在的问题是：要切取很小的茎尖分生组织，需在显微镜下操作，具有一定难度；切取茎尖组织越小，成活率越低，而切取茎尖组织偏大，又不能完全脱除病毒，同时容易造成污染；因此，仍需要一种更好的脱毒方法。

发明内容

本发明目的是克服以上存在不足，提出一种无需切取微小植物茎尖，即能大量快繁半夏脱毒组培苗的方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

一种半夏脱毒组培快繁的方法，按如下步骤进行：

1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：

(1)基本培养基：选用MS培养基，蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8；

(2)诱导培养基：MS中添加6-BA 0.5～1.5mg/L和NAA 0.15～0.5mg/L或MS中添加6-BA2.0mg/L和IBA 0.1mg/L；

(3)愈伤组织分化培养基：MS中添加6-BA2.5～3.0mg/L和NAA 0.2～0.3mg/L；

(4)增殖培养基：MS中添加6-BA1.0mg/L和NAA0.5mg/L或MS中添加6-BA0.5～1.0mg/L和IBA 0.1mg/L；

(5)生根培养基：1/2MS或1/2MS中添加NAA0.1mg/L或1/2MS中添加IBA0.1mg/L。

2)外植体的选取与灭菌：取半夏的种子，经灭菌处理，作为脱毒组培用的外植体；

3)诱导培养：将步骤2)灭菌处理后的种子接种在诱导培养基上，直接形成无根组培苗或先形成愈伤组织，再将愈伤组织移植至分化培养基诱导出丛芽，形成无根组培苗、珠芽和小块根；

4)增殖培养：将步骤3)直接形成的无根组培苗或先形成愈伤组织，再经分化培养基诱导形成的无根组培苗、珠芽和小块根接种在增殖培养基上，诱导出丛芽，形成无根组培苗、珠芽和小块根；

5)生根培养：将步骤4)增殖形成的无根组培苗、珠芽和小块根接种在生根培养基中进行生根培养；

6)移栽：当步骤5)的生根组培苗生长至3～5cm以上、生根珠芽0.2～0.5cm以上，生根小块根直径0.5～1.0cm以上，移栽基质培养至成苗。

7)病毒检测：利用RT-PCR扩增技术，构建其基因组序列克隆，原核表达制备病毒特异性的抗血清，建立ELISA检测技术进行半夏大豆花叶病毒、芋花叶病毒、马蹄莲花叶病毒的检测。

所述的半夏的种子是未成熟种子和/或成熟种子；其中，半夏的未成熟种子：于5月中、下旬采种，总苞片、果皮、种子为绿色；半夏的成熟种子：于6月下旬、7月上旬采种，当总苞片发黄，果皮发白绿色，种子浅茶色、茶绿色，易脱落时摘回。

所述的灭菌处理是经75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用0.1％升汞溶液灭菌20～30min，或酒精处理后再用2％的次氯酸钠水溶液灭菌20～30min，最后升汞灭菌或次氯酸钠灭菌之后均需用无菌水冲洗3～5次。

所述的培养基进一步可改进为，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量是：(1)基本培养基：选用MS基本培养基，白糖为的30g/L，琼脂为7g/L，pH为5.8；(2)诱导培养基：MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.15mg/L；(3)愈伤组织分化培养基：MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 0.2mg/L；(4)增殖培养基：MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L；(5)生根培养基：1/2MS+IBA 0.1mg/L。

所述的移栽基质是泥炭：珍珠岩：蛭石按体积比3∶1∶1配制而成。

本发明的有益效果是：

1)本发明利用半夏种子作为脱毒组培的外植体，由于体积较大接种操作容易；接种污染率只有5％左右或更低，而茎尖培养接种大多数情况下污染率约40％～80％；接种成功率高可达100％，而茎尖培养接种成活率一般只有20％～40％；可比茎尖脱毒培养提早1～2个月获得脱毒组培苗，降低了成本30％，实用易推广；

2)本发明脱毒简便、快捷，解决了茎尖脱毒不彻底的问题，将脱毒组培苗、脱毒珠芽和脱毒小块根经病毒检测后，带毒率均为0(见试验例)，可解决病毒引起半夏种质退化问题，恢复其产量和品质；

3)半夏种子留种容易，可快速获得大量脱毒组培苗、脱毒珠芽和脱毒小块根，月繁殖系数达5～10倍，适合工厂化育苗，可商品化生产。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1(以半夏未成熟种子为外植体)

1)外植体的选取与灭菌：于5月中、下旬，总苞片、果皮、种子为绿色时，取半夏的未成熟种子，经75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用0.1％升汞溶液灭菌20min，最后用无菌水冲洗3～5次，作为脱毒组培用的外植体；

2)基本培养基：选用MS基本培养基，白糖25g/L，琼脂8g/L，pH5.6；

3)诱导培养：在无菌条件下将种子接种在MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L的诱导培养基上，先形成愈伤组织，再将愈伤组织移植至MS+6-BA 3.0mg/L+NAA0.3mg/L的分化培养基上诱导出丛芽，形成无根组培苗、珠芽和小块根；

4)增殖培养：在无菌条件下将无根组培苗、珠芽和小块根接种在MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.5mg/L的增殖培养基上，诱导丛芽，形成无根组培苗、珠芽和小块根；

5)生根培养：将无根组培苗、珠芽和小块根接种到1/2MS的生根培养基中进行生根培养；

6)移栽：当脱毒组培苗生长达3～5cm以上、脱毒珠芽长到0.2～0.5cm以上，脱毒小块根长到0.5～1.0cm以上，移栽入由泥炭：珍珠岩：蛭石按体积比3∶1∶1配制而成的基质中；

实施例2：(以半夏的成熟种子为外植体)

1)外植体的选取与灭菌：于6月下旬、7月上旬，当总苞片发黄，果皮发白绿色，种子浅茶色、茶绿色，易脱落时，取半夏的成熟种子经75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用2％的次氯酸钠水溶液灭菌30min，最后用无菌水冲洗3～5次，作为脱毒组培用的外植体；

2)基本培养基：选用MS基本培养基，白糖20g/L，琼脂9g/L，pH5.7；

3)诱导培养：在无菌条件下将种子接种在MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L的诱导培养基上，直接形成无根组培苗，再形成珠芽和小块根；

4)增殖培养：再在无菌条件下将无根组培苗、珠芽和小块根接种在MS+6-BA0.5mg/L+IBA 0.1mg/L的增殖培养基上，诱导丛芽，形成无根组培苗、珠芽和小块根；

5)生根培养：将无根组培苗、珠芽和小块根接种到1/2MS+NAA0.1mg/L的生根培养基中进行生根培养；

6)移栽：当组培苗生长达3～5cm以上、珠芽长到0.2～0.5cm以上，小块根长到0.5～1.0cm以上，移栽入由泥炭：珍珠岩：蛭石按体积比3∶1∶1配制而成的基质中；

实施例3：(以半夏的未成熟种子为外植体)

2)基本培养基：选用MS基本培养基，白糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8；

3)诱导培养：在无菌条件下将种子接种在MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.15mg/L的诱导培养基上，通过诱导形成愈伤组织，然后愈伤组织接种在MS+6-BA2.5mg/L+NAA 0.2mg/L的愈伤组织分化培养基上，诱导丛芽，形成无根组培苗、珠芽和小块根；

4)增殖培养：在无菌条件下将无根组培苗、珠芽和小块根接种在MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L的增殖培养基上，诱导丛芽，形成无根组培苗、珠芽和小块根；

5)生根培养：将无根组培苗、珠芽和小块根接种到1/2MS+IBA 0.1mg/L的生根培养基中进行生根培养；

试验例：(病毒检测)

对照材料：从田间采集的半夏小块根为材料。

处理材料：以实施例1获得的小块根为材料。

1)抗血清制备：

a)根据已报道的芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus，DsMV)、大豆花叶病毒半夏株系(Soybean mosaic virus P strain，SMV-P)和马蹄莲花叶病毒(mosaic virus，ZaMV)已发表的序列设计相关病毒外壳蛋白表达引物；

b)扩增相关病毒外壳蛋白基因并构建原核表达质粒，在大肠杆菌中表达；

c)将目的蛋白与2×SDS上样缓冲液按1∶1(v/v)混合，煮沸变性后用12％的SDS聚丙烯凝胶电泳分离，电泳完毕后用0.25 M KCl溶液染色；

d)切下的目的蛋白条带用适量1×SDS上样缓冲液匀浆后，再用5-20％梯度的SDS聚丙烯凝胶电泳分离，电泳完毕后用0.25 M KCl溶液染色；

e)切下目的蛋白条带免疫小鼠，共免疫4次，前3次间隔7天，第4次免疫3天后断头取血。

2)ELISA检测技术：

a)包被：称取病样和健康对照各0.2g，分别加入包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6)各1mL研磨，6000rpm离心后包被96孔板，每孔100uL，4℃，12h；

b)封闭：加封闭液，每孔150uL，37℃孵育1h；

c)加一抗：加入适当稀释的抗血清(ELISA缓冲液稀释)，37℃孵育2h；

d)加酶标二抗：加入1/5000的羊抗鼠IgG-碱性磷酸酶(Sigma，ELISA缓冲液稀释)，37℃孵育2h；

e)加底物：1mg/mL的p-NPP(Sigma，溶于10％二乙醇胺，pH 9.8)，37℃黑暗中孵育，分别在40min、1 h和2 h测OD₄₀₅值。

3)检测的结果等如下表所示。

处理	检测的结果
处理	检测的结果	对照	阳性
脱毒组培苗	阴性	对照	阳性
脱毒组培苗	阴性	脱毒珠芽	阴性
脱毒小块根	阴性	脱毒珠芽	阴性

Claims

1.一种半夏脱毒组培快繁的方法，其特征在于按以下步骤进行：

1)培养基的配制：

(1)基本培养基：用MS培养基，蔗糖或白糖20～30g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8；

(2)诱导培养基：MS中添加6-BA0.5～1.5mg/L和NAA0.15～0.5mg/L，或MS中添加6-BA2.0mg/L和IBA0.1mg/L；

(3)愈伤组织分化培养基：MS中添加6-BA2.5～3.0mg/L和NAA0.2～0.3mg/L；

(4)增殖培养基：MS中添加6-BA1.0mg/L和NAA0.5mg/L，或MS中添加6-BA0.5～1.0mg/L和IBA0.1mg/L；

(5)生根培养基：1/2MS，或1/2MS中添加NAA0.1mg/L，或1/2MS中添加IBA0.1mg/L；

3)诱导培养：将步骤2)灭菌处理后的种子接种在诱导培养基上，直接形成无根组培苗；或在诱导培养基上先形成愈伤组织，然后再将愈伤组织移植至愈伤组织分化培养基上诱导出丛芽以后，再形成无根组培苗、珠芽和小块根；

4)增殖培养：将步骤3)获得的无根组培苗、珠芽和小块根接种在增殖培养基上，诱导出丛芽，然后形成无根组培苗、珠芽和小块根；

6)移栽：当步骤5)的组培苗生长至3～5cm、珠芽0.2～0.5cm，小块根直径0.5～1.0cm时，移栽基质培养至成苗。

2.根据权利要求1所述的半夏脱毒组培快繁的方法，其特征在于：所述的半夏的种子是未成熟种子或成熟种子。

3.根据权利要求1所述的半夏脱毒组培快繁的方法，其特征在于：所述的灭菌处理是先经75％酒精浸泡0.5～1.0min再用0.1％升汞溶液灭菌20～30min；或先经75％酒精浸泡0.5～1.0min后再用2％的次氯酸钠水溶液灭菌20～30min；最后升汞灭菌或次氯酸钠灭菌之后均需用无菌水冲洗3～5次。

4.根据权利要求1所述的半夏脱毒组培快繁的方法，其特征在于：所述的培养基，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：

(1)基本培养基：用MS培养基，白糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8；

(2)诱导培养基：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.15mg/L；

(3)愈伤组织分化培养基：MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.2mg/L；

(4)增殖培养基：MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L；

(5)生根培养基：1/2MS+IBA0.1mg/L。

5.根据权利要求1所述的半夏脱毒组培快繁的方法，其特征在于：所述的移栽基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比3∶1∶1配制而成。