CN100382679C - 一种半夏脱毒组培快繁的方法 - Google Patents

一种半夏脱毒组培快繁的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种半夏脱毒组培快繁的方法,包括如下步骤:取半夏的未成熟种子和/或成熟种子为外植体,经诱导培养、增殖培养、生根培养、移栽、病毒检测后,大量繁殖脱毒组培苗、脱毒珠芽和脱毒小块根。本发明的优点是:接种操作容易;接种污染率低、成活率高;脱毒简便、快捷、彻底;繁殖系数达5~10倍,速度快,适合工厂化育苗,可商品化生产。

Description

一种半夏脱毒组培快繁的方法
技术领域
本发明涉及植物脱毒组培快繁技术,尤其涉及一种半夏脱毒组培快繁的方法。
背景技术
半夏为天南星科多年生草本植物,多为野生,由于药用和出口需要量大,野生资源枯竭而难以满足需求,现已开始进行人工栽培。人工栽培一般采用小块茎和珠芽作为繁殖器官,但繁殖系数低,年繁殖系数只有2~3倍;同时在栽培和生产中,由于长期无性繁殖导致病毒感染和不断积累,使其产量和药用成分均下降,致使半夏的栽培生产受到很大限制,研究表明,病毒感染的半夏实际生产能力只有脱病毒半夏的30~40%。因此为了提高半夏的繁殖系数,适应大规模种植的需要和减低病毒对品质的危害,对半夏进行脱毒组培快繁研究具有重要的价值。
组培与脱毒苗生产的关键是脱毒技术,获得无病毒植株的方法有多种,例如热处理脱毒、茎尖培养脱毒和茎尖微嫁接脱毒以及组合方法。普遍采用的较好的方法是茎尖培养脱毒法,具体的步骤是:通过植物顶端分生组织切取茎尖(0.2mm以下分生组织),诱导愈伤组织,然后从愈伤组织再分化产生芽,长成小植株得到脱毒苗是目前通常采用的方法。相关的技术已有许多的专利。例如,CN1031637A、CN1238122A、CN1258435A、CN1258436A披露了采用茎尖作为外植体,经茎尖培养后得到脱毒苗的方法。CN1475107A发明名称为“半夏规模化组培快繁方法”公开了在无菌条件下用解剖针剥取试管苗的茎尖(0.3~0.6mm)采用常规方法进行培养,获得大量脱毒组培苗。
但是这种茎尖分生组织脱毒法存在的问题是:要切取很小的茎尖分生组织,需在显微镜下操作,具有一定难度;切取茎尖组织越小,成活率越低,而切取茎尖组织偏大,又不能完全脱除病毒,同时容易造成污染;因此,仍需要一种更好的脱毒方法。
发明内容
本发明目的是克服以上存在不足,提出一种无需切取微小植物茎尖,即能大量快繁半夏脱毒组培苗的方法。
本发明目的通过以下技术方案来实现:
一种半夏脱毒组培快繁的方法,按如下步骤进行:
1)培养基的配制,包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为:
(1)基本培养基:选用MS培养基,蔗糖或白糖20~30g/L,琼脂7~9g/L,pH5.6~5.8;
(2)诱导培养基:MS中添加6-BA 0.5~1.5mg/L和NAA 0.15~0.5mg/L或MS中添加6-BA2.0mg/L和IBA 0.1mg/L;
(3)愈伤组织分化培养基:MS中添加6-BA2.5~3.0mg/L和NAA 0.2~0.3mg/L;
(4)增殖培养基:MS中添加6-BA1.0mg/L和NAA0.5mg/L或MS中添加6-BA0.5~1.0mg/L和IBA 0.1mg/L;
(5)生根培养基:1/2MS或1/2MS中添加NAA0.1mg/L或1/2MS中添加IBA0.1mg/L。
2)外植体的选取与灭菌:取半夏的种子,经灭菌处理,作为脱毒组培用的外植体;
3)诱导培养:将步骤2)灭菌处理后的种子接种在诱导培养基上,直接形成无根组培苗或先形成愈伤组织,再将愈伤组织移植至分化培养基诱导出丛芽,形成无根组培苗、珠芽和小块根;
4)增殖培养:将步骤3)直接形成的无根组培苗或先形成愈伤组织,再经分化培养基诱导形成的无根组培苗、珠芽和小块根接种在增殖培养基上,诱导出丛芽,形成无根组培苗、珠芽和小块根;
5)生根培养:将步骤4)增殖形成的无根组培苗、珠芽和小块根接种在生根培养基中进行生根培养;
6)移栽:当步骤5)的生根组培苗生长至3~5cm以上、生根珠芽0.2~0.5cm以上,生根小块根直径0.5~1.0cm以上,移栽基质培养至成苗。
7)病毒检测:利用RT-PCR扩增技术,构建其基因组序列克隆,原核表达制备病毒特异性的抗血清,建立ELISA检测技术进行半夏大豆花叶病毒、芋花叶病毒、马蹄莲花叶病毒的检测。
所述的半夏的种子是未成熟种子和/或成熟种子;其中,半夏的未成熟种子:于5月中、下旬采种,总苞片、果皮、种子为绿色;半夏的成熟种子:于6月下旬、7月上旬采种,当总苞片发黄,果皮发白绿色,种子浅茶色、茶绿色,易脱落时摘回。
所述的灭菌处理是经75%酒精浸泡0.5~1.0min,再用0.1%升汞溶液灭菌20~30min,或酒精处理后再用2%的次氯酸钠水溶液灭菌20~30min,最后升汞灭菌或次氯酸钠灭菌之后均需用无菌水冲洗3~5次。
所述的培养基进一步可改进为,包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量是:(1)基本培养基:选用MS基本培养基,白糖为的30g/L,琼脂为7g/L,pH为5.8;(2)诱导培养基:MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.15mg/L;(3)愈伤组织分化培养基:MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 0.2mg/L;(4)增殖培养基:MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L;(5)生根培养基:1/2MS+IBA 0.1mg/L。
所述的移栽基质是泥炭:珍珠岩:蛭石按体积比3∶1∶1配制而成。
本发明的有益效果是:
1)本发明利用半夏种子作为脱毒组培的外植体,由于体积较大接种操作容易;接种污染率只有5%左右或更低,而茎尖培养接种大多数情况下污染率约40%~80%;接种成功率高可达100%,而茎尖培养接种成活率一般只有20%~40%;可比茎尖脱毒培养提早1~2个月获得脱毒组培苗,降低了成本30%,实用易推广;
2)本发明脱毒简便、快捷,解决了茎尖脱毒不彻底的问题,将脱毒组培苗、脱毒珠芽和脱毒小块根经病毒检测后,带毒率均为0(见试验例),可解决病毒引起半夏种质退化问题,恢复其产量和品质;
3)半夏种子留种容易,可快速获得大量脱毒组培苗、脱毒珠芽和脱毒小块根,月繁殖系数达5~10倍,适合工厂化育苗,可商品化生产。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明,但本发明的内容并不局限于此。
实施例1(以半夏未成熟种子为外植体)
1)外植体的选取与灭菌:于5月中、下旬,总苞片、果皮、种子为绿色时,取半夏的未成熟种子,经75%酒精浸泡0.5~1.0min,再用0.1%升汞溶液灭菌20min,最后用无菌水冲洗3~5次,作为脱毒组培用的外植体;
2)基本培养基:选用MS基本培养基,白糖25g/L,琼脂8g/L,pH5.6;
3)诱导培养:在无菌条件下将种子接种在MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L的诱导培养基上,先形成愈伤组织,再将愈伤组织移植至MS+6-BA 3.0mg/L+NAA0.3mg/L的分化培养基上诱导出丛芽,形成无根组培苗、珠芽和小块根;
4)增殖培养:在无菌条件下将无根组培苗、珠芽和小块根接种在MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.5mg/L的增殖培养基上,诱导丛芽,形成无根组培苗、珠芽和小块根;
5)生根培养:将无根组培苗、珠芽和小块根接种到1/2MS的生根培养基中进行生根培养;
6)移栽:当脱毒组培苗生长达3~5cm以上、脱毒珠芽长到0.2~0.5cm以上,脱毒小块根长到0.5~1.0cm以上,移栽入由泥炭:珍珠岩:蛭石按体积比3∶1∶1配制而成的基质中;
7)病毒检测:利用RT-PCR扩增技术,构建其基因组序列克隆,原核表达制备病毒特异性的抗血清,建立ELISA检测技术进行半夏大豆花叶病毒、芋花叶病毒、马蹄莲花叶病毒的检测。
实施例2:(以半夏的成熟种子为外植体)
1)外植体的选取与灭菌:于6月下旬、7月上旬,当总苞片发黄,果皮发白绿色,种子浅茶色、茶绿色,易脱落时,取半夏的成熟种子经75%酒精浸泡0.5~1.0min,再用2%的次氯酸钠水溶液灭菌30min,最后用无菌水冲洗3~5次,作为脱毒组培用的外植体;
2)基本培养基:选用MS基本培养基,白糖20g/L,琼脂9g/L,pH5.7;
3)诱导培养:在无菌条件下将种子接种在MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L的诱导培养基上,直接形成无根组培苗,再形成珠芽和小块根;
4)增殖培养:再在无菌条件下将无根组培苗、珠芽和小块根接种在MS+6-BA0.5mg/L+IBA 0.1mg/L的增殖培养基上,诱导丛芽,形成无根组培苗、珠芽和小块根;
5)生根培养:将无根组培苗、珠芽和小块根接种到1/2MS+NAA0.1mg/L的生根培养基中进行生根培养;
6)移栽:当组培苗生长达3~5cm以上、珠芽长到0.2~0.5cm以上,小块根长到0.5~1.0cm以上,移栽入由泥炭:珍珠岩:蛭石按体积比3∶1∶1配制而成的基质中;
7)病毒检测:利用RT-PCR扩增技术,构建其基因组序列克隆,原核表达制备病毒特异性的抗血清,建立ELISA检测技术进行半夏大豆花叶病毒、芋花叶病毒、马蹄莲花叶病毒的检测。
实施例3:(以半夏的未成熟种子为外植体)
1)外植体的选取与灭菌:于5月中、下旬,总苞片、果皮、种子为绿色时,取半夏的未成熟种子,经75%酒精浸泡0.5~1.0min,再用0.1%升汞溶液灭菌20min,最后用无菌水冲洗3~5次,作为脱毒组培用的外植体;
2)基本培养基:选用MS基本培养基,白糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.8;
3)诱导培养:在无菌条件下将种子接种在MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.15mg/L的诱导培养基上,通过诱导形成愈伤组织,然后愈伤组织接种在MS+6-BA2.5mg/L+NAA 0.2mg/L的愈伤组织分化培养基上,诱导丛芽,形成无根组培苗、珠芽和小块根;
4)增殖培养:在无菌条件下将无根组培苗、珠芽和小块根接种在MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L的增殖培养基上,诱导丛芽,形成无根组培苗、珠芽和小块根;
5)生根培养:将无根组培苗、珠芽和小块根接种到1/2MS+IBA 0.1mg/L的生根培养基中进行生根培养;
6)移栽:当组培苗生长达3~5cm以上、珠芽长到0.2~0.5cm以上,小块根长到0.5~1.0cm以上,移栽入由泥炭:珍珠岩:蛭石按体积比3∶1∶1配制而成的基质中;
7)病毒检测:利用RT-PCR扩增技术,构建其基因组序列克隆,原核表达制备病毒特异性的抗血清,建立ELISA检测技术进行半夏大豆花叶病毒、芋花叶病毒、马蹄莲花叶病毒的检测。
试验例:(病毒检测)
对照材料:从田间采集的半夏小块根为材料。
处理材料:以实施例1获得的小块根为材料。
1)抗血清制备:
a)根据已报道的芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,DsMV)、大豆花叶病毒半夏株系(Soybean mosaic virus P strain,SMV-P)和马蹄莲花叶病毒(mosaic virus,ZaMV)已发表的序列设计相关病毒外壳蛋白表达引物;
b)扩增相关病毒外壳蛋白基因并构建原核表达质粒,在大肠杆菌中表达;
c)将目的蛋白与2×SDS上样缓冲液按1∶1(v/v)混合,煮沸变性后用12%的SDS聚丙烯凝胶电泳分离,电泳完毕后用0.25 M KCl溶液染色;
d)切下的目的蛋白条带用适量1×SDS上样缓冲液匀浆后,再用5-20%梯度的SDS聚丙烯凝胶电泳分离,电泳完毕后用0.25 M KCl溶液染色;
e)切下目的蛋白条带免疫小鼠,共免疫4次,前3次间隔7天,第4次免疫3天后断头取血。
2)ELISA检测技术:
a)包被:称取病样和健康对照各0.2g,分别加入包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液,pH 9.6)各1mL研磨,6000rpm离心后包被96孔板,每孔100uL,4℃,12h;
b)封闭:加封闭液,每孔150uL,37℃孵育1h;
c)加一抗:加入适当稀释的抗血清(ELISA缓冲液稀释),37℃孵育2h;
d)加酶标二抗:加入1/5000的羊抗鼠IgG-碱性磷酸酶(Sigma,ELISA缓冲液稀释),37℃孵育2h;
e)加底物:1mg/mL的p-NPP(Sigma,溶于10%二乙醇胺,pH 9.8),37℃黑暗中孵育,分别在40min、1 h和2 h测OD405值。
3)检测的结果等如下表所示。
处理 检测的结果
对照 阳性
脱毒组培苗 阴性
脱毒珠芽 阴性
脱毒小块根 阴性

Claims (5)

1.一种半夏脱毒组培快繁的方法,其特征在于按以下步骤进行:
1)培养基的配制:
(1)基本培养基:用MS培养基,蔗糖或白糖20~30g/L,琼脂7~9g/L,pH5.6~5.8;
(2)诱导培养基:MS中添加6-BA0.5~1.5mg/L和NAA0.15~0.5mg/L,或MS中添加6-BA2.0mg/L和IBA0.1mg/L;
(3)愈伤组织分化培养基:MS中添加6-BA2.5~3.0mg/L和NAA0.2~0.3mg/L;
(4)增殖培养基:MS中添加6-BA1.0mg/L和NAA0.5mg/L,或MS中添加6-BA0.5~1.0mg/L和IBA0.1mg/L;
(5)生根培养基:1/2MS,或1/2MS中添加NAA0.1mg/L,或1/2MS中添加IBA0.1mg/L;
2)外植体的选取与灭菌:取半夏的种子,经灭菌处理,作为脱毒组培用的外植体;
3)诱导培养:将步骤2)灭菌处理后的种子接种在诱导培养基上,直接形成无根组培苗;或在诱导培养基上先形成愈伤组织,然后再将愈伤组织移植至愈伤组织分化培养基上诱导出丛芽以后,再形成无根组培苗、珠芽和小块根;
4)增殖培养:将步骤3)获得的无根组培苗、珠芽和小块根接种在增殖培养基上,诱导出丛芽,然后形成无根组培苗、珠芽和小块根;
5)生根培养:将步骤4)增殖形成的无根组培苗、珠芽和小块根接种在生根培养基中进行生根培养;
6)移栽:当步骤5)的组培苗生长至3~5cm、珠芽0.2~0.5cm,小块根直径0.5~1.0cm时,移栽基质培养至成苗。
2.根据权利要求1所述的半夏脱毒组培快繁的方法,其特征在于:所述的半夏的种子是未成熟种子或成熟种子。
3.根据权利要求1所述的半夏脱毒组培快繁的方法,其特征在于:所述的灭菌处理是先经75%酒精浸泡0.5~1.0min再用0.1%升汞溶液灭菌20~30min;或先经75%酒精浸泡0.5~1.0min后再用2%的次氯酸钠水溶液灭菌20~30min;最后升汞灭菌或次氯酸钠灭菌之后均需用无菌水冲洗3~5次。
4.根据权利要求1所述的半夏脱毒组培快繁的方法,其特征在于:所述的培养基,包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为:
(1)基本培养基:用MS培养基,白糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.8;
(2)诱导培养基:MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.15mg/L;
(3)愈伤组织分化培养基:MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.2mg/L;
(4)增殖培养基:MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L;
(5)生根培养基:1/2MS+IBA0.1mg/L。
5.根据权利要求1所述的半夏脱毒组培快繁的方法,其特征在于:所述的移栽基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比3∶1∶1配制而成。
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