CN102150624A

CN102150624A - 半夏属植物的组培快繁方法

Info

Publication number: CN102150624A
Application number: CN 201110111047
Authority: CN
Inventors: 陈集双; 贾明良; 张本厚; 何珣; 刘学威
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2011-04-29
Filing date: 2011-04-29
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2031-04-29
Also published as: CN102150624B

Abstract

本发明涉及一种半夏属植物的组培快繁方法，属于植物细胞工程技术领域。本发明将半夏无菌叶片、叶柄以及丛生芽等器官作为接种材料，转接到间歇浸没培养反应器中进行增殖诱导、生根和块茎生成培养两个阶段，增殖培养结束后，在无菌条件下将增殖培养基替换为生根及块茎生成培养基以促进半夏块茎形成。本方法大大提高了半夏种苗生产过程中的自动化程度，减少培养时的人力投入，并且可以大大提高增殖率。并且利用反应器生产半夏种苗具有无病原菌，遗传均一稳定等优点。且成活率显著提高，劳动力成本显著降低，为低成本的生产大量高质量的种苗和离体块茎提供保障。在提高半夏属药材种植中的种苗质量的同时降低种苗成本，经济效益明显提高。

Description

半夏属植物的组培快繁方法

技术领域

本发明涉及一种半夏属植物的组培快繁方法，属于植物细胞工程技术领域。具体涉及一种利用高通量生物反应器进行半夏属及其近似物种组织培养和规模化快繁以获得大批量种苗（块茎）的方法。

背景技术

半夏属(Pinellia spp.)为天南星科植物，其块茎可入药，距今已经有2000多年的药用历史，为我国重要的中药材。野生半夏属药材主要分部于四川、湖北和河南省，其次是江苏、山东、江西和浙江等省。据统计，在558种中药处方中，半夏属药材使用频率为第22位。现代药理学研究表明，半夏属药材具有燥湿化痰、降逆止咳、消痞散结、抗早孕、抗肿瘤作用、降血脂，护肝和治疗冠心病等多种功效，具有极高的药用价值。近年来，半夏属药材的市场需求量大幅度增长，但由于土地开发、环境污染及过度采挖等原因，野生半夏属药材资源日益枯竭。人工栽培半夏属药材目前普遍存在产量低、有效成分含量低等问题，严重制约了半夏属药材的产业化发展。

半夏属植物正常的繁殖主要有种子繁殖、珠芽繁殖和块茎繁殖3种繁殖方式，但由于半夏属植物的种子和珠芽体积小采集不便，且成熟时间很长，所以生产上一般采用块茎繁殖。但块茎繁殖效率很低，块茎、种子、珠芽的总繁殖效率约为1:15-1:20。从少量符合要求的优质半夏属种苗开始自然扩繁和栽培，形成规模需要10年以上甚至更长时间；因此采用传统的块茎繁殖难以满足半夏属植物规模化生产的需求。半夏属植物的这一生物学特征严重制约其生产规模化的发展。加之野生资源的日益枯竭和种植时用种量大的特点导致了半夏属产业的快速发展受到限制。并且由于生产上半夏属植物主要以块茎进行无性繁殖，在连续种植后由于病毒侵染等出现的种质退化已成为半夏属植物生产中最突出的问题。另外，半夏属植物生长还受到各种“种传病害”的危害，如细菌性软腐病一旦发生，往往导致半夏属植物大量减产甚至绝收。

以上问题可以利用组培快繁的方法来解决。组培快繁，顾名思义就是对植物进行组织培养实现其快速繁殖的意思。半夏属的组织培养研究始于20世纪80年代，作为种苗生产中一般的生产流程为：首先将不同外植体如叶片、叶柄、珠芽和茎尖等灭菌后接种到特定培养基中诱导产生愈伤组织，再将愈伤组织进行诱导产生丛生芽，然后通过不断的丛生芽诱导增殖达到需要的量后进行生根苗的诱导，得到的生根苗取出洗净琼脂后即可以炼苗移栽。

通过组培快繁利用优良单株作为扩繁的材料，可获得遗传基础和外观品质形状等重要性状均一的繁殖体，并进一步获得品质均一的原药材，同时通过无性繁殖可有效解决野生变家种过程中的种苗基数问题，保证规模化种植中的优质种苗批量生产问题。同时组织培养过程中可以利用茎尖培养对侵染半夏属的病毒进行脱除，实现复壮的目的。但是传统的组织培养方法得到的半夏属组培苗细弱，在进行炼苗移栽时，对组培苗上附着琼脂的清洗时对其伤害较大，且由于半夏属属于小草本植物，叶片没有角质层保护，因此炼苗成活率大概在50%左右，且在移栽成活后生长一段时间后才能形成小块茎。因此组培苗应用于大田生产时需要严格的驯化条件和管理操作。

为了解决炼苗成活率低的问题，本发明人团队发明了“一种半夏属离体块茎的高效诱导方法”（ZL 200510049742.4）。相比于一般的组培苗生产，离体块茎的方法生产得到的离体块茎具有较强的抗逆性、储藏性，不需要特殊驯化可直接移栽于大田，不受生产季节限制，可全年生产。并且诱导得到的离体块茎外形大小一致，发生同步性好，可人为控制生长发育。另外可以缩短大田生长周期。但是离体块茎的方法也具有一般组织培养所具有的缺点，主要是要消耗大量的组培容器及琼脂等不可回收的试剂，且接种过程中需要大量的人工来达到获得大量组培苗的目的。从而导致组培苗的成本居高不下。且后续清洗时如琼脂和没有生长活力的根未清洗干净会导致离体块茎腐烂。

以上各个技术路线为本发明提供了基本的方法和材料，为本发明的创造了条件。

因此，本发明人团队通过综合以上各种半夏属组培技术路线的优缺点，成功应用了植物间歇浸没式培养的方法对半夏属进行了培养。利用间歇浸没培养反应器成功进行其它无性繁殖植物的组织培养的研究已有报道。如申请号为200910114406.1的“利用间歇浸没式生物反应器进行甘蔗组织培养快繁”的研究，该专利的发明人利用双瓶培养方式对甘蔗进行了组织培养快繁。利用间歇浸没式培养方法进行半夏属属及其近似物种组织培养快繁的方法未见报道和公开应用。

间歇浸没培养反应器主要是利用培养液对植物组织的间歇浸没进行培养，浸没时供给植物营养，间歇时提供植物足够的氧气。由于该培养方式较好的解决了玻璃化的问题，并且营养物质随着对植物组织的浸没可以得到很好的传递，因此间歇浸没培养可以很好的解决植物组织培养中的各种难题。利用传统方法进行种苗生产的自动化水平低、且成本居高不下。而其中很大的一部分是劳动力的成本，如传统的半夏属种苗及离体块茎生产需要经历的初代诱导培养、继代增殖培养、生根培养及离体块茎诱导和后续的炼苗移栽都需要大量的人员来进行工作。其中包括培养基的配制、大量培养瓶的清洗灌装灭菌和耗费劳动力最大的切割转接过程。这些都大大增加了组培生产过程中劳动力的投入。

本发明人团队发明了中国专利申请号为200920116327.X的“间歇浸没植物组织器官的培养反应器”。该反应器包括与与时控器相连的充气泵，还包括储液罐和主反应罐；充气泵通过进气管与储液罐的进口密封相连，在进气管上设置空气除菌器Ⅰ；储液罐的出口通过连接管与主反应罐的进口密封相连，主反应罐上设有气体出口，气体出口与空气除菌器Ⅱ相连。

本发明人团队还发明了中国专利申请号为201020288879.1的“间歇浸没的开合式植物生物反应器”。如附图1所示，所述的间歇浸没的开合式植物生物反应器，主要包括时控器1、充气泵2、储液室5和主反应器7等，时控器1通过导线与充气泵2相连，充气泵2的工作与否由时控器1来控制。

储液室5与主反应器7之间依靠玻璃板6相隔离，玻璃板6成弧形，玻璃板6的凹部面朝主反应器7的内腔。主反应器7由主反应室74和可开启的盖子73组成，盖子73与主反应室74之间通过磨砂口72或螺纹旋口实现密封相连；即，玻璃板6的凹部面朝主反应室74。在盖子73上设置与主反应器7的内腔（即主反应室74的内腔）密封相连通的出口管71，位于主反应器7外的空气除菌器Ⅱ8与出口管71密封相连通。在玻璃板6中心处设置一通气小孔63，位于储液室5空腔内的玻璃弯管61与通气小孔63密封地相连通；从而实现储液室5与主反应器7（即主反应室74）之间依靠玻璃弯管61相连通。在玻璃弯管61内设置过滤网62，设置过滤网62的目的是：为了防止主反应室74内的植物组织通过玻璃弯管61掉入储液室5内。在储液室5的底部设置放液口52，在放液口52内设置密封塞53；实验结束后，拔出密封塞53，能从放液口52排出储液室5内的液体培养基。在储液室5的侧壁上设有与储液室5内腔密封相连通的进口管51，位于储液室5外的空气除菌器Ⅰ4的一端与进口管51密封相连通、另一端与进气管3密封相连通；进气管3与充气泵2密封相连通。

因此要实现半夏属种苗的产业化生产必须进行培养方式的革新。而应用间歇浸没培养反应器进行半夏属的培养可以大大提高生产过程中的自动化程度，减少培养时的人力投入，并且可以大大提高增殖率，为低成本的生产大量高质量的种苗和离体块茎提供保障。并且利用反应器生产半夏种苗具有无病原菌，遗传均一稳定等优点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用间歇浸没培养反应器进行半夏属植物组培快繁的方法，使得采用该方法相对于传统半夏属组织培养方法可具有增殖率高、健壮、无需炼苗直接移栽、成活率高，并且具有自动化程度高，节省劳动力消耗的优点。

本发明的技术方案是：

一种半夏属植物的组培快繁方法，包括外植体选材料的选择和处理、增殖培养、生根及块茎生成、炼苗及离体块茎移栽的步骤，其特征在于在间歇浸没培养反应器进行所述的增殖培养和生根及块茎生成步骤。

具体地，所述的方法包括以下步骤：

（1）外植体材料选择与处理：选择传统组培方法得到的分化状态的半夏属植物无菌苗或经过消毒灭菌后自然生长的种苗，取其外植体并切出伤口备用。

其中，具体的外植体及处理方法为：叶片外植体取完全展开的叶片，将其横切出伤口以利于愈伤组织的诱导；叶柄外植体取叶柄中部切为0.5~2 cm长度，优选1cm；丛生芽及块茎外植体切出伤口以利于愈伤组织的诱导。

（2）增殖培养：在无菌状态下，将步骤（1）得到的处理好的外植体接种到预先灭好菌的间歇浸没培养反应器中进行增殖培养。

其中，所述的间歇浸没培养反应器应理解为现有技术中任何间歇浸没式培养反应器，因为它们均具备对半夏属植物外植体进行间歇式浸没培养的功能。本发明所使用的间歇浸没培养反应器“间歇浸没植物组织器官的培养反应器”和“间歇浸没的开合式植物生物反应器”，其专利号分别为ZL 200920116327.X和ZL 201020288879.1。

所述的间歇浸没培养反应器的容积大小为1~10 L，优选3~5L。

间歇浸没培养反应器的参数设置为：浸没频率：1~20 min/2h，优选5 ~10min/2h；培养时间：15~30 d，优选20~25d；培养用培养基配方为但不限于Ms+1.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。

（3）生根及块茎生成：增殖培养结束后，在无菌条件下将间歇浸没培养反应器中的增殖用培养基替换为生根及块茎生成培养基进行组织培养得到种苗。所述生根及块茎生成培养基为但不限于Ms+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+45 g/L蔗糖，pH5.8。设置间歇浸没培养参数为：浸没频率：1~20min/4h, 优选5~10 min/4h；培养时间：20~40d，优选25~30 d；培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。

（5）炼苗及离体块茎移栽：将组织培养得到的种苗取出后，无需炼苗直接移栽到珍珠岩中，保持湿度、控制适当光照和保证营养，以保证移栽成活率。通过以上方法炼苗和培育的种苗可以直接移栽到大田培养，从而获得大量生长一致的组培种苗。

本发明所述的半夏属植物为为中药半夏属(Pinellia Tenore)的植物；主要包括三叶半夏(P. ternata (Thunb.) Breit.)、水半夏（P. cordata N. E. Brown）、盾叶半夏（P. peltata Pei）、天南星（P. pedatisecta Schott）和犁头尖（Typhonium divaricatum (L.) Decne.）等，优选三叶半夏和水半夏。

本发明是利用间歇浸没生物反应器进行半夏属组培苗的生产具有如下优势：

（1）自动化水平高，可节省大量的劳动力消耗。利用间歇浸没反应器培养半夏属植物可以大大减少培养瓶的个数，大大减少了灌装洗涤以及接种等各个方面的劳动力消耗。并且在培养过程中可实现自动化的控制。这样就大大节省了劳动力成本。

（2）增殖率高，生物产量大。间歇浸没培养反应器培养是利用液体培养对植物组织器官进行间歇浸没的培养，这种培养方式下半夏属植物的增殖率远远高于常规培养。

（3）减少继代次数，降低组培苗变异频率。间歇浸没反应器培养半夏属植物可一次成苗，减少了继代的次数，并且间歇浸没培养可以很好的解决液体培养的玻璃和问题，消除了致使组培苗变异的条件，从而从根本上降低了组培苗的变异频率。

（4）组培苗质量好。间歇浸没培养过程中当液体浸没时可以很好的给植物组织提供养分，且可以进行气体交换，使植物进行自养型的光和作用，且在这个过程中已经对组培苗进行了炼苗的步骤，从而得到的组培苗更加健壮，取出后不需炼苗可直接移栽。并且由于经过了诱导块茎生成的步骤，得到的组培苗移栽后短时间内即可长成较大的块茎。

综上所述利用间歇浸没培养反应器进行半夏属植物组培快繁相对于传统培养具有自动化程度高，增殖率高以及成本低的优点。是适合半夏属植物组培快繁的培养方法。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步详细说明。

图1为中国专利申请号为201020288879.1的“间歇浸没的开合式植物生物反应器”的结构示意图；

其中，1为时控器；2为充气泵；3为进气管；4为空气除菌器Ⅰ；5为储液室；6为玻璃板；7为主反应器；8为空气除菌器Ⅱ；51为进口管；52为放液口；53为密封塞；61为玻璃弯管；62为过滤网；63为通气小孔；71为出口管；72为磨砂口；73为盖子；74为主反应室。

图2为本发明中实施实例1中叶柄在反应器内不同培养阶段的诱导增殖情况；

其中，①、②为增值培养阶段，其中①为叶柄接种后培养2周的状态，②为叶柄接种后培养4周的状态；

③、④为生根及块茎生成阶段，其中③为叶柄接种后培养6周的状态，④为叶柄接种后培养8周的状态。

图3为本发明中丛生芽、叶柄及叶片三种不同的外植体在间歇浸没培养反应器中诱导得到的的组培苗状态；

其中，①以丛生芽为外植体诱导得到的组培苗；

②以叶柄为外植体诱导得到的组培苗；

③以叶片为外植体诱导得到的组培苗。

具体实施方式

实施例1

利用间歇浸式没培养反应器对三叶半夏无菌苗的叶柄外植体进行扩繁的具体步骤如下：

（1）间歇浸没式培养反应器的选择：利用“间歇浸没植物组织器官的培养反应器”专利号分别为ZL 200920116327.X。容积大小为3L。

（2）材料选择与处理：利用常规组培方法得到的无菌三叶半夏组培苗的叶柄作为外植体，取生长健壮的叶柄，取叶柄中部分别切为0.5、1、1.5、2 cm长度几种，后作为下一步接种用的外植体材料。

（3）增殖培养：具体方法是在无菌状态下，将处理好的外植体接种到预先灭好菌的间歇浸没培养反应器中。间歇浸没培养反应器的参数设置为：浸没频率：1-20 min/2h；培养时间：30 d。培养用培养基配方为Ms+1.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，pH5.8。培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。

（4）生根及块茎生成：具体方法是增殖培养结束后，在无菌条件下将增殖用培养基替换为生根及块茎生成培养基。所述生根及块茎生成培养基为Ms+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+45 g/L蔗糖，pH5.8。设置间歇浸没培养参数为：浸没频率：5-10min/4h；培养时间：30 d。培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。

（5）炼苗及离体块茎移栽：将培养的组培种苗取出后，直接移栽到珍珠岩中，保持湿度、控制适当光照和保证营养，以保证移栽成活率。在一个培养周期内增殖效率达360以上。得到的组培苗成活率在95%以上。

具体的生长状态如说明书附图1中所示。得到的组培苗状态如说明书附图2②所示。

实施例2

利用间歇浸没式培养反应器对半夏属无菌苗的丛生芽外植体进行扩繁的具体步骤：

（1）间歇浸没式培养反应器的选择：利用“间歇浸没植物组织器官的培养反应器”专利号分别为ZL 200920116327.X。容积大小为5L。

（2）材料选择与处理：2）材料选择与处理：利用常规组培方法得到的无菌三叶半夏组培苗的分化状态的丛生芽作为外植体，取叶片未展开的状态良好的丛生芽，切为单棵状态后作为接种用外植体材料。

（3）增殖培养：具体方法是在无菌状态下，将处理好的外植体接种到预先灭好菌的间歇浸没培养反应器中。间歇浸没培养反应器的参数设置为：浸没频率：5-10 min/2h；培养时间：20-25 d。培养用培养基配方为Ms+1.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，pH5.8。培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。

（4）生根及块茎生成：具体方法是增殖培养结束后，在无菌条件下将增殖用培养基替换为生根及块茎生成培养基。所述生根及块茎生成培养基为Ms+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+45 g/L蔗糖，pH5.8。设置间歇浸没培养参数为：浸没频率：1-5min/4h；培养时间：20 d。培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。

（5）炼苗及离体块茎移栽：将培养的组培种苗取出后，直接移栽到珍珠岩和泥炭的混合物中，保持湿度、控制适当光照和保证营养，以保证移栽成活率。在一个培养周期内增殖效率可达1:400以上。得到的组培苗成活率在90%以上。得到的组培苗状态如说明书附图2①所示。

实施例3

利用间歇浸没式培养反应器对三叶半夏无菌苗的叶片外植体进行扩繁的具体步骤如下：

（1）间歇浸没式培养反应器的选择：利用“间歇浸没植物组织器官的培养反应器”专利号分别为ZL 200920116327.X。容积大小为1L。

（2）材料选择与处理：利用常规组培方法得到的无菌半夏属组培苗的叶片作为外植体，取完全展开的叶片，将其横切出三道伤口后作为下一步接种用的外植体材料。

（3）增殖培养：具体方法是在无菌状态下，将处理好的外植体接种到预先灭好菌的间歇浸没培养反应器中。间歇浸没培养反应器的参数设置为：浸没频率：8-20 min/2h；培养时间：15-30 d。培养用培养基配方为Ms+1.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，pH5.8。培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。

（4）生根及块茎生成：具体方法是增殖培养结束后，在无菌条件下将增殖用培养基替换为生根及块茎生成培养基。所述生根及块茎生成培养基为Ms+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+45 g/L蔗糖，pH5.8。设置间歇浸没培养参数为：浸没频率：1-20min/4h；培养时间：20-40 d。培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。

（5）炼苗及离体块茎移栽：将培养的组培种苗取出后，无需炼苗直接移栽到珍珠岩中，保持湿度、控制适当光照和保证营养，以保证移栽成活率。在一个培养周期内增殖效率可达1:300以上。得到的组培苗成活率在90%以上。得到的组培苗状态如说明书附图2③所示。

实施例4

利用间歇浸式没培养反应器对三叶半夏无菌苗的叶柄外植体进行扩繁的具体步骤如实施例1所示，所不同的是所选用的“间歇浸没植物组织器官的培养反应器”的容积大小为10L。在一个培养周期内增殖效率可达1:380以上。得到的组培苗成活率在90%以上。

实施例5

利用间歇浸式没培养反应器对三叶半夏无菌苗的叶柄外植体进行扩繁的具体步骤如实施例1所示，所不同的是所选用的“间歇浸没植物组织器官的培养反应器”的容积大小为8L。在一个培养周期内增殖效率可达1:350以上。得到的组培苗成活率在90%以上。

实施例6

利用间歇浸式没培养反应器对三叶半夏无菌苗的叶柄外植体进行扩繁的具体步骤如实施例1所示，所不同的是所选用的反应器为“间歇浸没的开合式植物生物反应器”，ZL 201020288879.1。容积大小为3L。在一个培养周期内增殖效率可达1:400以上。得到的组培苗成活率在90%以上。

实施例7

利用间歇浸式没培养反应器对三叶半夏无菌苗的叶柄外植体进行扩繁的具体步骤如实施例1所示，所不同的是所选用的反应器为“间歇浸没的开合式植物生物反应器”，ZL 201020288879.1。容积大小为5L。在一个培养周期内增殖效率可达1:400以上。得到的组培苗成活率在90%以上。

实施例8

利用间歇浸没式培养反应器对三叶半夏大田苗叶柄外植体进行扩繁的具体步骤如实施例1所示。所不同的是大田苗叶柄外植体需要经过75%酒精消毒1min后经升汞灭菌3min后无菌水冲洗干净后备用。在一个培养周期内增殖效率可达1:350以上。得到的组培苗成活率在90%以上。

实施例9

利用间歇浸没式培养反应器对三叶半夏无菌苗的叶片外植体进行扩繁的具体步骤如实施例3所示，所不同的是大田苗叶片外植体需要经过75%酒精消毒1min后经升汞灭菌3min，无菌水冲洗干净后备用。在一个培养周期内增殖效率可达1:300以上。得到的组培苗成活率在85%以上。

实施例10

利用间歇浸没式培养反应器对水半夏（P. cordata N. E. Brown）无菌苗的丛生芽外植体进行扩繁的具体步骤如实施例2所示。所不同的是外植体为水半夏生长旺盛的丛生芽切为单个植株后培养。在一个培养周期内增殖效率可达1:350以上。得到的组培苗成活率在95%以上。

实施例11

利用间歇浸没式培养反应器对盾叶半夏（P. peltata Pei）无菌苗的丛生芽外植体进行扩繁的具体步骤如实施例2所示。所不同的是外植体为盾叶半夏生长旺盛的丛生芽切为单个植株后培养。在一个培养周期内增殖效率可达1:260以上。得到的组培苗成活率在90%以上。

实施例12

利用间歇浸没式培养反应器对天南星（P. pedatisecta Schott）无菌苗的丛生芽外植体进行扩繁的具体步骤如实施例2所示。所不同的是外植体为天南星生长旺盛的丛生芽切为单个植株后培养。在一个培养周期内增殖效率可达1:350以上。得到的组培苗成活率在95%以上。

实施例13

利用间歇浸没式培养反应器对犁头尖（Typhonium divaricatum (L.) Decne.）无菌苗的丛生芽外植体进行扩繁的具体步骤如实施例2所示。所不同的是外植体为犁头尖生长旺盛的丛生芽切为单个植株后培养。在一个培养周期内增殖效率可达1:260以上。得到的组培苗成活率在95%以上。

对照例1

利用常规固体培养方法对三叶半夏无菌苗的叶柄外植体进行扩繁的具体步骤如下：

（1）材料选择与处理：利用常规组培方法得到的无菌三叶半夏组培苗的叶柄作为外植体，取生长健壮的叶柄，取叶柄中部切为0.5 cm左右长度后作为下一步接种用的外植体材料。

（2）增殖培养：将处理好的叶柄外植体于无菌状态下接种到装有50 mL固体培养基的大小为250 mL的培养瓶中，每个培养瓶中接种5个外植体，保证每个外植体培养用的培养基的量与间歇浸没反应器培养的量一致。培养用培养基配方为Ms+1.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，pH5.8。培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。

（3）生根及块茎生成：增殖培养30 d结束后将组培苗取出后转入同样量的生根及块茎生成培养基，其配方为Ms+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+45 g/L蔗糖，pH5.8。再进行30 d的培养。培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。

（4）炼苗及离体块茎移栽：将培养60 d后的组培苗取出后，炼苗5 d后移栽到珍珠岩中，保持湿度、温度及光照。一个培养周期内增殖效率可达到1:150以上。移栽成活率可达到60%以上。

对照例2

利用常规液体摇瓶培养方法对三叶半夏无菌苗的叶柄外植体进行扩繁的具体步骤如下：

（2）增殖培养：将处理好的叶柄外植体于无菌状态下接种到装有100 mL液体培养基的大小为250 mL的三角瓶中，接种10个外植体以保证每个外植体培养用的培养基的量与间歇浸没反应器培养的量一致。置于摇床上，100rpm振荡培养。培养用培养基配方为Ms+1.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，pH5.8。培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。

（4）炼苗及离体块茎移栽：将培养60 d后的组培苗取出后，炼苗5 d后移栽到珍珠岩中，保持湿度、温度及合适光照。一个培养周期内增殖效率可达到1:100以上。移栽成活率可达到40%以上。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种半夏属植物的组培快繁方法，包括外植体选材料的选择和处理、增殖培养、生根及块茎生成、炼苗及离体块茎移栽的步骤，其特征在于在间歇浸没培养反应器进行所述的增殖培养和生根及块茎生成步骤。

2.根据权利要求1所述的半夏属植物的组培快繁方法，其特征在于具体包括以下步骤：

（1）外植体材料选择与处理：选择传统组培方法得到的半夏属植物无菌苗或经过消毒灭菌后自然生长的种苗，取其外植体并切出伤口备用；

（2）增殖培养：在无菌状态下，将步骤（1）得到的处理好的外植体接种到预先灭好菌的间歇浸没培养反应器中进行增殖培养；

（3）生根及块茎生成：增殖培养结束后，在无菌条件下将间歇浸没培养反应器中的增殖用培养基替换为生根及块茎生成培养基进行组织培养得到种苗；

（4）炼苗及离体块茎移栽：将组织培养得到的种苗取出后，直接移栽到珍珠岩中。

3.根据权利要求2所述的半夏属植物的组培快繁方法，其特征在于所述的步骤（1）的外植体处理方法为：叶片外植体取完全展开的叶片，将其横切出伤口以利于愈伤组织的诱导；叶柄外植体取叶柄中部切为0.5~2 cm长度；丛生芽及块茎外植体切出伤口以利于愈伤组织的诱导。

4.根据权利要求3所述的半夏属植物的组培快繁方法，其特征在于所述的叶柄外植体取叶柄中部切为1cm长度。

5.根据权利要求2所述的半夏属植物的组培快繁方法，其特征在于所述的步骤（2）的间歇浸没培养反应器的参数设置为：浸没频率1~20 min/2h；培养时间：15~30 d；培养用培养基配方为Ms+1.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。

6.根据权利要求5所述的半夏属植物的组培快繁方法，其特征在于所述的间歇浸没培养反应器的参数设置为：浸没频率5 ~10 min/2h；培养时间：20~25d。

7.根据权利要求2所述的半夏属植物的组培快繁方法，其特征在于所述的步骤（3）的生根及块茎生成培养基为Ms+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+45 g/L蔗糖，pH5.8；设置间歇浸没培养参数为：浸没频率1~20min/4h；培养时间20~40d；培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。

8.根据权利要求7所述的半夏属植物的组培快繁方法，其特征在于所述的设置间歇浸没培养参数为：浸没频率5~10 min/4h；培养时间25~30 d。

9.根据权利要求2所述的半夏属植物的组培快繁方法，其特征在于所述的间歇浸没培养反应器的容积大小为1~10 L。

10.根据权利要求7所述的半夏属植物的组培快繁方法，其特征在于所述的间歇浸没培养反应器的容积大小为3~5L。

11.根据权利要求1至10之一所述的半夏属植物的组培快繁方法，其特征在于所述的半夏属植物为中药半夏属(Pinellia Tenore)的植物。

12.根据权利要求11所述的半夏属植物的组培快繁方法，其特征在于所述的中药半夏属(Pinellia Tenore)是三叶半夏(P. ternata (Thunb.) Breit.)、水半夏（P. cordata N. E. Brown）、盾叶半夏（P. peltata Pei）、天南星（P. pedatisecta Schott）或犁头尖（Typhonium divaricatum (L.) Decne.）。