CN115176706A - 珍珠半夏叶片一步成苗高效育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用珍珠半夏叶片体外一步成苗的高效育种方法，包括的步骤有：(1)将消毒处理后的叶片接种于培养基A中，45d后产生12‑15个小块茎，其上均有叶芽发生，共能产生18个左右具1枚叶片的叶柄；每个叶片能分割为3‑4个材料，每个叶柄分割为2个材料，小块茎不再分割，重新转入新鲜培养基A中，如此增殖系数可达110.0左右，同时具100％生根率。(2)待试管苗长至5.0‑7.0cm、块茎直径约1.0‑2.0cm，将试管苗取出，移入基质中保温保湿培养，45d后再生成活率100％。本发明实现了珍珠半夏整个培养过程同时在一个培养基中进行并能够一步成苗，极大地提高了人工体外繁殖效率，且操作简单、成本低、增殖系数极高。

Description

珍珠半夏叶片一步成苗高效育种方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及珍珠半夏叶片一步成苗高效育种方法。

背景技术

半夏属(Pinellia)隶属天南星科(Araceae)，共有6个种，分布在亚洲东部，中国有5种，分别是半夏(P.ternata(Thunb.)Breit.)、滴水珠(P.cordata N.E.Brown)、盾叶半夏(P.peltata Pei)、石蜘蛛(P.integrifolia N.E.Brown)、虎掌(P.pedatisecta Schott)，南北均有分布。半夏属植物为多年生草本，具块茎，叶出自块茎顶端，叶基部常有株芽，花单性，无花被；喜生于潮湿肥沃的沙质土上，多见于房前屋后、山野溪边及林下；在中国主产于湖北、河南、安徽、四川、贵州等地。半夏以干燥块茎入药，其性辛温有毒，有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结等功效，是复方半夏片、半夏厚朴丸、半夏泻心丸等中成药的主要组成成分。现代研究表明，半夏含有生物碱、挥发油、有机酸、甾醇类、氨基酸等多种化学成分，具有止咳祛痰、镇吐、抗早孕、抗溃疡、抗肿瘤、抗哮喘、降血脂等药理作用；半夏凝集素不仅能凝集红血球，抑制癌细胞发生，亦用于植物保护中的病虫害防治；近年来已证明半夏具有效治疗抑郁症且副作用较小的临床功效。在中国，半夏的使用量居常用药物第22位，广泛应用于各种方剂。中国云南昭通为半夏的道地产区，其外形圆润、粉性足、质量佳，为中国中药界公认的上品，享有“珍珠半夏”之美誉；其有效成分含量高于其他产区的旱半夏，曾作为出口免检商品而被大量使用。

半夏属植物主产于中国，为杂草性植物，随着荒地的开发、现代农业除草剂的广泛使用、人为的过度采挖以及目前采用的母种块茎繁殖方式，导致种植规模弱小零散，品质稳定性无法保障，供需失衡，野生资源采挖枯竭的现状日趋突出。在长期自然选择下，半夏有性繁殖退化，主要依靠块茎或珠芽繁殖。然而，一个成熟的半夏植株每年只能产生2-3个珠芽和7-8个块茎，繁殖系数较低，加之块茎的商品价值使得其每年的繁殖基数成倍递减。半夏的种植主要面临两个问题，其一为半夏腐烂病极易在大田里传播，一旦发生，难以根治，是目前人工种植的瓶颈；其二是长期无性系繁殖导致种质退化，抗病害、免疫力和结实率降低，其品质无法满足市场要求。目前，世界各国半夏原材料基本依靠中国进口，但半夏的种植量和品质已经远远不能满足整体市场的需求。从已有的文献上看，各国学者对半夏的研究主要集中在药理活性以及半夏凝集素基因通路上。组织培养技术能够保持母本的优良特性，短期能获大量遗传性质高度一致的种苗。然而，有关半夏的组织培养虽有报道，但大多为间接器官发生，存在周期长、系数低、再生植株羸弱等问题，很难应用于规范化生产中；而珍珠半夏的人工快繁研究则未见报道。

组织培养技术不仅有生长快、周期短、可重复性强等优点，且材料来源单一，可保留植株原有的优良性状，短期能获大量遗传性质高度一致的种苗。植物离体培养技术的发展，为药用植物资源稀缺提供了有效的保障。面对珍珠半夏的市场供求状况，急需寻求一种新的成本低、时间短、质量和成活率高，且能将母本优良性状固定下来的无性繁殖方法来扩大珍珠半夏种苗的繁殖量，进行高品质种苗的工厂化生产，以满足种植需求。

发明内容

本发明的目的在于通过直接器官发生方式解决珍珠半夏种苗缺乏并避免间接器官发生所存在的周期长、系数低、再生植株羸弱、产生变异、移栽成活率低等问题，该方法可为固定母本优良性状、发展人工种植奠定技术基础。通过本发明，可提供基因型背景一致的优质种苗以满足人工种植的需求。

为了解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：

珍珠半夏叶片一步成苗高效育种方法，其特征在于，包括的步骤有：将消毒灭菌处理后的叶片切割为适当大小，接种于培养基中获得增殖生根一体化培养及炼苗移栽。

进一步地，所述的珍珠半夏叶片一步成苗高效育种方法，包括以下步骤：

(1)外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，取其幼嫩叶片；

(2)将(1)步骤的叶片进行消毒处理；

(3)将经过(2)步骤消毒灭菌好的叶片切为适当大小，接入下列培养基A中，所述培养基A，包括以下原料：

MS基本培养液

6-苄胺基嘌呤(6-BA)

α-萘乙酸(NAA)

激动素(KT)

蔗糖

琼脂粉

控制光照度、温度、光照时间进行培养，即可获得增殖和生根一体化试管苗；；

(4)炼苗和移栽：取(3)步骤中的培养瓶置于室温下炼苗3-5d后，打开瓶盖从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入多菌灵溶液中消毒后，剪去根叶，只留块茎，移栽至经消毒的基质中保温保湿培养，即得移栽苗；

进一步地，步骤(2)中所述叶片进行消毒处理的方法为：用自来水洗净表面后用质量百分比10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积百分比75％乙醇溶液处理10s，再用质量百分比0.1％升汞水溶液灭菌8-10min，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。

进一步地，(3)步骤中所述培养基A，包括以下原料：

MS基本培养液：

进一步地，所述培养基A的pH值为5.4-5.8。

进一步地，(3)步骤所述叶片切割大小为1.0×1.0cm左右。

进一步地，(4)步骤中所述基质消毒方法为，质量浓度为0.05-0.1％的高锰酸钾溶液喷撒至腐质土中，微湿后用塑料薄膜密封一周，备用。

进一步地，(4)步骤中所述多菌灵溶液的质量浓度为0.1-0.5％。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明用组织培养技术在培养室内可实现周年生产，既节约了土地资源，又提高了经济效益，克服了传统营养繁殖方式无法周年进行生产的难点；

(2)本发明利用珍珠半夏叶片为外植体，不仅材料易得，且通过直接器官发生方式，可最大程度固定母本优良性状，避免了间接器官发生方式可能产生的变异；

(3)本发明仅需一种培养基中利用直接器官发生方式完成增殖和生根过程，既可在满足大规模生产需要的同时，又保持了母本的优良性状，为其人工快繁最有效的增殖方式，且提高了种苗质量；

(4)本发明实现了高效快繁的目的，45d为一个增殖培养周期，繁殖系数可达110.0以上；

(5)本发明简化了培养程序，整个快速繁殖过程只需1种培养基就解决了从增殖到生根的过程，利于后期生产计划的安排；

(6)通过本发明生产的珍珠半夏试管苗，由于每一株均具大小不一的小块茎，移栽成活率高，且生长迅速，目前已在云南省昭通绥江进行示范栽培，效果很好；

(7)本发明对珍珠半夏人工快速繁殖具有重要意义和价值，同时也可为天南星科其他多年生草本类药用植物的快速繁殖提供技术参考。

附图说明

图1为叶片直接器官发生及一步成苗培养，标尺＝1.5cm；

其中图1-A为培养15d后叶片表面开始有白色突起产生图；图1-B为培养25d后不定根发生明显，小块茎越来越多，几乎占据整个材料表面，其上由叶芽发育而来的叶片舒展，具显著的叶柄图；图1-C为培养35d后可明显观察到小块茎膨大图；图1-D为培养45d后再生植株的根粗、长且分布在整个培养基底部，小块茎明显，长势茂盛图；图1-E、F为培养45d时，每个材料产生12-15个小块茎，其上均有叶芽发生，共能产生18个左右具1枚叶片的叶柄；每个叶片能分割为3-4个材料，每个叶柄分割为2个材料，小块茎不再分割，重新转入新鲜培养基A中，如此增殖系数可达110.0左右图。

图2为驯化移栽的图，标尺＝3.0cm。

其中图2-A为试管苗修剪去多余部分，只留下块茎，移入装有消毒后的基质中保温保湿培养图；图2-B为10d后一部分块茎新生叶从基质中重新发出，叶片卷曲，叶柄短小图；图2-C为20d后大部分块茎自土里长出新芽，块茎产生新的根系图；图2-D为30d时将泡沫箱中的再生植株移入大田种植，15d后，三裂叶长出，叶脉明显，叶面积变大，成活率为100％。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

珍珠半夏叶片一步成苗高效育种方法，包括以下步骤：

1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，取其幼嫩叶片。

2、将1步骤的叶片用质量百分比10％洗衣粉溶液浸泡10min，并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积百分比75％乙醇溶液处理10s，再用质量百分比0.1％升汞水溶液灭菌8min，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。

3、增殖、生根一步成苗体系的建立：将经过2步骤消毒灭菌好的叶片剪切为1.0×1.0cm左右，接入下列培养基A中：

MS基本培养液：

培养条件：在光照度1800-2500lx，光照时间10h/d，温度控制在22±2℃的条件下进行培养，15d后叶片表面开始有白色突起产生；培养25d后不定根发生明显，小块茎越来越多，几乎占据整个叶片表面，其上由叶芽发育而来的叶片舒展，具显著的叶柄；培养35d后可明显观察到小块茎膨大；培养45d后再生植株的根粗、长且分布在整个培养基底部，小块茎明显，长势茂盛；此时，每个材料产生12-15个小块茎，其上均有叶芽发生，共能产生18个左右具1枚叶片的叶柄；每个叶片能分割为3-4个材料，每个叶柄分割为2个材料，小块茎不再分割，重新转入新鲜培养基A中，如此增殖系数可达112.65。

4、炼苗和移栽：3步骤中生根苗高至5cm、块茎约1.0cm直径大小时，将培养瓶于自然光条件下放置3d后，打开瓶盖取出生根苗，小心洗净残余培养基，用0.1％多菌灵(质量比)泡洗5min，将叶片、叶柄和根去掉，只留下小块茎，浅埋于经质量浓度为0.05％的高锰酸钾消毒后的腐殖质中保温保湿培养30d(温度20-25℃湿度70％左右)，后，即得移栽苗，成活率可达100％。

实施例2

珍珠半夏叶片一步成苗高效育种方法，包括以下步骤：

1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，取其幼嫩叶片。

2、将1步骤的叶片用质量百分比10％洗衣粉溶液浸泡10min，并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积百分比75％乙醇溶液处理10s，再用质量百分比0.1％升汞水溶液灭菌9min，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。

3、增殖、生根一步成苗体系的建立：将经过2步骤消毒灭菌好的叶片剪切为1.0×1.0cm左右，接入下列培养基A中：

MS基本培养液：

培养条件：在光照度1800-2500lx，光照时间10h/d，温度控制在22±2℃的条件下进行培养，15d后叶片表面开始有白色突起产生；培养25d后不定根发生明显，小块茎越来越多，几乎占据整个叶片表面，其上由叶芽发育而来的叶片舒展，具显著的叶柄；培养35d后可明显观察到小块茎膨大；培养45d后再生植株的根粗、长且分布在整个培养基底部，小块茎明显，长势茂盛；此时，每个材料产生12-15个小块茎，其上均有叶芽发生，共能产生18个左右具1枚叶片的叶柄；每个叶片能分割为3-4个材料，每个叶柄分割为2个材料，小块茎不再分割，重新转入新鲜培养基A中，如此增殖系数可达119.89。

4、炼苗和移栽：3步骤中生根苗高至6cm、块茎约1.5cm直径大小时，将培养瓶于自然光条件下放置3d后，打开瓶盖取出生根苗，小心洗净残余培养基，用0.1％多菌灵(质量比)泡洗5min，将叶片、叶柄和根去掉，只留下小块茎，浅埋于经质量浓度为0.08％的高锰酸钾消毒后的腐殖质中保温保湿培养30d(温度20-25℃湿度70％左右)，后，即得移栽苗，成活率可达100％。

实施例3

珍珠半夏叶片一步成苗高效育种方法，包括以下步骤：

1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，取其幼嫩叶片。

2、将1步骤的叶片用质量百分比10％洗衣粉溶液浸泡10min，并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积百分比75％乙醇溶液处理10s，再用质量百分比0.1％升汞水溶液灭菌10min，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。

3、增殖、生根一步成苗体系的建立：将经过2步骤消毒灭菌好的叶片剪切为1.0×1.0cm左右，接入下列培养基A中：

MS基本培养液：

培养条件：在光照度1800-2500lx，光照时间10h/d，温度控制在22±2℃的条件下进行培养，15d后叶片表面开始有白色突起产生；培养25d后不定根发生明显，小块茎越来越多，几乎占据整个叶片表面，其上由叶芽发育而来的叶片舒展，具显著的叶柄；培养35d后可明显观察到小块茎膨大；培养45d后再生植株的根粗、长且分布在整个培养基底部，小块茎明显，长势茂盛；此时，每个材料产生12-15个小块茎，其上均有叶芽发生，共能产生18个左右具1枚叶片的叶柄；每个叶片能分割为3-4个材料，每个叶柄分割为2个材料，小块茎不再分割，重新转入新鲜培养基A中，如此增殖系数可达116.37。

4、炼苗和移栽：3步骤中生根苗高至7cm、块茎约2.0cm直径大小时，将培养瓶于自然光条件下放置3d后，打开瓶盖取出生根苗，小心洗净残余培养基，用0.1％多菌灵(质量比)泡洗5min，将叶片、叶柄和根去掉，只留下小块茎，浅埋于经质量浓度为0.1％的高锰酸钾消毒后的腐殖质中保温保湿培养30d(温度20-25℃湿度70％左右)，后，即得移栽苗，成活率可达100％。

本发明的技术原理：

1、本发明只需1种培养基就完成了增殖和生根的问题，二者合二为一，利于后期生产计划的安排；同时小块茎的出现解决了驯化成活率低的问题；

2、本发明利用直接器官发生方式，可使所有种苗保持同一基因型背景，易于标准化、工厂化操作，有效地提高了种苗质量，可为大面积推广种植提供统一标准的优良种苗；

3、本发明提供的珍珠半夏叶片一步成苗高效育种方法，成本低、时间短、品质好且成活率高，并能将优良性状固定下来的无性繁殖方法来扩大其种苗的繁殖量，进行珍珠半夏高品质种苗的工厂化生产，以满足种植需求。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.珍珠半夏叶片一步成苗高效育种方法，其特征在于，包括的步骤有：将消毒灭菌处理后的叶片切割为适当大小，接种于培养基中培养。

2.根据权利要求1所述的珍珠半夏叶片一步成苗高效育种方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，取其幼嫩叶片；

(2)将(1)步骤的叶片进行消毒处理；

(3)将经过(2)步骤消毒灭菌好的叶片切为适当大小，接入下列培养基A中，所述培养基A，包括以下原料：

MS基本培养液

6-苄胺基嘌呤(6-BA)

α-萘乙酸(NAA)

激动素(KT)

蔗糖

琼脂粉

控制光照度、温度、光照时间进行培养，即可获得增殖和生根一体化试管苗；

(4)炼苗和移栽：取(3)步骤中的生根植株置于室温下炼苗3-5d后，打开瓶盖从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入多菌灵溶液中消毒后，剪去根叶，只留块茎，移栽至经消毒的基质中保温保湿培养，即得移栽苗。

3.根据权利要求2所述的珍珠半夏叶片一步成苗高效育种方法，其特征在于，(2)步骤中所述叶片进行消毒处理的方法为：用自来水洗净表面后用质量百分比10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积百分比75％乙醇溶液处理10s，再用质量百分比0.1％升汞水溶液灭菌8-10min，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。

4.根据权利要求2所述的珍珠半夏叶片一步成苗高效育种方法，其特征在于，(3)步骤所述培养基A，包括以下原料：

MS基本培养液：

5.根据权利要求4所述的珍珠半夏叶片一步成苗高效育种方法，其特征在于，所述A培养基的pH值为5.4-5.8。

6.根据权利要求2所述的珍珠半夏叶片一步成苗高效育种方法，其特征在于，(3)步骤所述叶片切割大小为1.0×1.0cm左右。

7.根据权利要求2所述的珍珠半夏叶片一步成苗高效育种方法，其特征在于，(4)步骤中所述基质消毒方法为，质量浓度为0.05-0.1％的高锰酸钾溶液喷撒至腐质土中，微湿后用塑料薄膜密封一周，备用。

8.根据权利要求2所述的珍珠半夏叶片一步成苗高效育种方法，其特征在于，(4)步骤中所述多菌灵溶液的质量浓度为0.1-0.5％。

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