CN102487823B

CN102487823B - 黄花蒿的快速繁殖方法

Info

Publication number: CN102487823B
Application number: CN 201110391241
Authority: CN
Inventors: 刘硕谦; 刘仲华; 田娜; 黄建安
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2011-12-01
Filing date: 2011-12-01
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2031-12-01
Also published as: CN102487823A

Abstract

一种黄花蒿的快速繁殖方法，该方法是切取单株或基因型完全一致的多株黄花蒿上的幼茎，在体外消毒后，横切成茎段，每个茎段带一个芽头，将茎段直接在生根培养基中培养，生根后移栽进行土培。本发明方法取材容易、变异率低、增值系数高、生根周期短，2周增殖倍数能达到200倍以上，生根率达到90％以上，移栽成活率高达95％以上，具有很强的工厂化生产能力。利用本发明的方法繁殖高产黄花蒿株系，可使后代得到稳定遗传，从而有效降低青蒿素生产成本。

Description

黄花蒿的快速繁殖方法

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种黄花蒿的快速无性繁殖方法。

背景技术

黄花蒿(Artemisia annua L.)又名臭蒿、青蒿，为菊科蒿属植物，是我国传统的中药材。青蒿素是我国学者首次从黄花蒿中分离得到的一种倍半萜内酯过氧化物，是治疗疟疾的特效药，国际市场需求量日益增长。进一步的药理研究证明，青蒿素及其类似物对多种肿瘤细胞具有毒性作用，包括乳腺癌细胞、血癌细胞、黑色素瘤细胞、肾癌细胞、中枢神经系统肿瘤细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞等，而对正常细胞损伤很小，并且与传统化疗药物不存在交叉耐药性。因此，青蒿素及其类似物有望被开发成高效、低毒、价廉、谱广的抗癌新药，具有广泛的应用前景，从而导致青蒿素的市场进一步扩大，青蒿素的需求量将进一步上升。

然而，目前药用青蒿素均是从黄花蒿植株中提取分离而得。由于其含量低，导致青蒿素的生产成本过高。因此，筛选并繁殖高青蒿素含量群体，是有效降低生产成本的关键。目前黄花蒿的繁殖均是采用种子繁殖，由于黄花蒿自交不亲和的特性，通过种子繁殖的黄花蒿后代变异大，导致青蒿素含量不稳定，所以很难得到稳定的高产群体。通过基因工程技术获得的高产黄花蒿株系在推广应用时，也存在如何保持遗传稳定性的问题。因此，保持青蒿素含量稳定是黄花蒿栽培和育种中要解决的主要问题。

中国专利200710170426.1公开了一种采用微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿的方法，该法以节间茎为外植体，通过诱导不定芽来对转基因植株进行无性繁殖。但是体细胞再生途径同样存在遗传变异现象，且再生时间长。中国发明专利200710179436.1公开了中药青蒿的一种组织培养快速繁殖方法，是将中药青蒿的顶芽或腋芽在初代培养基中培养，然后再继带培养几代直到获得足够的无菌苗后再诱导生根。该法能有效保持黄花蒿的遗传稳定性，但存在繁殖周期长、效率低的缺陷。中国发明专利公告号CN101213915公开了一种保持高青蒿素含量的青蒿无性繁殖方法，该法采用侧枝扦插的方式进行无性繁殖，存在生根率低、繁殖系数低的缺点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种黄花蒿的快速繁殖方法，该技术采用诱导黄花蒿带一个芽头的幼茎直接生根的无性繁殖方法，克服了黄花蒿由于“自交不亲和性”引起的遗传不稳定的缺点，可在2周内获得大量稳定遗传的后代。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种黄花蒿的快速繁殖方法，该方法包括如下步骤：

a、取材：选取生长旺盛、无病虫害的黄花蒿，待其长出多于200个芽头时，剪切所有幼茎作为外植体；

b、外植体的消毒：将上述幼茎置于带盖的容器中，加入质量浓度为0.5-1%的次氯酸钠溶液浸泡消毒15-20min，次氯酸钠溶液以淹盖住幼茎为宜，并滴加吐温20，使吐温20终浓度为0.05%（体积浓度），浸泡过程中盖上盖子，并不断晃动容器，然后取出幼茎，用无菌水冲洗4次，在无菌条件下，将消毒后的幼茎切成1.3～1.7cm的茎段，每个茎段带一个芽头；

c、诱导生根：将无菌的茎段扦插于灭菌的生根培养基上在组培室中培养10-20天，得到生根的试管苗，生根培养基为添加有生根诱导剂0.02～0.08 mg/L 萘乙酸的固态MS培养基，培养条件：每天 16h光照，8h黑暗，2600～3000 lx光照，温度24～26℃，相对湿度60～70%；

d、试管苗的移栽：将试管苗按常规技术移栽到大田。如将试管苗开盖炼苗后取出，洗净根部的培养基，移栽到营养穴盘中，移栽用的土壤为地疏松、保水性好的土壤，装到穴盘前，可用浓度为0.1%的多菌灵进行拌土，移栽后保持大棚的相对湿度为90-100%，之后进行浇水、施肥和除草等正常管理。待苗木高度到达8-12cm，移栽到大田。该些对试管苗移栽的叙述皆为现有常规技术，在此并未一一详述。

本发明方法的选材非常重要，最好是单株繁殖，如果选取多植株为繁殖材料时，必须保证所有植株的基因型完全一致。且本发明以幼茎为外植体，幼茎可以是主茎也可以是分枝条。幼茎切成小茎段，每个小茎段必须带一个芽头，芽头可以是顶芽，也可以是腋芽。

本发明方法使用的消毒剂为质量浓度0.5-1%的次氯酸钠溶液，较佳的为质量浓度1%的次氯酸钠溶液。

本发明方法所用固态MS（Murashige Skoog）培养基是标准的植物组织培养基。

本发明的优点是：

1、以大株黄花蒿带单个芽头的幼茎为生根材料，具有取材方便、数量多的优点，从而可一代繁殖200株以上；

2、外植体直接诱导生根而进行无性繁殖，不经过再生途径，具有遗传稳定、繁殖速度快、繁殖率高的优点；

3、本发明采用次氯酸钠对材料进行消毒，较升汞的毒性弱、环境污染轻，且未使用酒精消毒，提高了生根率；

4、本发明操作简单、步骤少，使用的激素量小，具有实用性强、易于推广、生产成本低的优点；本发明方法为大规模推广青蒿素高含量植株提供了技术保障。

具体实施方式：

下面，本发明将用实施例进行进一步地说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实施例。

实施例1

从生长旺盛、无病虫害的单株黄花蒿上剪切15-17cm长的幼茎，直立于带盖的玻璃容器中，加入质量浓度为0.5%的次氯酸钠溶液以淹盖住幼茎，并滴加吐温20，使吐温20终浓度为0.05%（体积浓度），盖上盖子，浸泡20min，浸泡过程中不时晃动溶液，消毒完后，倒掉消毒液（含吐温20的次氯酸钠溶液），使用无菌水冲洗灭菌幼茎4次，在无菌条件下，将消毒后的幼茎切成1.3～1.7cm的茎段，每个茎段带一个芽头，得到300个带芽头的茎段，将该茎段扦插于灭菌的生根培养基上，在组培室中培养，生根培养基为含0.08mg/L萘乙酸（NAA）的固态MS培养基，光照条件为：每天16h光照，8h黑暗，光照强度为2600lx，培养温度26℃，相对湿度60～70%；培养15天后，283个茎段产生了不定根，再培养5天后，开盖炼苗2天，然后从培养瓶中取出，用自来水洗净根部的培养基，移栽到营养穴盘中，移栽用的土壤为地疏松、保水性好的土壤，装入穴盘前，可用浓度为0.1%的多菌灵进行拌土，移栽后的3天，大棚的相对湿度保持在90-100%，之后进行浇水、施肥和除草等管理。经3周，苗木高度到达8-12cm，移栽到大田。结果271株得以成活，各株长势一致，青蒿素含量无明显差异。

实施例2

从生长旺盛、无病虫害的单株黄花蒿上剪切15-17cm长的幼茎，直立于带盖的玻璃容器中，加入质量浓度为0.7%的次氯酸钠溶液以淹盖住幼茎，滴加吐温20，使吐温20终浓度为0.05%（体积浓度），盖上盖子，浸泡18 min，不时晃动溶液，消毒完后，倒掉消毒液（含吐温20的次氯酸钠溶液），使用无菌水冲洗灭菌幼茎4次，在无菌条件下将幼茎切成1.3-1.7cm的茎段，每个茎段带一个芽，得到260个带单个芽头的茎段，将该茎段扦插于灭菌的生根培养基上，在组培室中培养，生根培养基为含0.02mg/LNAA的固态MS培养基，光照条件为：每天16h光照，8h黑暗，光照强度为2800lx，培养温度25℃，培养10天后，所有外植体均产生了不定根，再培养5天后，开盖炼苗3天，然后从培养瓶中取出，用自来水洗净根部的培养基，移栽到营养穴盘中，移栽用的土壤为地疏松、保水性好的土壤，装到穴盘前，可用浓度为0.1%的多菌灵进行拌土，移栽后的3天，大棚的相对湿度保持在90-100%，之后进行浇水、施肥和除草等正常管理。经3周，苗木高度到达8-12cm，移栽到大田。结果251株得以成活，各株长势一致，青蒿素含量无明显差异。

实施例3

从生长旺盛、无病虫害的单株黄花蒿上剪切15-17cm长的幼茎，直立于带盖的玻璃容器中，加入质量浓度为1%的次氯酸钠溶液以淹盖住幼茎，并滴加吐温20，使吐温20终浓度为0.05%（体积浓度），盖上盖子，浸泡15 min，不时晃动溶液，消毒完后，倒掉消毒液（含吐温20的次氯酸钠溶液），使用无菌水冲洗灭菌幼茎4次，在无菌条件下将幼茎切成1.3-1.7cm的茎段，每个茎段带一个芽，得到230个带单个芽头的茎段，将该茎段扦插于灭菌的生根培养基上，在组培室中培养，生根培养基为含0.06mg/LNAA的固态MS培养基，光照条件为：每天16h光照，8h黑暗，光照强度为3000lx，培养温度24℃；培养10天后，211个芽头产生了不定根，再培养5天后，开盖炼苗3天，然后从培养瓶中取出，用自来水洗净根部的培养基，移栽到营养穴盘中，移栽用的土壤为地疏松、保水性好的土壤，装入穴盘前，用浓度为0.1%的多菌灵进行拌土，移栽后的3天，大棚的相对湿度保持在90-100%，之后进行浇水、施肥和除草等正常管理。经3周，苗木高度到达8-12cm，移栽到大田。结果203株得以成活，各株长势一致，青蒿素含量无明显差异。

Claims

1.一种黄花蒿的快速繁殖方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

b、外植体的消毒：将上述幼茎置于带盖的容器中，加入质量浓度为0.5-1%的次氯酸钠溶液浸泡消毒15-20min，次氯酸钠溶液淹盖住幼茎，并滴加吐温20，使吐温20终浓度为0.05%，浸泡过程中盖上盖子，并不断晃动容器，然后取出幼茎，用无菌水冲洗4次，在无菌条件下，将消毒后的幼茎切成1.3～1.7cm的茎段，每个茎段带一个芽头；

c、诱导生根：将无菌的茎段扦插于灭菌的生根培养基上在组培室中培养10-20天，得到生根的试管苗，生根培养基组成：固态MS培养基 +0.02～0.08 mg/L 萘乙酸；培养条件：每天 16h光照，8h黑暗，2600～3000 lx光照，温度24～26℃，相对湿度60～70%；

d、试管苗的移栽：将上述试管苗按常规技术移栽到大田。

2.如权利要求1所述的黄花蒿的快速繁殖方法，其特征在于：所述外植体取自同一株黄花蒿。

3.如权利要求1所述的黄花蒿的快速繁殖方法，其特征在于：所述外植体取自基因型完全一致的黄花蒿。

4.如权利要求1所述的黄花蒿的快速繁殖方法，其特征在于：所述幼茎是黄花蒿的主枝幼茎。

5.如权利要求1所述的黄花蒿的快速繁殖方法，其特征在于：所述幼茎是黄花蒿的侧枝幼茎。