CN103999777B - 通过组织培养持续获得半夏种苗次生代谢产物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过组织培养持续获得半夏种苗次生代谢产物的方法，该方法的步骤包括（1）植物体批量获得：将植物体处理后接种入培养用反应器装置中，进行培养参数设定后，进行规模化培养，根据需要进行下一步的操作，所述植物体是指无菌培养下获得的植物细胞、植物组织、植物器官和丛生芽等状态；（2）植物次生代谢产物产生及诱导：将获得的植物体在一定的培养条件下生成或进行诱导以获得需要的次生代谢产物；（3）植物次生代谢产物的收集和提取；植物体为半夏种苗，将半夏块茎取出后，通过研磨，超声提取、真空干燥等步骤得到麻黄碱提取物，通过HPLC方法进行检测，得到所获得的半夏块茎中麻黄碱的含量可达到160.30ug/g。

Description

通过组织培养持续获得半夏种苗次生代谢产物的方法

本申请是申请号为“201310043116.9”，申请日为“2013年02月04日”，发明名称为“通过组织培养持续获得植物次生代谢产物的方法及其装置” 中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于植物生物技术领域；具体涉及一种通过组织培养持续获得植物次生代谢产物等有效成分的方法及实现这一方法的装置。

背景技术

次生代谢产物是由次生代谢产生的一类细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。可分为苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、萜类、甾体及其甙、生物碱七大类。药用植物中次生代谢产物是其发挥药用作用的关键成分。

植物次生代谢产物是植物对环境的一种适应，是在长期进化过程中植物与生物和非生物因素相互作用的结果。在对环境胁迫的适应、植物与植物之间的相互竞争和协同进化、植物对昆虫的危害、草食性动物的采食及病原微生物的侵袭等过程的防御中起着重要作用。

植物特别是药用植物中含有丰富的次生代谢产物，有的代谢产物对人体疾病具有显著的疗效，因此植物的次生代谢产物受到了非常高的重视。一般情况下，植物次生代谢产物是从种植或自然分布的植物体中提取得到，而对于某种次生代谢产物的大量需求往往会导致某种植物的利用采摘过度，如紫杉醇的利用导致红豆杉的濒危就是一个很好的例子。

因此，人们开始采用植物组织培养的方法来进行特定植物的培养来进行次生代谢产物的生产。但传统植物组织培养的方法具有低通量和高人工消耗的缺点，反应器的应用是一个比较好的解决方案。传统的反应器培养只是针对植物细胞的培养，而植物次生代谢途径是高度分支的途径，这些途径在植物体内或细胞中并不全部开放，而是定位于某一器官、组织、细胞或细胞器中并受到独立的调控。它们是细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必需的小分子化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性，因此特定植物组织器官的培养对次生代谢产物的获得是必须的。

植物次生代谢产物积累到一定的浓度后往往会抑制其进一步的产生，因此及时的移去生长环境中产生的代谢产物，使其控制在一定的浓度范围内对次生代谢产物的持续生成具有非常重要的作用。实际生产过程中需要一种大批量持续获得培养植物器官和组织的途径，进一步可以通过调控外在的环境等因子来使得植物产生并提高产量，并通过一定的方法控制次生代谢产物的浓度。本发明即提供了此种方法并公开了实现上述方法的装置。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的缺点和不足，提供一种通过植物组织培养方法大批量、持续的获得次生代谢产物的方法。

本发明的另一目的在于提供一种实现上述通过组织培养方法获得次生代谢产物的方法的装置。

本发明的目的是通过以下技术方案实现：通过植物组织培养方法对植物进行组织器官水平的培养获得批量的植物材料，而后通过创造合适的培养条件、逆境胁迫环境或添加诱导因子使植物材料产生所需的大量次生代谢产物，而后通过对植物体及培养液来进行提取从而获得所需要的次生代谢产物。

本发明的通过植物组织培养方法获得次生代谢产物的方法更具体的包括下述步骤：

（1）植物体批量获得，也即植物体批量扩繁：将植物体处理后接种入本发明所述的装置中进行培养参数设定后，进行规模化培养，根据需要进行下一步的操作；

（2）植物次生代谢产物的产生及诱导：将获得的植物体在一定的培养条件下产生或进行诱导以获得需要的次生代谢产物；

（3）植物次生代谢产物的收集和提取：根据次生代谢产物存在的部位，以及次生代谢产物的特性进行次生代谢产物的收集提取操作以获得所需；

所述（1）中植物体的处理方法为一般植物组织培养方法中将灭菌后或无菌状态的外植体接种至固体培养瓶或培养反应器装置中。根据不同的植物及培养目的接种不同的外植体类型。所述培养用反应器装置是利用间歇浸没原理设计的植物生物反应器变型。

所述植物生物反应器装置的培养因素主要有：

培养基：根据植物种类的不同进行不同培养基的确定及激素种类及浓度的选择，包含现有的培养基类型及通过改良后的培养基类型；

培养基pH：用于培养扩繁的pH为植物适宜生长的范围为5.0~7.0，优选5.5~6.5；

浸没频率：根据植物种类不同调整不同的浸没频率，1min/24h~24h/24h，优选3min/18h~30min/3h；

接种密度：1个/L~300个/L，优选10个/L~200个/L。可以利用可拆卸的多层培养网架来进行植物体的多层培养，来提高培养密度，并且可以提高空间利用效率。

培养条件：光照强度1000~50000lux，优选1500~2000 lux，光照时间5~20 h/d，优选8~18 h/d，培养温度25±1℃；

培养时间：培养时间依据不同植物生长状态来确定，一般生长时间为10~90d，优选20~40d。以植物体长满培养容器为宜，期间营养液的消耗可以通过装置中方便拆卸组装的储液罐结构来进行更新或补充。

所述规模化培养是通过装置可拆卸的多层培养支架来实现。

所述步骤（2）中一定的培养条件包括创造合适的培养条件、逆境胁迫环境或添加诱导因子。

所述合适培养条件是针对不同的植物种类设定不同的适合其生长的因素，通过培养后即可获得大量植物体特定部位的组织，从而从植物体中或从其分泌物中获得所需次生代谢产物；

所述逆境胁迫环境指高温、低温、强光照、弱光照、机械刺激和辐射等环境因子等，通过逆境胁迫环境诱导使植物体内产生新的次生代谢产物或提高原有次生代谢产物的含量，或诱导使次生代谢产物分泌到细胞外或提高分泌效率；环境因子如合适的培养条件及逆境胁迫环境等的改变可以通过装置外置的环境控制装备来实现，如控温装置可以提高培养环境温度、外置光照装置可以调节培养环境的光照强度等来诱导前述步骤（1）中大量的植物体产生所需的次生代谢产物；

所述诱导因子指盐分含量、化学物质、植物激素、前体物质等，通过诱导因子诱导使植物体内产生新的次生代谢产物或提高原有次生代谢产物的含量，或诱导使次生代谢产物分泌到细胞外或提高分泌效率；诱导因子的改变可以通过装置中方便拆卸组装的储液罐结构，在更换培养液的同时将诱导因子如盐、诱导前体物质或具有毒害作用的化学物质等添加到培养液中来实现，在添加后通过培养使前期得到的大量植物体在诱导因子的作用下产生所需的次生代谢产物。

所述步骤（3）中次生代谢产物存在的部位包括：一是存在植物体内的次生代谢产物；二是植物体分泌到细胞外的次生代谢产物；三是存在植物体内同时亦可分泌到胞外的次生代谢产物；

所述次生代谢产物的收集根据其所存在的部位采取不同的操作：当次生代谢产物存在植物体内时，将诱导后的多层培养支架上的植物体根据需要收获部分植物体收集用于后续的提取操作，剩余的部分可以继续培养以持续的获得所需的植物体；

当次生代谢产物分泌到植物细胞外时，此时次生代谢产物被冲刷到培养液中，此时只需要将装置下部储液罐中的培养液收集来进行提取操作；通过上部的植物体的持续培养同时控制培养的数量，从培养液中就可以持续的提取所需的次生代谢产物；

当次生代谢产物同时存在于植物体内及分泌到细胞外时，可结合上述两种方法来进行操作，既可从植物体内提取又可从培养液中收集所需的次生代谢产物；

所述次生代谢产物的提取所采用的具体方法根据次生代谢产物的形式采用不同的方法，如沉淀、萃取、层析过滤、吸附层析等。

本发明要解决的另一个技术问题是提供实现通过组织培养方法持续的获得次生代谢产物的方法的培养用反应器装置，该装置包括空气除菌器，第一连接管，反应器罐体盖子，反应器培养罐体，第二连接管，储液罐，储液罐盖子，多层培养网架，充气泵，时控器，辅助装置。

所述空气除菌器 通过第一连接管安装在反应器罐体盖子；多层培养网架放置入反应器培养罐体内进行分层培养，所述多层培养网架，为可以拆卸组装的分层培养网架；第二连接管与反应器培养罐体相连，其长度可接触到储液罐的底部，所述储液罐上端还设有储液罐盖子；还包括有与反应器培养罐体相连的充气泵和时控器；

所述空气除菌器用于过滤空气，使培养反应器内进出的空气处于无菌状态；所述第一连接管，为可耐高温高压灭菌材料，用于连接反应器罐体盖子、反应器培养罐体和空气除菌器；所述反应器罐体盖子，具有螺纹或其他方式与反应器罐体连接，且反应器罐体的上部可通过第一连接管与空气除菌器连接，实现罐体中气压的排放。反应器罐体盖子为可耐高温高压（121℃，30 min）灭菌材料，且材料为可透光材料，以利于培养时光的通过，从而使植物培养时光照的供给。

所述反应器培养罐体，为培养植物组织的部分，罐体中部设置挡板，挡板中间位置具有向下突出的小口，用于连接第二连接管，且该突出的小口与挡板连接位置具有过滤网，防止培养的外植体掉入；反应器培养罐体的下部具有螺纹或者其他方式可与储液罐密封连接；反应器培养罐体的外部，挡板下部和连接上部的中间位置具有横向突出的进气口，可通过第一连接管与空气除菌器相连接，实现无菌空气进入反应器的目的；反应器培养罐体的材质可耐高温高压（121℃，30 min）灭菌材料，且材料为可透光材料，从而保证植物培养时光照的供给。

所述第二连接管可连接到反应器培养罐体，长度为可接触到储液罐的底部位置，以便使培养液在气压的作用下，从第二连接管到达培养罐体进行植物的浸没，并在气压消失时使培养液可通过其回到储液罐体中。

所述分层培养网架为可以拆卸组装的分层培养网架，根据培养植物品种的不同，可放置入反应器培养罐体内进行分层培养，提高单位反应器的培养效率，所述多层培养网架为可耐高温高压（121℃，30 min）灭菌材料，网孔大小0.5mm~3cm左右以支撑植物体材料并使培养液顺利通过为准，网架之间利用可组装拆卸支柱支撑，可根据培养目的调整网架的层数，网架层数为2~10层，优选3~8层；网架间距为0.25~25.0cm，优选3.0~10cm.

所述储液罐盖子，具有与储液罐相配合的螺纹或其他方式可与储液罐密封结合，在反应器培养过程的换液步骤中用于单独对培养液进行灭菌时应用。

所述储液罐，用于储存培养液，上部具有螺纹或其他方式可与反应器培养罐体下部密封结合，储液罐罐体材质可耐高温高压（121℃）灭菌材料。

上述部件为装置的主体部分，装置主体直径为5~50cm，优选10~30cm。

装置主体高度10~50cm，优选20~40cm。

所述充气泵，用于提供工作时的气压动力，所述的空气泵的气压压力需配合储液罐中液体的量，以使培养液在2min内泵到培养室中为宜。

所述时控器，通过控制电流的通断来控制充气泵的工作，通过控制电流的通断频率来实现反应器的浸没频率。

所述辅助装置包括：加热装置，用以提供培养液的温度控制；光照装置，以提供植物培养时的光照；CO₂输入装置，可结合气泵通气时调整通入反应器的空气组分，使植物生长更加健壮；传感探针，可实时监测培养液中的PH及各种成分的变化以指导具体的操作。除此之外，辅助装置还可以提供不同的逆境胁迫来达到不同的培养目的。

本发明的原理是：

一般的用于植物培养来生产次生代谢产物是利用发酵罐等通过进行细胞水平的培养来获得，但多数的次生代谢产物需要在组织器官水平才能够生成。本发明上部采用的是可拆卸的分层培养进行植物组织器官的培养，可以方便的分阶段进行培养物的采收来进行次生代谢产物的提取操作，并且多层培养网架的设计可以同时培养足够数量的植物体，从而提供足够的提高植物体分泌到培养液中的有用物质的浓度，便于次生代谢产物的富集及后续的提取浓缩收集。本发明下部采用分体式的设计，下部的储液罐可以方便的拆卸，经过一段时间的培养后，一些胞外分泌的次生代谢产物会分泌到培养液中，通过培养液的收集可以获得所需的物质，并且更换上新鲜培养基后经过一段时间的培养后可以持续的获得培养液中的次生代谢产物。并且由于培养液更换方便，可以在培养液中添加某种前体物质以及胁迫因子等来通过代谢通路的调控进行所需代谢产物的富集操作。加热、辅助光照及辅助CO₂等装置可以提供植物体生长的必要条件，可以提高植物体生长的状态，并且可以通过调整提供此生代谢产物产生的必要逆境环境。

本发明相对现有技术具有如下的优点及效果：

（1）节省成本。与传统组织培养方式相比，采用本发明的装置及方法进行大规模植物组织培养可以节省大量的不能重复利用的物料（如琼脂等）的消耗，并且培养容器体积的增加以及接种过程的简化和培养过程的自动化程度的提高使人力的消耗也大大减少。因此具有降低植物组织培养成本的作用。

（2）可实现大规模快繁，提高单位产出量。本发明与传统的组织培养室可以很好的配合进行大规模快繁。并且通过对组织培养微环境的调整可以大大提高扩繁效率，并且可以使植物处于最佳的生长发育代谢状态，提高组培苗的质量和品质。并且本发明所述的装置可根据生产规模进行放大。并且配备了分层培养网架，可根据需要对培养的植物组织进行分层培养。这样就提高了单位产出量。

（3）方便高效的次生代谢产物的生产。通过提高培养的密度可以产出更多的含有代谢产物的植物体，另外通过对培养一段时间后的培养液的收集可以从中提取分泌到细胞外的次生代谢产物，且可以通过调整营养液的构成来调控所需物质的生成。通过培养液的更换减少次生代谢产物浓度对其继续产生的抑制，从而提高产物的产量。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步详细说明：

图1是通过组织培养持续获得植物次生代谢产物的方法的操作流程图；

图2是培养用反应器装置分解图。

具体实施方式

为了行文的简便，以下涉及上下左右与附图中的方位是一致的。

实施例1

如图1、2所示，一种通过植物组织培养获得植物次生代谢产物的方法所涉及的装置各部分进行装置的组装。反应器罐体盖子3，具有螺纹，与反应器罐体4连接，储液罐8上部具有螺纹与反应器培养罐体4的下部密封结合，储液罐盖子7具有与储液罐8相配合的螺纹可与储液罐8密封结合。

装置主体直径为20cm，装置主体高度30cm；多层培养网架6为可耐高温高压（121℃，30min）灭菌材料，网孔大小0.5cm左右以支撑植物体材料并使培养液顺利通过为准。多层培养网架6的各层网架利用可组装拆卸支柱支撑，可根据培养目的调整网架的层数，图2中的网架层数为3层；网架间距为5cm。

利用装置实现本发明的具体操作步骤如下：

（1）植物体批量获得，也即植物体批量扩繁：

在储液罐8中注入一定量的培养液后，按照图2中所示的各个部件顺次相连接后，将其在121℃下高温高压蒸汽灭菌20min。取出冷却备用。将灭菌好的反应器主体部分于无菌条件下，将反应器培养罐体盖子3打开后，接种入需要规模扩繁的外植体，后密封即完成接种；将时控器10根据需要设定不同的通断频率后连接充气泵9，然后再与反应器主体部分反应器培养罐体4连接即可。

将连接好的培养用反应器装置接通电源后置于普通组织培养室中进行光照培养。培养过程如图1所示。当充气泵9处于工作状态时，气体由与反应器培养罐体4中部横向突出的进气小嘴连接的空气除菌器2进行除菌处理，然后通过第一连接管1进入储液罐8；储液罐8中的培养液在气压的作用下通过第二连接管5进入反应器培养罐体4内，使反应器培养罐体4中的的植物组织器官浸没在培养液中。反应器培养罐体4中的气体则通过反应器培养罐体盖子3中间出口位置连接的第一连接管2和空气除菌器1被排出。

当充气泵9停止工作时，反应器培养罐体4内的培养液在自身重力的作用下，通过反应器培养罐体4中部挡板向下突出的小嘴和第二连接管5回流至储液罐8中；由于反应器培养罐体4中部的挡板中心向下突出的小嘴位置设置了过滤网，因此，反应器培养罐4内的植物组织器官不会随着培养液回流至储液罐8中。此时，整个反应器培养罐体4内形成负压，外界的气体经过与反应器培养罐体盖子3向上突出的小嘴连接的空气除菌器1的过滤除菌处理后沿着第一连接管2进入反应器培养罐体4内。这样，反应器培养罐体4内的植物组织器官就完成了一个被间歇浸没的循环。可通过调节时控器10来调节上述循环的时间。

当培养一段时间后，培养液中成分会有一定的消耗，根据培养需要可对培养液进行更换来保证植物的生长。更换培养液的步骤为：首先将新鲜的培养液注入备用的储液罐8中，利用储液罐盖子7密封后，121℃下高温高压灭菌20min，冷却备用。然后将其与正在培养植物的反应器主体部分紫外灭菌后，于无菌条件下将装有新鲜培养液的储液罐8替换装有营养耗尽的培养液的储液罐8，如图2所示，右边的储液罐8就是用于替换左边的储液罐8。完成更换培养液过程。

具体的培养因素按照不同的植物进行不同的设定。进行规模化培养，根据需要进行下一步的操作；

（2）植物次生代谢产物的产生及诱导：利用环境因子或诱导因子进行植物体的诱导，从而进行次生代谢产物的诱导。

环境因子如合适的培养条件及逆境胁迫环境等的改变可以通过装置外置的环境控制装备来实现，如控温装置可以提高培养环境温度、外置光照装置可以调节培养环境的光照强度等来诱导前述步骤（1）中大量的植物体产生所需的次生代谢产物；

诱导因子的改变可以通过装置中方便拆卸组装的储液罐结构，在更换培养液的同时将诱导因子如盐、诱导前体物质或化学物质等添加到培养液中来实现，在添加后通过培养使前期得到的大量植物体在诱导因子的作用下产生所需的次生代谢产物。

（3）植物次生代谢产物的收集和提取：根据次生代谢产物存在的部位，以及次生代谢产物的特性进行次生代谢产物的收集提取操作以获得所需；当次生代谢产物存在植物体内时，将诱导后的多层培养网架上的植物体根据需要收获部分植物体收集用于后续的提取操作，剩余的部分可以继续培养以持续的获得所需的植物体；

当次生代谢产物分泌到植物细胞外时，此时次生代谢产物被冲刷到培养液中，此时只需要将装置下部储液罐中的培养液收集来进行提取操作；通过上部的植物体的持续培养同时控制培养的数量，从培养液中就可以持续的提取所需的次生代谢产物；

当次生代谢产物同时存在于植物体内及分泌到细胞外时，可结合上述两种方法来进行操作，既可从植物体内提取又可从培养液中收集所需的次生代谢产物。

实施例2

依据图2所示一种通过植物组织培养获得植物次生代谢产物的方法所涉及的装置各部分进行装置的组装，反应器罐体盖子3，具有卡槽方式与反应器罐体4连接，储液罐8上部具有卡槽方式可与反应器培养罐体4下部密封结合，储液罐盖子7具有卡槽方式可与储液罐8密封结合；

装置主体直径为30 cm。装置主体高度40cm；

所述多层培养网架为可耐高温高压（121℃,30 min）灭菌材料，网孔大小1mm左右以支撑植物体材料并使培养液顺利通过为准，网架之间利用可组装拆卸支柱支撑，网架层数为5层；网架间距为4cm；

其余具体操作步骤与实施例1一致。

实施例3

依据图2所示一种通过植物组织培养获得植物次生代谢产物的方法所涉及的装置各部分进行装置的组装，同实施例1中所述，所不同的是网架层数为2层；网架间距为10cm。

实施例4

依据图2所示一种通过植物组织培养获得植物次生代谢产物的方法所涉及的装置各部分进行装置的组装，同实施例1中所述，所不同的是网架层数为10层；网架间距为2cm。

实施例5

根据实施例1中所述的装置，通过植物组织培养进行半夏中麻黄碱的获得的方法，具体操作步骤如下：

（1）半夏种苗的批量获得：

所述培养参数主要有：将半夏丛生芽接种入实施例1中所述的装置中，接种密度：60个/L，分开接种3层，每层20个，调整好培养基后进行培养。其中：培养基配方为：Ms+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30 g/L蔗糖；培养基pH：5.8；浸没频率：5min/12h。培养条件：光照强度2000 lux，光照时间12 h/d，培养温度25±1℃，培养时间：40d后植物体长满培养容器。

（2）植物次生代谢产物的诱导：在培养液不必更换的条件下，将获得的足量的植物体及装置通过外加辅助设备控制环境温度达到35 ℃，处理时间15 d后待半夏倒苗后即可得到所要提取次生代谢产物的半夏块茎。利用可拆卸的多层培养网架的特点，取出部分半夏块茎进行次生代谢产物的提取，剩余部分通过更换新鲜的培养基后继续培养以获得更多的提取材料，所述继续培养的参数同步骤（1）中所述。

（3）植物次生代谢产物的收集和提取：将半夏块茎取出后，通过研磨，超声提取、真空干燥等步骤得到麻黄碱提取物，通过HPLC方法进行检测，得到所获得的半夏块茎中麻黄碱的含量可达到160.30ug/g。

实施例6

根据实施例3中所述的装置，通过植物组织培养进行半夏中麻黄碱的获得的方法，具体操作步骤同实施例5所述，最后得到的半夏块茎中麻黄碱的含量达190.70 ug/g。

实施例7

根据实施例4中所述的装置，通过植物组织培养进行半夏中麻黄碱的获得的方法，具体操作步骤同实施例5所述，最后得到的半夏块茎中麻黄碱的含量达120.50ug/g。

实施例8

根据实施例1中所述的装置，通过植物组织培养进行半夏中麻黄碱的获得的方法，具体操作步骤如下：

（1）半夏种苗的批量获得：

所述培养参数同实施例3中（1）中所述，所不同的是培养时间为30d。

（2）植物次生代谢产物的诱导：

通过装置中可分体式的设计，方便的对培养液进行更换，代谢产物诱导培养液的配方为：Ms+0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖，更换后继续对半夏进行培养，所述继续培养的参数同步骤（1）中所述。

在培养一定时间后，更换新鲜的代谢产物诱导培养液继续进行培养。所述继续培养的参数同步骤（1）中所述。

利用可拆卸的多层培养网架的特点，根据培养物的生长情况，取出部分半夏块茎进行次生代谢产物的提取，剩余部分在更换新鲜的培养基后继续培养以获得更多的提取材料。

（3）植物次生代谢产物的收集和提取：

将更换下来的培养液通过离心，沉淀直接进行超声提取真空干燥，上清液经过浓缩后进行提取后真空干燥，后合并提取得到的麻黄碱产物，通过HPLC检测得到，在更换下来的培养液中麻黄碱的含量可以达到12.56ug/L。

将取出的部分半夏愈伤半夏通过研磨，超声提取、真空干燥等步骤得到麻黄碱提取物，通过HPLC方法进行检测，得到所获得的半夏块茎中麻黄碱的含量可达92.50 ug/g。

实施例9

根据实施例2中所述的装置，通过植物组织培养进行紫草中紫草素的获得的方法，具体操作步骤如下：

（1）紫草愈伤的批量获得：

所述培养参数主要有：将紫草愈伤组织接种入实施例2中所述的装置中，接种密度：120个/L，分开接种6层，每层20个，调整好培养基后进行培养。其中：培养基配方为：B5+1.0 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30 g/L蔗糖；培养基pH：6.0；浸没频率：1min/6h。培养条件：光照强度1000 lux，光照时间18 h/d，培养温度25±1℃，培养时间：60d。

（2）植物次生代谢产物的诱导：通过装置中可分体式的设计，方便的对培养液进行更换，代谢产物诱导培养液的配方为：B5+1.0 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30 g/L蔗糖，并同时在培养液中添加CuSO₄·5H₂O，使培养液中的CuSO₄浓度为0.075mg/L。更换后继续对紫草愈伤组织进行培养，所述继续培养的参数同步骤（1）中所述，所不同的是培养时间为20 d。在培养20 d后，再次更换新鲜的代谢产物诱导培养液继续进行培养。在更换新鲜培养液的同时进行旧的培养液的收集来提取所需紫草素，如此往复。同时通过多层培养网架的结构调整紫草愈伤的数量使其保持相当的活力。

（3）植物次生代谢产物的收集和提取：

将更换下来的培养液经过浓缩后进行丙酮提取紫草素，利用分光光度计通过在520nm下检测来计算紫草苏的产量，得到在更换下来的培养液中紫草素的含量可以达到2.3mg/L。

实施例10

根据实施例3中所述的装置，通过植物组织培养进行紫草中紫草素的获得的方法，具体操作步骤同实施例9中所述，最终得到在更换下来的培养液中紫草素的含量可以达到1.6mg/L。

实施例11

根据实施例4中所述的装置，通过植物组织培养进行紫草中紫草素的获得的方法，具体操作步骤同实施例9中所述，最终得到在更换下来的培养液中紫草素的含量可以达到4.2mg/L。

实施例12

根据实施例1中所述的装置，通过组织培养进行人参毛状根中人参皂甙的获得方法，具体操作步骤如下：

（1）人参毛状根的批量获得：

所述培养参数主要有：将人参毛状根接种入实施例1中所述的装置中，接种密度：120个/L，分开接种3层，每层40个，调整好培养基后进行培养。其中：培养基配方为：Ms+0.1mg/L IBA +30 g/L蔗糖；培养基pH：5.8；浸没频率：3min/4h。培养条件：光照强度2000 lux，光照时间8 h/d，培养温度25±1℃，培养时间：10d。

（2）植物次生代谢产物的诱导：利用可拆卸的设计方便更换培养液为：Ms+30 g/L蔗糖；培养基pH：5.8；浸没频率：10min/2h。培养条件：光照强度1000 lux，光照时间5 h/d，培养温度25±1℃，培养时间：90d。

（3）植物次生代谢产物的收集和提取：将人参毛状根取出后按照中国人民药典2010年版测定人参总皂甙以及人参皂甙Re+Rg的含量，经检测所获得的人参毛状根中人参总皂甙含量可达到6.182%，人参皂甙Re+Rg的含量可达到0.3752%。

实施例13

根据实施例2中所述的装置，通过组织培养进行人参毛状根中人参皂甙的获得方法。具体操作步骤同实施例12中所述，最终得到人参毛状根中人参总皂甙含量可达到4.8912%，人参皂甙Re+Rg的含量可达到0.2527%。

实施例14

根据实施例3中所述的装置，通过组织培养进行人参毛状根中人参皂甙的获得方法，具体操作步骤同实施例12中所述，最终得到人参毛状根中人参总皂甙含量可达到6.532%，人参皂甙Re+Rg的含量可达到0.3852%。

实施例15

根据实施例4中所述的装置，通过组织培养进行人参毛状根中人参皂甙的获得方法，具体操作步骤同实施例12中所述，最终得到人参毛状根中人参总皂甙含量可达到4.6752%，人参皂甙Re+Rg的含量可达到0.2319%。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种通过组织培养持续获得半夏种苗次生代谢产物的方法，包括以下步骤：

（1）植物体批量获得：将植物体处理后接种入培养用反应器装置中，进行培养参数设定后，进行规模化培养，根据需要进行下一步的操作，所述植物体是指无菌培养下获得的植物细胞、植物组织、植物器官和丛生芽；

（2）植物次生代谢产物产生及诱导：将获得的植物体在一定的培养条件下生成或进行诱导以获得需要的次生代谢产物；

（3）植物次生代谢产物的收集和提取：根据次生代谢产物存在的部位，以及次生代谢产物的特性进行次生代谢产物的收集提取操作以获得所需；

在步骤（1）中，植物体为半夏种苗，半夏种苗的批量获得：所述培养参数主要有，接种密度：60个/L，分开接种3层，每层20个，调整好培养基后进行培养，其中：培养基配方为：Ms+1.5 mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖；培养基pH：5.8；浸没频率：5min/12h，培养条件：光照强度2000 lux，光照时间12 h/d，培养温度25±1℃，培养时间：40d后植物体长满培养容器；

在步骤（2）植物次生代谢产物的诱导中：在培养液不必更换的条件下，将获得的足量的植物体及装置通过外加辅助设备控制环境温度达到35 ℃，处理时间15 d后待半夏倒苗后即可得到所要提取次生代谢产物的半夏块茎，利用可拆卸的多层培养网架的特点，取出部分半夏块茎进行次生代谢产物的提取，剩余部分通过更换新鲜的培养基后继续培养以获得更多的提取材料，所述继续培养的参数同步骤（1）中所述；

在步骤（3）植物次生代谢产物的收集和提取中：将半夏块茎取出后，通过研磨，超声提取、真空干燥等步骤得到麻黄碱提取物，通过HPLC方法进行检测，得到所获得的半夏块茎中麻黄碱的含量可达到160.30ug/g；

所述步骤（1）中的培养用反应器装置包括反应器罐体盖子（3），具有螺纹，与反应器罐体（4）连接，储液罐（8）上部具有螺纹与反应器培养罐体（4）下部密封结合，储液罐盖子（7）具有与储液罐（8）相配合的螺纹可与储液罐（8）密封结合；

培养用反应器装置主体直径为20cm，装置主体高度30cm；

所述步骤（2）中的多层培养网架（6）为可耐高温高压灭菌材料，网孔大小0.5mm左右以支撑植物体材料并使培养液顺利通过为准，网架之间利用可组装拆卸支柱支撑；网架间距为5cm。