CN101619326B - 一种石榴细胞培养法制备黄酮类化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种石榴细胞培养法制备黄酮类化合物的方法，首先以石榴种子制备无菌苗，以无菌苗为外植体接种在固体接着基(I)上于25±1℃培养愈伤组织将愈伤组织接种在液体培养基(II)中进行种子培养和生产培养，经分离提纯得到总黄酮。所述的培养基(I)是在MS培养基中添加0.5～2.0mg/L 2，-4D和0.0～0.5mg/L KT，pH5.5～5.7；所述的培养基(II)是未加琼脂的MS培养基，pH5.4～5.6。培养物中总黄酮含量达8.31％，远高于石榴中的含量。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种细悬浮细胞培养法制备生物药物的方法，具体地说是一种利用石榴的愈伤组织进行细胞悬浮培养生产黄酮类化合物的方法。
二、背景技术
人类对植物次生代谢物质的利用有着悠久的历史，当今对植物次生代谢物质的研究更是如火如荼。但植物次生代谢物质的产量受植物产量和次生物含量的限制，有些次生物质在自然界的含量甚微，从而局限了植物次生代谢物质的广泛应用。随着在生物技术方面取得的长足进步，人们把目光聚集在如何利用生物技术以获取植物次生物质的研究上。为此，相关研究的科学家们开始不懈的研究和努力，经过近几十年的探索发现，通过植物细胞的规模培养，可以实现植物次生代谢物质“工厂化”高效生产。
通过植物细胞的大规模培养生产植物次生代谢物质较从天然植物提取及人工仿生合成的化合物，更具有其独到的优点：
(一)不破坏自然资源。
(二)不受地域季节、土壤、病虫害等自然条件限制。
(三)与人工合成相比，细胞培养工艺、设备简单；节约能源；产业投资少；生产过程几乎没有环境污染，对工人安全性高。
(四)与从植物提取相比，细胞培养方法生产周期短、细胞个体差异小、生长过程中可以人工控制、代谢过程可以人为合理调节，有利于降低成本、提高效率。
(五)某些天然物质经修饰后，可以产生药效更好的物质，也可以通过此技术获得结构复杂的修饰物前体。
(六)对于分泌到胞外培养液中的活性物质，更方便规模化生产。在这方面的研究及成果应用比较多，我国罗士韦采用液体悬浮培养人参细胞，产率可日增一倍，而培养物总人参皂甙含量高达10.5％，超过栽培人参的含量(9.6％)，每立方米培养液可获干参13.98公斤。日本Uitsui公司通过对紫草细胞培养生产尚无法人工合成的紫草素，培养细胞的产率为天然细胞产率1000倍，现在日本紫草来源主要是细胞组织培养。另外紫杉醇、长春花碱等许多植物次生代谢产物在生产上均已取得较大的成绩，有的培养规模可达上万吨。这些实验及实践证明，亲本植株能合成的次生代谢物质都可以通过植物细胞的培养来生产，因而被认为是一条利用生物技术生产次生代谢物质(如药物、天然色素、香料、天然调味品)的新的有效途径。
石榴(Punica granatum L.)原名安石榴，是石榴科石榴属植物，石榴作为果实，是很多人喜爱的水果，而石榴皮和石榴叶是我国的传统中药，在我国传统医药中主要有涩肠止泄、止血、杀虫等功效。现代药理研究证明，石榴全身器官中均含有黄酮类化合物。黄酮类化合物具有抗菌、抗病毒、抗癌、杀灭精子、防治性病传播等独特的活性。经研究发现石榴叶的醇提取成分具有抗氧化、抗肿瘤、抗突变等作用。
黄酮在自然界中大多数植物基本上都含有，在38种常见水果中，石榴黄酮类化合物是自然界黄酮类物质含量最为丰富的物质之一，石榴植株的黄酮含量最为丰富，目前研究的热点的银杏叶黄酮，它的黄酮类化合物含量远远低于石榴皮的黄酮类化合物的含量。
关于黄酮类化合物的生理活性研究是黄酮类化合物研究的热点之一，也是黄酮类化合物化学中发展最快的一个方向。黄酮类化合物在抗诱变、抗肿瘤、抗衰老等很多方面具有良好的作用，黄酮类化合物的生理活性往往是其化学活性的综合体现，可阻止自由基在体内的形成，并能阻止脂质的过氧化过程，具有消除自由基和抗氧化能力。
此外，黄酮类化合物能调节心肌收缩、改善心肌舒张功能，提高机体在常压与低压下的耐缺氧能力。因此，可用于治疗心血管病，偏头痛、动脉粥样硬化等症。黄酮类化合物还有降血压，防止血管破裂和止血作用、抗炎作用，消化性溃疡的保护作用和抗肿瘤作用等功能。
目前国内对黄酮类化合物的降血脂作用机理和作用效果研究成果较多。在医药上已经广泛应用，在功能食品开发方面越来越受到重视。除了利用它的生理活性外，也把它作为功能食品的添加剂，如天然抗氧化剂、天然色素、天然甜味剂等，已经开发了许多黄酮类功能食品，如大豆生命素等。所以目前市场是对黄酮类化合物需求量增长迅速，目前的生产方式并不能满足市场的需求。
三、发明内容
本发明旨在为人们提供一种可以供药用的黄酮类化合物，所要解决的技术问题是利用石榴植物细胞的大规模培养技术，通过对石榴愈伤细胞的诱导、扩大培养、细胞大规模培养法生产黄酮类化合物。
本发明的技术方案是以石榴种子为起始原料，包括石榴无菌苗的制备、愈伤组织培养和细胞悬浮培养以及总黄酮的分离和提取，所述的愈伤组织培养是由石榴种子培养获得的石榴无菌苗作为外植体在固体培养基(I)上所进行的培养，并继代培养至少5代获得可供悬浮培养的愈伤组织；所述的细胞悬浮培养是愈伤组织在液体培养基(II)中依次进行的种子培养和生产培养，生产培养结束后分离、提取总黄酮。
所述的固体培养基(I)是在配制的MS培养基中添加0.5～2.0mg/L2，-4D和0.0～0.5mg/LKT，pH5.5～5.7，外植体接种后于25±1℃培养20～30天，继代培养25±1℃，20～22天为一代。
所述的液体培养基(II)是未加琼脂的MS培养基，pH5.4～5.6种子培养条件25±1℃、光照条件下12～18天；生产培养条件25±1℃、暗培养21～24天。
具体过程如下：
1、以石榴种子为材料，用70％的乙醇浸泡10～30秒，随后转移至0.1％次升汞溶液中进行表面消毒，播种于高温灭菌过的1/2MS基本培养基上，在温度为25±1℃下培养，10天后得石榴无菌苗。
2、以所获无菌苗的叶等器官为外植体，在固体培养基(I)上培养，温度25±1℃，经4周培养，即可在外植体的切口部位形成愈伤组织。固体培养基(I)是配制MS培养时添加0.5～2.0mg/L 2，4-D和0.0～0.5mg/L KT，调pH5.5～5.7。
3、将所得的愈伤组织用相同培养基上培养稳定后，平均三周继代一次，5～8代后，形成松软、颜色浅黄色的稳定的愈伤组织，培养温度25+1℃，暗培养，此时的愈伤组织可建立悬浮细胞体系。
4、以步骤3中制得的最佳愈伤组织细胞系为种源，接种于液体培养基(II)中培养扩增，培养条件为温度25±1℃，暗培养，摇床转速110-120转/分钟，15天；液体培养基(II)是未加琼脂的MS培养基，pH5.4～5.6，分装于250ml三角瓶中，每瓶50～60ml，封口并高温灭菌。
5、将液体培养基(II)分装于1升培养瓶(每瓶200-300ml)，封口，并高温灭菌，以4中制得培养细胞为种子，进行接种，接种量为15％(W/V)，继续以上述培养条件培养21～24天后即可从培养液中提取黄酮类化合物。
本发明以石榴种子为原始材料，获得石榴无菌实生苗外植体，对外植体进行诱导培养，建立并筛选出适合通过细胞培养法生产黄酮的悬浮培养体系。设计了相应的生长、生产培养基配方。该方法有培养周期短、效率高、对环境无污染等特点。
本发明较已有技术相比具有如下优点：
(1)生产过程完全可控，不受自然环境的影响
(2)无农药及重金属残留
(3)提取工艺简单
(4)低成本，节约大量耕地，提高资源利用率和石榴经济林的综合经济价值。
(5)生产效率高：石榴细胞悬浮培养的黄酮类物质最高含量达到8.31％，为石榴总黄酮含量的1.3倍(原植物含量为6.23％)。
四、具体实施方式
现以实验室培养为例，非限定实施例叙述如下：
下面以实施例形式详细叙述本发明的石榴细胞培养生产黄酮类化合物的工艺流程(不限于本实施例)：
1、培养基的配制、杀菌
在实验室培养中，配制MS生长培养基，琼脂7g/L，蔗糖浓度30g/L，调节培养基pH值在5.6。然后分装于100ml的三角瓶中，每瓶20～30ml。用棉花和纸封口后，进行高压消毒，压力为1.0～1.2Kg/cm2，时间为20～25分钟。石榴种子在70％的酒精和0.1％升汞中灭菌后接入上述培养基，25±1℃光照培养10天得石榴无菌苗。
2、愈伤组织的培养与继代优化
配制固体培养基(I)，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，添加0.5～1.5mg/L 2，4-D和0.0～0.25mg/LKT，调节pH值在5.6，封口、消毒同上，将无菌苗真叶接种于固体培养基(I)上，于25±1℃、暗培养4周，然后挑选出颜色鲜黄色，较疏松的愈伤进行继代培养5～8代，这样优化出最佳愈伤组织进行下一步的细胞悬浮培养。
3、细胞悬浮培养
以继代后(2)的石榴完美愈伤组织为种源，在超净工作台中接种于不加琼脂的MS培养基中进行培养，接种量为10～15％(w/v)。接种后培养瓶放入培养室的摇床上，培养条件为：温度25±1℃，摇床转速110转/分钟，培养20天后每瓶细胞鲜重可达3.5g，将其转至生产培养基中，培养条件：温度25±1℃，暗培养18～20天后每瓶细胞鲜重可达5.0g左右，培养物总黄酮含量达8.31％，高于石榴总的黄酮类化合物的含量，并且相对而言有更加环保，生产成本更低的优点。
4、分离提取总黄酮
细胞悬浮液→过滤→50℃烘箱干燥→60-70％乙醇溶剂萃取12-24h→乙醇回收→乙酸乙酯提纯→甲醇重结晶→得到分离物→分析测定→黄酮
Claims (1)
1.一种石榴细胞培养法制备黄酮类化合物的方法，其特征在于：以石榴种子为起始原料，包括石榴无菌苗的制备、愈伤组织培养和细胞悬浮培养以及总黄酮的分离和提取，所述的愈伤组织培养是由石榴种子培养获得的石榴无菌苗作为外植体接种在固体培养基I上于25±1℃培养20～30天，并继代培养至少五代，每代20～22天，所述的固体培养基I是在MS培养基中添加0.5～2.0mg/L 2，4-D和0～0.5mg/L KT，pH5.5～5.7；所述的细胞悬浮培养是愈伤组织接种在液体培养基II中于25±1℃、暗培养20天得到种子，然后将种子接种在液体培养基II中于25±1℃、暗培养18～20天；所述的液体培养基II是未加琼脂的MS培养基，pH5.4～5.6。
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