CN101113430A - 利用竹节参细胞培养和生物转化技术获得竹节参次生代谢产物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于植物细胞培养工程领域的一种利用竹节参细胞培养和生物转化技术获得竹节参次生代谢产物的方法。在改良的RW培养基中，加蔗糖、植物生长激素和植物细胞分裂素，再加入凝固剂经高温消毒，经冷却后制成诱导培养基；将竹节参的外植体在无菌条件下接种在诱导培养基中诱导形成愈伤组织；经扩增，获得大量细胞；在合成培养基中将大量扩增的愈伤组织细胞接种到合成培养液中，用溶剂萃取收获细胞获得竹节参皂苷粗提物及其副产物，再经过纯化获得竹节参皂苷，竹节参多糖以及其它化合物。利用本发明所述方法可以生产出竹节参的次生代谢产物，生产成本低，培养周期短，不受自然环境限制，可以实现周年生产。
Description
技术领域
本发明属于植物细胞培养工程领域，特别涉及一种利用竹节参细胞培养和生物转化技术获得竹节参次生代谢产物的方法，尤其是涉及利用竹节参细胞大规模培养和生物转化技术获得竹节参皂苷等化合物的方法。
背景技术
竹节参(Panax japonicus C.A.Mey)又名竹节人参或白三七，是五加科人参属植物。分布于我国江西、湖北、广西、四川、贵州、云南、西藏等省区的高山灌木丛下，阴湿地或岩石沟涧旁边。它有许多的异名，《中药大辞典》上就说：不同的书籍中有不同的称谓，如：土参、土精、血参(《花镜》)，甜七、竹节七(《草本便方》)，竹节参(《科学的民间药草》)，竹鞭三七、罗汉三七(《中国药植志》)，竹节七、竹七(《中药形性经验鉴别法》)，萝卜七、白三七(《中药材品种论述》)，水三七(《贵州草药》)，明七、野三七、鸡头七(《云南经济植物》)，这种种纷杂的异称，足见竹节参在中药药用中的历史和地位。民间用于滋补强壮，散瘀止痛，止血等。对于竹节参的作用早有记载，如：《草本便方》中有云：“散血活血破血，治痈肿，疗犬伤，金刀，跌扑……”近年来又由于有报道证实竹节参皂大甙具有扩张冠状动脉、降低心肌氧耗作用。同时发现竹节参皂甙能使小鼠心肌细胞内CAMP/CGMP比值明显升高，此作用与其增强心力，扩张冠状动脉有关，其药用价值潜力巨大，成为一个研究热点。
竹节参的生长缓慢，每年生1节，生物量极为有限，作为药用的野生竹节参一般在5年～数十年生不等。据统计我国的竹节参储量只有2吨左右，属于珍稀名贵药材，目前只是在湖北山区和川西南山区被当地医生有条件使用，在各大城市医院和药店不见销售。虽然在江西、湖南、湖北等地有人进行人工栽培，但是由于其生长量有限，且繁殖困难，又易受病虫害的困扰，长期以来很难实现大面积人工栽培。因此利用生物技术大规模生产其替代产品，并且开发成治疗心脑血管疾病的特效新药具有重要的经济价值和社会价值。
为此清华大学化工系生化所经过数年研究开发出了一套为了将竹节参的自然生产方式转变为工业化生产方式的新技术。该技术的应用可以大幅度减少人们对野生资源的采摘和依赖，同时可以大量获得人们所需求的竹节参制品。为人们对于竹节参的药用价值进行深入研究奠定物质基础，为广大患者提供更优良的廉价药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用竹节参细胞培养和生物转化技术生产竹节参次生代谢产物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)在RW培养基中，添加α-萘乙酸(NAA)、2，4-D或吲哚乙酸(IAA)0.1～10mg/L和6-卞氨基嘌呤(6-BA)或激动素(KT)0.1～10mg/L，蔗糖或葡萄糖20～50g/L，然后用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0，再添加1.8～8g/L凝固剂，在115～120℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后，经冷却制成斜面诱导培养基；
(2)将竹节参幼茎或幼芽作为外植体经70％乙醇表面杀菌30～50秒，然后再放入5～10％次氯酸钠或次氯酸钙溶液中杀菌10～20分钟，用无菌水冲洗三次后，在无菌条件下将表面杀菌后的茎尖切下来，或将其幼茎切成1mm长的茎段，接种到上述斜面诱导培养基中，之后转移到18～25℃，2000～3000Lux，12～16小时照光条件下进行诱导培养，1～2个月后形成愈伤组织；
(3)在RW培养基中，添加0.1～5mg/L α-萘乙酸(NAA)、2，4-D或吲哚乙酸(IAA)，0.1～5mg/L和6-卞氨基嘌呤(6-BA)或激动素(KT)，20～50g/L蔗糖、1.8～8g/L凝固剂，经115～120℃，0.1～0.15MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成平板驯化培养基；
(4)将上述诱导形成的愈伤组织，在上述驯化培养基中进行反复驯化继代培养后，可以筛选出生长速度快，质地疏松的高产细胞株；
(5)在RW培养基的基础上，添加蔗糖20～40g/L，α-萘乙酸(NAA)，2，4-D或吲哚乙酸(IAA)0.1～2mg/L，6-卞氨基嘌呤(6-BA)或激动素(KT)0.1～2mg/L，然后用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0，再添加1.8～8g/L凝固剂，在115～120℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成大型平面扩增培养基或者取消凝固剂做成液体培养基；
(6)将上述高产细胞株接种在扩增培养基上，在20～25℃，黑暗条件下培养4～5周后，可以获得大量高活力细胞，液体培养时摇床或生物反应器的转速为80～120转/分；
(7)在RW培养基中，添加葡萄糖20～50g/L，α-萘乙酸(NAA)，2，4-D或吲哚乙酸(IAA)0.1～2mg/L，6-卞氨基嘌呤(6-BA)或激动素(KT)0.1～2mg/L，再添加组合前体(40～150mg)和组合诱导子(80μg～60mg)，用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0，在115～120℃，0.1～0.15MPa压力下消毒15分钟后制成合成培养基；
(8)将上述扩增的高活力竹节参愈伤组织细胞接种到上述合成培养基内，在25～30℃，避光条件，80～120转/分的摇床或大型生物反应器中悬浮培养1周，过滤收获细胞，培养液经调整后可返回反应器继续反复利用；
(9)将收获细胞移送到提取灌中，经过高速搅拌(300～400转/分)破碎，经溶剂萃取和减压浓缩获得粗提物，再经过分离纯化获得竹节参皂苷等化合物
所述组合诱导子组成为赤霉素2～5mg/L、水杨酸20～90mg/L、过氧化氢20～80μl/L、酵母提取物0.5～2g/L。
所述凝固剂为琼脂或Gellan Gum。
所述组合前体为丙酮酸钠40~80mg/L、乙酸酐20～40μl/L和番茄汁100～200ml/L。
本发明的有益效果是将竹节参的自然生产方式转变为工业化生产方式。该技术的应用可以大幅度减少人们对野生资源的采摘和依赖，同时可以大量获得人们所需求的竹节参制品。为人们对于竹节参的药用价值进行深入研究奠定物质基础，为广大患者提供更优良的廉价药物。
具体实施例
本发明提供一种利用竹节参细胞培养和生物转化技术生产竹节参次生代谢产物的方法
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实例一：
(1)在改良的RW培养基中，添加α-萘乙酸(NAA)2mg/L和6-卞氨基嘌呤(6-BA)4mg/升，蔗糖20g/L，然后用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0，再添加1.9g/L Gellan Gum，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后，经冷却制成斜面诱导培养基；
(2)将竹节参幼茎或幼芽作为外植体经70％(v/v)乙醇表面杀菌50秒，然后再放入5％(v/v)次氯酸钠溶液中杀菌20分钟，用无菌水冲洗三次后，在无菌条件下将表面杀菌后的茎尖切下来，接种到上述斜面诱导培养基中。之后转移到25℃，2000Lux，12小时照光条件下进行诱导培养，1个月后形成愈伤组织；
(3)在改良的RW培养基中，添加1mg/L α-萘乙酸(NAA)，2mg/L和6-卞氨基嘌呤(6-BA)，30g/L蔗糖、1.9 Gellan Gum，经115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成平板驯化培养基；
(4)将上述诱导形成的愈伤组织，在上述驯化培养基中进行反复驯化继代培养后，可以获得生长速度快，质地疏松的高产细胞系；
(5)在改良RW培养基的基础上，添加蔗糖40g/L，α-萘乙酸(NAA)0.8mg/L，6-卞氨基嘌呤(6-BA)0.5mg/L，然后用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0，再添加1.9g/L Gellan Gum(是国内外常用的多糖类物质)，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成大型平面扩增培养基或取消凝固剂做成液体培养基；
(6)将上述高产细胞株接种在扩增培养基上，在25℃，黑暗条件下培养4周后，可以获得大量高活力细胞。液体培养时摇床或生物反应器的转速为80～120转/分；
(7)在RW培养基中，添加葡萄糖30g/L，α-萘乙酸(NAA)0.2mg/L，6-卞氨基嘌呤(6-BA)0.2mg/L，再添加组合前体(包括丙酮酸钠40mg/L、乙酸酐20μl/L和番茄汁100ml/L)和组合诱导子(赤霉素2mg/L、水杨酸30μl/L、过氧化氢25μl/L、酵母提取物1.0％)，用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后制成合成培养基；
(8)将上述扩增的高活力竹节参愈伤组织细胞接种到上述合成培养基内，在28℃，避光条件，100转/分的摇床或大型生物反应器中悬浮培养1周，过滤收获细胞，培养液经调整后可返回反应器继续反复利用；
(9)将收获细胞移送到提取灌中，经过高速搅拌(300转/分)破碎，经溶剂萃取和减压浓缩获得粗提物-竹节参皂苷粗提物及其副产物，再经过纯化获得竹节参总皂苷10％以上，竹节参多糖5％以上以及其它化合物。
实例二：
(1)在改良的RW培养基中，添加吲哚乙酸(IAA)2mg/L和激动素(KT)4mg/升，蔗糖20g/L，然后用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0，再添加1.9g/L GellanGum，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后，经冷却制成斜面诱导培养基；
(2)将竹节参幼茎或幼芽作为外植体经70％乙醇表面杀菌30秒，然后再放入8％次氯酸钙溶液中杀菌15分钟，用无菌水冲洗三次后，在无菌条件下将表面杀菌后的茎尖切下来，接种到上述斜面诱导培养基中。之后转移到25℃，2000Lux，14小时照光条件下进行诱导培养，1个月后形成愈伤组织；
(3)在改良的RW培养基中，添加1mg/L α-萘乙酸(NAA)，2mg/L和激动素(KT)，30g/L蔗糖、1.9 Gellan Gum，经115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成平板驯化培养基；
(4)将上述诱导形成的愈伤组织，在上述驯化培养基中进行反复驯化继代培养后，可以获得生长速度快，质地疏松的高产细胞系；
(5)在改良RW培养基的基础上，添加蔗糖30g/L，添加吲哚乙酸(IAA)1mg/L和激动素(KT)1mg/升，然后用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0，再添加1.9g/LGellan Gum，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成大型平面扩增培养基或取消凝固剂做成液体培养基；
(6)将上述高产细胞株接种在扩增培养基上，在20℃，黑暗条件下培养4周后，可以获得大量高活力细胞。液体培养时摇床或生物反应器的转速为80～120转/分；
(7)在RW培养基中，添加葡萄糖40g/L，α-萘乙酸(NAA)0.4mg/L，激动素(KT)0.2mg/L，再添加组合前体(包括丙酮酸钠60mg/L、乙酸酐30μl/L和番茄汁150ml/L)和组合诱导子(赤霉素3mg/L、水杨酸90mg/L、过氧化氢30μl/L、酵母提取物1.5％)，用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0，在115℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后制成合成培养基；
(8)将上述扩增的高活力竹节参愈伤组织细胞接种到上述合成培养基内，在29℃，避光条件，90转/分的摇床或大型生物反应器中悬浮培养1周，过滤收获细胞，培养液经调整后可返回反应器继续反复利用；
(9)将收获细胞移送到提取灌中，经过高速搅拌(350转/分)破碎，经溶剂萃取和减压浓缩获得粗提物-竹节参皂苷粗提物及其副产物，再经过纯化获得竹节参总皂苷10％以上，竹节参多糖5％以上以及其它化合物。
实例三：
(1)在改良的RW培养基中，添加2，4-D 1.5mg/L和6-卞氨基嘌呤(6-BA)3mg/升，蔗糖20g/L，然后用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0，再添加6g/L琼脂，在120℃，0.15MPa压力下消毒15分钟后，经冷却制成斜面诱导培养基；
(2)将竹节参幼茎或幼芽作为外植体经70％乙醇表面杀菌40秒，然后再放入10％次氯酸钠溶液中杀菌10分钟，用无菌水冲洗三次后，在无菌条件下将表面杀菌后的茎尖切下来，接种到上述斜面诱导培养基中。之后转移到25℃，2000Lux，16小时照光条件下进行诱导培养，1个月后形成愈伤组织；
(3)在改良的RW培养基中，添加0.8mg/L 2，4-D，0.5mg/L和6-卞氨基嘌呤(6-BA)，30g/L蔗糖、6g/L琼脂，经120℃，0.15MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成平板驯化培养基；
(4)将上述诱导形成的愈伤组织，在上述驯化培养基中进行反复驯化继代培养后，可以获得生长速度快，质地疏松的高产细胞系；
(5)在改良RW培养基的基础上，添加蔗糖30g/L，2，4-D 0.5mg/L，6-卞氨基嘌呤(6-BA)0.3mg/L，然后用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0，再添加6g/L琼脂，在120℃，0.15MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成大型平面扩增培养基或取消凝固剂做成液体培养基；
(6)将上述高产细胞株接种在扩增培养基上，在22℃，黑暗条件下培养4周后，可以获得大量高活力细胞。液体培养时摇床或生物反应器的转速为80～120转/分；
(7)在RW培养基中，添加葡萄糖50g/L，2，4-D 0.4mg/L，6-卞氨基嘌呤(6-BA)0.4mg/L，再添加组合前体(包括丙酮酸钠70mg/L、乙酸酐25μl/L和番茄汁130ml/L)和组合诱导子(赤霉素4mg/L、水杨酸40mg/L、过氧化氢20μl/L、酵母提取物1.3％)，用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0，在120℃，0.15MPa压力下消毒15分钟后制成合成培养基；
(8)将上述扩增的高活力竹节参愈伤组织细胞接种到上述合成培养基内，在30℃，避光条件，110转/分的摇床或大型生物反应器中悬浮培养1周，过滤收获细胞，培养液经调整后可返回反应器继续反复利用；
(9)将收获细胞移送到提取灌中，经过高速搅拌(400转/分)破碎，经溶剂萃取和减压浓缩获得粗提物-竹节参皂苷粗提物及其副产物，再经过纯化获得竹节参总皂苷10％以上，竹节参多糖5％以上以及其它化合物。
Claims (7)
1.一种利用竹节参细胞培养和生物转化技术生产竹节参次生代谢产物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在RW培养基中，按每升培养液添加蔗糖或葡萄糖20～50g，植物生长激素0.1～5mg和植物细胞分裂素0.1～5mg，将pH值调整到5.5～7.0，再添加1.8～8g/L凝固剂，在115～120℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后，经冷却制成斜面诱导培养基；
2)将竹节参的外植体经表面杀菌，在无菌条件下接种在诱导培养基中，25℃避光条件下培养1～2个月诱导形成愈伤组织；
3)将竹节参愈伤组织接种在生长培养基上扩增，25℃避光条件下培养1个月获得大量细胞；
4)在RW培养基中添加组合前体40～150mg和组合诱导子80μg～60mg，制成合成培养基；
5)将大量扩增的愈伤组织细胞接种到合成培养液中，在25℃避光条件下振荡培养1周后收获细胞；
6)用溶剂萃取收获细胞获得竹节参皂苷粗提物及其副产物，再经过纯化获得竹节参皂苷，竹节参多糖以及其它化合物。
2.根据权利要求1所述利用竹节参细胞培养和生物转化技术生产竹节参次生代谢产物的方法，其特征在于，所述植物生长激素为6-卞氨基嘌呤(6-BA)或激动素(KT)。
3.根据权利要求1所述利用竹节参细胞培养和生物转化技术生产竹节参次生代谢产物的方法，其特征在于，所述植物细胞分裂素为α-萘乙酸(NAA)、2，4-D或吲哚乙酸(IAA)。
4.根据权利要求1所述利用竹节参细胞培养和生物转化技术生产竹节参次生代谢产物的方法，其特征在于，所述组合诱导子的组成为赤霉素2～5mg/L、水杨酸20～90mg/L、过氧化氢20～80μl/L、酵母提取物0.5～2g/L。
5.根据权利要求1所述利用竹节参细胞培养和生物转化技术生产竹节参次生代谢产物的方法，其特征在于，所述凝固剂为琼脂或Gellan Gum。
6.根据权利要求1所述利用竹节参细胞培养和生物转化技术生产竹节参次生代谢产物的方法，其特征在于，所述组合前体为丙酮酸钠40～80mg/L、乙酸酐20～40μl/L和番茄汁100～200ml/L。
7.根据权利要求1所述利用竹节参细胞培养和生物转化技术生产竹节参次生代谢产物的方法，其特征在于，该方法具体步骤如下：
(1)在RW培养基中，添加α-萘乙酸(NAA)、2，4-D或吲哚乙酸(IAA)0.1～10mg/L和6-卞氨基嘌呤(6-BA)或激动素(KT)0.1~10mg/L，蔗糖或葡萄糖20～50g/L，然后用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0，再添加1.8～8g/L凝固剂，在115～120℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后，经冷却制成斜面诱导培养基；
(2)将竹节参幼茎或幼芽作为外植体经70％乙醇表面杀菌30～50秒，然后再放入5～10％次氯酸钠或次氯酸钙溶液中杀菌10～20分钟，用无菌水冲洗三次后，在无菌条件下将表面杀菌后的茎尖切下来，或将其幼茎切成1mm长的茎段，接种到上述斜面诱导培养基中，之后转移到18～25℃，2000～3000 Lux，12～16小时照光条件下进行诱导培养，1～2个月后形成愈伤组织；
(3)在RW培养基中，添加0.1～5mg/L α-萘乙酸(NAA)、2，4-D或吲哚乙酸(IAA)，0.1～5mg/L和6-卞氨基嘌呤(6-BA)或激动素(KT)，20～50g/L蔗糖、1.8～8g/L凝固剂，经115～120℃，0.1～0.15MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成平板驯化培养基；
(4)将上述诱导形成的愈伤组织，在上述驯化培养基中进行反复驯化继代培养后，可以筛选出生长速度快，质地疏松的高产细胞株；
(5)在RW培养基的基础上，添加蔗糖20～40g/L，α-萘乙酸(NAA)，2，4-D或吲哚乙酸(IAA)0.1～2mg/L，6-卞氨基嘌呤(6-BA)或激动素(KT)0.1～2mg/L，然后用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0，再添加1.8～8g/L凝固剂，在115～120℃，0.1MPa压力下消毒15分钟后经冷却制成大型平面扩增培养基或者取消凝固剂做成液体培养基；
(6)将上述高产细胞株接种在扩增培养基上，在20～25℃，黑暗条件下培养4～5周后，可以获得大量高活力细胞，液体培养时摇床或生物反应器的转速为80～120转/分；
(7)在RW培养基中，添加葡萄糖20～50g/L，α-萘乙酸(NAA)，2，4-D或吲哚乙酸(IAA)0.1～2mg/L，6-卞氨基嘌呤(6-BA)或激动素(KT)0.1～2mg/L，再添加组合前体40~150mg和组合诱导子80μg~60mg，用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0，在115～120℃，0.1～0.15MPa压力下消毒15分钟后制成合成培养基；
(8)将上述扩增的高活力竹节参愈伤组织细胞接种到上述合成培养基内，在25～30℃，避光条件，80～120转/分的摇床或大型生物反应器中悬浮培养1周，过滤收获细胞，培养液经调整后可返回反应器继续反复利用；
(9)将收获细胞移送到提取灌中，经过高速搅拌(300～400转/分)破碎，经溶剂萃取和减压浓缩获得粗提物，再经过分离纯化获得竹节参皂苷等化合物。
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