CN101475929B

CN101475929B - 一种利用白桦悬浮培养生产齐墩果酸的方法

Info

Publication number: CN101475929B
Application number: CN2009100712965A
Authority: CN
Inventors: 詹亚光; 范桂枝; 尹静; 王博; 由香玲; 齐凤慧; 曾凡锁
Original assignee: 詹亚光
Priority date: 2009-01-19
Filing date: 2009-01-19
Publication date: 2011-03-30
Anticipated expiration: 2029-01-19
Also published as: CN101475929A

Abstract

一种利用白桦悬浮培养生产齐墩果酸的方法。该方法是以白桦成树一年生枝休眠芽、展叶芽和种子为材料，接种于WPM+6-BA 1mg/L培养基中获得白桦无菌苗，再以无菌苗茎段和叶片为外植体，在培养基IS上诱导获得稳定、快速生长的愈伤组织，最后在B5培养基，激素为0.1～0.4mg/L6-BA和0.01～0.1mg/L TDZ的培养基中进行悬浮细胞系的培养，蔗糖为20g/L，pH值为6.0～6.5，接种量鲜重为30～50g/L。23～25℃，110～130转/min，光照8～10h/d，光照强度1400～1700Lx，15天继代1次，多次继代培养后获得稳定的白桦悬浮培养细胞系。经高效液相色谱法检测，获得的白桦悬浮培养细胞中齐墩果酸含量可达到0.217～0.714mg/g(干重)。本发明是第一次在白桦植物中通过细胞工程方法生产齐墩果酸，此方法周期短，成本低，能节省大量人力、物力、提高劳动生产率，为解决天然植物药物来源紧缺和工业化大规模生产齐墩果酸药物提供了一种新途径。

Description

一种利用白桦悬浮培养生产齐墩果酸的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种由悬浮法培养白桦而生产齐墩果酸的方法。

背景技术

早在《本草纲目》中有记载，桦树皮可用于黄疸、乳痛、疥疮等疾病的治疗。在民间桦树皮还用于治疗慢性痢疾及清热解毒、止咳、平喘等。随着研究发现，桦树皮的主要药用成分是次生代谢类三萜物质，以白桦酯醇含量最为丰富，占树皮干重15～35％左右。许多研究都证实白桦三萜可抑制直肠癌、肺癌、白血病、淋巴癌、前列腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞生长(Zhukova，2005)。而齐墩果酸是白桦三萜的一种组成成分，具有降低谷丙转氨酶，促进细胞再生，防止肝硬化，抗炎和强心作用，是治疗肝炎的有效成分，近年又证明其具有一定的降糖、消炎、抗氧化、抗癌活性，且毒副作用小，安全性高，有广阔的临床应用前景，因此受到广泛关注。目前，以小花清风藤、木瓜、女贞子等为原料提取齐墩果酸的研究已有报道，但利用白桦细胞培养生产齐墩果酸的研究还未见报道。

以细胞全能性为基础建立起来的植物细胞培养技术为植物药生产提供了一条新途径。由于利用植物细胞培养法生产植物天然活性物质具有不受气候、病虫害等自然条件的影响，而且不占用土地，不消耗自然资源，生产周期短和人为可控等优点，因而被认为是解决植物药生产与天然植物资源可持续发展之间矛盾的一种新型生物技术。研究表明，通过细胞培养方法获得的次生代谢物质含量远远高于植物本身，如完整植株至少需2～3年时间才可使紫草素含量达1～2％(干重)，而细胞培养仅需三周时间即可使细胞中紫草素含量达14％。截止目前为止，已有300多种植物，超过600种的植物药物来自细胞培养，包括紫草素，人参皂苷，喜树碱，紫杉醇，甘草皂苷等。日本Uitsui公司通过对紫草细胞培养生产尚无法人工合成的紫草素，培养细胞产率为天然细胞产率1000倍，现在日本紫草来源主要是细胞组织培养，另外雷公藤，人参皂苷等许多植物次生代谢产物在生产上均已取得较大的成绩，有的培养规模上万吨，并已进行了工业化生产。这些试验及实践均证明植物细胞不仅具有构成一个完整植株的全部遗传信息，同时，在生化特征上，也具有其亲本植株产生次生代谢产物的遗传基础和生理功能。虽然有白桦叶和悬浮培养细胞中含达玛烷的报道(2003)，但目前尚未见能够使用来自白桦无菌苗诱导的愈伤组织和悬浮培养细胞进行合成齐墩果酸的报道。

发明内容：

以成年白桦一年生枝休眠芽、展叶芽以及种子为外植体，按常规方法经消毒灭菌和固体培养诱导愈伤组织，选取黄绿松散愈伤组织，在B5培养基中进行悬浮培养，培养激素为0.1～0.4mg/L6-BA和0.01～0.1mg/L TDZ。愈伤组织捣碎，接入250mL三角瓶，其中装有培养基100mL，接种量为3g～5g，置于旋转摇床中震荡培养，转速120rpm/min，培养基均以121℃高压灭菌，培养温度为24～26℃，光照强度1000～1500Lx，光/暗周期16h/8h，湿度60％～70％，每15天继代培养一次，增殖倍数达到4～8倍。进一步根据细胞团生长量和齐墩果酸含量选出高产白桦悬浮培养细胞系，多次继代稳定后通过高效液相色谱法检测齐墩果酸含量可达到0.217～0.714mg/g(干重)。为解决齐墩果酸类抗肿瘤天然药物来源紧缺，加速临床大规模应用，提供一种新方法。

技术方案：

以成年白桦一年生枝休眠芽、展叶芽以及种子为诱导组培苗的外植体，经表面消毒，接种于WPM+1.0mg/L 6-BA培养基进行白桦组培苗的诱导及继代培养，取生长30天左右的组培苗，将茎段和叶片切成1cm左右，接种于白桦愈伤组织诱导培养基IS上，进行白桦愈伤组织诱导，选择细胞生长速度快，松散的愈伤组织，接种在B5培养基中进行悬浮培养：将愈伤组织捣碎，接入250mL三角瓶，其中装有培养基100mL，接种量为3g～5g，置于旋转摇床中震荡培养，转速120rpm/min，培养基均以121℃高压灭菌，培养温度为24～26℃，光照强度1000～1500Lx，光/暗周期16h/8h，湿度60％～70％，每15天继代培养一次，获得稳定生产齐墩果酸的悬浮细胞系，经过滤，烘干，粉碎，有机溶剂(95％乙醇)提取等步骤，利用液相色谱方法对齐墩果酸检测和定量分析。

本专利具有以下优点：

1)生产环境不受地域、季节、水质、病虫害、气候等自然环境的影响。

2)生产周期短，生产过程不产生大量废渣废水，安全无污染，具有生态效益。

3)培养的白桦悬浮细胞具有生产齐墩果酸物质的能力，实现了白桦天然植物资源及其药用成分的开发利用。

4)该发明生产的白桦悬浮细胞，一个继代周期为15天，平均细胞增长4～8倍左右，一批细胞年继代至少20次。如能进入规模化生产，以原始细胞1kg计算，仅以齐墩果酸总产量100kg/年，1g齐墩果酸100元人民币计算，其价值也是相当可观的。

5)为解决抗肝病、抗肿瘤天然药物来源紧缺，加速临床大规模应用，提供一种新途径，具有很高的经济效益和社会效益。

具体实施方式

1)材料来源：

取自东北林业大学白桦强化种子园成年白桦的1年生枝的休眠芽和展叶芽以及种子。

2)外植体的表面消毒：

(1)休眠芽：经流水冲洗后，在70％乙醇中浸泡5min。在超净工作台上剥去外层芽鳞，仅剩2～3mm长的芽尖，基部连带1～2mm长的茎段。放到70％乙醇中30s，再在10％次氯酸钙上清液中消毒10min，无菌水漂洗3～5遍，接种到初始培养基上。

(2)展叶芽：剥掉外层绿叶，取出嫩芽(3～5mm长)放到70％乙醇中30s，再在10％次氯酸钙上清液中消毒10min，无菌水漂洗3～5遍，接种到初始培养基上。

(3)种子：先用无菌水浸泡48h，然后在70％乙醇中浸泡10min，10％次氯酸钙中消毒20min，最后无菌水漂洗3～5遍，接种到初始培养基上。

初始培养基和继代培养基为：WPM培养基，附加1.0mg/L 6-BA。100mL三角瓶，装60mL WPM培养基+6-BA 1mg/L，每瓶置3个外植体。接种初期(培养2～3d)时有轻微褐变，一般换一次新鲜培养基就可消除褐变。此后筛选壮苗，每25d继代一次，具体是以1cm长带叶芽的茎段或带嫩叶的组培苗顶端部分插于培养基中，每瓶3～5株。培养基用1mol/L NaOH或HCl调至pH为6.0～6.5，121℃高压灭菌20min，培养温度22～25℃，光/暗周期16h/8h，光照强度1000～1500Lx，湿度60％～70％。

3)愈伤组织诱导与继代：

选择生长状态良好的白桦组培苗，在超净工作台上取其茎段和叶片切成1cm左右，去掉茎段上的叶片及侧芽，每瓶三个茎段或叶片进行诱导愈伤组织。自桦愈伤组织诱导与继代培养基为IS，20g/L蔗糖、5.3g/L琼脂粉，pH值为6.0～6.5，100mL三角瓶，装60mL培养基。每25d继代一次，细胞变得松散，进行悬浮培养。培养基均以121℃高压灭菌，培养温度为24～26℃，光照强度1000～1500Lx，光/暗周期16h/8h，湿度60％～70％。

4)悬浮细胞培养方法：

选择生长速度快，形态松散，颜色黄绿的愈伤组织在B5培养基+0.1～0.4mg/L6-BA和0.01～0.1mg/L TDZ培养基中进行悬浮培养。在超净工作台上，将愈伤组织用无菌手术刀和镊子挟碎，接入250mL三角瓶，其中装有培养基100mL，接种量为3g～5g。置于旋转摇床中震荡培养，转速120rpm/min，培养基均以121℃高压灭菌，培养温度为24～26℃，光照强度1000～1500Lx，光/暗周期16h/8h，湿度60％～70％。，

将最初接种的愈伤组织分别进行悬浮培养，15天继代一次。每次继代前，将较大的细胞团取出，用镊子铗碎，过筛，在愈伤组织诱导培养基上继代培养，以保存细胞，其余单细胞和小细胞团，按3g～5g/100ml的接种量分装在含新鲜B5培养基的培养瓶，多次继代后，筛选高产悬浮细胞系。分别按最初愈伤组织无性系收获细胞团，60℃烘干至恒重，粉碎后，使用液相色谱方法测定细胞中齐墩果酸含量。

4)液相色谱测定齐墩果酸的方法

准确称取0.2g干燥的白桦细胞样品，将其直接加到5mL离心管中，并加入4mL 95％的分析乙醇，常温过夜浸提12h，然后在强度为10kHz下超声时间40min，取上清液，并将其用0.45um滤膜过滤作为样品检测液。液相色谱检测条件：色谱柱HiQ sil C18V 4.6mm×250mm；流动相乙腈(乙腈8∶水2)；柱温25℃；灵敏度16AUFS；流速1.0mL/min；检测波长210nm，进样10uL。检测获得的白桦悬浮培养细胞中齐墩果酸含量可达到0.217～0.714mg/g。

实例1

在实验室小试培养中，按本发明获得的自桦组培苗切成茎段1cm左右，3个材料接种愈伤组织诱导培养基IS培养基中。蔗糖20g/L，琼脂5.3g/L，调节PH值6.0～6.5左右，分装于100ml三角瓶中，每瓶60ml。塑料封口膜封口后，进行高压消毒，压力为1.0-1.2Kg/cm²，时间为20min。一个月后每瓶愈伤组织生长量可达10g左右。25天继代一次，获得松散的易于悬浮培养的细胞，悬浮培养基配方按本发明方法配制，培养基分装在250mL三角瓶中，接种量3g～5g/100mL，在摇床上培养，转速120转/min，光照16小时/天，温度25℃，培养15天后每瓶细胞鲜重可达15～20g，将大块愈伤组织挑出，破碎后在愈伤组织诱导培养基中培养或继续进行悬浮培养。再继代接种量3g～5g/100mL，接种于新鲜液体培养基中继续培养，培养15天后可获得鲜细胞总量75～100g左右，如需要可继续扩大培养，此时可收获一部分悬浮培养细胞，烘干，粉碎，称量，95％乙醇过夜浸提，0.45uM微膜过滤。色谱柱HiQsil C18V 4.6mm×250mm；流动相乙腈(乙腈8∶水2)；柱温25℃；灵敏度16AUFS；流速1.0mL/min；检测波长210nm，进样10uL。检测获得的白桦悬浮培养细胞中齐墩果酸含量。

附图说明

图1白桦悬浮培养细胞团。

Claims

1.一种通过悬浮培养植物细胞生产齐墩果酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)通过常规方法培养获得白桦愈伤组织；

2)将愈伤组织在接种于B5悬浮培养基上培养，接种量为3g～5g/100mL，250mL三角瓶，装100mL培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min，旋转摇床中震荡培养，转速为转速120rpm/min，培养温度为24～26℃，光照强度1000～1500Lx，光/暗周期为16h/8h，湿度60％～70％；每个悬浮培养继代周期后，所述继代培养周期为15天，将培养物过筛，将单细胞和小细胞团，分装在含新鲜液体培养基的培养瓶中继续培养获得悬浮细胞系；

3)步骤2)的培养基中添加了0.1～0.4mg/L的6-BA和0.01～0.1mg/L的TDZ

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述悬浮细胞系多次继代后，平均细胞增殖仍达到4～8倍，齐墩果酸含量可达到0.217～0.714mg/g。