CN104304016B - 一种利用栽培室制备冬虫夏草菌种材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用栽培室制备具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料的方法。该方法利用建立自动化或手动控制气候条件的高寒植物组培苗栽培室，模拟青藏高原的温度、湿度及光照等气候因子，应用组织培养快速繁殖栽培技术获得高寒植物组培苗，将制备的冬虫夏草菌源喷施接种到高寒植物组培苗上，通过营造适应环境促进冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢与高寒植物组织共生，共生处理后获得的冬虫夏草菌种材料对钩蝠蛾幼虫的侵染率可达95.8～98.9％。

Description

一种利用栽培室制备冬虫夏草菌种材料的方法

技术领域

本发明涉及一种利用栽培室制备冬虫夏草菌种材料的方法。

背景技术

冬虫夏草Ophiocordyceps sinensis(Berk.)Sung，Sung，Hywel-Jones&Spatafora是一种虫生子囊真菌，寄生于鳞翅目Lepidoptera蝠蛾科Hepialidae钩蝠蛾属Thitarodes昆虫的幼虫，其无性型为中国被毛孢Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu&Zeng。冬虫夏草寄主钩蝠蛾属Thitarodes昆虫的一个世代包括卵、幼虫、蛹和成虫四个发育阶段，幼虫营地下隧道式穴居生活，杂食性，喜食圆穗蓼、头花蓼、小大黄和珠芽蓼等高寒植物的幼嫩根茎。

冬虫夏草分布于青藏高原高海拔区域，其生长范围局限，产量也极为有限。它是青藏高原特色名贵滋补中药材，具有重要的药用和经济价值。由于冬虫夏草的形成过程中仍有许多关键问题尚不清楚，冬虫夏草菌侵染钩蝠蛾昆虫的侵染活性较弱，原生态冬虫夏草道地药材的产业化迄今仍存在许多障碍难题。冬虫夏草寄主昆虫的饲料高寒植物生长在青藏高原，其具有生长速度慢，繁殖系数不高等特点，在栽培室内利用离体组织培养快速繁殖技术可以解决高寒植物苗的来源问题，该技术是生产上应用最广泛、产生较大经济效益的一项技术，其特点是繁殖速度快、系数大，周年生产、生长整齐，利用这项技术可以使一个单株一年繁殖几万到几百万个植株。

目前采用常规冬虫夏草菌侵染寄主钩蝠蛾昆虫幼虫仍存在侵染率低、耗费时间长等问题。中国发明专利申请(公开号：CN102696555A)公开了一种半野生人工培殖冬虫夏草的方法，中国发明专利申请(公开号：CN102405763A)公开了一种冬虫夏草的培育方法，上述2个专利申请均采用含有中国被毛孢的菌液连续喷洒寄主幼虫体表的方法进行接种侵染；中国发明专利申请(公开号：CN102696392A)公开了天然冬虫夏草的增产方法，其中采用诱集液诱集蝙蝠蛾幼虫后，向幼虫喷洒蝙蝠蛾被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉两种菌种液体种；中国发明专利申请(公开号：CN102106235A)公开了一种全人工培养冬虫夏草的方法，其中采用一端直径小于0.2mm的不锈钢实心针或空心针的针状器具，沾取中国被毛孢菌体和孢子混悬液刺伤寄主幼虫的方法进行接种侵染；中国发明专利申请(公开号：CN102792855A)公开了一种用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料及寄主感染方法，采用冬虫夏草菌皮作为菌种材料灌注、或拌入饲料喂食、或注射、或喷淋侵染寄主幼虫。但上述方法存在侵染活性低、或损伤后存活率低、或耗费时间过长、或菌种材料产量有限等问题，是制约原生态冬虫夏草道地药材产业化的关键问题之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用栽培室制备冬虫夏草菌种材料的方法。该方法利用自动化或手动控制气候条件的高寒植物组培苗栽培室，通过构建冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢与活体高寒植物组培苗组织的共生体，激活中国被毛孢的侵染活性，得到对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料，达到高效侵染寄主钩蝠蛾幼虫的目的。

发明人研究发现冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢在自然界中与其适生地中的多种高寒植物的根、茎、叶等组织存在共生现象。进一步的研究发现，经高寒植物组织根、茎、叶等组织共生，共生后要比未共生的中国被毛孢的侵染活性高数十至数百倍，基于这一原理发明本方法。

本发明制备具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料的方法包括：建立自动化或手动控制气候条件的高寒植物组培苗栽培室，模拟青藏高原的温度、湿度及光照等气候条件，通过离体组织培养快速繁殖栽培技术，获得冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫取食的高寒植物组培苗；将制备的冬虫夏草菌源喷施接种到栽培室高寒植物组培苗上，促进冬虫夏草菌的无性阶段中国被毛孢与高寒植物组培苗共生，形成菌物-植物共生体，将菌丝检测结果为中国被毛孢的菌物-植物共生体作为对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料。

本发明的具体步骤包括：

1.采用通常植物离体组织培养栽培室建造方法，建立自动化或手动控制气候条件的高寒植物组培苗栽培室，以长10～20m×宽10～20m大小为建设单位，设置3～10层用于放置植物苗培养瓶或杀菌处理过的洁净土壤的培养架，通过电制冷、电加热设备(例如制冷压缩机、电热丝加热设备等)调节栽培室内空气温度；通过喷雾式管路及除湿机调节栽培室内空气湿度；培养架安装日光灯等光照系统，对栽培植物提供光照；利用活性炭微滤膜空气过滤系统，保持栽培室内无尘、清洁状态；栽培室内安装紫外灯，定期消毒；工作人员进入栽培室前，在更衣室更换消毒过的工作服、鞋、帽等。

2.在青海玉树或西藏那曲等冬虫夏草主产区海拔2500～5200米的高寒草甸采集高寒植物苗或其种子，通过常规植物离体组织培养快速繁殖技术，在栽培室内用通常植物组培培养基及常规植物生长激素，快速繁殖和栽培高寒植物组培苗，通过人工或自动化控制栽培室的波动温度保持在夜2℃～昼22℃，空气湿度保持在65～95％，离体快繁高寒植物组培苗接受的光照强度为500-2000lx，光照时间每天10～16小时，使高寒植物组培苗旺盛生长。

3.从青海玉树或西藏那曲等冬虫夏草主产区的冬虫夏草适生地采集新鲜冬虫夏草或其子囊孢子，采用合适嗜低温菌物的工业微生物方法进行分离纯化，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，通过常规低温发酵法在13±5℃条件下发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，并进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子按发酵物与水体积比1∶10～1∶200稀释成的悬浮液，或直接采用栽培室内的洁净的冬虫夏草新鲜子囊孢子稀释制成每毫升含有100～1000个子囊孢子的悬浮液，作为冬虫夏草菌源。

4.将制备的冬虫夏草菌源喷淋接种到栽培室栽培的高寒植物组培苗上，每瓶喷施1～5ml菌悬液，或每平方米洁净土壤培育区喷施50～100mL菌悬液，在1天内喷施1～2次，喷施后利用10～100lx的低强度散射光进行光照，通过人工或自动化控制栽培室内温度在13±5℃，空气湿度保持在70～90％，共生培育3～15天，激活冬虫夏草菌中国被毛孢的侵染活性；采用显微镜检查共培养的冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝与高寒植物组培苗的根、叶、茎组织缠绕形成共生体，经分子检验为中国被毛孢后，可直接作为具有高侵染活性的菌种材料；或是将获得的共生体组织切成5～20mm小段，制备成具有高侵染活性的菌种材料，用遮阴保水保鲜方法存放于2～4℃，保存备用。

本发明方法获得的具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料可用于高效侵染钩蝠蛾幼虫，使用时可直接冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫投置到冬虫夏草菌中国被毛孢与高寒植物组培苗形成共生体的培育瓶或洁净土壤培育区内，亦可将制备的高侵染活性菌种材料投喂冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫，使寄主幼虫取食并充分接触菌种材料，从而被高效侵染。在寄主钩蝠蛾幼虫取食接触菌种材料7～15天后，采用显微镜检查及分子生物方法检测钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体，经统计，钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为95.8～98.9％。

本发明所述的植物组培培养基根据高寒植物对无机元素、有机营养元素需求的不同，可以是MS培养基(Murashige and Skoog，1962)、LS培养基(Linsmairer and Skoog，1965)、BL培养基(Brown and Lawrence，1968)、ER培养基(Eriksson，1965)、B₅培养基(Gamborg et al.，1968)、N6培养基(朱至清等，1975)、SH培养基(Sckenk and Hidebrandt，1972)、Nitsch培养基(1969)、Miller培养基(1963)、H培养基(Bourgin and Nitsch，1967)、White培养基(White，1943)、WS培养基(Wolter and Skoog，1966)、HE培养基(Heller，1953)中的一种。

本发明所述的植物激素可以是植物生长素包括：吲哚乙酸(indole-3-aceticacid，IAA)、吲哚丁酸(indole-3-butyric acid，IBA)、萘乙酸(naphthalene acetic acid，NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichloro phenoxyacetic acid，2，4-D)；细胞分裂素包括：激动素(kinetin，KT)、玉米素(zeatin，ZT)、6-苄氨基腺嘌呤(6-Benzyladenine，6-BA)、噻重氮苯基脲(thidiazuron，TDZ)、异戊烯腺嘌呤(2-isopentenyladenine，2-ip)；或赤霉酸(gibberellins3，GA₃)；或脱落酸(abscisic acid，ABA)中的一种或多种。

本发明所述的采用合适嗜低温菌物的工业微生物方法进行分离纯化所用的分离培养基可以是察氏培养基、或马铃薯培养基、或肉汤培养基、或酵母浸出粉葡萄糖培养基、或高氏一号培养基中的一种。所述的通常发酵方法可以是固体发酵，或是液体发酵，或是固液双相发酵。所述固体发酵可以是大麦、小麦、大米、玉米等常规农作谷物中的一种或多种作为固体培养基。所述液体发酵可以是普通肉汤、或蛋白胨水、或酵母提取物等常规底料中的一种或多种作为液体培养基。所述固液双相发酵可采用深层发酵产生菌丝和分生孢子或芽生孢子后，在固体培养基上再继续发酵的方法，其培养基可以是上述固体发酵培养基和液体发酵培养基中的各一种。

本发明所述的高寒植物的种类包括柔软点地梅(Androsace mollis)、东俄洛紫菀(Aster tongolensis)、川滇苔草(Carex schneideri)、膨囊苔草(C.lehmanii)、青绿苔草(C.breviculmis)、黑褐苔草(C.atrofusca)、一岁苔草(C.heterostachya)、萨嘎苔草(C.sagaensis)、舌叶垂头菊(Cremanthodium linguiatum)、裂叶蓝钟花(Cyananthuslobatus)、丽江蓝钟花(C.lichiangensis)、大萼蓝钟花(C.macrocalyx)、发草(Deschampsia caespitosa)、锡金柳叶菜(Epilobium sikkimense)、高山嵩草(Kobresiapygmaea)、大花嵩草(K.macrantha)、西藏嵩草(K.Schoenoides)、矮生嵩草(K.humilis)、线叶嵩草(K.capollifolia)、林芝橐吾(Ligularia nyingchiensis)、聂拉木厚棱芹(Pachypleurum nyalamense)、西藏厚棱芹(P.xizangense)、斑唇马先蒿(Pedicularislongifora)、昌都马先蒿(P.sherriffii)、草甸马先蒿(P.roylei)、西藏糙苏(Phlomistibetica)、长果车前(Plantago asiatica)、细茎蓼(Polygonum filicaule)、叉枝蓼(P.tortuonum)、珠芽蓼(P.viviparum)、圆穗蓼(P.macrophyllum)、狭叶圆穗蓼(P.macrophyllum)、头花蓼(P.capitatum)、穆坪耳蕨(Polystichum moupinense)、楔叶委陵菜(Potentilla cuneata)、纤细委陵菜(P.gracillima)、多头委陵菜(P.multiceps)、大萼委陵菜(P.conferta)、多裂委陵菜(P.multifida)、西藏委陵菜(P.xizangensis)、杂色钟报春(Primula alpicola)、高原毛茛(Ranunculus tanguticus)、云生毛茛(R.nephelogens)、西藏大黄(Rheum tibeticum)、小大黄(R.pumilum)、尼泊尔酸模(Rumexnepalensis)、双齿风毛菊(Saussurea lavrenkoana)、禾叶风毛菊(S.graminea)、星状凤毛菊(S.stella)、卵叶风毛菊(S.ovatifolia)、钩柱唐松草(Thalictrum uncatum)、高山唐松草(T.alpinun)和长果婆婆娜(Veronica chayuensis)中的一种或多种。

本发明所述的冬虫夏草寄主钩蝠蛾包括曲线钩蝠蛾T.fusconebulosa(De Geer，1778)(Hepialus)comb.n.、赭褐钩蝠蛾T.gallicus(Lederer，1852)(Hepialus)comb.n.、白线钩蝠蛾T.nubifer(Lederer，1853)(Hepialus)comb.n.、德氏钩蝠蛾T.davidi(Poujade，1886)(Hepialus)comb.n.、虫草钩蝠蛾Thitarodes armoricanus(Oberthur，1909)(Hepialus)、斜脉钩蝠蛾T.oblifurcus(Chu et Wang，1985)(Hepialus)、樟木钩蝠蛾T.zhangmoensis(Chu et Wang，1985)(Hepialus)、康姬钩蝠蛾T.kangdingroides(Chu etWang，1985)(Hepialus)、康定钩蝠蛾T.kangdingensis(Chu et Wang，1985)(Hepialus)、德钦钩蝠蛾T.deqingensis(Liang，1988)(Hepialus)、白马钩蝠蛾T.baimaensis(Liang，1988)(Hepialus)、梅里钩蝠蛾T.meiliensis(Liang，1988)(Hepialus)、贡嘎钩蝠蛾T.gonggaensis(Fu et Huang，1991)(Hepialus)、人支钩蝠蛾T.renzhiensis(Yang，1991)(Hepialus)、芒康钩蝠蛾T.markamensis(Yang et al.，1992)(Hepialus)、草地钩蝠蛾T.pratensis(Yang et al.，1992)(Hepialus)、锈色钩蝠蛾T.ferrugineus(Yang et al.，1993)(Hepialus)、金沙钩蝠蛾T.jinshaensis(Yang，1993)(Hepialus)、白纹钩蝠蛾T.albipictus(Yang，1993)(Hepialus)、甲郎钩蝠蛾T.jialangensis(Yang，1994)(Hepialus)、察里钩蝠蛾T.zaliensis(Yang，1994)(Hepialus)、中支钩蝠蛾T.zhongzhiensis(Liang，1995)(Hepialus)、叶日钩蝠蛾T.yeriensis(Liang，1995)(Hepialus)、美丽钩蝠蛾T.callinivalis(Liang，1995)(Hepialus)、里塘钩蝠蛾T.litangensis(Liang，1995)(Hepialus)、循化钩蝠蛾T.xunhuaensis(Yang et Yang，1995)(Hepialus)、白带钩蝠蛾T.cingulatus(Yang et Zhang，1995)(Hepialus)、巴青钩蝠蛾T.baqingensis(Yang et Jiang，1995)(Hepialus)、当雄钩蝠蛾T.damxungensis(Yang，1995)(Hepialus)、玉树钩蝠蛾T.yushuensis(Wang et al.，1995)(Hepialus)、宽兜钩蝠蛾T.latitegumenus(Shen et al.，1997)(Hepialus)comb.n.、双带钩蝠蛾T.bibelteus(Shenet al.，1997)(Hepialus)comb.n.、拉脊蝠蛾T.lagii(Yan，2001)(Hepialus)comb.n.、比如钩蝠蛾T.biruens(Fu，2002)(Hepialus)comb.n.、海南钩蝠蛾T.hainanensis(Chu etWang，2004)(Hepialus)comb.n.、纳木钩蝠蛾T.namensis(Chu et al.，2004)(Hepialus)comb.n.、日喀则钩蝠蛾T.xigazeensis(Chu et al.，2004)(Hepialus)comb.n.、永胜钩蝠蛾T.yongshengensis(Chu et al.，2004)(Hepialus)comb.n.、定结钩蝠蛾T.dinggyeensis(Chu et al.，2004)(Hepialus)comb.n.、南木林钩蝠蛾T.nanmlinensis(Chu et al.，2004)(Hepialus)comb.n.、亚东钩蝠蛾T.yadongensis(Chu et al.，2004)(Hepialus)comb.n.、蒲氏钩蝠蛾T.pui(Zhang et al.，2007)(Hepialus)comb.n.、小金钩蝠蛾T.xiaojinensis(Tu et al.，2009)(Hepialus)comb.n.、色季拉钩蝠蛾T.sejilaensis(Zouet al.，2011)、加查钩蝠蛾T.jiachaensis(Zou et al.，2011)中的一种或多种。

具体实施方式

实施例一

1.选择交通便利、电能便宜的地区，以10m×10m为一个房间单位，建造自动化控制气候条件的高寒植物栽培室，栽培室内设置5层培养架用于放置植物苗培养瓶；栽培室内安装常规工业冷库用中央空调系统调节栽培室内空气温度；安装喷雾式管路与中央空调系统共同调节栽培室内空气湿度；培养架安装日光灯光照系统，对栽培植物提供光照；利用活性炭微滤膜空气过滤系统，保持栽培室内无尘、清洁状态；栽培室内安装紫外灯，定期消毒，工作人员进入栽培室前，在更衣室更换消毒过的工作服、鞋、帽等。

2.在青海玉树冬虫夏草主产区海拔4700米的高寒草甸采集高山嵩草(Kobresiapygmaea)、一岁苔草(Carex heterostachya)、禾叶风毛菊(Saussurea graminea)、多裂委陵菜(Potentilla multifida)、高山唐松草(Thalictrum alpinum)、火绒草(Leontopodiumhastioides)、头花蓼(Polygonum macrophytum)的嫩苗或种子，通过常规植物离体组织培养快速繁殖技术，在栽培室内用MS培养基及植物激素IAA(0.4mg/L)、6-BA(0.5mg/L)及GA₃(0.4mg/L)快速繁殖和栽培高寒植物组培苗，通过自动化控制栽培室的波动温度保持在夜5℃～昼20℃，空气湿度保持在65～95％，离体组培快繁植物苗接受的光照强度为500～1200lx，光照时间10～16小时，使组培苗旺盛生长并获得高寒植物苗。

3.从青海玉树地区冬虫夏草主产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规察氏培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，经通常蛋白胨水液体培养基在13±5℃发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，并将发酵获得的菌球用搅拌器均匀打碎，最后按发酵液与水体积比1∶10进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，作为冬虫夏草菌源。

4.将制备的冬虫夏草菌源，用灭菌的注射器均匀喷淋接种到栽培室的高寒植物组培苗上，每瓶组培苗喷入1ml菌悬液，在1天内喷施接种2次，喷施后利用20～50lx的低强度散射光进行光照，通过人工或自动化控制栽培室内温度在13±5℃，空气湿度保持在70～90％，共生培育3天，激活冬虫夏草菌中国被毛孢的侵染活性；经显微镜检查冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝与高寒植物根、叶、茎组织缠绕形成共生体，经分子检验菌丝为中国被毛孢后，将获得的共生体组织切成5～20mm小段，制备成对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的菌种材料，用遮阴保水保鲜方法存放于4℃，保存备用。

5.将制备的高侵染活性菌种材料投喂冬虫夏草寄主玉树钩蝠蛾Thitarodesyushuensi幼虫，每头幼虫投放5～10克，使寄主幼虫取食并充分接触菌种材料，10天后采用显微镜检查及分子生物方法检测玉树钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，玉树钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为98.4％。

实施例二

1.在青藏高原海拔4500米的铁路运输便利的地区，以20m×20m为一个单位建造自动化控制气候条件的高寒植物栽培室，栽培室内设置10层培养架用于放置植物苗培养瓶；栽培室内安装常规工业冷库用中央空调通风系统调节栽培室内空气温度；安装喷雾式管路与中央空调系统共同调节栽培室内空气湿度；培养架安装日光灯光照系统，对栽培植物提供光照；利用活性炭微滤膜空气过滤系统，保持栽培室内无尘、清洁状态；栽培室内安装紫外灯，定期消毒，工作人员进入栽培室前，在更衣室更换消毒过的工作服、鞋、帽等。

2.在西藏那曲冬虫夏草主产区海拔5200米的高寒草甸采集高山嵩草(Kobrasiapygmaea)、矮生嵩草(Kobrasia humilis)、苔草(Carex moorcroftii)、风毛菊(Saussureasuperba)、圆穗蓼(Polygonum macrophytum)、叉枝蓼(Polygonum tortuonum)、珠芽蓼(Polygonum viviparum)、高山唐松草(Thactriun alpinun)、矮火绒草(Leontopodiumalpinum)、委陵菜(Potentilla anserine)、火绒草(Leonlopodium)、斑唇马先蒿(Pedicularis longifora)、黑褐苔草(Carex atrofusca)高寒植物的嫩苗或种子，通过常规植物离体组织培养快速繁殖技术，在栽培室内用LS培养基及植物激素NAA(0.02mg/L)、IBA(0.4mg/L)、TDZ(0.2mg/L)及GA₃(0.4mg/L)快速繁殖和栽培高寒植物组培苗，通过自动化控制栽培室的波动温度保持在夜2℃～昼18℃，空气湿度保持在65～95％，离体组培快繁植物苗接受的光照强度为1000～2000lx，光照时间10～16小时，使组培苗旺盛生长并获得高寒植物苗。

3.从西藏冬虫夏草产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规马铃薯培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法及形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，进一步经通常的大麦固态培养基在13±5℃发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，将发酵获得的菌团用搅拌器均匀打碎，并按发酵物重量与水体积比1∶100进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，将培养基颗粒物用孔径2mm的纱布粗过滤后，作为冬虫夏草菌源。

4.将制备的冬虫夏草菌源用灭菌的注射器均匀喷淋接种到栽培室的高寒植物组培苗上，每瓶喷入5ml菌悬液，在1天内喷施接种2次，喷施后利用20～80lx的低强度散射光进行光照，通过人工或自动化控制栽培室内温度在13±5℃，空气湿度保持在70～90％，共生培育5天后，激活冬虫夏草菌中国被毛孢的侵染活性；经显微镜检查共培养的冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝与高寒植物根、叶、茎组织缠绕形成大量共生体，经分子检验为中国被毛孢后，可直接作为对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的菌种材料。

5.寄主蒲氏钩蝠蛾(Thitarodes pui)幼虫投置到冬虫夏草菌中国被毛孢与高寒植物组培苗形成共生体的培育瓶内，每瓶控释5～10头，使蒲氏钩蝠蛾幼虫取食并充分接触高侵染活性的共生体菌种材料，14天后将蒲氏钩蝠蛾幼虫从瓶中挖出采用显微镜检查及分子生物方法检测蒲氏钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，蒲氏钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率为98.9％。

实施例三

1.在工业配套设施齐全、物资运输便捷的工业区，以长20m×宽10m为一个单位建设，建造自动化控制气候条件的高寒植物栽培室，栽培室内设置3层灭菌土壤培养架；栽培室内安装常规工业冷库用中央空调通风系统调节栽培室内空气温度；安装喷雾式管路与中央空调系统共同调节栽培室内空气湿度；培养架安装日光灯光照系统，对栽培植物提供光照；利用活性炭微滤膜空气过滤系统，保持栽培室内无尘、清洁状态；栽培室内安装紫外灯，定期消毒，工作人员进入栽培室前，在更衣室更换消毒过的工作服、鞋、帽等。

2.在海拔2900～4600m的冬虫夏草适生地区域采集西藏大黄(Rheum tibeticum)、小大黄(R.pumilum)、斑唇马先蒿(Pedicularis longifora)、昌都马先蒿(P.sherriffii)、草甸马先蒿(P.roylei)、钩柱唐松草(Thalictrum uncatum)、高山唐松草(T.alpinun)植株或种子，通过常规植物离体组织培养快速繁殖技术，在栽培室培养瓶内用BL培养基及植物激素IAA(0.1mg/L)、2，4-D(0.2mg/L)、KT(0.2mg/L)及ABA(0.5mg/L)快速繁殖和栽培高寒植物组培苗，然后将组培苗移栽到杀菌处理过的栽培室洁净土壤中，通过自动化控制栽培室的波动温度保持在夜4℃～昼20℃，空气湿度保持在65～85％，离体组培快繁植物苗接受的光照强度为600～1500lx，光照时间10～12小时，使组培苗旺盛生长并获得高寒植物苗。

3.将室内栽培获得的洁净冬虫夏草喷发的子囊孢子套袋收集，直接用无菌生理盐水稀释制成子囊孢子悬浮液，通过显微镜计数使每毫升悬浮液中含有100个子囊孢子，作为冬虫夏草菌源。

4.将制备的冬虫夏草菌源，用消毒过的喷雾器均匀喷淋接种到栽培室灭菌土壤中的高寒植物组培苗上，每平方米喷100ml菌悬液，在1天内喷施接种2次，喷施后利用50～100lx的低强度散射光进行光照，通过人工或自动化控制栽培室内温度在13±5℃，空气湿度保持在70～90％，共生培育7天后，激活冬虫夏草菌中国被毛孢的侵染活性；经显微镜检查共培养的冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝与高寒植物根、叶、茎组织缠绕形成大量共生体，经分子检验为中国被毛孢后，可直接作为对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的菌种材料。

5.寄主虫草钩蝠蛾(Thitarodes armoricanus)幼虫投置到冬虫夏草菌中国被毛孢与高寒植物组培苗形成共生体的灭菌土壤培育区，每平方米约控释100头，使虫草钩蝠蛾幼虫取食并充分接触高侵染活性的共生体菌种材料，15天后将虫草钩蝠蛾幼虫从土壤中挖出采用显微镜检查及分子生物方法检测虫草钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，虫草钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为95.8％。

实施例四

1.在电网及交通方便的高山平台区域，以长20m×宽15m为一个单位建设，建造自动化控制气候条件的高寒植物栽培室，栽培室内设置4层灭菌土壤培养架；栽培室内安装常规工业冷库用中央空调通风系统调节栽培室内空气温度；安装喷雾式管路与中央空调系统共同调节栽培室内空气湿度；培养架安装日光灯光照系统，对栽培植物提供光照；利用活性炭微滤膜空气过滤系统，保持栽培室内无尘、清洁状态；栽培室内安装紫外灯，定期消毒，工作人员进入栽培室前，在更衣室更换消毒过的工作服、鞋、帽等。

2.在海拔3800～4500m的冬虫夏草适生地区域采集细茎蓼(Polygonumfilicaule)、叉枝蓼(P.tortuonum)、圆穗蓼(P.macrophyllum)、狭叶圆穗蓼(P.macrophyllum)、头花蓼(P.capitatum)、西藏大黄(Rheum tibeticum)、小大黄(R.pumilum)植株或种子，通过常规植物离体组织培养快速繁殖技术，在栽培室培养瓶内用BL培养基及植物激素IBA(0.2mg/L)、2，4-D(0.05mg/L)、KT(0.5mg/L)及ABA(0.5mg/L)快速繁殖和栽培高寒植物组培苗，然后将组培苗移栽到杀菌处理过的栽培室洁净土壤中，通过自动化控制栽培室的波动温度保持在夜5℃～昼22℃，空气湿度保持在65～85％，离体组培快繁植物苗接受的光照强度为800～1600lx，光照时间10～14小时，使组培苗旺盛生长并获得高寒植物苗。

3.将室内栽培获得的洁净冬虫夏草喷发的子囊孢子套袋收集，直接用无菌生理盐水稀释制成子囊孢子悬浮液，通过显微镜计数使每毫升悬浮液中含有1000个子囊孢子，作为冬虫夏草菌源。

4.将制备的冬虫夏草菌源，用消毒过的喷雾器均匀喷淋接种到栽培室灭菌土壤中的高寒植物组培苗上，每平方米喷50ml菌悬液，在1天内喷施接种1次，喷施后利用30～50lx的低强度散射光进行光照，通过人工或自动化控制栽培室内温度在13±5℃，空气湿度保持在70～90％，共生培育15天后，激活冬虫夏草菌中国被毛孢的侵染活性；经显微镜检查共培养的冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝与高寒植物根、叶、茎组织缠绕形成大量共生体，经分子检验为中国被毛孢后，可直接作为对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的菌种材料。

5.寄主色季拉钩蝠蛾(Thitarodes sejilaensis)幼虫投置到冬虫夏草菌中国被毛孢与高寒植物组培苗形成共生体的灭菌土壤培育区，每平方米约控释100头，使色季拉钩蝠蛾幼虫取食并充分接触高侵染活性的共生体菌种材料，12天后将色季拉钩蝠蛾幼虫从土壤中挖出采用显微镜检查及分子生物方法检测色季拉钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，色季拉钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为97.9％。

实施例五

1.选择气候条件夏季最高气温30℃左右冬季最低温度-10℃左右的电网水运交通便利的地区，以15m×10m为一个建设单位，建造自动化控制气候条件的高寒植物栽培室，栽培室内设置5层灭菌土壤培养架；栽培室内安装常规工业冷库用中央空调通风系统调节栽培室内空气温度；安装喷雾式管路与中央空调系统共同调节栽培室内空气湿度；培养架安装日光灯光照系统，对栽培植物提供光照；利用活性炭微滤膜空气过滤系统，保持栽培室内无尘、清洁状态；栽培室内安装紫外灯，定期消毒，工作人员进入栽培室前，在更衣室更换消毒过的工作服、鞋、帽等。

2.在在海拔2500～5000m的冬虫夏草适生地区域采集高山嵩草(Kobresiapygmaea)、大花嵩草(K.macrantha)、西藏嵩草(K.Schoenoides)、矮生嵩草(K.humilis)、线叶嵩草(K.capollifolia)、楔叶委陵菜(Potentilla cuneata)、纤细委陵菜(P.gracillima)、多头委陵菜(P.multiceps)、大萼委陵菜(P.conferta)、多裂委陵菜(P.multifida)、西藏委陵菜(P.xizangensis)的植株或种子，通过常规植物离体组织培养快速繁殖技术，在栽培室培养瓶内用MS培养基及植物激素NAA(0.2mg/L)、2，4-D(0.05mg/L)、ZT(1mg/L)及ABA(0.5mg/L)快速繁殖和栽培高寒植物组培苗，然后将组培苗移栽到杀菌处理过的栽培室洁净土壤中，通过自动化控制栽培室的波动温度保持在夜5℃～昼21℃，空气湿度保持在65～85％，离体组培快繁植物苗接受的光照强度为500～1000lx，光照时间10～16小时，使组培苗旺盛生长并获得高寒植物苗。

3.从青海玉树地区的冬虫夏草主产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规肉汤培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，进一步经通常普通肉汤液体培养基在13±5℃发酵21天，然后置于小麦为底物的固体培养基上再继续发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，并将发酵获得菌团用搅拌器均匀打碎，按发酵物重量与水体积比1∶200进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，将培养基颗粒物用孔径1.5mm的灭菌纱布粗过滤后，作为冬虫夏草菌菌源。

4.将制备的冬虫夏草菌菌源，用消毒过的喷雾器均匀喷淋接种到栽培室灭菌土壤中的高寒植物组培苗上，每平方米喷75ml悬浮液，在1天内喷施接种1次，喷施后利用5～20lx的低强度散射光进行光照，通过人工或自动化控制栽培室内温度在13±5℃，空气湿度保持在70～90％，共生培育10天后，激活冬虫夏草菌中国被毛孢的侵染活性；经显微镜检查共培养的冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝与高寒植物根、叶、茎组织缠绕形成大量共生体，经分子检验为中国被毛孢后，将共生体地上部分割回，将共生体组织切成5～20mm小段，制备成对寄主钩蝠蛾幼虫具有高侵染活性的菌种材料，用遮阴保水保鲜方法存放于2℃，保存备用。

5.将制备的高侵染活性菌种材料投喂冬虫夏草寄主比如钩蝠蛾(Thitarodesbiruens)幼虫，每头投入5g高侵染活性物料，使寄主幼虫取食并充分接触菌种材料，7天后将比如钩蝠蛾幼虫从土壤中挖出，采用显微镜检查及分子生物方法检测比如钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，比如钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率约为98.8％。

实施例六(反向例)

1.选择交通便利、电能便宜的地区，以10m×10m为一个房间单位，建造自动化控制气候条件的高寒植物栽培室，栽培室内设置5层培养架用于放置植物苗培养瓶；栽培室内安装常规工业冷库用中央空调系统调节栽培室内空气温度；安装喷雾式管路与中央空调系统共同调节栽培室内空气湿度；培养架安装日光灯光照系统，对栽培植物提供光照；利用活性炭微滤膜空气过滤系统，保持栽培室内无尘、清洁状态；栽培室内安装紫外灯，定期消毒，工作人员进入栽培室前，在更衣室更换消毒过的工作服、鞋、帽等。

2.在青海玉树冬虫夏草主产区海拔4700米的高寒草甸采集高山嵩草(Kobresiapygmaea)、一岁苔草(Carex heterostachya)、禾叶风毛菊(Saussurea graminea)、多裂委陵菜(Potentilla multifida)、高山唐松草(Thalictrum alpinum)、火绒草(Leontopodiumhastioides)、头花蓼(Polygonum macrophytum)的嫩苗或种子，通过常规植物离体组织培养快速繁殖技术，在栽培室内用MS培养基及植物激素IAA(0.4mg/L)、6-BA(0.5mg/L)及GA₃(0.4mg/L)快速繁殖和栽培高寒植物组培苗，通过自动化控制栽培室的波动温度保持在夜5℃～昼23℃，空气湿度保持在65～85％，离体组培快繁植物苗接受的光照强度为4000～8000lx，光照时间10～16小时，使组培苗旺盛生长并获得高寒植物苗。

3.从青海玉树地区冬虫夏草主产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规察氏培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，经通常蛋白胨水液体培养基在13±5℃发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，并将发酵获得的菌球用搅拌器均匀打碎，最后按发酵液与水体积比1∶100进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，作为冬虫夏草菌源。

4.将获得的高寒植物组培苗组织切成5～20mm小段作为玉树钩蝠蛾幼虫的饲料，同时将冬虫夏草菌源喷淋到高寒植物饲料表面，直接投喂冬虫夏草寄主玉树钩蝠蛾Thitarodes yushuensi幼虫，每头幼虫投放5～10克，使寄主幼虫取食并充分接触菌种，10天后采用显微镜检查及分子生物方法检测玉树钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，玉树钩蝠蛾幼虫被中国被毛孢侵染率只有23.4％。

实施例七(反向例)

1.从西藏那曲冬虫夏草产区采集新鲜冬虫夏草，采用常规马铃薯培养基分离纯化菌种，经分子生物学方法及形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，进一步经通常的大麦固态培养基在13±5℃发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，将发酵获得的菌球用搅拌器均匀打碎，并按发酵物重量与水体积比1∶100进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子稀释搅匀成的悬浮液，将培养基颗粒物用孔径2mm的纱布粗过滤后，作为冬虫夏草菌源。

2.将制备的冬虫夏草菌源直接喷淋到冬虫夏草寄主比如钩蝠蛾Thitarodesbiruens幼虫，使寄主幼虫充分接触菌种，10天后采用显微镜检查及分子生物方法检测玉树钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，中国被毛孢侵染比如钩蝠蛾幼虫的侵染率只有18.7％。

实施例八(反向例)

1.在每年6～8月在青海玉树的冬虫夏草产区采集新鲜冬虫夏草子囊孢子，直接稀释制成悬浮液，通过显微镜计数使每毫升悬浮液中含有1000个子囊孢子，作为冬虫夏草菌源。

2.将冬虫夏草菌源直接喷淋到冬虫夏草寄主玉树钩蝠蛾Thitarodes yushuensi幼虫，使寄主幼虫充分接触菌种，10天后采用显微镜检查及分子生物方法检测玉树钩蝠蛾幼虫血淋巴中的中国被毛孢虫菌体。经统计，玉树钩蝠蛾幼虫被冬虫夏草子囊孢子的侵染率只有10.8％。

Claims (2)

1.一种利用栽培室制备具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料的方法，其特征是，该方法包括如下步骤：建立自动化或手动控制气候条件的高寒植物组培苗栽培室，模拟青藏高原的温度、湿度及光照的气候条件，通过离体组织培养快速繁殖栽培技术，获得冬虫夏草寄主钩蝠蛾幼虫取食的高寒植物组培苗；将制备的冬虫夏草菌源喷施接种到栽培室高寒植物组培苗上，促进冬虫夏草菌中国被毛孢与高寒植物组培苗共生，形成菌物-植物共生体，将菌丝检测结果为中国被毛孢的菌物-植物共生体作为对寄主钩蝠蛾昆虫具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料；

所述的将制备的冬虫夏草菌源喷施接种到栽培室高寒植物组培苗的方法是：将制备的冬虫夏草菌源喷淋接种到栽培室栽培的高寒植物组培苗上，每瓶喷施1～2ml菌悬液，或每平方米洁净土壤培育区喷施50～100mL菌悬液，在1天内喷施1～2次，喷施后利用5～100lx的低强度散射光进行光照，控制栽培室内温度在13±5℃，空气湿度保持在70～90％，共生培育3～15天；

所述的离体组织培养快速繁殖栽培技术是：在冬虫夏草主产区海拔2500～5200米的高寒草甸采集高寒植物苗或其种子，应用常规植物离体组织培养快速繁殖技术，快速繁殖和栽培高寒植物组培苗，控制栽培室的波动温度保持在夜2℃～昼22℃，空气湿度保持在65～95％，离体快繁高寒植物组培苗接受的光照强度为500～2000lx，光照时间每天10～16小时，使组培苗旺盛生长获得高寒植物苗；

所述的冬虫夏草菌源的制备方法是：从冬虫夏草主产区的冬虫夏草适生地采集新鲜冬虫夏草或其子囊孢子，采用合适嗜低温菌物的工业微生物方法进行分离纯化，经分子生物学方法或形态学方法鉴定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，通过常规低温发酵法在13±5℃条件下发酵为冬虫夏草菌中国被毛孢菌丝体及分生孢子或芽生孢子，并进一步将菌丝体及分生孢子或芽生孢子按发酵物与水体积比1∶10～1∶200稀释成的悬浮液，作为冬虫夏草菌源；或者是直接采用洁净的冬虫夏草新鲜子囊孢子稀释制成每毫升含有100～1000个子囊孢子的悬浮液，作为冬虫夏草菌源。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征是，所述的高寒植物组培苗栽培室是：采用通常植物离体组织培养栽培室建造方法，建立自动化或手动控制气候条件的高寒植物组培苗栽培室，以长10～20m×宽10～20m大小为建设单位，设置3～5层用于放置植物苗培养瓶或杀菌处理过的洁净土壤的培养架，通过电制冷、电加热设备调节栽培室内空气温度；通过喷雾式管路及除湿机调节栽培室内空气湿度；培养架安装日光灯光照系统，对栽培植物提供光照；利用活性炭及微滤膜空气过滤系统，保持栽培室内无尘、清洁状态；栽培室内安装紫外灯，定期消毒。