CN113604363B - 一种茄链格孢菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种茄链格孢菌及其应用，属于微生物技术领域。该茄链格孢菌(Alternaria solani)XL‑0023，已于2021年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.23048。本发明菌株对6株中药病原真菌——苍术根腐病病原菌、苍术枯萎病病原菌、丹参根腐病病原菌、橘红褐斑病病原菌、丹参枯萎病病原菌、丹参根腐病病原菌，具有显著的抑制效果，应用前景广泛，易于推广应用。

Description

一种茄链格孢菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种茄链格孢菌及其在抑菌方面的应用。

背景技术

链格孢属(Alternaria)是半知菌暗色丝孢菌中重要的一类真菌，该属真菌种类多，寄主范围和地理分布广泛。95％以上的种能兼性寄生在植物上，是重要的植物病原菌。有些种是人和动物的条件致病菌，引起多种疾病。有些种可用作杀菌剂、除草剂等，是有应用潜力的生物资源。茄链格孢菌(Alternaria solani)是重要植物内生真菌之一，属于半知菌纲链孢霉目黑霉科链格孢属。

苍术具有燥湿健脾祛风散寒，明目等功效，用途广泛，是湖北省地道中药材，在英山、罗田、孝昌、大悟等县种植面积较大。近几年来随着茅苍术野生转家种，以及规模化种植面积的增加，其病害问题日渐突出，发病后一般田块产量损失10％-30％，严重时田块造成大面积绝收。苍术根腐病主要由真菌尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)引起，苍术受害后，须根及根茎呈黄褐色，随后变为褐色，继续向茎杆蔓延，后期根茎干腐，皮层和木质部脱离，仅残留木质部纤维及碎屑，地上部分叶片萎蔫，后期叶片全部脱落而成光杆。该病一般5月中旬开始发生，6-7月为发病盛期。苍术枯萎病主要由真菌腐皮镰刀菌(Fusarium solani)引起，苍术受害后，最初是下部叶片失绿，然后逐渐向上蔓延，使整株叶片发黄枯死、叶片不脱落。有时植株的个别枝条半边出现黄叶症状，以后发展到全株。剖视病株基部，维管束褐色。在土填和病株根茎上越冬。该病一般次年病菌从近地面的伤口或根部侵入，6月下开始发病，一直为害到9月下旬。

丹参，唇形科多年生草木，以干燥的肉质根入药，是世界公认的治疗心脑血管病的首选药物。随着连作和种植年限的延长，丹参根部病害严重发生，主要有枯萎病和根腐病，2种病害通常混合发生。病菌侵袭丹参植株后会导致植株根系腐烂，叶片枯黄，严重时植株大面积枯死，丹参严重减产，有效成分降低。目前有研究发现，丹参枯萎病病原菌主要有尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)和链格孢属(Alternaria sp.)；丹参根腐病病原菌主要为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和腐皮镰刀菌(Fusarium solani)。

橘红，是一种常用中药，具有散寒、燥湿、利气、消痰等功效。橘红原产我国，主产四川、重庆等地，其中三峡库区腹地的云阳县，以种植大红袍红橘为主，种植历史达4000年。近年来，柑橘褐斑病的危害面积不断扩大，对橘红品质的影响严重。柑橘褐斑病是一种由真菌Alternaria alternate引起的落叶性病害，病菌主要危害嫩叶、新梢和幼果(对高感病品种，果实整个生育期均可受害)，引起落叶、落果和枯梢，未脱落果实也因果面病斑无法上市鲜销。感病植株的果实则可以刚坐果一直到采果前都可以感染并导致严重落果。

近年来，药用植物种植业的高速发展，有效地缓解了药材需求紧张的问题，但大面积集中生产的方式导致田间病害发生和传播蔓延的加剧。通过研究表明，危害药用植物的病因主要为病原真菌，为准确的防治病害，亟需找到一种新的广谱性抑菌物质。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种茄链格孢菌，该菌株具有易于培养、产量高、培养性状稳定等的特点，其培养物对上述6株中药病原真菌具有较高的抑菌活性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023，已于2021年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.23048。

本发明同时提供所述的茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023在制备抑菌剂中的应用。

进一步，优选的是，所述的抑菌剂抑制的真菌为苍术根腐病病原菌、苍术枯萎病病原菌、丹参根腐病病原菌、橘红褐斑病病原菌、丹参枯萎病病原菌或丹参根腐病病原菌。

进一步，优选的是，所述的抑菌剂中的活性成分包括所述的茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023培养物。

进一步，优选的是，所述的茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023培养物为液体培养物；培养方法为：将茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023划线接种于PDA斜面培养基上，置于28℃培养箱中培养3-5天；

配制PDB液体培养基，将生长好的斜面直接接入PDB液体培养基，置于28℃、180rpm摇床中培养15-20天，取出，即得液体培养物；

所述PDA斜面培养基含有：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，pH值5.6±0.2；

所述PDB液体培养基含有：马铃薯浸粉5g/L，葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。

本发明还提供所述的茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023培养物。

本发明另外提供所述的茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023在制备抑菌剂中的应用，所述的抑菌剂中的活性成分包括茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023培养物的提取物；所述的提取物以茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023培养物为原料经有机溶剂萃取获得。

进一步，优选的是，所述有机溶剂为乙酸乙酯。

本发明并且提供所述的茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023培养物的提取物。

本发明所述的茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023培养物还可以以茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023为原料，以本领域常规的PDA培养基、PDB培养基等进行培养获得。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明提供了一种茄链格孢菌及其应用，本发明茄链格孢菌XL-0023的液体培养物对于苍术根腐病病原菌(Fusarium oxysporum，YB-01)、苍术枯萎病病原菌(Fusariumsolani，YB-02)、丹参根腐病病原菌(Fusarium solani，YB-04)、橘红褐斑病病原菌(Alternaria alternata，YB-05)、丹参枯萎病病原菌(Fusarium sp.，YB-07)和丹参根腐病病原菌(Fusarium solani，YB-08)这6株真菌具有显著的抑制作用，其抑菌率能最高可达到50％，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为茄链格孢菌XL-0023的单菌落形态图(PDA平板)；其中，图1-A为平板正面图；图1-B为平板背面图；

图2为茄链格孢菌XL-0023对6株中药病原真菌的抑制作用(PDA平板)；其中，图2-A为平板正面图；图2-B为平板背面图；

茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023，已于2021年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.23048，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023的来源及鉴定

①茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023的来源

2017年9月4日从辽宁省沈阳药科大学植物园采摘的柴胡中分离到一株真菌，命名为XL-0023。

②XL-0023的鉴定

XL-0023的ITS测序序列见序列表(SEQ ID NO.1)，与Sequence ID:MW008899.1的序列相似性最高，相似性为99.25％。

根据以上鉴定结果，XL-0023属于茄链格孢菌(Alternaria solani)。

实施例2茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023的主要形态特征

将茄链格孢菌XL-0023接于PDA培养基上，28℃培养7天，菌落直径为80-83mm，菌落边缘呈现白色，中部呈现黑色，平铺，菌丝稀少；质地颗粒状，孢梗束大量产生，长约2-5mm，菌丝体白色，背面白色，色素不溶于培养基中。分生孢子呈链状或单生，淡褐色至深褐色，形状不一，表面光滑或具微刺，有纵横隔膜，顶端常具喙。菌丝有隔膜和分枝，较老的颜色较深。分生孢子梗直立或稍弯曲，色深而短，单生或丛生，有1-7个隔膜，大小为50-90um×6-9um。分生孢子自分生抱子梗顶端产生，通常单生，其形状差异很大，倒棍棒形至长椭圆形，颜色为淡灰色至深黑色，具长嚎，表面光滑，9-11个横隔膜，0到数个纵隔膜，大小为117-154um×9.8-15.7um，嚎长等于或长于孢身，有时有分枝，嚎宽2.5-5um。

所述PDA培养基配方：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，pH值5.6±0.2。

该菌株在PDA平板单菌落形态图见图1，图1-A为图1-A为平板正面图；图1-B为平板背面图。

实施例3茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023对病原真菌抑菌率测定

采用平板对峙法测定待筛真菌(茄链格孢菌XL-0023)对供试真菌(十数株病原真菌)的抑菌能力，具体方法如下：

配制PDA平板，分别培养待筛菌株和供试菌株，待菌落直径达到70-80mm后，然后用灭菌的5mm的打孔器，分别在两种培养基生长一致的部位打孔(距皿边缘等距离)。在PDA空平板上，分别用灭菌的小镊子挑取打孔的培养基块，在距离平板中心同一直线上约为3cm处，分别反转接种两种真菌，然后每24小时度量一次抑菌圈大小(十字交叉法)。依据以下公式计算抑菌率：

抑菌率＝[(对照菌落直径-5)-(处理菌落直径-5)]÷(对照菌落直径-5)×100％

注：“5”为打孔器所取菌落的直径。

所述PDA培养基配方：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，pH值5.6±0.2。

茄链格孢菌XL-0023对不同病原真菌抑制率见表1。

表1茄链格孢菌对不同病原真菌的抑制作用

选用供试真菌	抑菌率％
		YB-01	44.78％
YB-02	20.35％
		YB-04	52.05％
YB-05	21.05％
		YB-07	23.81％
YB-08	35.66％

其中，YB-01为苍术根腐病病原菌(Fusarium oxysporum)，YB-02为苍术枯萎病病原菌(Fusarium solani，YB-02)，YB-04为丹参根腐病病原菌(Fusarium solani)、YB-05为橘红褐斑病病原菌(Alternaria alternata)、YB-07为丹参枯萎病病原菌(Fusarium sp.)，YB-08为丹参根腐病病原菌(Fusarium solani)。

由表1可见，茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023对6株中药病原真菌抑菌活性较强，其中对丹参根腐病病原菌(Fusarium solani，YB-04)的抑菌率最高，为52.05％。

该菌株对6株中药病原真菌在PDA平板的抑制作用见图2，平板上半部分为6株中药病原真菌，下半部分为茄链格孢菌XL-0023，其中，图2-A为平板正面图；图2-B为平板背面图。由图2可见，茄链格孢菌XL-0023对6株中药病原真菌表现出明显的抑制作用。

实施例4茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023的液体培养

菌株的活化：将保藏的茄链格孢菌XL-0023划线接种于PDA斜面培养基上，置于28℃培养箱中培养3-5天；

菌株的液体培养：配制200ml/瓶的PDB液体培养基，将生长好的斜面直接接入液体摇瓶，置于28℃、180rpm摇床中培养15-20天，取出，即得液体培养物(即发酵液)。

所述PDA斜面培养基配方：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，pH值5.6±0.2。

所述PDB液体培养基配方：马铃薯浸粉5g/L，葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH值自然。

实施例5茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023乙酸乙酯粗提物的制备

取实施例4的发酵液用等体积乙酸乙酯进行萃取，方法为：振荡30min，使发酵液与乙酸乙酯充分混合后，静置24h分液后，取出乙酸乙酯相即上层相，42℃减压旋蒸(真空度一般为﹣0.08Mpa～﹣0.01MPa)，利用旋转蒸发仪将溶剂完全蒸干，得到菌液乙酸乙酯粗提物，置4℃冰箱保藏备用。

实施例6茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023乙酸乙酯粗提物的MIC和MBC值的测定

取实施例5的菌液乙酸乙酯粗提物采用96孔板法进一步测定其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，具体方法如下：

①供试菌液的培养：将保藏的供试真菌(6株病原真菌)划线接种于PDA斜面培养基上，置于28℃培养箱中培养3-5天后，将生长好的斜面直接接入备用PDB液体培养基中，置于28℃，180rpm摇床中培养48h，取出备用，即得供试菌液。

②样品溶液的配置：取1mg实施例5的菌液乙酸乙酯粗提物，加入100uL DMSO使其充分溶解，再用DMSO定容，得到100ug/mL的样品溶液。

③96孔板法测定MIC和MBC：取无菌96孔板，1-7孔中分别加入100μL的PDB液体培养基，取样品溶液100μL加到1号孔中，混匀(浓度为50ug/mL)，从1号中取出100μL加到2号孔中，混匀，依次稀释到7号孔，7号孔中取出100μL弃去。1-7号孔中样品浓度依次为50、25、12.5、6.25、3.125、1.563和0.7815ug/mL，再分别加入100μL的供试菌液。同一块96孔板上，以加100μL DMSO的小孔作为空白对照，以不加样品溶液只加100μL供试菌液的小孔作为阳性对照，以不加供试菌液只加100μL PDB液体培养基的小孔作为阴性对照。观察孔中培养液澄清的最低浓度为MIC，取小孔液体澄清的50μL液体涂布到PDA培养基上，28℃倒置培养48小时，重复三次，PDA培养基上完全没有细菌生长的最低浓度为MBC。

所述PDA培养基配方：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，pH值5.6±0.2。

所述PDB液体培养基配方：马铃薯浸粉5g/L，葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH值自然。

茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023对不同病原真菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)见表2。

表2茄链格孢菌XL-0023对不同病原真菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)

选用供试真菌	MIC/(ug/mL)	MBC/(ug/mL)
			YB-01	6.25	50
YB-02	12.5	50
			YB-04	3.125	12.5
YB-05	6.25	50
			YB-07	6.25	50
YB-08	0.7815	3.125

由表2可见，XL-0023对6株中药病原真菌——苍术根腐病病原菌、苍术枯萎病病原菌、丹参根腐病病原菌、橘红褐斑病病原菌、丹参枯萎病病原菌、丹参根腐病病原菌，具有显著的抑制效果。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 杨凌未来中科环保科技有限公司

<120> 一种茄链格孢菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 543

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ggctcgcttg acgcgggctg gacctctcgg ggttacagcc ttgctgaatt attcaccctt 60

gtcttttgcg tacttcttgt ttccttggtg ggttcgccca ccactaggac aaacataaac 120

cttttgtaat tgcaatcagc gtcagtaaca aattaataat tacaactttc aacaacggat 180

ctcttggttc tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtagtg tgaattgcag 240

aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc ctttggtatt ccaaagggca 300

tgcctgttcg agcgtcattt gtaccctcaa gctttgcttg gtgttgggcg tcttgtctct 360

agctttgctg gagactcgcc ttaaagtaat tggcagccgg cctactggtt tcggagcgca 420

gcacaagtcg cactctctat cagcaaaggt ctagcatcca ttaagccttt ttttcaactt 480

ttgacctcgg atcaggtagg gatacccgct gaacttaagc atatctaacc ccggaagaaa 540

ttg 543

Claims (2)

1.一种茄链格孢菌 (Alternaria solani)XL-0023，已于2021年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.23048。

2.权利要求1所述的茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023的培养物，其特征在于：茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023培养物为液体培养物；培养方法为：将茄链格孢菌(Alternaria solani)XL-0023划线接种于PDA斜面培养基上，置于28℃培养箱中培养3-5天；

配制PDB液体培养基，将生长好的斜面直接接入PDB液体培养基，置于28℃、180rpm摇床中培养15-20天，取出，即得液体培养物；

所述PDA斜面培养基含有：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，pH值5.6±0.2；

所述PDB液体培养基含有：马铃薯浸粉5g/L，葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。

Images