CN117165495B - 一株维吉尼亚链霉菌Sv1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物病虫害防治技术领域，具体涉及一株维吉尼亚链霉菌Sv1及其应用。本发明要解决的技术问题是为生物防治提供一种新选择。本发明的技术方案是一株维吉尼亚链霉菌（Streptomyces virginiae）Sv1，保藏编号为GDMCC No:63833。本发明提供的维吉尼亚链霉菌Sv1的抑菌谱更广，可有效抑制4种瓜类枯萎病菌、10种炭疽病菌、3种链隔孢、4种黑孢霉以及灰葡萄孢、瓜类尾孢、多主棒孢、瓜类蔓枯病菌、核盘菌、高粱附球菌、新暗色柱节孢等共28种病原真菌的生长，能够有效防治瓜类枯萎病，对瓜类作物苗期具促生作用。
Description
技术领域
本发明属于植物病虫害防治技术领域，具体涉及一株维吉尼亚链霉菌Sv1及其应用。
背景技术
瓜类枯萎病（Fusarium wilt）是由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）侵染引起的土传性真菌病害，染病作物会萎蔫、死亡，产量损失严重。因此，瓜类枯萎病是瓜类作物的重要病害。引起瓜类枯萎病的尖孢镰刀菌存在专化型分化，已报道的专化型包括尖孢镰刀菌黄瓜专化型（F. oxysporumf. sp.cucumerinum）、尖孢镰刀菌苦瓜专化型（F. oxysporumf.sp.momodicase）、尖孢镰刀菌冬瓜专化型（F. oxysporumf. sp.benincasae）、尖孢镰刀菌葫芦专化型（F. oxysporumf. sp.lagenariae）、尖孢镰刀菌丝瓜专化型（F. oxysporumf.sp.luffae）、尖孢镰刀菌西瓜专化型（F. oxysporumf. sp.niveum）、尖孢镰刀菌甜瓜专化型（F. oxysporumf. sp.melonis）和尖孢镰刀菌瓜类专化型（F. oxysporumf.sp.cucurbitacearum）。不同专化型对瓜类作物的致病性存在明显差异，例如黄瓜专化型对黄瓜致病，而对丝瓜、苦瓜和葫芦不致病；苦瓜专化型对苦瓜致病，而对黄瓜、西瓜、冬瓜不致病；丝瓜专化型对丝瓜致病，而对苦瓜、葫芦和甜瓜不致病，对黄瓜和冬瓜不致病或致病力较弱；冬瓜专化型对冬瓜和节瓜致病，对西瓜、甜瓜和黄瓜不致病或致病力较弱。目前，选育抗病品种和使用化学杀菌剂是控制瓜类枯萎病的传统方法。但由于瓜类抗病资源较少，病原菌变异导致品种抗性丧失，长期使用化学杀菌剂容易导致枯萎病菌产生抗药性，还会导致化学杀菌剂残留、农田生态系统破坏、环境污染等问题。
植物炭疽病（anthoracnose disease）是由刺盘孢属真菌（Colletotrichumspp.）侵染引起的气传性病害。刺盘孢属真菌寄主范围广泛，可侵染热带和亚热带地区植物的茎、叶、花、果实等部位，引起蔬菜、水果、花卉、茶树、豆类等植物炭疽病。植物炭疽病不仅在田间发生，还是果实储藏期重要病害之一。目前，由于缺乏抗病品种，防治植物炭疽病主要依赖于化学杀菌剂，但刺盘孢属真菌已对传统化学杀菌剂产生了不同程度的抗药性，增加了防治炭疽病的难度。
植物叶斑病是由链隔孢属（Alternaria）、黑孢霉属（Nigrospora）、多主棒孢（Corynespora cassicola）、瓜类尾孢（Cercosporacf.citrullina）及高粱附球菌（Epicoccum sorghinum）等多种病原真菌侵染引起的叶部病害的统称。叶斑病在作物全生育期均可发生，影响植株光合作用，导致减产，因此具有极大的经济重要性。然而叶斑病的病原菌种类复杂，有时还存在多种病原菌混合侵染，为生产上防治该病害带来困难。
瓜类蔓枯病是由3种瓜类蔓枯病菌（Stagonosporopsis spp.）侵染引起的，是瓜类作物的重要病害。瓜类蔓枯病在瓜类的全生育期均能发生，导致瓜类作物蔓枯、叶斑、果腐等症状，严重时导致植株死亡。植物灰霉病主要由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染引起，植物菌核病主要由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）侵染引起。灰葡萄孢和核盘菌的寄主范围十分广泛，均能导致植物叶斑、茎腐、花腐、果腐等症状，危害严重。目前，尚缺乏瓜类蔓枯病、植物灰霉病和植物菌核病的抗病品种，防治这些病害主要依赖化学杀菌剂，然而这些病原菌的寄主范围广泛，极易产生抗药性，导致防治困难。
火龙果溃疡病是火龙果生产上的毁灭性病害。火龙果溃疡病的病原菌为新暗色柱节孢（Neoscytalidium dimidiatum），该病原菌主要侵染火龙果的肉质茎和果实，易成片发病，严重时导致果园绝收。然而目前对火龙果溃疡病的研究较少，目前的防治技术尚难以应对火龙果生产上的问题。
链霉菌（Streptomyces）是一类独特的革兰氏阳性细菌，因其能够产生大量特有的活性代谢产物（如抗生素、杀菌剂、免疫抑制剂等）而被广泛应用于医药、食品、畜牧、水产和种植等领域。维吉尼亚链霉菌（Streptomyces virginiae）最早在1952年由Grundy等人命名为肉桂链霉菌（Streptomyces cinnamonensis），2018年Nouioui等人命名维吉尼亚链霉菌是肉桂链霉菌的别名（emended name），2021年Komaki和Tamura重新分类认为肉桂链霉菌是维吉尼亚链霉菌最近异模式的异名（a later heterotypic synonym）。维吉尼亚链霉菌发酵产生的内酯环肽类抗生素维吉尼亚霉素具有安全无毒特点，因而在食品保鲜、兽用饲料添加剂、水产养殖等方面广泛研究与应用，而维吉尼亚链霉菌在植物病害防控中的研究与报道较少。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为生物防治提供一种新选择。
本发明的技术方案是一株维吉尼亚链霉菌（Streptomyces virginiae）Sv1，保藏编号为GDMCC No:63833。
本发明还提供了所述维吉尼亚链霉菌Sv1在植物病害防治中的应用。
具体的，所述应用为维吉尼亚链霉菌Sv1在瓜类枯萎病菌防治中的应用。
进一步的，所述瓜类枯萎病的病原菌为苦瓜枯萎病菌、丝瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌和/或黄瓜枯萎病菌。
具体的，所述应用为维吉尼亚链霉菌Sv1在植物炭疽病防治中的应用。
特别的，所述植物炭疽病的病原菌为刺盘孢属（Colletotrichum）真菌。
具体的，所述为刺盘孢属（Colletotrichum）真菌为果生刺盘孢（Colletotrichum fructicola）、平头刺盘孢（Colletotrichum truncatum）、希金斯刺盘孢（Colletotrichum higginsanum）、葫芦科刺盘孢（Colletotrichum orbiculare）、暹罗刺盘孢（Colletotrichum siamense）、白蜡树刺盘孢（Colletotrichum spaethianum）、Colletotrichum endophytica、Colletotrichum plurivorum、Colletotrichum queenslandicum和/或Colletotrichum salsolae。
其中，所述应用为维吉尼亚链霉菌Sv1在防治植物叶斑病中的应用。
具体的，所述植物叶斑病的病原菌为链隔孢属（Alternaria）真菌、黑孢霉属（Nigrospora）真菌、多主棒孢（Corynespora cassicola）、引起苦瓜白斑病的瓜类尾孢（Cercosporacf.citrulina）和/或引起菜心叶斑病的高粱附球菌（Epicoccum sorghinum）。
具体的，所述链隔孢属（Alternaria）真菌为链隔孢（Alternaria alternata）、梨黑斑链格孢（Alternaria gaisen）和/或Alternaria jacinthicola。
具体的，所述黑孢霉属（Nigrospora）真菌为Nigrospora aurantiaca、Nigrospora bambusae、Nigrospora lacticolonia和/或Nigrospora saccharicola。
具体的，所述瓜类蔓枯病的病原菌为瓜类蔓枯病菌（Stagonosporopsis citrulli）。
具体的，所述植物灰霉病的病原菌为灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。
具体的，所述植物菌核病的病原菌为核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）。
具体的，所述火龙果溃疡病的病原菌为新暗色柱节孢（Neoscytalidium dimidiatum）。
本发明还提供了一种生防菌剂，其主要成分为维吉尼亚链霉菌Sv1。
具体的，所述维吉尼亚链霉菌Sv1为维吉尼亚链霉菌Sv1发酵液或其代谢产物、维吉尼亚链霉菌Sv1孢子液或维吉尼亚链霉菌Sv1孢子粉。
本发明还提供了所述维吉尼亚链霉菌Sv1在促进植物生长中的应用。
具体的，所述植物为瓜类。
优选的，所述瓜类为苦瓜、丝瓜、冬瓜或黄瓜。
本发明还提供了一种植物生长调节剂，其主要成分为维吉尼亚链霉菌Sv1。
具体的，所述维吉尼亚链霉菌Sv1为维吉尼亚链霉菌Sv1发酵液或其代谢产物、维吉尼亚链霉菌Sv1孢子液或维吉尼亚链霉菌Sv1孢子粉。
本发明的有益效果：利用本发明提供的维吉尼亚链霉菌Sv1的抑菌谱更广，可有效抑制4种瓜类枯萎病菌、10种炭疽病菌、3种链隔孢、4种黑孢霉以及瓜类蔓枯病菌、灰葡萄孢、核盘菌、瓜类尾孢、多主棒孢、高粱附球菌、新暗色柱节孢等共28种病原真菌的菌丝生长；Sv1发酵物滤液可有效抑制苦瓜枯萎病菌菌丝生长和分生孢子萌发；Sv1的孢子液和发酵液对苦瓜枯萎病均有良好的防病效果，其发酵液还对丝瓜枯萎病有良好的防病效果；Sv1的发酵液对苦瓜苗期具有显著的促生作用。上述这些功能现有技术并未报道。由于菌株Sv1是从植物根围土壤中分离获得，且对植物具促生作用，因此可以考虑利用Sv1防治土传病害。该菌株可避免化学农药对环境和作物安全的潜在不良影响，在病害的生物防治实践中具有潜在的商业开发和应用价值。
本发明菌株于2023年9月22日送至位于广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC）保藏，保藏编号为GDMCC No:63833，分类命名：Streptomyces virginiae。该保藏菌株在本申请中被称为维吉尼亚链霉菌（Streptomyces virginiae）Sv1。
附图说明
图1为菌株Sv1形态特征示意图（ISP2，28℃，7d）。
图2为菌株Sv1系统发育树（基于16S rDNA序列）。
图3为菌株Sv1与4种瓜类枯萎病菌对峙培养示意图。
图4为菌株Sv1无菌发酵液对苦瓜枯萎病菌菌丝生长和分生孢子萌发影响示意图。
图5为菌株Sv1与10种刺盘孢属真菌对峙培养示意图。
图6为菌株Sv1与14种植物病原真菌对峙培养示意图。
图7为菌株Sv1孢子液对苦瓜枯萎病防病效果示意图。
图8为菌株Sv1发酵液对苦瓜枯萎病防病效果示意图。
图9为菌株Sv1发酵液对丝瓜枯萎病防病效果示意图。
图10为菌株Sv1发酵液对苦瓜苗期促生效果示意图。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。本发明实施例所涉及的技术方案，如未特别说明，均为本领域常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1维吉尼亚链霉菌（Streptomyces virginiae）Sv1的分离、鉴定及生物学特性分析
一、菌株Sv1的分离
申请人从云南省玉溪市采集辣椒根际土壤，用无菌水配置土壤悬浮液，采用梯度稀释分离法将土壤悬浮液均匀涂布在PDA培养基平板表面，待平板表面水分吹干后置于28℃下培养，每天挑取单菌落与苦瓜枯萎病菌对峙培养，经初筛和复筛后获得一株对苦瓜枯萎病菌具显著抑制作用的链霉菌菌株，命名为Sv1。
二、菌株Sv1的形态特征
菌株Sv1在ISP2培养基上28℃培养初期菌落表面形成褶皱，培养7天菌落表面产生大量致密的气生菌丝，菌落呈灰白色至灰粉色，厚绒毛状；孢子丝呈松散的螺旋状，断裂形成孢子，孢子短棒状，大小为0.7~1.1 μm × 0.6~0.7 μm（图1）。
三、菌株Sv1的生理生化特征
菌株Sv1的生长温度范围为4℃~45℃，最适生长温度为25℃~37℃，能较好利用葡萄糖，明胶液化、牛奶凝固与胨化、淀粉水解、硫化氢产生和七叶苷水解试验结果呈阳性，黑色素产生、纤维素水解和硝酸盐还原试验结果呈阴性。
四、菌株Sv1的分类属性鉴定
将菌株Sv1菌丝块接种至100 mL PDB液体培养基中，28℃摇床中180rpm培养5天，经三层擦镜纸过滤收集菌体，在液氮中研磨，采用常规DNA提取试剂盒提取菌株Sv1的基因组DNA。以菌株Sv1的基因组DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物27F（SEQ ID No.1，5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（SEQ ID No.2，5’-TACGGCTACCTTGACGACTT-3’）进行PCR扩增与测序。将菌株Sv1的16S rDNA测序结果（SEQ ID No.3）在NCBI上进行BLASTn比对，获得近缘种菌株序列信息，下载近缘种及相关模式菌株的16S rDNA序列构建系统发育树。利用分子系统学方法鉴定菌株Sv1为维吉尼亚链霉菌（Streptomyces virginiae）（图2）。
SEQ ID No.3 16S rDNA
ACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACCACTCCTGCCTGCATGGGCGGGGGTTGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGAGGCTTAACCTCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCTTGTGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTA
将上述菌株于2023年9月22日送至位于广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC）保藏，保藏编号为GDMCC No: 63833，分类命名：Streptomyces virginiaeSv1。
在本发明中，维吉尼亚链霉菌（Streptomyces virginiae）Sv1简写为Sv1。
实施例2维吉尼亚链霉菌Sv1的培养与发酵
一、菌株Sv1的培养
用接种环在菌株Sv1的菌落表面刮取适量气生菌丝，在PDA培养基表面划线后置于28℃下培养7天。
二、菌株Sv1孢子液的制备
用接种环刮取上述步骤一菌落表面的气生菌丝，转接到新鲜的PDA培养基表面划线，28℃恒温箱中培养7~10天待菌落表面气生菌丝变成灰粉色。用无菌蒸馏水洗脱菌落表面的气生菌丝和孢子，转至装有灭菌玻璃珠的无菌三角瓶中，在28℃下180rpm培养2小时，悬浮液经三层擦镜纸过滤，收集至灭菌三角瓶中。在普通光学显微镜下用血球计数板计数，测定孢子液浓度，用灭菌蒸馏水调节孢子液浓度至1×107个孢子/mL。
三、菌株Sv1发酵液的制备
用接种环刮取上述步骤一菌落表面的气生菌丝，转接到新鲜的PDA培养基表面划线，28℃恒温箱中培养7~10天待菌落表面气生菌丝变成灰粉色。用灭菌5mm直径打孔器在气生菌丝密集处打取菌丝块，挑取4个菌丝块接种至装有100mL PDB液体培养基的250mL灭菌三角瓶中，于28℃下180rpm培养3天后作为种子液。
用去头的灭菌1mL枪头吸取2mL种子液（菌体鲜重0.1g）接种至装有100mL PDB液体培养基的250mL灭菌三角瓶中，于28℃下180rpm培养7天后，发酵液经单层灭菌纱布过滤后收集滤液，即获得菌株Sv1发酵液。
四、菌株Sv1无菌发酵液的制备
将上述步骤三发酵液装于灭菌50mL离心管中，4℃下4000rpm离心20分钟，收集上清至新的灭菌50mL离心管中重复离心1次，用无菌注射器缓慢吸取上清液，经0.22μm孔径的细菌过滤器过滤除菌，即获得菌株Sv1无菌发酵液。
实施例3维吉尼亚链霉菌Sv1对4种重要瓜类枯萎病菌的拮抗效果
本试验选取苦瓜枯萎病菌、丝瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌和黄瓜枯萎病菌与Sv1对峙培养，测定Sv1对瓜类枯萎病菌的抑菌活性。
将苦瓜枯萎病菌、丝瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌和黄瓜枯萎病菌分别接种至PDA培养基平板上，于28℃培养4天后，在菌落边缘打取直径为5mm的菌丝块，分别接种至新的PDA培养基平板中央。用接种环刮取Sv1孢子，在距离枯萎病菌菌丝块中央3cm处涂布直径为5mm的圆形接种区，以不接种Sv1的处理为对照。每个处理16个重复。将平板于28℃下倒置培养5天后，测量菌落直径和抑菌带宽度，计算抑菌率。抑菌率（%）=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径×100。
结果如图3所示，菌株Sv1对4种瓜类枯萎病菌均有较强的抑菌效果，对苦瓜枯萎病菌的抑菌率为52%，对丝瓜枯萎病菌的抑菌率为45%，对冬瓜枯萎病菌的抑菌率为47%，对黄瓜枯萎病菌的抑菌率为49%。培养5天和培养10天的抑制效果无明显差异，因此Sv1对瓜类枯萎病菌的抑菌时效性长，具有良好的生防潜力。
实施例4维吉尼亚链霉菌Sv1无菌发酵液对苦瓜枯萎病菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑制效果
一、菌株Sv1无菌发酵液平板的制备
向90mL融化的PDA培养基（冷却至50℃）中分别加入1mL、2mL、5mL和10mL菌株Sv1无菌发酵液，分别加入灭菌PDB培养基补足至100mL，混合均匀后倒平板，每皿25mL培养基，制备终浓度分别为1%、2%、5%和10%的发酵液平板，对照组加入10mLPDB培养基。
二、菌株Sv1无菌发酵液对苦瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制效果
在事先培养4天的苦瓜枯萎病菌菌落边缘打取直径为5mm的菌丝块接种至上述步骤一中不同浓度的无菌发酵液平板中央，在28℃下倒置培养。每个处理5个重复。培养3天后，每天观察并测量菌落直径至5天，计算菌株Sv1无菌发酵液对苦瓜枯萎病菌的菌丝生长生长抑制率。菌丝生长抑制率（%）=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径×100。
结果如图4所示，菌株Sv1的无菌发酵液对苦瓜枯萎病菌菌丝生长具较强的抑制效果，且抑制效果随着无菌发酵液浓度的增加而增强。处理3天时，10%无菌发酵液对苦瓜枯萎病菌菌丝生长抑制率为64%；继续处理至5天，10%无菌发酵液对苦瓜枯萎病菌菌丝生长抑制率仍为61%。可见菌株Sv1的无菌发酵液对苦瓜枯萎病菌的抑菌时效性也较长。
三、菌株Sv1无菌发酵液对苦瓜枯萎病菌分生孢子萌发的抑制效果
用无菌水配置浓度为1×106个孢子/mL的苦瓜枯萎病菌分生孢子悬浮液，分别吸取100μL分生孢子悬浮液涂布至上述步骤一中不同浓度的无菌发酵液平板上，在超净工作台吹干表面水分后置于28℃下恒温培养16h，在普通光学显微镜下观察记录苦瓜枯萎病菌分生孢子萌发情况，随机测量30个已萌发的分生孢子的芽管长度，计算菌株Sv1无菌发酵液对苦瓜枯萎病菌的芽管伸长抑制率。芽管伸长抑制率（%）=（对照组芽管长度-处理组芽管长度）/对照组芽管长度×100。
结果如图4所示，菌株Sv1的无菌发酵液对枯苦瓜枯萎病菌芽管生长具较强的抑制效果，且抑制效果随着无菌发酵液浓度的增加而增强。5%无菌发酵液对苦瓜枯萎病菌芽管伸长抑制率为75%，10%无菌发酵液对苦瓜枯萎病菌芽管伸长抑制率高达88%。
实施例5维吉尼亚链霉菌Sv1对10种重要刺盘孢属真菌的拮抗效果
本试验采用对峙培养法测定了菌株Sv1对引起葫芦科、豆科、十字花科、百合科、蔷薇科等多个科植物炭疽病的10种刺盘孢属（Colletotrichum）真菌的抑菌活性。10种刺盘孢属真菌分别为果生刺盘孢（Colletotrichum fructicola）、平头刺盘孢（Colletotrichum truncatum）、希金斯刺盘孢（Colletotrichum higginsanum）、葫芦科刺盘孢（Colletotrichum orbiculare）、暹罗刺盘孢（Colletotrichum siamense）、白蜡树刺盘孢（Colletotrichum spaethianum）、Colletotrichum endophytica、Colletotrichum plurivorum、Colletotrichum queenslandicum和Colletotrichum salsolae。
在事先培养5天的上述10种刺盘孢属真菌菌落边缘打取直径为5mm的菌丝块，分别接种至PDA培养基平板中央，用接种环刮取Sv1孢子，在距离枯萎病菌菌丝块中央3cm处涂布直径为5mm的圆形接种区，以不接种Sv1的处理为对照。每个处理4个重复。将平板于28℃下倒置培养5至18天，待对照组菌丝长至培养皿边缘时，测量该菌株的对照组和处理组的菌落直径，计算抑菌率。抑菌率（%）=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径×100。
结果如图5所示，菌株Sv1对供试10种刺盘孢属真菌均有较强的抑菌效果。菌株Sv1对葫芦科刺盘孢（Colletotrichum orbiculare）的抑菌效果最强，为74%；对Colletotrichum queenslandicum的抑菌效果最弱，为44%。可见菌株Sv1具有良好的防治植物炭疽病潜力。
实施例6维吉尼亚链霉菌Sv1对14种重要植物病原真菌的拮抗效果
本试验采用对峙培养法测定了菌株Sv1对引起植物病害的14种病原真菌的抑菌活性。这些病原真菌包括引起植物叶斑病的3种链隔孢属（Alternaria）真菌链隔孢（Alternaria alternata）、梨黑斑链格孢（Alternaria gaisen）和Alternaria jacinthicola、4种黑孢霉属（Nigrospora）真菌Nigrospora aurantiaca、Nigrospora bambusae、Nigrospora lacticolonia和Nigrospora saccharicola及多主棒孢（Corynespora cassicola）、引起作物灰霉病的灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、引起作物菌核病的核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、引起瓜类蔓枯病的瓜类蔓枯病菌（Stagonosporopsis citrulli）、引起火龙果溃疡病的新暗色柱节孢（Neoscytalidium dimidiatum）、引起苦瓜白斑病的瓜类尾孢（Cercosporacf.citrulina）、引起菜心叶斑病的高粱附球菌（Epicoccum sorghinum）。测定方法同实施例5。
结果如图6所示，菌株Sv1对供试14种植物病原真菌均有较强的抑菌效果，抑菌率为47%~68%。因此，菌株Sv1的抑菌谱广，在植物病害生物防治实践中具有良好的开发和应用价值。
实施例7维吉尼亚链霉菌Sv1孢子液对苦瓜枯萎病的防病效果
本试验采用苦瓜苗期活体灌根接种法，测定菌株Sv1孢子液对苦瓜枯萎病的防病效果。
接种液配制：分别配制浓度为2×107个孢子/mL Sv1孢子液和2×106个孢子/mL苦瓜枯萎病菌分生孢子悬浮液作为母液，将Sv1母液与苦瓜枯萎病菌母液等体积混合后配制成处理组接种液，该接种液中Sv1终浓度为1×107个孢子/mL、苦瓜枯萎病菌终浓度为1×106个孢子/mL。将苦瓜枯萎病菌母液与蒸馏水等体积混合后配制成终浓度为1×106个孢子/mL的苦瓜枯萎病菌阳性对照组接种液。以灭菌蒸馏水为阴性对照。所有处理现配现用。
接种：在网室中用直径为12cm的育苗杯种植苦瓜幼苗，选择长势一致的两叶一心期苦瓜幼苗，使用灭菌药匙在幼苗茎基部松土伤根后，将处理组与对照组接种液分别灌根接种至幼苗根围土中，每株接种35mL，每个处理接种15株苦瓜苗，每个处理重复3次。
病害调查：接种后跟踪观察植株发病情况，分别于接种后21天、28天、35天和42天调查每株植株的发病等级，计算病情指数和防病效果。防病效果（%）=（阳性对照组病情指数-处理组病情指数）/阳性对照组病情指数×100。
结果如图7所示，菌株Sv1孢子液对苦瓜枯萎病具有良好的防病效果。与仅接种苦瓜枯萎病菌的阳性对照相比，在相同时间内经1×107个孢子/mL 的Sv1孢子液处理后苦瓜植株叶片更绿，长势更好，枯萎病症状更轻，病情指数显著降低。接种21天和28天时Sv1孢子液的防病效果最好，分别为79%和75%；尽管随着时间的延长防治效果呈降低趋势，接种42天时Sv1孢子液的防病效果仍可达56%。可见，菌株Sv1孢子液对苦瓜枯萎病的防病时效性也较长。
实施例8维吉尼亚链霉菌Sv1发酵液对苦瓜枯萎病的防病效果
本试验采用苦瓜苗期活体灌根接种法，测定Sv1发酵液对苦瓜枯萎病的防病效果。
接种液配制：用灭菌蒸馏水将菌株Sv1的发酵液稀释5倍，配制成终浓度为20%的Sv1发酵液母液，将Sv1发酵液母液与2×106个孢子/mL苦瓜枯萎病菌分生孢子悬浮液等体积混合后配制成处理组接种液，该接种液中Sv1发酵液终浓度为10%、苦瓜枯萎病菌终浓度为1×106个孢子/mL。将2×106个孢子/mL苦瓜枯萎病菌分生孢子悬浮液与20% PDB培养基等体积混合后配制成终浓度为1×106个孢子/mL的苦瓜枯萎病菌阳性对照组接种液。以终浓度为10%的PDB培养基为阴性对照。所有处理现配现用。
接种：方法同实例7。
病害调查：接种后跟踪观察植株发病情况，分别于接种后21天和28天调查每株植株的发病等级，计算病情指数和防病效果。防病效果（%）=（阳性对照组病情指数-处理组病情指数）/阳性对照组病情指数×100。
结果如图8所示，菌株Sv1的发酵液对苦瓜枯萎病具有良好的防病效果。与仅接种苦瓜枯萎病的阳性对照相比，在相同时间内经10%的Sv1发酵液处理后苦瓜枯萎病病情指数显著降低；接种21天时Sv1发酵液的防病效果为81%，接种28天时防病效果仍为53%。
实施例9维吉尼亚链霉菌Sv1发酵液对丝瓜枯萎病的防病效果
本试验采用丝瓜苗期活体灌根接种法，测定Sv1发酵液对丝瓜枯萎病的防病效果。
接种液配制：用灭菌蒸馏水稀释菌株Sv1的发酵液，配制成终浓度为30%的Sv1发酵液母液，将Sv1发酵液母液与2×106个孢子/mL丝瓜枯萎病菌分生孢子悬浮液等体积混合后配制成处理组接种液，该接种液中Sv1发酵液终浓度为15%、丝瓜枯萎病菌终浓度为1×106个孢子/mL。将2×106个孢子/mL丝瓜枯萎病菌分生孢子悬浮液与30% PDB培养基等体积混合后配制成终浓度为1×106个孢子/mL的丝瓜枯萎病菌阳性对照组接种液。以终浓度为15%的PDB培养基为阴性对照。所有处理现配现用。
接种：方法同实例7，在丝瓜幼苗两叶一心期分别灌根接种上述处理组和对照组接种液。
病害调查：接种后跟踪观察植株发病情况，分别于接种后7天和14天调查每株植株的发病等级，计算病情指数和防病效果。防病效果（%）=（阳性对照组病情指数-处理组病情指数）/阳性对照组病情指数×100。
结果如图9所示，菌株Sv1的发酵液对丝瓜枯萎病具有良好的防病效果。与仅接种丝瓜枯萎病的阳性对照相比，在相同时间内经15%的Sv1发酵液处理后丝瓜枯萎病病情指数显著降低；接种7天时Sv1发酵液的防病效果为50%，接种14天时防病效果为48%。
实施例10维吉尼亚链霉菌Sv1发酵液对苦瓜苗期的促生效果
本试验采用不同浓度的Sv1发酵液灌根接种苦瓜幼苗，测定Sv1发酵液对苦瓜的促生效果。
接种液配制：向800mL灭菌蒸馏水中分别添加10mL、20mL、50mL、100mL、150mL和200mL菌株Sv1发酵液，使用PDB培养基补充至总体积为1000mL，获得终浓度分别为1%、2%、5%、10%、15%和20%的Sv1发酵液。用灭菌蒸馏水配制终浓度为20%的PDB培养基为对照。
接种：在网室中用直径为12cm的育苗杯种植苦瓜幼苗，选择长势一致的两叶一心期苦瓜幼苗，将处理组与对照组接种液分别灌根接种至幼苗根围土中，每株接种35mL，每个处理接种10株苦瓜苗。
调查：常规管理15天后测量每株苦瓜植株的株高、茎粗和鲜重。
结果如图10所示，菌株Sv1发酵液能够显著促进苦瓜苗期生长。与对照相比，2%、5%、10%、15%和20%浓度的Sv1发酵液均可显著增加苦瓜苗期茎粗，1%、2%和15%的Sv1发酵液可显著增加苦瓜苗期鲜重。可见菌株Sv1还具备开发成植物生长调节剂或微生物菌肥的潜力。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (12)
1.一株维吉尼亚链霉菌（Streptomyces virginiae）Sv1，保藏编号为GDMCC No:63833。
2.权利要求1所述维吉尼亚链霉菌Sv1在防治瓜类枯萎病中的应用，其特征在于：所述瓜类枯萎病的病原菌为苦瓜枯萎病菌、丝瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌和/或黄瓜枯萎病菌。
3.权利要求1所述维吉尼亚链霉菌Sv1在防治植物炭疽病中的应用，其特征在于：所述植物炭疽病的病原菌为刺盘孢属（Colletotrichum）真菌；具体的，所述刺盘孢属（Colletotrichum）真菌为果生刺盘孢（Colletotrichum fructicola）、平头刺盘孢（Colletotrichum truncatum）、希金斯刺盘孢（Colletotrichum higginsanum）、葫芦科刺盘孢（Colletotrichum orbiculare）、暹罗刺盘孢（Colletotrichum siamense）、白蜡树刺盘孢（Colletotrichum spaethianum）、Colletotrichum endophytica、Colletotrichumplurivorum、Colletotrichum queenslandicum和/或Colletotrichum salsolae。
4.权利要求1所述维吉尼亚链霉菌Sv1在防治植物叶斑病中的应用，其特征在于：所述植物叶斑病的病原菌为链隔孢属（Alternaria）真菌、黑孢霉属（Nigrospora）真菌、多主棒孢（Corynespora cassicola）、瓜类尾孢（Cercospora cf. citrulina）和/或高粱附球菌（Epicoccum sorghinum）。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述链隔孢属（Alternaria）真菌为链隔孢（Alternaria alternata）、梨黑斑链格孢（Alternaria gaisen）和/或Alternariajacinthicola；所述黑孢霉属（Nigrospora）真菌为Nigrospora aurantiaca、Nigrosporabambusae、Nigrospora lacticolonia和/或Nigrospora saccharicola。
6.权利要求1所述维吉尼亚链霉菌Sv1在防治瓜类蔓枯病中的应用，其特征在于：所述瓜类蔓枯病的病原菌为瓜类蔓枯病菌（Stagonosporopsis citrulli）。
7.权利要求1所述维吉尼亚链霉菌Sv1在防治植物灰霉病中的应用，其特征在于：所述植物灰霉病的病原菌为灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。
8.权利要求1所述维吉尼亚链霉菌Sv1在防治植物菌核病中的应用，其特征在于：所述植物菌核病的病原菌为核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）。
9.权利要求1所述维吉尼亚链霉菌Sv1在防治植物火龙果溃疡病中的应用，其特征在于：所述火龙果溃疡病的病原菌为新暗色柱节孢（Neoscytalidium dimidiatum）。
10.一种生防菌剂，其特征在于：包含权利要求1所述维吉尼亚链霉菌Sv1的发酵液。
11.权利要求1所述维吉尼亚链霉菌Sv1在促进植物生长中的应用，其特征在于：所述植物为瓜类；所述瓜类为苦瓜、丝瓜、冬瓜或黄瓜。
12.一种植物生长调节剂，其特征在于：包含权利要求1所述维吉尼亚链霉菌Sv1的发酵液。
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