CN110607346A - 一种杂草稻病原菌的鉴定方法及应用 - Google Patents
一种杂草稻病原菌的鉴定方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种杂草稻病原菌的鉴定方法及应用，具体涉及杂草稻病原菌的鉴定技术领域，具体方法如下：S1、杂草稻病害标本的广泛采集；S2、杂草稻病原菌的分离、纯化及保存；S3、杂草稻病原菌的鉴定；S4、杂草稻病原菌致病性测定。本发明通过积极开展杂草稻病原真菌的调查和筛选，建立杂草稻的病原真菌资源数据库，有助于研制出真菌除草剂，在水稻生产上应用而减少杂草稻的危害，最大化保障水稻种植的安全，提高稻农的经济效益，进而有利于农业发展和农民增收，不仅具有重要的科学意义，而且也具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及杂草稻病原菌的鉴定技术领域，更具体地说，本发明涉及一种杂草稻病原菌的鉴定方法及应用。
背景技术
杂草稻又称野稻、杂稻，是全球性草害，世界上许多国家和地区广泛分布着与栽培稻伴生的杂草稻，它们的形态特征介于野生稻和栽培籼粳稻间，大多杂草稻与野生稻很相似,成熟种子轻、休眠强、易于落粒，分蘖期和开花期比伴生栽培稻品种一般偏早，同栽培稻相比,杂草稻在稻田中处于竞争养分、水分和光照的优势地位,从而造成水稻减产、品质下降，在水稻生产中因杂草稻造成的减产一般可达4.3％～8.4％，严重时大幅度减产。
近年来，杂草稻在中国北方移栽稻区开始发生，分布范围逐渐扩大，对栽培稻产量和品质危害越来越严重，杂草稻与栽培稻为同种，但杂草稻属于野生类型，在生存繁殖过程中遵循自然生存的法则，其表型、抗逆等特性与栽培稻具有一定差异性，杂草病原真菌是杂草的天敌，已有不少病原微生物防治杂草的成功实例，利用真菌发展的生物除草剂称之为真菌除草剂，虽然目前利用生物技术来建立防治杂草稻的方法还停留在理论和前期探索阶段，但是利用生物技术防治杂草稻的设想具有广阔的前景，因此，利用杂草病原菌开发真菌除草剂来防治杂草稻危害是一种新的思路，真菌除草剂研究开发的最基础工作是杂草病原菌的调查，迄今为止，对杂草稻病原真菌的调查研究尚未见报道。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种杂草稻病原菌的鉴定方法及应用，通过积极开展杂草稻病原真菌的调查和筛选，建立杂草稻的病原真菌资源数据库，有助于研制出真菌除草剂，在水稻生产上应用而减少杂草稻的危害，最大化保障水稻种植的安全，提高稻农的经济效益，进而有利于农业发展和农民增收，不仅具有重要的科学意义，而且也具有广阔的应用前景。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种杂草稻病原菌的鉴定方法，具体方法如下：
S1、杂草稻病害标本的广泛采集：不同时期从全区水稻种植区采集发生病害的杂草稻标本，按照茎、叶、种子等分类采集易分离能够产生分生孢子菌株的标本，置于保鲜袋内带回，于4℃冷藏保存和无菌风干保存各一份；
S2、杂草稻病原菌的分离、纯化及保存：
S2.1、选取发病植株的茎、叶和种子部位，取其病键交界处，用清水洗去污垢后，在超净工作台内用无菌水冲洗数次，用消毒灭菌的剪刀剪成小块，用酒精浸泡10s消除表面气泡，再用次氯酸钠浸泡5min，立即用无菌水洗涤3次，置于PDA固体培养基上，每皿放置组织块5块，置于培养箱中培养；
S2.2、恒温培养后，从分离的杂草稻病原真菌菌落边缘处，切取菌丝到新的PDA培养基上，重复两次进行纯化培养；
S2.3、将纯化培养后的真菌培养7d后将产的孢子抖在新的培养基上，十几个小时以后在超净工作台内显微镜下进行单孢分离，挑的单孢于PDA培养基培养5d后挑取菌丝于WA培养基培养5d，然后将菌落切成0.5平方厘米的小块，然后放在灭菌后的PC管中进行保存，构建杂草稻病原菌资源活体保存库；
S3、杂草稻病原菌的鉴定：将纯化后菌株接种在PDA培养基上恒温培养，然后记录菌落的形态、颜色、生长速度等，做成玻片标本显微观察其产孢情况及形态学特征，包括菌丝形态、孢子形态、孢子长和孢子长宽；
S4、杂草稻病原菌致病性测定：
S4.1、孢子悬浮液制备：选取产孢能力强的菌株,把菌株接种在稻谷粉培养基平板上，然后放入培养箱中恒温培养，观察产孢情况，产孢较多时，加灭菌水将菌落用毛笔轻轻刷下，经两层灭菌镜头纸过滤，收集孢子滤液加入吐温80，配制成30ml孢子悬浮液，得到100倍镜下每视野30个孢子的悬浮液；
S4.2、杂草稻供试植株培育：将供试杂草稻种子，用次氯酸钠浸泡5-8min进行表面灭菌，种植用的营养土和基质装入铝盆进行湿热灭菌，灭菌后装入花盆中，将表面灭菌后的供试杂草稻的种子每盆20粒，每种播种6盆种下，在温度为20-30℃的温棚中培育，按时浇水，观察生长情况，待植株长至3-5叶期时，将其置于接种箱里，保留生长一致的植株待用；
S4.3、杂草稻接种方法：将培养皿和滤纸高压灭菌，将长势大小一致的新叶取下并用酒精消毒，剪成5厘米长，将配制好的孢子悬浮液混匀在叶片均匀滴三滴，每个菌株接种杂草稻新叶3皿，另外有3皿滴无菌水做对照，接种后的叶片置于准备好的26℃的专用灭菌恒温培养箱内进行保湿无菌培养，每天光照12h，确保叶片接种发病的条件；
S4.4、接种菌株的发病调查：接种十天后观测杂草稻叶片的病斑形状和病斑大小，并记载接种杂草稻的真菌对叶片所置病害症状，对发病叶片进行拍照记录，从而确定致病性。
在一个优选地实施方式中，在步骤S2.1中将发病植株的茎、叶和种子部位剪成0.25-0.5平方厘米的小块，酒精的浓度为75％(v/v)，次氯酸钠的浓度为5％(m/v)，培养箱培养温度为26℃，培养时间为5d。
在一个优选地实施方式中，在步骤S2.3中PC管中盛装有无菌水。
在一个优选地实施方式中，在步骤S3中纯化后菌株接种在PDA培养基上培养的温度为26℃，培养时间为恒温5-10d。
在一个优选地实施方式中，在步骤S3中若菌株在PDA培养基上不易产孢，可以按照以下方法进行促孢：一、取其直径2㎝的菌块放在铺有两层湿润的滤纸的培养皿中，二、把菌株接种在放有小麦秸秆的水琼脂培养基中，10d的时候将其制作玻片标本，用显微照相系统观察记录菌丝形态、孢子形态、孢子长和孢子长宽，进行详细描述，查阅专著文献进行鉴定。
在一个优选地实施方式中，在步骤S4.1中培养箱的温度为26℃，并且12h光照间隔黑暗培养7-10d。
在一个优选地实施方式中，在步骤S4.2中次氯酸钠的浓度为5％(m/v)。
一种杂草稻病原菌的鉴定方法的应用，该方法应用于开发真菌除草剂。
本发明的技术效果和优点：
本发明通过积极开展杂草稻病原真菌的调查和筛选，建立杂草稻的病原真菌资源数据库，有助于研制出真菌除草剂，在水稻生产上应用而减少杂草稻的危害，最大化保障水稻种植的安全，提高稻农的经济效益，进而有利于农业发展和农民增收，不仅具有重要的科学意义，而且也具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本发明提供了一种杂草稻病原菌的鉴定方法，具体方法如下：
S1、杂草稻病害标本的广泛采集：不同时期从全区水稻种植区采集发生病害的杂草稻标本，按照茎、叶、种子等分类采集易分离能够产生分生孢子菌株的标本，置于保鲜袋内带回，于4℃冷藏保存和无菌风干保存各一份；
S2、杂草稻病原菌的分离、纯化及保存：
S2.1、选取发病植株的茎、叶和种子部位，取其病键交界处，用清水洗去污垢后，在超净工作台内用无菌水冲洗数次，用消毒灭菌的剪刀剪成0.25平方厘米的小块，用75％(v/v)的酒精浸泡10s消除表面气泡，再用5％(m/v)的次氯酸钠浸泡5min，立即用无菌水洗涤3次，置于PDA固体培养基上，每皿放置组织块5块，置于26℃培养箱中培养5d；
S2.2、恒温培养后，从分离的杂草稻病原真菌菌落边缘处，切取菌丝到新的PDA培养基上，重复两次进行纯化培养；
S2.3、将纯化培养后的真菌培养7d后将产的孢子抖在新的培养基上，十几个小时以后在超净工作台内显微镜下进行单孢分离，挑的单孢于PDA培养基培养5d后挑取菌丝于WA培养基培养5d后将菌落切成0.5平方厘米的小块于灭菌后的装无菌水的PC管中进行保存，构建杂草稻病原菌资源活体保存库；
S3、杂草稻病原菌的鉴定：将纯化后菌株接种在PDA培养基上，26℃恒温培养5天，记录菌落的形态、颜色、生长速度等，做成玻片标本显微观察其产孢情况及形态学特征，包括菌丝形态、孢子形态、孢子长和宽等，若菌株在PDA培养基上不易产孢，可以按照以下方法进行促孢：一、取其直径2㎝的菌块放在铺有两层湿润的滤纸的培养皿中，二、把菌株接种在放有小麦秸秆的水琼脂培养基(TWA+W)中，10d的时候将其制作玻片标本，用显微照相系统(Olympus，BX53F型)观察记录孢子形态、测量孢子的大小等，进行详细描述，查阅专著文献进行鉴定；
S4、杂草稻病原菌致病性测定：
S4.1、孢子悬浮液制备：选取产孢能力强的菌株,把菌株接种在稻谷粉培养基平板上，26℃恒温培养箱中12h光照间隔黑暗培养7天，观察产孢情况，产孢较多时，加灭菌水将菌落用毛笔轻轻刷下，经两层灭菌镜头纸过滤，收集孢子滤液加入吐温80，配制成30ml孢子悬浮液，得到100倍镜下每视野30个孢子的悬浮液；
S4.2、杂草稻供试植株培育：将供试杂草稻种子，用5％(m/v)的次氯酸钠浸泡5min进行表面灭菌，种植用的营养土和基质装入铝盆进行湿热灭菌，灭菌后装入花盆中，将表面灭菌后的供试杂草稻的种子每盆20粒，每种播种6盆种下，在温度为20℃的温棚中培育，按时浇水，观察生长情况，待植株长至3叶期时，将其置于接种箱里，保留生长一致的植株待用；
S4.3、杂草稻接种方法：将培养皿和滤纸高压灭菌，将长势大小一致的新叶取下并用酒精消毒，剪成5厘米长，将配制好的孢子悬浮液混匀在叶片均匀滴三滴，每个菌株接种杂草稻新叶3皿，另外有3皿滴无菌水做对照，接种后的叶片置于准备好的26℃的专用灭菌恒温培养箱内进行保湿无菌培养，每天光照12h，确保叶片接种发病的条件；
S4.4、接种菌株的发病调查：接种十天后观测杂草稻叶片的病斑形状和病斑大小，并记载接种杂草稻的真菌对叶片所置病害症状，对发病叶片进行拍照记录，从而确定致病性。
一种杂草稻病原菌的鉴定方法的应用，该方法应用于开发真菌除草剂。
实施例2：
本发明提供了一种杂草稻病原菌的鉴定方法，具体方法如下：
S1、杂草稻病害标本的广泛采集：不同时期从全区水稻种植区采集发生病害的杂草稻标本，按照茎、叶、种子等分类采集易分离能够产生分生孢子菌株的标本，置于保鲜袋内带回，于4℃冷藏保存和无菌风干保存各一份；
S2、杂草稻病原菌的分离、纯化及保存：
S2.1、选取发病植株的茎、叶和种子部位，取其病键交界处，用清水洗去污垢后，在超净工作台内用无菌水冲洗数次，用消毒灭菌的剪刀剪成0.4平方厘米的小块，用75％(v/v)的酒精浸泡10s消除表面气泡，再用5％(m/v)的次氯酸钠浸泡5min，立即用无菌水洗涤3次，置于PDA固体培养基上，每皿放置组织块5块，置于26℃培养箱中培养5d；
S2.2、恒温培养后，从分离的杂草稻病原真菌菌落边缘处，切取菌丝到新的PDA培养基上，重复两次进行纯化培养；
S2.3、将纯化培养后的真菌培养7d后将产的孢子抖在新的培养基上，十几个小时以后在超净工作台内显微镜下进行单孢分离，挑的单孢于PDA培养基培养5d后挑取菌丝于WA培养基培养5d后将菌落切成0.5平方厘米的小块于灭菌后的装无菌水的PC管中进行保存；
S3、杂草稻病原菌的鉴定：将纯化后菌株接种在PDA培养基上，26℃恒温培养8天，记录菌落的形态、颜色、生长速度等，做成玻片标本显微观察其产孢情况及形态学特征，包括菌丝形态、孢子形态、孢子长和宽等，若菌株在PDA培养基上不易产孢，可以按照以下方法进行促孢：一、取其直径2㎝的菌块放在铺有两层湿润的滤纸的培养皿中，二、把菌株接种在放有小麦秸秆的水琼脂培养基(TWA+W)中，10d的时候将其制作玻片标本，用显微照相系统(Olympus，BX53F型)观察记录孢子形态、测量孢子的大小等，进行详细描述，查阅专著文献进行鉴定；
S4、杂草稻病原菌致病性测定：
S4.1、孢子悬浮液制备：选取产孢能力强的菌株,把菌株接种在稻谷粉培养基平板上，26℃恒温培养箱中12h光照间隔黑暗培养8天，观察产孢情况，产孢较多时，加灭菌水将菌落用毛笔轻轻刷下，经两层灭菌镜头纸过滤，收集孢子滤液加入吐温80，配制成30ml孢子悬浮液，得到100倍镜下每视野30个孢子的悬浮液；
S4.2、杂草稻供试植株培育：将供试杂草稻种子，用5％(m/v)的次氯酸钠浸泡6min进行表面灭菌，种植用的营养土和基质装入铝盆进行湿热灭菌，灭菌后装入花盆中，将表面灭菌后的供试杂草稻的种子每盆20粒，每种播种6盆种下，在温度为25℃的温棚中培育，按时浇水，观察生长情况，待植株长至4叶期时，将其置于接种箱里，保留生长一致的植株待用；
S4.3、杂草稻接种方法：将培养皿和滤纸高压灭菌，将长势大小一致的新叶取下并用酒精消毒，剪成5厘米长，将配制好的孢子悬浮液混匀在叶片均匀滴三滴，每个菌株接种杂草稻新叶3皿，另外有3皿滴无菌水做对照，接种后的叶片置于准备好的26℃的专用灭菌恒温培养箱内进行保湿无菌培养，每天光照12h，确保叶片接种发病的条件；
S4.4、接种菌株的发病调查：接种十天后观测杂草稻叶片的病斑形状和病斑大小，并记载接种杂草稻的真菌对叶片所置病害症状，对发病叶片进行拍照记录，从而确定致病性。
一种杂草稻病原菌的鉴定方法的应用，该方法应用于开发真菌除草剂。
实施例3：
本发明提供了一种杂草稻病原菌的鉴定方法，具体方法如下：
S1、杂草稻病害标本的广泛采集：不同时期从全区水稻种植区采集发生病害的杂草稻标本，按照茎、叶、种子等分类采集易分离能够产生分生孢子菌株的标本，置于保鲜袋内带回，于4℃冷藏保存和无菌风干保存各一份；
S2、杂草稻病原菌的分离、纯化及保存：
S2.1、选取发病植株的茎、叶和种子部位，取其病键交界处，用清水洗去污垢后，在超净工作台内用无菌水冲洗数次，用消毒灭菌的剪刀剪成0.5平方厘米的小块，用75％(v/v)的酒精浸泡10s消除表面气泡，再用5％(m/v)的次氯酸钠浸泡5min，立即用无菌水洗涤3次，置于PDA固体培养基上，每皿放置组织块5块，置于26℃培养箱中培养5d；
S2.2、恒温培养后，从分离的杂草稻病原真菌菌落边缘处，切取菌丝到新的PDA培养基上，重复两次进行纯化培养；
S2.3、将纯化培养后的真菌培养7d后将产的孢子抖在新的培养基上，十几个小时以后在超净工作台内显微镜下进行单孢分离，挑的单孢于PDA培养基培养5d后挑取菌丝于WA培养基培养5d后将菌落切成0.5平方厘米的小块于灭菌后的装无菌水的PC管中进行保存；
S3、杂草稻病原菌的鉴定：将纯化后菌株接种在PDA培养基上，26℃恒温培养10天，记录菌落的形态、颜色、生长速度等，做成玻片标本显微观察其产孢情况及形态学特征，包括菌丝形态、孢子形态、孢子长和宽等，若菌株在PDA培养基上不易产孢，可以按照以下方法进行促孢：一、取其直径2㎝的菌块放在铺有两层湿润的滤纸的培养皿中，二、把菌株接种在放有小麦秸秆的水琼脂培养基(TWA+W)中，10d的时候将其制作玻片标本，用显微照相系统(Olympus，BX53F型)观察记录孢子形态、测量孢子的大小等，进行详细描述，查阅专著文献进行鉴定；
S4、杂草稻病原菌致病性测定：
S4.1、孢子悬浮液制备：选取产孢能力强的菌株,把菌株接种在稻谷粉培养基平板上，26℃恒温培养箱中12h光照间隔黑暗培养10天，观察产孢情况，产孢较多时，加灭菌水将菌落用毛笔轻轻刷下，经两层灭菌镜头纸过滤，收集孢子滤液加入吐温80，配制成30ml孢子悬浮液，得到100倍镜下每视野30个孢子的悬浮液；
S4.2、杂草稻供试植株培育：将供试杂草稻种子，用5％(m/v)的次氯酸钠浸泡8min进行表面灭菌，种植用的营养土和基质装入铝盆进行湿热灭菌，灭菌后装入花盆中，将表面灭菌后的供试杂草稻的种子每盆20粒，每种播种6盆种下，在温度为30℃的温棚中培育，按时浇水，观察生长情况，待植株长至5叶期时，将其置于接种箱里，保留生长一致的植株待用；
S4.3、杂草稻接种方法：将培养皿和滤纸高压灭菌，将长势大小一致的新叶取下并用酒精消毒，剪成5厘米长，将配制好的孢子悬浮液混匀在叶片均匀滴三滴，每个菌株接种杂草稻新叶3皿，另外有3皿滴无菌水做对照，接种后的叶片置于准备好的26℃的专用灭菌恒温培养箱内进行保湿无菌培养，每天光照12h，确保叶片接种发病的条件；
S4.4、接种菌株的发病调查：接种十天后观测杂草稻叶片的病斑形状和病斑大小，并记载接种杂草稻的真菌对叶片所置病害症状，对发病叶片进行拍照记录，从而确定致病性。
一种杂草稻病原菌的鉴定方法的应用，该方法应用于开发真菌除草剂。
实施例4：
本发明提供了一种杂草稻病原菌的鉴定方法，具体方法如下：
S1、杂草稻病害标本的广泛采集：不同时期从全区水稻种植区采集发生病害的杂草稻标本，按照茎、叶、种子等分类采集易分离能够产生分生孢子菌株的标本，置于保鲜袋内带回，于4℃冷藏保存和无菌风干保存各一份，在银黄灌区4市26个地点采集各类标本132份，具体见下表：
S2、杂草稻病原菌的分离、纯化及保存：
S2.1、选取发病植株的茎、叶和种子部位，取其病键交界处，用清水洗去污垢后，在超净工作台内用无菌水冲洗数次，用消毒灭菌的剪刀剪成0.5平方厘米的小块，用75％(v/v)的酒精浸泡10s消除表面气泡，再用5％(m/v)的次氯酸钠浸泡5min，立即用无菌水洗涤3次，置于PDA固体培养基上，每皿放置组织块5块，置于26℃培养箱中培养5d；
S2.2、恒温培养后，从分离的杂草稻病原真菌菌落边缘处，切取菌丝到新的PDA培养基上，重复两次进行纯化培养；
S2.3、将纯化培养后的真菌培养7d后将产的孢子抖在新的培养基上，十几个小时以后在超净工作台内显微镜下进行单孢分离，挑的单孢于PDA培养基培养5d后挑取菌丝于WA培养基培养5d后将菌落切成0.5平方厘米的小块于灭菌后的装无菌水的PC管中进行保存；
试验结果：共保存可以产生分生孢子的菌株82株；
S3、杂草稻病原菌的鉴定：将纯化后菌株接种在PDA培养基上，26℃恒温培养10天，记录菌落的形态、颜色、生长速度等，做成玻片标本显微观察其产孢情况及形态学特征，包括菌丝形态、孢子形态、孢子长和宽等，若菌株在PDA培养基上不易产孢，可以按照以下方法进行促孢：一、取其直径2㎝的菌块放在铺有两层湿润的滤纸的培养皿中，二、把菌株接种在放有小麦秸秆的水琼脂培养基(TWA+W)中，10d的时候将其制作玻片标本，用显微照相系统(Olympus，BX53F型)观察记录孢子形态、测量孢子的大小等，进行详细描述，查阅专著文献进行鉴定；
试验结果：根据菌落形态、显微镜下孢子的大小、长宽比、隔膜数量以及菌丝的形状，初步将这82个菌株鉴定为6个属，分别为镰刀菌属、平脐孺孢属、凸脐孺孢属、链格孢属、黑孢属和梨孢属，具体见下表：
S4、杂草稻病原菌致病性测定：
S4.1、孢子悬浮液制备：选取产孢能力强的菌株,把菌株接种在稻谷粉培养基平板上，26℃恒温培养箱中12h光照间隔黑暗培养10天，观察产孢情况，产孢较多时，加灭菌水将菌落用毛笔轻轻刷下，经两层灭菌镜头纸过滤，收集孢子滤液加入吐温80，配制成30ml孢子悬浮液，得到100倍镜下每视野30个孢子的悬浮液；
S4.2、杂草稻供试植株培育：将供试杂草稻种子，用5％(m/v)的次氯酸钠浸泡8min进行表面灭菌，种植用的营养土和基质装入铝盆进行湿热灭菌，灭菌后装入花盆中，将表面灭菌后的供试杂草稻的种子每盆20粒，每种播种6盆种下，在温度为30℃的温棚中培育，按时浇水，观察生长情况，待植株长至5叶期时，将其置于接种箱里，保留生长一致的植株待用；
S4.3、杂草稻接种方法：将培养皿和滤纸高压灭菌，将长势大小一致的新叶取下并用酒精消毒，剪成5厘米长，将配制好的孢子悬浮液混匀在叶片均匀滴三滴，每个菌株接种杂草稻新叶3皿，另外有3皿滴无菌水做对照，接种后的叶片置于准备好的26℃的专用灭菌恒温培养箱内进行保湿无菌培养，每天光照12h，确保叶片接种发病的条件；
S4.4、接种菌株的发病调查：接种十天后观测杂草稻叶片的病斑形状和病斑大小，并记载接种杂草稻的真菌对叶片所置病害症状，对发病叶片进行拍照记录，从而确定致病性。
试验结果：通过对28份菌株的接种病斑面积测量，初步发现平脐蠕孢属和梨孢属对杂草稻有较强致病作用。
一种杂草稻病原菌的鉴定方法的应用，该方法应用于开发真菌除草剂。
最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种杂草稻病原菌的鉴定方法，其特征在于：具体方法如下：
S1、杂草稻病害标本的广泛采集：不同时期从全区水稻种植区采集发生病害的杂草稻标本，按照茎、叶、种子等分类采集易分离能够产生分生孢子菌株的标本，置于保鲜袋内带回，于4℃冷藏保存和无菌风干保存各一份；
S2、杂草稻病原菌的分离、纯化及保存：
S2.1、选取发病植株的茎、叶和种子部位，取其病键交界处，用清水洗去污垢后，在超净工作台内用无菌水冲洗数次，用消毒灭菌的剪刀剪成小块，用酒精浸泡10s消除表面气泡，再用次氯酸钠浸泡5min，立即用无菌水洗涤3次，置于PDA固体培养基上，每皿放置组织块5块，置于培养箱中培养；
S2.2、恒温培养后，从分离的杂草稻病原真菌菌落边缘处，切取菌丝到新的PDA培养基上，重复两次进行纯化培养；
S2.3、将纯化培养后的真菌培养7d后将产的孢子抖在新的培养基上，十几个小时以后在超净工作台内显微镜下进行单孢分离，挑的单孢于PDA培养基培养5d后挑取菌丝于WA培养基培养5d，然后将菌落切成0.5平方厘米的小块，然后放在灭菌后的PC管中进行保存，构建杂草稻病原菌资源活体保存库；
S3、杂草稻病原菌的鉴定：将纯化后菌株接种在PDA培养基上恒温培养，然后记录菌落的形态、颜色、生长速度等，做成玻片标本显微观察其产孢情况及形态学特征，包括菌丝形态、孢子形态、孢子长和孢子长宽；
S4、杂草稻病原菌致病性测定：
S4.1、孢子悬浮液制备：选取产孢能力强的菌株,把菌株接种在稻谷粉培养基平板上，然后放入培养箱中恒温培养，观察产孢情况，产孢较多时，加灭菌水将菌落用毛笔轻轻刷下，经两层灭菌镜头纸过滤，收集孢子滤液加入吐温80，配制成30ml孢子悬浮液，得到100倍镜下每视野30个孢子的悬浮液；
S4.2、杂草稻供试植株培育：将供试杂草稻种子，用次氯酸钠浸泡5-8min进行表面灭菌，种植用的营养土和基质装入铝盆进行湿热灭菌，灭菌后装入花盆中，将表面灭菌后的供试杂草稻的种子每盆20粒，每种播种6盆种下，在温度为20-30℃的温棚中培育，按时浇水，观察生长情况，待植株长至3-5叶期时，将其置于接种箱里，保留生长一致的植株待用；
S4.3、杂草稻接种方法：将培养皿和滤纸高压灭菌，将长势大小一致的新叶取下并用酒精消毒，剪成5厘米长，将配制好的孢子悬浮液混匀在叶片均匀滴三滴，每个菌株接种杂草稻新叶3皿，另外有3皿滴无菌水做对照，接种后的叶片置于准备好的26℃的专用灭菌恒温培养箱内进行保湿无菌培养，每天光照12h，确保叶片接种发病的条件；
S4.4、接种菌株的发病调查：接种十天后观测杂草稻叶片的病斑形状和病斑大小，并记载接种杂草稻的真菌对叶片所置病害症状，对发病叶片进行拍照记录，从而确定致病性。
2.根据权利要求1所述的一种杂草稻病原菌的鉴定方法，其特征在于：在步骤S2.1中将发病植株的茎、叶和种子部位剪成0.25-0.5平方厘米的小块，酒精的浓度为75％(v/v)，次氯酸钠的浓度为5％(m/v)，培养箱培养温度为26℃，培养时间为5d。
3.根据权利要求1所述的一种杂草稻病原菌的鉴定方法，其特征在于：在步骤S2.3中PC管中盛装有无菌水。
4.根据权利要求1所述的一种杂草稻病原菌的鉴定方法，其特征在于：在步骤S3中纯化后菌株接种在PDA培养基上培养的温度为26℃，培养时间为恒温5-10d。
5.根据权利要求1所述的一种杂草稻病原菌的鉴定方法，其特征在于：在步骤S3中若菌株在PDA培养基上不易产孢，可以按照以下方法进行促孢：一、取其直径2㎝的菌块放在铺有两层湿润的滤纸的培养皿中，二、把菌株接种在放有小麦秸秆的水琼脂培养基中，10d的时候将其制作玻片标本，用显微照相系统观察记录菌丝形态、孢子形态、孢子长和孢子长宽，进行详细描述，查阅专著文献进行鉴定。
6.根据权利要求1所述的一种杂草稻病原菌的鉴定方法，其特征在于：在步骤S4.1中培养箱的温度为26℃，并且12h光照间隔黑暗培养7-10d。
7.根据权利要求1所述的一种杂草稻病原菌的鉴定方法，其特征在于：在步骤S4.2中次氯酸钠的浓度为5％(m/v)。
8.根据权利要求1所述的一种杂草稻病原菌的鉴定方法的应用，其特征在于：该方法应用于开发真菌除草剂。
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