CN106416774A - 一种野生稻抗纹枯病的鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种野生稻抗纹枯病的鉴定方法，属植物保护学技术领域。本发明的一种野生稻抗纹枯病的鉴定方法包括：病样采集；分离纹枯病菌；菌株保存；病菌菌种准备；待鉴定品种的准备；接种；及鉴定野生稻抗纹枯病特性步骤。本发明用到的仪器及材料均为市场购买。本发明的有益的效果在于：能够快速鉴定药用野生稻抗纹枯病抗源，提高筛选效率；工作周期大大缩短，操作方便、快捷，工作量小。

Description

一种野生稻抗纹枯病的鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种野生稻抗纹枯病的鉴定方法，属植物保护学技术领域。
背景技术
水稻纹枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)侵染引起的一种世界性水稻病害，造成水稻巨大的产量损失和品质降低(Savary et al.,2006)。水稻纹枯病致病菌的菌丝主要在叶鞘、叶片，导致叶片枯死，最终使水稻结实率降低和千粒重下降，严重时引起植株倒伏或整株枯死，损失高达50％以上。尽管不同菌株间的致病性差异显著，但是初步认为纹枯菌中不存在生理小种分化(Jia et al.,2007；Marchetti et al.,1991)。水稻对纹枯病的抗性易受环境影响，不同的水稻品种对纹枯病的抗病力是有差异的(潘学彪等，2001)，中抗纹枯病的品种可以减轻纹枯病对产量的影响(向珣朝等，2005)，迄今未发现免疫或高抗种质，开展抗病遗传育种研究难度较大，国际上对该领域的研究较少。
野生稻是栽培稻的祖先，经过长期的多样性生态环境选择进化，富含水稻育种可利用的重要基因。中国在“八五”计划期间鉴定了2000余份普通野生稻的纹枯病抗性，结果未发现免疫和高抗材料,仅检测到少数中抗材料，如S1001,S3192,S1031,S3304和S8153等(韩飞等，2007)。Eizenga等在生长箱中对21份野生稻材料进行纹枯病菌接种鉴定，发现印度野生稻(Oryza nivara)、巴蒂野生稻(Oryza barthii)和南方野生稻(Oryzameridionalis)的纹枯病抗性较好，其他均较易感纹枯病(Eizenga et al.,2007)。Prasad和Eizenga采用多种评定方法对涉及15个种的60份野生稻材料进行了纹枯病抗性鉴定，结果只发现4份中抗材料，包括上述3种野生稻和1种药用野生稻(Oryza officinalis)等(Prasad et al.,2008)。云南药用野生稻由于原生境生态类型的多样性，在长期自然进化中形成了丰富的遗传多样性，具有许多优异性状，是改良和拓宽栽培稻遗传基础的宝贵基因资源。周而勋等1998年发表的水稻纹枯病菌分离的技术，病样组织只用自来水冲洗，即放在水琼脂上分离，在实际操作非常容易污染，且分离病菌时间长等不足(周而勋等，1998)。因此，快速分离纹枯病菌并从云南药用野生稻资源中精确鉴定免疫或中高抗水稻纹枯病材料至关重要。
本发明将提供快速分离水稻纹枯病菌并对云南药用野生稻居群抗纹枯病特性进行鉴定的方法，对深入挖掘抗水稻纹枯病稻种资源，为水稻抗病育种及云南药用野生稻抗病机理研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于克服现有分离和鉴定技术之不足，而提供一种野生稻抗纹枯病特性鉴定的方法。
本发明的野生稻抗纹枯病的鉴定方法，其具体步骤如下：
1、病样采集：在水稻分蘖盛期及孕穗期，在采集水稻茎秆上有典型云纹状病斑的水稻茎秆用剪刀从植株基部剪断，保留病斑部位，去除叶片后于自封袋中密封保存；
2、分离纹枯病菌：采集当天或第二天开始分离病菌，将有明显病斑的茎秆用剪刀剪成1-2cm段，用体积百分比为75％的酒精对病样消毒5sec，无菌水漂洗2次，后放置于1段于水琼脂培养基上培养皿中央，或分散放置1-2段，并在1000ml水琼脂培养基中滴入2-3滴乳酸，培养1-2天后，在无菌和强光的环境中，观察在带病茎秆周围向琼脂培养基中生长的透明菌丝的形状，树枝状分叉的菌丝为纹枯病菌丝，呈放射状的菌丝为其他杂真菌的菌丝；挑取含有分叉树枝状的1.0cm×1.0cm水琼脂培养基菌丝块或用1.0cm直径的打孔器打菌丝转移至PDA培养基上培养；2天后，米糠色的菌丝呈放射状布满培养皿，再培养3天即长出米糠色菌核，说明分离出的病菌即是水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)；
3、菌株保存：无菌状态下，在PDA培养基上挑取收集菌核于1.5ml离心管中，装至2/3处，将离心管放置在-20℃的冰箱中保存待用；
4、病菌菌种准备：将分离获得水稻纹枯病菌用PDA培养基培养活化2-4天,获得菌丝；活化培养后的菌落边缘，用6mm打孔器打孔获取5mm×5mm菌饼接种至新的PDA培养基上，黑暗、28℃培养2天后菌丝铺满整个培养皿，按1根5cm木质牙签剪短成5段，用体积百分比为75％的酒精对牙签灭菌5sec后放置于长满菌丝的培养基中，培养3-5天至菌丝菌核覆盖牙签段，待用；
5、待鉴定品种的准备：将武育粳3号的种子浸泡24-48h，种子在培养皿中于湿润滤纸上28℃催芽，待种子露白，将种子播种于盆中，每品种均匀播种3行,每行10株苗；每品种播3次重复；注意浇水，盆中保水深度为5cm,在温室或露天放置,待苗长至3-4叶期待用；药用野生稻植株的准备，将药用野生稻按分蘖分成带根的植株，剪去叶片，分别种植在盆中，1盆1个分蘖，保水深度5cm，待新芽新茎长出后接种；
6、接种：将步骤(4)中的长有菌丝和菌核的牙签用镊子夹取放置于2cm×5cm的胶带纸上，贴包至步骤(5)获得的水稻苗基部，使牙签与稻茎接触，每行选择10株接种；喷雾，使保湿度大于80％，环境温度28℃；待病斑扩展至胶带纸外时，将胶带纸及牙签取下；幼苗正常生长管理；
7、鉴定野生稻抗纹枯病抗性：在接种7-10天后、或感病对照品种武育粳3号发病至9级，调查待鉴定药用野生稻病情；病情严重程度，采用Eizenga等的调查标准，即为0级：全株无病；1级：以剑叶为第1片叶向下数起，第4片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；3级：第3片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；5级：第2片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；7级：第1片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；9级：全株发病，枯死。
上述步骤中的水琼脂培养基和PDA培养基均为公知的通用培养基，培养和活化条件同现有技术。
本发明用到的仪器及材料均为市场购买。
本发明的有益的效果在于：本发明能够快速鉴定药用野生稻抗纹枯病抗源，提高筛选效率；工作周期大大缩短，操作方便、快捷，工作量小；对深入挖掘抗水稻纹枯病稻种资源，为水稻抗病育种及云南药用野生稻抗病机理研究奠定基础。
附图说明
图1显示水稻纹枯病菌分离。
图2为打孔器打孔获得的水稻纹枯病菌菌饼。
图3显示纹枯病菌饼转移至PDA培养基中扩大培养。
图4显示放入灭菌牙签。
图5显示长满菌丝和菌核的牙签。
图6显示将牙签移入待接种药用野生稻植株叶鞘或茎基部用胶带纸固定。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的详述。
本实施例所用到的仪器及材料均为市场购买。水琼脂培养基和PDA培养基均为公知的通用培养基，培养和活化条件同现有技术。
实施实例1：从水稻纹枯病病叶中快速分离纯化纹枯病病菌
1、病样采集：在水稻分蘖盛期及孕穗期，在采集水稻茎秆上有典型云纹状病斑的水稻茎秆用剪刀从植株基部剪断，保留病斑部位，去除叶片后于自封袋中密封保存，贴上标有采集地、时间的标签。
2、分离纹枯病菌：采集当天或第二天开始分离病菌，将带有明显病斑的茎秆用剪刀剪成长度为1cm或2cm的数段，用浓度百分比为75％的酒精对茎杆消毒5sec，无菌水漂洗2次，后放置1段茎杆于装有灭过菌的水琼脂培养基的培养皿中央，或分散放置1或2段消过毒的茎杆，28℃黑暗培养24-48h后，在无菌状态的超净台上，放置一个白色光的台灯，将培养皿对准光源，观察在带病茎秆周围向琼脂培养基中生长的透明菌丝的形状，呈树枝状分叉的菌丝为纹枯病菌丝，呈放射状的菌丝为其他杂真菌的菌丝；挑取含有分叉树枝状的1.0cm×1.0cm水琼脂培养基菌丝块或用1.0cm直径的打孔器打菌丝转移至PDA培养基上培养；2天后，米糠色的菌丝呈放射状布满培养皿，再培养3天即长出米糠色菌核，说明分离出的病菌即是水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)。
图1是水稻纹枯病菌的分离。结果显示消毒后的带菌水稻茎杆放置于水琼脂培养基后1-2天后，在水琼脂培养基中快速生长的呈树枝状分叉的菌丝即为纹枯病菌菌丝。
3、菌株保存：无菌状态下，在PDA培养基上挑取收集菌核于1.5ml离心管中，装至2/3处，将离心管放置在-20℃的冰箱中保存待用。
实施实例2用纹枯病菌接种鉴定药用野生稻抗纹枯病特性
1、病菌菌种准备：将分离获得水稻纹枯病菌用PDA培养基培养活化2天或3天或4天，获得菌丝；活化培养后的菌落边缘，用6mm打孔器打孔获取5mm×5mm菌饼接种至新的PDA培养基上(见图2-3)，黑暗、28℃培养2天后菌丝铺满整个培养皿，按1根木质牙签剪短成5段，用浓度百分比为75％的酒精对牙签灭菌5sec后放置于长满菌丝的培养基中，培养5天至菌丝菌核覆盖牙签段，待用，见图4-5。
2、待鉴定品种的准备：将感病品种武育粳3号的种子浸泡48h，种子在培养皿中于湿润滤纸上28℃催芽，待种子露白，将种子播种于盆中，每品种均匀播种3行，每行10株苗；每品种播种3次重复；注意浇水，盆中保水深度为5cm，在温室或露天放置，待苗长至3叶或4叶期待用；药用野生稻植株的准备，将药用野生稻按分蘖分成带根的植株，剪去叶片，分别种植在盆中，1盆1个分蘖，保水深度5cm，待新芽新茎长至株高20cm接种。
3、接种：将长有菌丝和菌核的牙签(见图5)用镊子夹取放置于2cm×5cm的胶带纸上，贴至步骤2中获得的水稻苗的基部，使牙签与稻茎接触，每行选择10株接种；喷雾，使保湿度大于80％，环境温度28℃；待病斑扩展至胶带纸外时，将胶带纸及牙签取下；幼苗正常生长管理。
4、鉴定野生稻抗纹枯病抗性：在接种7-10天后、或感病对照品种武育粳3号发病至9级，调查待鉴定药用野生稻材料病情；病情严重程度分级，按病斑扩展程度，采用Eizenga等的调查标准，即为0级：全株无病；1级：以剑叶为第1片叶算起，第 4片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；3级：第 3片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；5级：第 2片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；7级：第 1片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；9级：全株发病，枯死。结果表明：参试的7个来源的药用野生稻发病级别为1-3级，表现为高抗纹枯病，为良好的抗纹枯病抗源。
发明用上述方法对7个不同来源的药用野生稻抗纹枯病进行鉴定，其结果如表1所示。
表1 7个不同来源的药用野生稻抗纹枯病鉴定结果
实际应用表明：本方法不仅能够快速鉴定药用野生稻抗纹枯病抗源，而且筛选效率高，操作方便、快捷。

Claims (1)

1.一种野生稻抗纹枯病的鉴定方法，其具体步骤如下：
(1)病样采集：在水稻分蘖盛期及孕穗期，在采集水稻茎秆上有典型云纹状病斑的水稻茎秆用剪刀从植株基部剪断，保留病斑部位，去除叶片后于自封袋中密封保存；
(2)分离纹枯病菌：采集当天或第二天开始分离病菌，将有明显病斑的茎秆用剪刀剪成1-2cm段，用体积百分比为75％的酒精对病样消毒5sec，无菌水漂洗2次，后放置于1段于水琼脂培养基上培养皿中央，或分散放置1-2段，并在1000ml水琼脂培养基中滴入2-3滴乳酸，培养1-2天后，在无菌和强光的环境中，观察在带病茎秆周围向琼脂培养基中生长的透明菌丝的形状，树枝状分叉的菌丝为纹枯病菌丝，呈放射状的菌丝为其他杂真菌的菌丝；挑取含有分叉树枝状的1.0cm×1.0cm水琼脂培养基菌丝块或用1.0cm直径的打孔器打菌丝转移至PDA培养基上培养；2天后，米糠色的菌丝呈放射状布满培养皿，再培养3天即长出米糠色菌核，说明分离出的病菌即是水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)；
(3)菌株保存：无菌状态下，在PDA培养基上挑取收集菌核于1.5ml离心管中，装至2/3处，将离心管放置在-20度的冰箱中保存待用；
(4)病菌菌种准备：将分离获得水稻纹枯病菌用PDA培养基培养活化2-4天,获得菌丝；活化培养后的菌落边缘，用6mm打孔器打孔获取5mm×5mm菌饼接种至新的PDA培养基上，黑暗、28℃培养2天后菌丝铺满整个培养皿，按1根木质牙签剪短成5段，用体积百分比为75％的酒精对牙签灭菌5sec后放置于长满菌丝的培养基中，培养3-5天至菌丝菌核覆盖牙签段，待用；
(5)待鉴定品种的准备：将武育粳3号的种子浸泡24-48h，种子在培养皿中于湿润滤纸上28℃催芽，待种子露白，将种子播种于盆中，每品种均匀播种3行，每行10株苗；每品种播3次重复；注意浇水，盆中保水深度为5cm，在温室或露天放置，待苗长至3-4叶期待用；药用野生稻植株的准备，将药用野生稻按分蘖分成带根的植株，剪去叶片，分别种植在盆中，1盆1个分蘖，保水深度5cm，待新芽新茎长出后接种；
(6)接种：将步骤(4)中的长有菌丝和菌核的牙签用镊子夹取放置于2cm×5cm的胶带纸上，贴至步骤(5)获得的水稻苗基部，使牙签与稻茎接触，每行选择10株接种；喷雾，使保湿度大于80％，环境温度28℃；待病斑扩展至胶带纸外时，将胶带纸及牙签取下；幼苗正常生长管理；
(7)鉴定野生稻抗纹枯病抗性：在接种7-10天后、或感病对照品种武育粳3号发病至9级，调查待鉴定药用野生稻病情；病情严重程度，采用Eizenga等的调查标准，即为0级：全株无病；1级：以剑叶为第1片叶向下数起，第4片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；3级：第3片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；5级：第2片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；7级：第1片叶及其以下各叶鞘、叶片发病；9级：全株发病，枯死。
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