CN103828601B - 一种干巴菌菌种的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种干巴菌菌种的分离方法，涉及食用菌培育领域。该方法是取新鲜干巴菌子实体，用镊子将其撕成小块，放入无菌培养皿中，用封口膜裹严，25℃培养2‑5天；在解剖镜下观察菌丝体萌发情况，选取长势好的干巴菌块，放到另一无菌培养皿中，并将PDA琼脂块放入其中；在解剖镜下无菌操作，将PDA琼脂块用解剖刀推至干巴菌长菌丝部位，与菌丝接触，但不能接触菌块，用封口膜裹严，25℃培养2‑5天；在解剖镜下观察，当菌丝长到PDA琼脂块上时，在PDA琼脂块上得到干巴菌菌丝体。本发明能够获得纯干巴菌菌丝体，是分离干巴菌菌种的一种简便、易操作的方法。
Description
技术领域
本发明涉及食用菌培育领域，尤其涉及的是一种干巴菌菌种的分离方法。
背景技术
干巴菌（ThelephoraganbajunZang.）属革菌属（Thelephora）是云南特有的珍稀野生食用菌。随着商品经济的发展，干巴菌越来越为国人所青睐，近几年干巴菌市场售价每公斤均超过千元，品质较好的干巴菌要价1600元/公斤。干巴菌已成为地方重要的经济来源之一。由于干巴菌为一种共生真菌,目前尚不能进行人工栽培，所有市售商品均来自野生资源，而且由于市场价格较高，导致了对野生资源的掠夺性开发，导致其生长的自然林地遭受严重破坏，干巴菌产量逐年下降，在部分地区甚至产生了严峻的生态环境问题和社会经济问题。因此，在指导农民合理采收干巴菌的同时，积极开展干巴菌菌种的实验室分离培养及其生长规律的研究是目前该研究领域比较紧迫的任务。
干巴菌的菌种分离非常困难。在已报道的文献中，有研究者也发现干巴菌的子实体中至少有20余种真菌。这与干巴菌的形成有关，由于干巴菌主要生长在松林的根部土壤中，而干巴菌的形成与其它蘑菇类不一样，其它蘑菇类是先形成菌蕾，由菌蕾再长大，是个体整体在长大，外形变化不大。据观察发现，干巴菌的形成是一层一层形成的，耗时半个月到一个月。由于形成过程相对其它蘑菇类要慢，有大量的微生物通过风或雨水侵入到干巴菌子实体内部。因此，要想从众多的微生物中得到干巴菌菌种，按微生物常规分离方法是很难得到的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术对干巴菌菌种分离困难的问题，提供了一种干巴菌菌种的分离方法。
本发明的技术方案如下：
一种干巴菌菌种的分离方法，其技术方案为，取新鲜干巴菌子实体，用镊子将其撕成5*10mm小块，放入无菌培养皿中，用封口膜裹严，25℃培养2-5天；在解剖镜下观察菌丝体萌发情况，选取长势好的干巴菌块，放到另一无菌培养皿中，并将PDA琼脂块放入其中；在解剖镜下无菌操作，将PDA琼脂块用解剖刀推至干巴菌长菌丝部位，与菌丝接触，但不能接触菌块，用封口膜裹严，25℃培养2-5天；在解剖镜下观察，当菌丝长到PDA琼脂块上时，在PDA琼脂块上得到干巴菌菌丝体。
所述新鲜干巴菌子实体，其表面不做任何处理。
本发明获得了纯干巴菌菌丝体，是分离干巴菌菌种的一种简便、易操作的方法。
附图说明
图1为干巴菌组织块与PDA琼脂块的摆放位置。
图2为干巴菌菌丝萌发接触PDA琼脂块。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例
1、材料和方法
1.1分离材料：云南省嵩明县阿子营乡林地采集新鲜干巴菌子实体样品。
培养基：分离培养基：PDA
1.2分离方法
1.2.1组织分离法
先将新鲜干巴菌子实体经紫外线照射10min，用镊子瓣开，再用烧红的手术剪剪黄豆大的组织块，无菌操作接入PDA培养基斜面上，26℃培养。
1.2.2孢子分离法
在盛有培养基的三角瓶顶部安细钢丝钩，钩朝下，钩上吊适当大不作表面消毒的新鲜干巴菌菌侧朝培养基，待孢子弹射后，无菌操作取出细钢丝钩和菌盖，收集孢子，于26℃培养。
1.2.3空气传导分离法
（1）新鲜干巴菌子实体表面不做任何处理，用镊子将干巴菌子实体撕成5*10mm小块，放入无菌培养皿中，用封口膜裹严，25℃培养2-5天。
（2）在解剖镜下观察菌丝体萌发情况，选取长势好的干巴菌块，放到另一无菌培养皿中，并将PDA琼脂块放到同一培养皿中（如图1）。
（3）在解剖镜下无菌操作，将PDA琼脂块用解剖刀推至干巴菌长菌丝部位，与菌丝接触，但不能接触菌块，用封口膜裹严，25℃培养2-5天。
（4）在解剖镜观察菌丝是否已长到PDA琼脂块上（如图2）。
（5）得到的PDA琼脂块上菌丝体经ITS序列比对鉴定是否是干巴菌菌种。
2、结果
三种分离干巴菌菌种的结果，见表1。
由于干巴菌子实体的形成过程中有大量的微生物混入子实体里，而组织分离法无法将酵母菌和其它真菌分开，此方法没有获得纯干巴菌菌丝体；孢子分离法虽然获得了大量的干巴菌担孢子，但担孢子在PDA培养上，经3个月培养不萌发，孢子的担萌发条件还需进一步优化。使用空气传导分离法（图1，图2），有效地避开了干巴菌中的酵母菌、细菌和其它真菌等微生物，可以获得纯干巴菌菌丝体，是分离干巴菌菌种的一种简便、易操作的成功方法。
表1三种分离方法比较统计
注：组织分离法和空气传导分离法采用的是干巴菌组织块，孢子分离法采用的是干巴菌担孢子。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (1)
1.一种干巴菌菌种的分离方法，其特征在于，取新鲜干巴菌子实体，用镊子将其撕成5*10mm小块，放入无菌培养皿中，用封口膜裹严，25℃培养2-5天；在解剖镜下观察菌丝体萌发情况，选取长势好的干巴菌块，放到另一无菌培养皿中，并将PDA琼脂块放入其中；在解剖镜下无菌操作，将PDA琼脂块用解剖刀推至干巴菌长菌丝部位，与菌丝接触，但不能接触菌块，用封口膜裹严，25℃培养2-5天；在解剖镜下观察，当菌丝长到PDA琼脂块上时，在PDA琼脂块上得到干巴菌菌丝体；
新鲜干巴菌子实体，其表面不做任何处理。
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