CN105103947B - 一种天然林下外生菌根合成的专用菌源的使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种天然林下外生菌根合成的专用菌源的使用方法，培养健康林业苗木，实施苗木菌根化技术以获得目标菌的成熟菌根。精挑细选健康菌根，剪切成适宜长度后，按比例与蛭石、泥碳土、无菌水的混合物混匀，制成接种菌源，使用于天然林下或扩繁菌根化苗木。本发明不仅可以通过人工繁殖获得大量在天然林下存活时间较长、接种成功率高的菌源，同时还弥补少数难于分离纯化的菌根菌的繁殖问题。
Description
技术领域
本发明属于真菌学领域，具体涉及一种天然林下外生菌根合成的专用菌源的使用方法。
背景技术
据国内报道，外生菌根食用菌占已知食用菌种数的677个/966个，且多数因含人类必须活性物质而归属于人类健康食品，加上外生菌根菌对森林生态的巨大贡献，必将成为未来食用菌产业的发展方向。包括正红菇、松茸、美味牛肝菌、松乳菇、鸡枞、红牛肝、黄牛肝、干巴菌，但不限止这些种类，相当多种类被公认是世界著名的健康+美味食品。
使林业树木感染菌根菌并形成共生体的技术称为菌根化技术。菌根化技术无疑是发展菌根食用菌的必由之路。目前实现产业化的块菌菌根化技术就是一个经济效益突显的应用例子。
到目前为止，能够稳定地进行规模化、商业化仿生栽培的菌根化模式仅块菌(Ttuber sp)模式，该模式通过苗期接种、菌根合成、园林化移植、规范化管理来获得可食用子实体，这些获得成功的菌根食用菌的共同特征是可以在森林郁闭度较低环境下获得子实体。而对于更大比例的中后期菌根菌，该模式无效。由于中后期外生菌根菌需要在郁闭度较高的成熟林分下才能采集到，不能采用块菌菌根化的办法，天然林下菌根化技术是中后期菌根食用菌开发的前提，技术应用前景广阔。
世界各地，包括我国主要进行林业苗木菌根化，成林菌根化研究进展缓慢。究其原因包括：其一，林木幼苗期的细根幼嫩，易于菌根侵入（孟繁荣 邵景文 曲绍义，1995）；其二，苗圃的土壤易于人工控制环境，直至使用消毒土壤以减少菌根接种过程的杂菌干扰；其三，苗木接种较易控制光温水湿等外部条件。相比较而言，天然林下接种非但无上述有利条件，还得忍受林下土壤中丰富的微生物种类，包括先期定殖的菌根菌，对菌根菌接种的种种不利影响。林下接种难是外生菌根菌和菌根食用菌发展的瓶颈。试图绕过这个瓶颈，采用美味牛肝菌共生苗木移入成林的办法也无法成功（Hall I. R. Lyon A. J. E. Wang Y.，1998）。
菌根化技术中通常使用的接种源有人工培养菌丝体和真菌孢子，人工培养菌丝体在微生物种类丰富的森林土壤中存活时间很短，难以接种成功；真菌孢子可以在森林土壤中获得较长的存活期和较高接种率，但由于收集难、成本高，且无法进行人工繁殖，从而影响规模化、商业化发展，目前主要用于天然林下菌根化试验。
发明内容
本发明的目的在于提供一种天然林下外生菌根合成的专用菌源的使用方法，不仅可以通过人工繁殖获得大量在天然林下存活时间较长、接种成功率高的菌源，同时还弥补少数难于分离纯化的菌根菌的繁殖问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种天然林下外生菌根合成的专用菌源的使用方法：培养与目标菌根菌有共生关系的健康林业苗木，实施苗期菌根化技术以获得目标菌的成熟菌根；将精挑细选的健康菌根截成2±0.5mm长的片断，按150±50个片断/L的比例混入预先混匀经高温灭菌且温度为10℃-25℃的蛭石、泥碳土、无菌水的混合物中，直接用作菌源实施苗木或成林菌根化，或用作下一代菌根的接种源。
所述的蛭石、泥碳土、无菌水的混合物中蛭石、泥碳土、无菌水的重量比为1：1：0.44。
精挑细选的健康菌根是指，剪切直径2mm以下的细根，用无菌水仔细清洗浮泥；置显微镜下检测，去除所有病变变色和/或菌套生长较弱的菌根，置10℃环境下无菌保存；使用前，先将菌根剪切成2±0.5mm长的片断，再次抽样镜检，确保菌根片断无病率达显著水平。
天然林下接种或苗圃接种方法：将接种物包被于寄主细根周边，每穴放150±30ml容积的接种物，以确保接种后每个寄主细根的周边平均8个，至少有1个菌源菌索与目标细根近距离接触，接种时及其后的2周时间，按菌根菌对环境的要求进行光、温、湿、气调节。
本发明的显著优点在于：本发明不仅可以通过人工繁殖获得大量在天然林下存活时间较长、接种成功率高的菌源，同时还弥补少数难于分离纯化的菌根菌的繁殖问题。本发明提供的接种源在10℃温度+70%湿度的阴暗环境下，存活时间可达4周以上（供试的红菇属及牛肝菌属真菌在15-20℃条件下，离体4周后的培养成功率30%）；在25℃环境下，存活时间1周以上，比以菌丝或孢子为菌源的接种明显提高接种的成功率。
1）技术简单：苗木菌根化是一个很成熟的技术，故本发明获得接种源技术简单，易于操作；2）效果显著：关键是将容易获得的菌根截成小片断后，其在适宜建立侵染关系的温、湿条件下的森林根系及土壤中可以保持活力1周以上，确保菌根上的菌丝或菌索有足够的时间延伸并获得成功侵染；3）对于难于分离纯化的菌根菌，也可通过其孢子作为初始接种源获得大量繁殖，大幅度扩大接种源数量，在生产上有着极为重要的意义；4）繁殖系数高：幼苗接种成功后移植到天然苗圃繁殖长达2年，繁殖系数高达10000倍以上，方便大面积推广应用。
附图说明
图1是处理1hr后菌根（正常）及菌丝体（正常）显微照片。
图2是处理40hr后菌根（正常）及菌丝体（菌丝体内出现大量液泡）显微照片。
图3是处理1周后菌根（菌根周边出现大量杂菌，但菌根依然有一定活力）及菌丝体（菌丝体溶解）显微照片。
图4是处理4周后的菌根显微照片，仍有一些菌索伸出，显示一定活力。
图5是长满大量白色菌索的丝栗栲苗木根部。
具体实施方式
本发明介绍的一种外生菌根真菌接种专用菌源的使用，包括在严格无菌条件下培养无菌林业苗木，在苗木长出细根至1周年之间的任意时期，控制温光水湿气条件下，采用人工分离菌丝体或菌根菌的孢子进行人工接种苗木细根，在适宜菌根生长的条件下培育4周以上，以获得成熟菌根。所获得的菌根在显微镜下可以观察到细根上的菌鞘及茂密的、向外延伸的菌丝，甚至可以肉眼观察到大量的菌索（图5）。
剪切直径2mm以下的菌根，用无菌水在超声波洗涤机清洗浮泥；置显微镜下检测，去除所有病变变色和/或菌套生长较弱的菌根，置10℃环境下无菌保存。使用前，将上述菌根用锋利剪刀或切刀截成2±0.5mm长的片断，再次抽检，确保菌根片断健康率达显著水平，按150±50个片断/L的比例混入预先混匀并高温灭菌且温度10℃-25℃的蛭石/泥碳土/无菌水（1：1：0.44）混合物，直接用作菌源实施苗木或成林菌根化，或用于下一代菌根接种源培养。天然林下接种或苗圃接种，是指将上述混合好的接种物包被于寄主细根周边，每穴放150±30ml容积的接种物。由如下的图片可以看到，健康菌根的周边有很多的延伸菌索，长者可达0.5mm，以上述浓度的接种方法，可以确保每个接种穴内至少有12个菌源菌根，可以测算出接种后每个寄主细根的周边平均8个，至少有1个菌源菌索与目标细根近距离接触。接种时按菌根菌对环境的要求进行光、温、湿、气调节（选准接种季节）。
本发明采用严格的无菌环境下在相应的林业苗木上人工接种目标菌根菌，获得并就地（远离林区的旱地）大量繁殖菌根，之后收集菌根，并使用菌根于天然林业山场接种，实现成林菌根化。
本发明综合了现有两大类外生菌根菌接种物的优势，同时避免了各自的弊端，实现既易于大量繁殖，又可有效提高其在天然林下土壤中的存活时间和接种效率，使大面积天然林业山场的菌根化技术实施成为可能，将是规模化商业化天然林菌根化的重要途径。根据室内测定，在同等15-20℃下，森林土壤浸出液中，40hr时人工培养纯化的红菇属真菌的菌丝体内出现大量液泡，失去侵染活力，在一周内全部消亡。而本发明所介绍的同一菌的菌根可以在4周后仍保持30%以上的侵染活力（详见附图1-4菌根、菌丝在土壤浸出液中的存活时间）。
本发明技术应用于红菇属真菌仿生栽培，从武夷山脉采集的经DNA分析确认的正红菇（Russula griseocarnosa）孢子，接种于三角瓶中无菌培养20天的丝栗栲苗细根上，1个月后移栽至远离林区的红壤旱地上，再培养3个月至2年之间，截取长满白色菌索的（正红菇与丝栗栲共生的）直径2mm以下菌根（见图5），超声波洗涤器清洗根表浮土后，镜检选取无病菌根，剪成2±0.5mm长短的根段，再次镜检确认无病根段率远大于95%后，按150±50个片断/L的比例混入预先混匀并高温灭菌且温度10℃-25℃的蛭石/泥碳土/无菌水（1：1：0.44）混合物，在浦城选择原来无这种菌的山场，采用林下接种技术接种在红楮细根上，成功地于二年后获得红菇子实体。同时与没有镜检挑选的菌根接种进行比较，有认真实施本发明技术的穴接种成功率95%，对比仅使用根段而没有镜检剔除病根的穴接种成功率仅15%-33%，使用根段若是浓度在上述幅度之外，成功率5%以下（实践中林农的林下移土“种”菇）。本技术显著提高了效果，使无法接种成功的根段接种成为重要接种菌源。同时菌根苗可以移栽至自然土壤中繁殖，时间越长，繁殖系数越高，大大提高效率。
该技术应用于“正红菇保护地菌根多样性增产技术”的增产菌（菌根菌）接种，使该成果成功地在福建省主要红菇生长区推广，获得2010年福建省科技进步二等奖。
该技术应用于“人工椎栗林菌根化技术”，逐步提高人工椎栗林下菌根率达67%以上，并成功培养出白红菇等可食用子实体。成果评价为国际领先水平，目前推广面积已达万亩。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (2)
1.一种天然林下外生菌根合成的专用菌源的使用方法，其特征在于：培养与目标菌根菌有共生关系的健康林业苗木，采用苗木菌根化技术，以获得目标菌的成熟菌根；将精挑细选的健康菌根截成2±0.5mm 长的片断，按150±50 个片断/L 的比例混入预先混匀经高温灭菌且温度为10℃ -25℃的蛭石、泥碳土、无菌水的混合物中，直接用作菌源实施苗木或成林菌根化，或用作下一代菌根的接种源；
精挑细选的健康菌根是指，剪切直径2mm以下的细根，用无菌水清洗浮泥；置显微镜下检测，去除所有病变变色和/ 或菌套生长较弱的菌根，置10℃环境下无菌保存；使用前，先将菌根剪切成2±0.5mm 长的片断，再次抽样镜检，确保菌根片断无病率达显著水平；
天然林下接种或苗圃接种方法：将接种物包被于寄主细根周边，每穴放150±30ml 容积的接种物，以确保接种后每个寄主细根的周边平均8 个，至少有1 个菌源菌索与目标细根近距离接触，接种时及其后的2 周时间，按菌根菌对环境的要求进行光、温、湿、气调节。
2.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：所述的蛭石、泥碳土、无菌水的混合物中蛭石、泥碳土、无菌水的重量比为1 ：1 ：0.44。
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