CN109429971A

CN109429971A - 丛枝菌根真菌菌剂的制备方法

Info

Publication number: CN109429971A
Application number: CN201811396360.2A
Authority: CN
Inventors: 纪宝明; 郭鑫; 王平
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2018-11-22
Filing date: 2018-11-22
Publication date: 2019-03-08
Anticipated expiration: 2038-11-22
Also published as: CN109429971B

Abstract

本发明公开了丛枝菌根真菌菌剂的制备方法。本发明的丛枝菌根真菌菌剂的制备方法，包括：在含有丛枝菌根真菌的培养基质中培养高丹草，收集培养后高丹草的根系及根际的培养基质，即得到丛枝菌根真菌菌剂；含有丛枝菌根真菌的培养基质由向土壤中添加原始接种剂得到，原始接种剂为从植物根际获得的含有丛枝菌根真菌的土壤。将利用该方法制备的丛枝菌根真菌菌剂接种于植物根际后AMF群落接近自然状态植物根区群落，本发明的丛枝菌根真菌菌剂的制备方法能够大量生产AMF菌剂用于实验及生产实践，且培养基质易获得，成本低，制备丛枝菌根真菌菌剂的周期短，质量好。

Description

丛枝菌根真菌菌剂的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，丛枝菌根真菌菌剂的制备方法。

背景技术

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,简称AMF)是土壤中生态功能最为重要的微生物功能群之一，能够与80％以上的陆生植物根系形成互惠共生体-丛枝菌根，AMF可以帮助植物吸收氮、磷等土壤养分，促进植物生长，提高植物对生物及非生物胁迫的抗性，同时还能够改良土壤结构，因此能够减少农田生态系统中化肥、农药的使用，还可以在生态系统修复中发挥作用。已有研究证明，由于AMF宿主专一性的存在，同一生态系统中，不同植物根际区系的AMF群落结构可能大不相同，而从野外植物根际区系取得的AMF群落在用于生产实践及生态恢复时的表现也会不同，从本地环境中取得的土著AMF在用于本地生态恢复时的有益效果更加显著。

另一方面，AMF是严格的共生微生物，无法离体培养，目前，常规的AMF接种剂制备技术存在不足：部分方法针对特定种类AMF，步骤较为复杂，培养基质不易获得，成本高，周期长，菌剂产量低，孢子密度低，菌剂质量不稳定，且多以单一种类AMF为扩繁对象。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备丛枝菌根真菌菌剂。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了丛枝菌根真菌菌剂的制备方法，所述方法包括：在含有丛枝菌根真菌的培养基质中培养高丹草，收集培养后高丹草的根系及根际的培养基质，即得到丛枝菌根真菌菌剂。

上述方法中，所述含有丛枝菌根真菌的培养基质可由向土壤中添加丛枝菌根真菌得到。

上述方法中，所述含有丛枝菌根真菌的培养基质可由向土壤中添加原始接种剂得到；所述原始接种剂为从植物根际获得的含有丛枝菌根真菌的土壤。

上述方法中，所述含有丛枝菌根真菌的培养基质中所述原始接种剂与所述土壤的体积比可为a1)或a2)：

a1)1:(1-5)；

a2)1:1。

所述土壤可为无菌土壤。

上述方法中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。

所述双子叶植物可为豆科植物。所述单子叶植物可为禾本科植物。在本发明的一个实施例中，所述豆科植物为柠条锦鸡儿、杨柴或小叶锦鸡儿，所述禾本科植物为早熟禾。

上述方法中，所述高丹草的培养时间可为b1)或b2)：

b1)1-3个月；

b2)2个月。

所述培养的条件为高丹草正常生长的条件。在本发明的一个实施例中，所述培养的温度条件为16℃-22℃，光照长度为12-14h/d。

上述方法还可包括在高丹草培养结束后干燥高丹草根部培养基质。

所述干燥的时间可为1-2周。

上述方法还可包括在得到的丛枝菌根真菌菌剂中进一步培养高丹草以进一步提高丛枝菌根真菌菌剂中丛枝菌根真菌含量。

本发明还提供了下述X1)或X2)的方法：

X1)一种培养植物的方法，包括：利用来源于目的植物的丛枝菌根真菌按照所述丛枝菌根真菌菌剂的制备方法制备丛枝菌根真菌菌剂，向培养所述目的植物的基质中添加所述丛枝菌根真菌菌剂，完成所述目的植物的培养；

X2)一种提高植物生物产量的方法，包括：利用来源于目的植物的丛枝菌根真菌按照所述丛枝菌根真菌菌剂的制备方法制备丛枝菌根真菌菌剂，向培养所述目的植物的基质中添加所述丛枝菌根真菌菌剂，培养所述目的植物，实现所述目的植物生物产量的提高。

上述方法中，所述目的植物可为双子叶植物或单子叶植物。

所述丛枝菌根真菌菌剂的制备方法制备的丛枝菌根真菌菌剂的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：

Y1)在促进植物对土壤养分吸收中的应用；

Y2)在促进植物生长中的应用；

Y3)在提高植物对生物胁迫或非生物胁迫抗性中的应用；

Y4)在改良土壤结构中的应用；

Y5)在生态系统修复中的应用。

上述应用中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。

本发明以野外植物根区土著AMF为繁殖体，以高丹草为宿主植物，建立了丛枝菌根真菌菌剂的制备方法，将利用该方法制备的丛枝菌根真菌菌剂接种于植物根际后AMF群落接近自然状态植物根区群落，本发明的丛枝菌根真菌菌剂的制备方法能够大量生产AMF菌剂用于实验及生产实践，且培养基质易获得，成本低，制备丛枝菌根真菌菌剂的周期短，质量好。

附图说明

图1为侵染丛枝菌根真菌的根系染色后的显微图片。

图2为柠条锦鸡儿根际AMF群落结构LDA分析结果。a、b和c分别表示丛枝菌根真菌接种剂a、b和c，ck表示对照接种剂。

图3为AMF群落结构NMDS分析结果。接种剂得到的AMF群落与自然状态下(野外4种植物根际)AMF群落结构的比较。a、b、c和d分别表示丛枝菌根真菌接种剂a、b、c、d；a1、b1、c1和d1分别表示原始接种剂a、b、c和d。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、丛枝菌根真菌接种剂的制备及应用

发明人对目标植物柠条锦鸡儿和早熟禾植物进行根际土进行取样，作为原始AMF扩繁材料，制备了丛枝菌根真菌接种剂，具体方法如下：

1、野外AMF繁殖体获得：

(1)除去目标植物柠条锦鸡儿和早熟禾周围土壤表层2cm土壤。

(2)采用标准土钻(直径4cm)紧贴目标植物根系取得0-20cm根围土，剪碎根系，获得包括菌丝、孢子、植物根段在内的AMF繁殖体，即原始接种剂。将由柠条锦鸡儿根际得到的原始接种剂记为原始接种剂a，将由早熟禾根际得到的原始接种剂记为原始接种剂b，低温保存至实验室冷藏。

2、培养基质的制备

取土壤过2mm筛，将过完筛的土壤混合均匀，经121℃高压蒸汽灭菌2h后，24h后再次高压灭菌，得到无菌土壤；将步骤1得到的原始接种剂分别与无菌土壤按照体积比为1:1混合均匀，将得到培养基质。将利用原始接种剂a和b得到的培养基质分别命名为培养基质a和b。

3、宿主植物的培养

将容器为容量2L塑料花盆，底部覆无纺布，均利用75％酒精常规消毒，然后底层覆1cm厚的无菌土壤，将步骤2准备的培养基质装入容器至4/5处，浇透水，均匀播撒消毒后宿主植物——高丹草种子50粒，覆1cm无菌土壤，然后移入光照培养箱中培养，温度设定为16℃-22℃，光照长度12-14h/d，定期浇适量水，根据植物生长状况施肥，肥料为低磷或无磷肥料，另外可添加Hoagland's营养液。

4、丛枝菌根真菌接种剂的获得

宿主植物长至2个月后，停止浇水，干燥1周促使孢子形成，沿盆栽表面剪去宿主植物地上部分，收获容器中所有培养物，得到丛枝菌根真菌接种剂。将利用培养基质a和b得到的丛枝菌根真菌接种剂分别记为丛枝菌根真菌接种剂a和b，将丛枝菌根真菌接种剂a和b等体积混合并灭菌得到的菌剂作为对照接种剂(ck)。

称取50g接种剂采用湿筛倾注-蔗糖分离法分离并测定AMF孢子密度，结果显示，丛枝菌根真菌接种剂a和b的AMF孢子密度为30-100个/g接种剂，丛枝菌根真菌接种剂a和b的AMF孢子密度的平均值分别为50个/g接种剂和50个/g接种剂，对照接种剂中不含有AMF孢子。

植物根系侵染率鉴定：在所得接种剂中挑选植物细根并剪成2cm小段，选择100段2cm根段，采用台盼蓝染色-放大交叉法测定植物根系侵染率，侵染率即为被侵染根段数占总根段数的百分比。其中，台盼蓝染色-十字交叉法按照文献“盛萍萍，刘润进，李敏，丛枝菌根观察与侵染率测定方法的比较，菌物学报，15July 2011,30(4):519-525”中的侵染率的检测方法进行。结果显示，丛枝菌根真菌接种剂a和b以及对照接种剂中的根系侵染率在90％以上。

侵染丛枝菌根真菌的根系染色后的显微图片如图1所示，菌丝及泡囊密布在根系内部。

5、丛枝菌根真菌接种剂的功效

供试植物：柠条锦鸡儿和早熟禾。

将供试植物的种子利用75％酒精消毒2分钟，然后用蒸馏水彻底冲洗干净后播种于盛有无菌土壤的花盆中，在温室中培养至种子发芽，幼苗长出3-5片叶后选取长势一致(株高3-5cm)的幼苗进行移栽。

每种供试植物均按照如下方法检测丛枝菌根真菌接种剂的功效：将1L有孔圆形塑料花盆经75％酒精消毒，然后装入500ml无菌土壤，之后加入步骤4得到的丛枝菌根真菌接种剂100ml，作为实验组，每种丛枝菌根真菌接种剂菌设置三个重复，并利用等量对照接种剂同步进行对照实验。每盆移栽幼苗3株于接种剂上方，覆盖100ml无菌土壤。定期浇适量水并轮换位置，接种30天后用打孔器取少量根样，用台盼蓝染色法显微观察根系并确定侵染成功。

移栽3个月后收获，收获前一天对所有存活植株进行株高测量，收获植株时将地上部和地下部分开，用水洗净根部，取部分新鲜根样保存，采用台盼蓝染色-放大交叉法测定侵染率(侵染率＝被侵染根段数/检测根段数*100％)，其余根样和地上部样品烘干测定生物量。结果如表1所示。

表1、

植物

接种剂

侵染率(％)

株高(cm)

地上生物量(g)

地下生物量(g)

总生物量(g)

柠条锦鸡儿

a

86.40±2.50

20.7±2

0.466±0.053

0.235±0.024

0.701±0.069

柠条锦鸡儿

b

87.70±3.10

28.4±1.7

0.571±0.046

0.268±0.016

0.839±0.049

柠条锦鸡儿

ck

0

6.4±0.6

0.161±0.017

0.239±0.018

0.4±0.032

早熟禾

a

81.60±7.20

21.7±2.1

0.237±0.062

0.137±0.042

0.306±0.081

早熟禾

b

83.20±6.20

36.3±1.5

0.508±0.047

0.269±0.054

0.756±0.065

早熟禾

ck

0

7.4±2.4

0.061±0.014

0.02±0.007

0.081±0.02

结果显示，柠条锦鸡儿在接种了分别来源于柠条锦鸡儿和早熟禾的丛枝菌根真菌接种剂a和b后，侵染率、株高、地上生物量以及总生物量均显著高于对照，对照的植物均未被侵染，表明，本发明成功得到了丛枝菌根真菌接种剂，且得到的接种剂均有助于植物的生长。

实施例2、丛枝菌根真菌接种剂对根际AMF群落结构的影响

发明人对目标植物柠条锦鸡儿、杨柴和小叶锦鸡儿植物进行根际土进行取样，作为原始AMF扩繁材料，制备了丛枝菌根真菌接种剂，具体方法如下：

1、野外AMF繁殖体获得：

同实施例1步骤1，将由柠条锦鸡儿根际得到的原始接种剂记为原始接种剂a，将由杨柴根际得到的原始接种剂记为原始接种剂b，将由小叶锦鸡儿根际得到的原始接种剂记为原始接种剂c，低温保存至实验室冷藏。

2、培养基质的制备

同实施例1步骤2，将利用原始接种剂a、b和c得到的培养基质分别命名为培养基质a、b和c。

3、宿主植物的培养

同实施例1步骤3。

4、丛枝菌根真菌接种剂的获得

同实施例1步骤4，将利用培养基质a、b和c得到的丛枝菌根真菌接种剂分别记为丛枝菌根真菌接种剂a、b和c，将丛枝菌根真菌接种剂a、b和c等体积混合并灭菌得到的菌剂作为对照接种剂(ck)。

5、田间试验

供试植物：柠条锦鸡儿。

当年7月，将供试植物的种子利用75％酒精消毒2分钟，然后用蒸馏水彻底冲洗干净后播种于盛有无菌土壤的花盆中，在温室中培养至种子发芽，幼苗长出3-5片叶后选取长势一致(株高3-5cm)的幼苗进行移栽。

在试验田划定5m*5m小区2个，种植供试植物柠条锦鸡儿，每小区4行分别为4个处理(即分别接种丛枝菌根真菌接种剂a、b和c以及对照接种剂)，每个处理7个重复，两个小区设置相同。移栽幼苗时先用铁锹挖直径约10cm深约5cm的小坑，坑底部加入约100ml所得接种剂接种剂(分别为丛枝菌根真菌接种剂a、b和c以及对照接种剂)，移入植物幼苗，回填土壤并轻微压实，移栽完毕后通过沟渠对两个小区浇适量水，建植后仅当植物遭受严重干旱时进行灌水。

第二年7月，用标准土钻(直径4cm)紧贴目标植物柠条锦鸡儿根系取得0-20cm根围土，获得植物细根，低温保存至实验室冷藏。

对田间试验所得到的根细样品，剪碎并挑选1cm根段20个，用ctab法提取根细样品中AMF的DNA，选取特异性引物进行巢式PCR扩增，PCR产物经电泳检测后进行回收，并进行高通量测序，获得数据后进行进一步处理，对AMF群落结构进行LDA分析，结果如图2所示。

所用特异性引物如下：

第一步PCR用的引物：

NS31：5’-TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3’；

AML2：5’-GAACCCAAACACTTTGGTTTCC-3’；

第二步PCR用的引物：

AMDGR：5’-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3’；

AMV4.5NF：5’-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3’。

可以看出在接种丛枝菌根真菌接种剂a、b和c后，柠条锦鸡儿根际AMF群落结构与接种对照接种剂的处理均有所区别，但得到的接种剂均很好的保持了自然状态下的AMF群落结构的差异。

实施例3、丛枝菌根真菌接种剂对根际AMF群落结构的影响

发明人对目标植物柠条锦鸡儿、小叶锦鸡儿、油蒿、沙柳植物进行根际土进行取样，作为原始AMF扩繁材料，制备了丛枝菌根真菌接种剂，具体方法如下：

1、野外AMF繁殖体获得：

同实施例1步骤1，将由柠条锦鸡儿根际得到的原始接种剂记为原始接种剂a，将由小叶锦鸡儿根际得到的原始接种剂记为原始接种剂b，将由油蒿根际得到的原始接种剂记为原始接种剂c，将由沙柳根际得到的原始接种剂记为原始接种剂d，低温保存至实验室冷藏。

2、培养基质的制备

同实施例1步骤2，将利用原始接种剂a、b、c、d得到的培养基质分别命名为培养基质a、b、c、d。

3、宿主植物的培养

同实施例1步骤3。

4、丛枝菌根真菌接种剂的获得

同实施例1步骤4，将利用培养基质a、b、c、d得到的丛枝菌根真菌接种剂分别记为丛枝菌根真菌接种剂a、b、c、d。

对各原始接种剂(野外植物根系样品)，剪碎并挑选1cm根段20个，用ctab法提取根细样品中AMF的DNA；以DNA试剂盒分别提取丛枝菌根真菌接种剂a、b、c、d中AMF的DNA。选取特异性引物(第一步PCR用的引物：NS31：5’-TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC

-3’；AML2：5’-GAACCCAAACACTTTGGTTTCC-3’。第二步PCR用的引物：AMDGR:5’-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3’；AMV4.5NF:5’-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3’)对各DNA进行巢式PCR扩增，PCR产物经电泳检测后进行回收，并进行高通量测序，获得数据后对AMF群落结构进行NMDS分析，结果如图3所示。

可以看出在自然状态下AMF群落结构存在差异，同时经过上文得到的接种剂均很好的保持了原有自然状态下的AMF群落结构的差异。

Claims

1.丛枝菌根真菌菌剂的制备方法，包括：在含有丛枝菌根真菌的培养基质中培养高丹草，收集培养后高丹草的根系及根际的培养基质，即得到丛枝菌根真菌菌剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有丛枝菌根真菌的培养基质由向土壤中添加丛枝菌根真菌得到。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述含有丛枝菌根真菌的培养基质由向土壤中添加原始接种剂得到；所述原始接种剂为从植物根际获得的含有丛枝菌根真菌的土壤。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述含有丛枝菌根真菌的培养基质中所述原始接种剂与所述土壤的体积比为a1)或a2)：

a1)1:(1-5)；

a2)1:1。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述高丹草的培养时间为b1)或b2)：

b1)1-3个月；

b2)2个月。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在高丹草培养结束后干燥高丹草根部培养基质。

8.下述X1)或X2)的方法：

X1)一种培养植物的方法，包括：利用来源于目的植物的丛枝菌根真菌按照权利要求1-7中任一所述的方法制备丛枝菌根真菌菌剂，向培养所述目的植物的基质中添加所述丛枝菌根真菌菌剂，完成所述目的植物的培养；

X2)一种提高植物生物产量的方法，包括：利用来源于目的植物的丛枝菌根真菌按照权利要求1-7中任一所述的方法制备丛枝菌根真菌菌剂，向培养所述目的植物的基质中添加所述丛枝菌根真菌菌剂，培养所述目的植物，实现所述目的植物生物产量的提高。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述目的植物可为双子叶植物或单子叶植物。

10.权利要求1-7中任一所述的方法制备的丛枝菌根真菌菌剂的下述任一应用：

Y1)在促进植物对土壤养分吸收中的应用；

Y2)在促进植物生长中的应用；

Y3)在提高植物对生物胁迫或非生物胁迫抗性中的应用；

Y4)在改良土壤结构中的应用；

Y5)在生态系统修复中的应用。