CN112889564A - 一种果树土著amf混合菌剂及其扩繁方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种果树土著AMF混合菌剂及其扩繁方法与应用，该方法将白三叶草播种于AMF侵染率为20‑30％的果树去根根围土与培养基质混合形成的培养基质中进行土著AMF菌群扩繁，并将白三叶草根系剪碎与培养基质混合作为土著AMF混合菌剂应用到果苗上促进果苗的生长。AMF与宿主植物相互选择，形成一种互利共生的关系。宿主植物对不同AMF菌种的选择具有偏好性，同一宿主可同时与多种AMF形成共生关系。利用AMF侵染率为20‑30％的果树去根根围土扩繁出的土著AMF菌群对果苗有更好的适应性和促生效应，相比接种普通单个AMF菌种，接种土著AMF菌群的效果更好，同时避免外源AMF的竞争发生，且接种方便快捷。

Description

一种果树土著AMF混合菌剂及其扩繁方法与应用
技术领域
本发明涉及一种简便的果树土著AMF混合菌剂及其扩繁方法与其在果苗培育中的应用，属于农业生产领域。
背景技术
丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)属于菌物界球菌门球菌纲，是一类古老的、专性活体共生菌，它在自然界分布广泛，并能够与绝大多数的陆地植物形成共生关系。丛枝菌根真菌具有根外菌丝、根内菌丝、丛枝、泡囊等结构，通过孢子进行繁殖，孢子着生在根外菌丝上。丛枝菌根真菌的根外菌丝分布于土壤中，能够吸收土壤中的水分和养分提供给宿主植物利用。土壤中能够被植物直接吸收利用的磷很少，低磷的情况下根外菌丝能够延伸到更深更远的土壤中吸收矿质元素供给宿主植物，促进植物的生长，提高宿主植物的抗逆性。丛枝菌根真菌作为一种专性活体共生菌，无法自身分解土壤中的有机质作为生长所需的碳水化合物来源，其营养来源主要来自宿主植物光合作用产生的碳水化合物。
研究表明接种AMF可以促进宿主植株的生长，尤其对植物的干重、株高等生物量指标影响显著。国际上已有很多公司能够大规模生产AMF菌剂，并投入到农业和园艺作物生产中，提高了作物的产量和品质。但国内由于菌剂制备成本较高和一些技术上的问题，限制了菌剂的规模化生产及推广应用。AMF与宿主植物形成的是共生关系，这种关系基于AMF与宿主植物的相互选择。不同的宿主植物所偏好的AMF也会不同，即所谓的优势AMF菌种，同一宿主植物可同时与多种AMF形成共生关系。目前，一方面，由于AMF无法进行纯培养，其菌剂的生产方式主要通过单孢接种或多孢接种实现，该过程不仅存在挑选单孢和接种培养方面的难度和操作繁琐，尤其重要的是经过上述过程得到的菌剂可能对植物无促生作用或作用较小，费时费力效率低。另一方面，果树是多年生植物，多年的种植管理使得土壤中已产生稳定的优势土著AMF菌群结构，如果施用的外源AMF菌剂不含目标植物的优势菌种，那么外源AMF就可能与土著AMF形成竞争关系，导致接种失败，徒劳无益，有时甚至不利于果树的生长。有研究指出，通过对土著AMF进行扩繁能够有效克服上述问题，如在柑橘上报道可用新鲜根段作为繁殖体对土著AMF进行快速增殖，但该方法需要挖取足量的新鲜根段和土壤，并经过保存、运输、剪碎、根际土过筛、混匀等步骤，加大了扩繁成本。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种不需要分离特定孢子、促生效果好、方便快捷制备得到的果树土著AMF混合菌剂。本发明的第二目的是提供一种该果树土著AMF混合菌剂的扩繁方法。本发明的第三目的是提供该果树土著AMF混合菌剂在培育果苗中的应用。多年生果树的根围土壤已包含大量的优势AMF孢子。因此，本发明以多年生的梨树为例，培养一种AMF混合菌剂简便高效的AMF扩繁方法，并将扩繁后的AMF混合菌剂应用在梨苗的培育上，旨在充分利用AMF与根系的共生特点促进果树根系发育和地上部生长。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种果树土著AMF混合菌剂，所述混合菌剂具体获得方法为：将根系AMF侵染率为20-30％的果树根围土去根后得到去根根围土，将白三叶草种子播种于去根根围土与栽培基质混合得到培养基质中进行AMF菌群扩繁，将培养出的白三叶草根系剪碎与培养基质混匀，得到果树土著AMF混合菌剂。
进一步地，所述去根根围土与栽培基质的体积比为1：1，且该去根根围土无需混入剪碎的果树根段。
本发明所述果树土著AMF混合菌剂的扩繁方法，包括以下步骤：
1)从根系AMF侵染率为20-30％的果树采集根围土，将明显的根系和杂质挑拣出，自然风干，得到果树去根根围土；
2)将河沙和蛭石混合，高温高压杀菌，得到栽培基质；
3)将果树去根根围土与栽培基质混匀，装入塑料盆内，撒上白三叶草种子，盖上栽培基质，得到含白三叶草种子的培养基质，浇水培养；
4)将培养出的白三叶草的地上部分除去，并将根系剪碎与步骤3)中的培养基质混匀，风干，研磨，得到扩繁出的果树土著AMF混合菌剂。
进一步地，步骤1)中，所述采集的根围土为距离果树土壤表层0-20cm的根围土。
进一步地，步骤2)中，所述河沙和蛭石体积比为2：1，所述高温高压杀菌的压力为0.11MPa、温度为121℃。
进一步地，步骤3)中，所述去根根围土和栽培基质体积比为1：1，所述白三叶草种子与所述培养基质的质量比为0.2-0.3：1000。
进一步地，步骤4)中，所述培养出白三叶草为2.5-3个月的白三叶草，根系剪碎成1cm根段。
本发明内容还包括所述的果树土著AMF混合菌剂在培育果树中的应用。
进一步地，所述果树土著AMF混合菌剂培育果树的方法，包括以下步骤：
1)从根系AMF侵染率为20-30％的果树采集根围土，将明显的根系和杂质挑拣出，自然风干，得到果树去根根围土；
2)将河沙和蛭石混合，高温高压杀菌，得到栽培基质；
3)将果树去根根围土与栽培基质混匀，装入塑料盆内，撒上白三叶草种子，盖上栽培基质，得到含白三叶草种子的培养基质，浇水培养；
4)将培养出的白三叶草的地上部分除去，并将根系剪碎与步骤3)中的培养基质混匀，风干，研磨，得到扩繁出的果树土著AMF混合菌剂；
5)将土壤、河沙和蛭石混合，辐照杀菌，得到接种基质；
6)将果树种子洗净后用浸湿的纱布包裹放入冰箱，清洗，洗去粘液，发芽后移栽到穴盘中培养，得到果苗；
7)将塑料盆底铺一层接种基质，倒入扩繁出的果树土著AMF混合菌剂，再铺一层接种基质，再次倒入扩繁出的果树土著AMF混合菌剂，将果苗移栽入盆中，最后在表面撒上一层薄薄的接种基质，浇水培养得到果树。
进一步地，步骤5)中，所述土壤、河沙和蛭石质量比为2：2：1，所述辐照剂量为50kGy；步骤6)中，所述冰箱温度为4℃；步骤7)所述接种基质与果树土著AMF混合菌剂的质量比为10：1，所述移入的果苗为长出3-5片真叶的果苗。
具体的，本发明的果树包括但不仅限于梨树，其他果树也可以适用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：AMF与宿主植物相互选择，从而形成一种互利共生的关系。不同的宿主植物选择的AMF也会不同。同时原生果园中，与宿主形成共生关系的AMF不止一种。利用AMF侵染率为20-30％的果树去根根围土壤中扩繁出的果树土著AMF混合菌剂对果苗有更好的适应性和促生效应，相比接种普通单个AMF菌种，接种果树土著AMF混合菌剂的效果更好，且与带根扩繁土著AMF菌群的方法效果相当，同时还避免了外源AMF的竞争发生，操作更加方便快捷。
附图说明
图1为接种不同菌剂梨苗的长势；图1中从左到右依次为灭菌、-R、+R、R.i、G.m。
图2为接种不同菌剂梨苗根系总侵染率M。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
试验材料
供试植物：白三叶草种子、梨树种子
果树根系及根围土：采自江苏常州梨园。
实施例1
本实施例以梨树为例制备梨苗土著AMF混合菌剂并培养梨苗。
根围土处理方式：选取长势较好的健康梨树，采集距离土壤表层0-20cm的带根根围土壤，根系AMF侵染率为20-30％，将明显的根系和杂质挑拣出，自然风干，得到梨树的去根根围土。将梨根系剪碎成1cm左右根段与梨树的去根根围土混匀，得到梨树的带根根围土。共包括3个处理方法：(1)对照(CK)：风干的根围土，挑出明显的根系和杂质，经高温高压灭菌(0.11MPa、121℃、2h)；(2)带根(+R)处理：风干的根围土，挑出明显的根系和杂质，再将其与剪碎的根系混匀；(3)去根(-R)处理：风干的根围土，挑出明显的根系和杂质弃除。
栽培基质：基质由河沙和蛭石按照体积比2：1混合而成，河沙是必要的，蛭石是为了增加透气性。经过0.11MPa、121℃高压蒸汽灭菌2h，以杀死土著丛枝菌根真菌及其他杂菌。
将上述3种处理方法得到的根围土分别和栽培基质按体积比1：1混匀后装盆1kg，盆钵为塑料盆，上口外径13cm，盆底内径9cm，高11cm，均匀撒上白三叶草种子，每盆0.3g，最后铺上薄薄一层栽培基质，盖住种子即可，得到含有白三叶草种子的培养基质，浇水培养。
菌剂制备：上述3种根围土培养的白三叶草在生长2.5-3个月后，将地上部分剪掉，分别将根系取出剪碎成1cm左右根段与上述培养基质混匀后风干，研磨，最后得到含有菌根化的根段、孢子、菌丝和根际土的梨苗土著AMF混合菌剂3组：(1)灭菌去根根围土土著AMF混合菌剂；(2)带根根围土土著AMF混合菌剂；(3)去根根围土土著AMF混合菌剂。
接种基质：土壤、河沙和蛭石体积比为2：2：1混合而成，经过50kGy辐照42h灭菌，以杀死土著丛枝菌根真菌及其他杂菌。
梨苗准备：将梨树种子洗净后用浸湿的纱布包裹放入4℃冰箱，每周清洗一次，洗去粘液，2个月发芽后移栽到穴盘中，生长出3-5片真叶的时候进行接种处理。
接种方法：试验采用随机区组设计，环境条件设置：温度为25℃，相对空气湿度恒定为68％。在上口外径13cm，盆底内径9.5cm，高24cm塑料盆底铺一层接种基质，倒入一半梨苗土著AMF混合菌剂，再铺一层接种基质，再倒入另一半梨苗土著AMF混合菌剂，将梨苗移栽入盆中，最后铺一层薄薄的接种基质，浇水培养。每1kg接种基质中共接种100g梨苗土著AMF混合菌剂。
其他AMF菌剂(R.i：Rhizophagus intraradices；G.m：Glomus mosseae)由北京市农林科学院植物营养与资源研究所微生物实验室提供。经白三叶草扩繁培养3个月，将含有菌丝、侵染根段和孢子的培养基质作为实验菌剂。处理方法同前述梨苗土著AMF混合菌剂，共得到5组处理的梨苗，分别为：(1)灭菌梨(对照)，接种灭菌去根根围土土著AMF混合菌剂；(2)+R梨，接种带根根围土土著AMF混合菌剂；(3)-R梨，接种去根根围土土著AMF混合菌剂；(4)G.m梨，接种G.m菌剂；(5)R.i梨，接种R.i菌剂。
实验结果：5种菌剂培养梨苗的具体生长情况见表1。
表1 5种菌剂培养梨苗的具体生长情况
地上部干重(g) 株高(cm) 茎粗(mm) 叶片数
灭菌梨 0.09±0.03c 5.53±0.15c 1.30±0.07d 7.33±1.53c
+R梨 1.19±0.13ab 19.73±1.45ab 2.66±0.16ab 28.33±3.51ab
-R梨 1.41±0.37a 24.63±5.99a 2.83±0.25a 35.67±8.96a
Gm梨 0.99±0.06b 19.87±3.26ab 2.32±0.08c 23.33±3.06b
Ri梨 0.87±0.13b 19.43±2.20ab 2.49±0.17bc 23.00±1.00b
由表1可知，接种梨苗土著AMF混合菌剂的梨苗较灭菌对照处理的梨苗，能够显著促进梨苗的重要生长指标。其中，接种处理的梨苗茎粗、叶片数及地上部干重整体表现为-R>+R>Gm≈Ri；株高则表现为-R>Gm≈Ri≈+R。
由图1可以看出，接种梨苗土著AMF混合菌剂的梨苗长势显著优于未接种对照组，且接种梨苗土著AMF混合菌剂的梨苗长势也较优于接种单种AMF菌即接种G.m菌剂和R.i菌剂的梨苗长势。
由图2可知，接种梨苗土著AMF混合菌剂的侵染率更高，侵染率从高到低依次为-R>+R>Ri>Gm。综上可见，接种梨苗土著AMF混合菌剂能够达到更好的促生效果，说明梨苗对梨苗土著AMF混合菌剂具有更好的适应性，从而形成共生互惠关系。此外，去根梨根围土培养梨苗土著AMF混合菌剂与梨苗有更好的适应性，较带根梨根围土培养梨苗土著AMF混合菌剂效果更佳，且在实际操作中，去根处理更为方便快捷。

Claims (10)

1.一种果树土著AMF混合菌剂，其特征在于，所述混合菌剂具体获得方法为：将根系AMF侵染率为20-30％的果树的根围土去根后得到去根根围土，将白三叶草种子播种于去根根围土与栽培基质混合得到的培养基质中进行AFM菌群扩繁，将培养出的白三叶草根系剪碎与培养基质混匀，得到果树土著AMF混合菌剂。
2.根据权利要求1所述的果树土著AMF混合菌剂，其特征在于，所述去根根围土与所述栽培基质的体积比为1：1。
3.权利要求1所述的果树土著AMF混合菌剂扩繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)从根系AMF侵染率为20-30％的果树采集根围土，将明显的根系和杂质挑拣出，自然风干，得到果树去根根围土；
2)将河沙和蛭石混合，高温高压杀菌，得到栽培基质；
3)将果树去根根围土与栽培基质混匀，装入塑料盆内，撒上白三叶草种子，盖上栽培基质，得到含白三叶草种子的培养基质，浇水培养；
4)将培养出的白三叶草的地上部分除去，并将根系剪碎与步骤3)中的培养基质混匀，风干，研磨，得到扩繁出的果树土著AMF混合菌剂。
4.根据权利要求3所述的果树土著AMF混合菌剂扩繁方法，其特征在于，步骤1)中，所述采集的根围土为距离果树土壤表层0-20cm的根围土。
5.根据权利要求3所述的果树土著AMF混合菌剂扩繁方法，其特征在于，步骤2)中，所述河沙和蛭石体积比为2：1，所述高温高压杀菌的压力为0.11Mpa、温度为121℃。
6.根据权利要求3所述的果树土著AMF混合菌剂扩繁方法，其特征在于，步骤3)中，所述果树去根根围土和所述栽培基质体积比为1：1，所述白三叶草种子与所述培养基质的质量比为0.2-0.3：1000。
7.根据权利要求3所述的果树土著AMF混合菌剂扩繁方法，其特征在于，步骤4)中，所述培养出的白三叶草为2.5-3个月的白三叶草，根系剪碎成1cm根段。
8.权利要求1或2所述的果树土著AMF混合菌剂在培育果树中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述果树土著AMF混合菌剂培育果树包括以下步骤：
1)从根系AMF侵染率为20-30％的果树采集根围土，将明显的根系和杂质挑拣出，自然风干，得到果树去根根围土；
2)将河沙和蛭石混合，高温高压杀菌，得到栽培基质；
3)将果树去根根围土与栽培基质混匀，装入塑料盆内，撒上白三叶草种子，盖上栽培基质，得到含白三叶草种子的培养基质，浇水培养；
4)将培养出的白三叶草的地上部分除去，并将根系剪碎与步骤3)中的培养基质混匀，风干，研磨，得到扩繁出的果树土著AMF混合菌剂；
5)将土壤、河沙和蛭石混合，辐照杀菌，得到接种基质；
6)将果树种子洗净后用浸湿的纱布包裹放入冰箱，清洗，洗去粘液，发芽后移栽到穴盘中培养，得到果苗；
7)将塑料盆底铺一层接种基质，倒入扩繁出的果树土著AMF混合菌剂，再铺一层接种基质，再次倒入扩繁出的果树土著AMF混合菌剂，将果苗移栽入盆中，最后在表面撒上一层薄薄的接种基质，浇水培养得到果树。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤5)中，所述土壤、河沙和蛭石质量比为2：2：1，所述辐照剂量为50kGy；步骤6)中，所述冰箱温度为4℃；步骤7)所述接种基质与果树土著AMF混合菌剂的质量比为10：1，所述移入的果苗为长出3-5片真叶的果苗。
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