CN107629966A - 真菌诱导子、其制备方法及利用该真菌诱导子进行白芨种苗快繁的方法 - Google Patents

真菌诱导子、其制备方法及利用该真菌诱导子进行白芨种苗快繁的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种真菌诱导子、其制备方法及利用该真菌诱导子进行白芨种苗快繁的方法。真菌诱导子由保藏编号为CGMCC NO：13690的淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)JSNLBJ‑001制备得到。本发明利用真菌诱导子，在白芨种子无菌播种阶段，在白芨种子萌发培养基中加入适宜浓度的真菌诱导子，替代其他人工激素，在上述培养基中无菌播种白芨种子，能一次成苗，对比原有生产流程，能大大缩短白芨组培苗生产周期，节约大量的生产成本，应用前景广阔。

Description

真菌诱导子、其制备方法及利用该真菌诱导子进行白芨种苗 快繁的方法
技术领域
本发明涉及植物组培和微生物发酵领域，具体的涉及一种真菌诱导子、其制备方法及利用该真菌诱导子进行白芨种苗快繁的方法。
背景技术
在自然条件下，兰科植物必须与菌根真菌建立共生关系，才能完成其正常的生长发育。在互惠互利的共生体系中，兰科菌根真菌可以为其宿主植物提供生长发育所必须的维生素和激素等物质。真菌诱导子(fungal elicitor)来自微生物分子，是一类能引起植物细胞合成积累次生代谢物活性的物质。真菌诱导子包括菌丝体、真菌培养物滤液、真菌孢子、匀浆和真菌细胞壁成分。真菌诱导子作为植物的“疫苗”，在很低的浓度下(10-9或更低)，也可被植物识别为信号物质，诱发植物自身的免疫系统，最终使植物获得抵御病害的能力。
目前在白芨组培上应用真菌诱导子生产种苗还未见报道。
发明内容
发明目的：为解决现有技术中的问题，本发明的目的之一是提供一种能够应用于白芨种苗快繁中的真菌诱导子，本发明的目的之二是提供所述真菌诱导子的制备方法，本发明的目的之三是提供包含所述真菌诱导子的培养基，本发明的目的之四是提供利用该真菌诱导子进行白芨种苗快繁的方法。
技术方案：本发明所述的真菌诱导子的制备方法，由淡紫紫孢菌制备而成，所述淡紫紫孢菌命名为淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)JSNLBJ-001，保藏编号为CGMCCNO：13690。
本发明所述的淡紫紫孢菌，命名为淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)JSNLBJ-001，分类命名为淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)，其分类地位为子囊菌门粪壳菌纲肉座菌目蛇形虫草科紫孢属，菌株号为JSNLBJ-001，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO：13690，保藏日期为2017年3月10日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
上述菌株在PDA培养基上培养7d，菌落直径3.5cm，生长较慢。菌落墨绿色，毛毡状，革质，边缘整齐，有1mm左右透明外圈。
具体的，所述的真菌诱导子的制备方法包括：将所述的淡紫紫孢菌接种于培养基中进行发酵培养，发酵培养结束后将发酵液和菌丝粉碎后灭菌。
接种前，将淡紫紫孢菌接种于PDA平板上培养一段时间后，取菌饼接种于培养基中进行发酵培养。
发酵培养中，所述的培养基为PDA液体培养基。
发酵培养为震荡培养，转速为120～150r/min，所述发酵培养的温度为25～27℃，时间为10～15d。
本发明还提供了根据上述制备方法制备得到的真菌诱导子。
本发明又提供了一种包含所述真菌诱导子的白芨种苗快繁的培养基。
所述的白芨种苗快繁的培养基中，所述真菌诱导子的浓度为50～200ml/L，优选为80～100ml/L。
具体的，所述的白芨种苗快繁的培养基组成包括：N6基础培养基+所述的真菌诱导子+花宝1号4～10g/L+25～30g/L蔗糖+5～6.5g/L琼脂+50～80g/L土豆+80～100g/L香蕉。
花宝1号为美国花宝(Hyponex)公司生产，货号为Hyponex NO.1。
土豆和香蕉是去皮后用料理机粉碎成泥状加入。花宝1号主要为白芨种子萌发和生长提供必要的N、P、K等大量元素以及相关的微量元素；
土豆中淀粉含量丰富，可以为白芨种子萌发和生长提供碳源，另外土豆中含有一定的植物激素，能促进白芨种子的萌发，土豆中还含有一定的过氧化物酶、超氧自由基岐化酶以及维生素C，可以防止空气中过多的氧气，产生氧负离子对组培植物造成伤害；
香蕉中含有大量的糖类，白芨生长提供碳源，并且，在香蕉中含有植物激素，比如细胞分裂素，生长素，乙烯和赤霉素，能促进白芨种子萌发和生长。
最后，本发明提供了一种利用真菌诱导子进行白芨种苗快繁的方法，包括：将白芨种子播撒于含真菌诱导子的培养基中进行培养，得组培苗。
其中培养基可以为上述的白芨种苗快繁的培养基。
播种前，白芨种子进行消毒处理。
白芨种苗快繁中，培养条件为：温度25±5℃、光照1500～2500Lx、光照时间8～12h/d、培养时间100～120天。
白芨种子播种后，在培养过程中，播种后前30～50天，温度控制在20～22℃、光照控制在1500～1800LX、光照时间控制在8～10h/d，待种子萌发成2cm高的小苗后，温度调整为22～28℃、光照调整为1800～2500LX、光照时间调整为10～12h/d培养50～90天即得可移栽的成品组培苗。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明利用保藏编号CGMCC NO.13690的淡紫紫孢菌，将其制备成真菌诱导子，在白芨种子无菌播种阶段，在白芨种子萌发培养基中加入适宜浓度的真菌诱导子，替代其他人工激素，在上述培养基中无菌播种白芨种子，能一次成苗，对比原有生产流程，能大大缩短白芨组培苗生产周期，节约大量的生产成本，应用前景广阔。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1菌株的分离与鉴定
菌株JSNLBJ-001是2015年5月在江苏省句容市江苏茅山道地药材有限公司白芨种植区内生长状况较好的植株上分离获得的。
分离方法为：取野生新鲜的白芨根，将根段表面上的基质土壤用流动的自来水冲洗干净后，在超净工作台内用滤纸吸干表面的水分。再用灭菌的去离子水冲洗干净，然后分次浸入75％酒精45s，2％次氯酸钠溶液浸泡消毒5min。消毒完成后，用灭菌的去离子水冲洗5-6次以彻底去除次氯酸钠，用灭菌的滤纸吸干根表面的残留水滴，然后用灭菌的解剖刀将根段切成0.5mm左右的组织段。将组织段转移到加有硫酸链霉素(100μg/mL)的PDA培养基平板上，每个平板上接种5个组织段，每种培养基接15个平板。将分离获得的内生真菌进行回接试验，得到本发明所述菌株，将该菌株定名为JSNLBJ-001，该菌株能明显促进白芨幼苗的生长，提高幼苗的成活率。
菌株JSNLBJ-001的菌落特征如下：
形态学特征观察表明：在PDA培养基上培养7d，菌落直径3.5cm，生长较慢。菌落墨绿色，毛毡状，革质，边缘整齐，有1mm左右透明外圈。
扩增ITS区全序列并进行测序，PCR扩增得到的16sRNA全序列如下所示。PCR扩增得到的全序列(SEQ ID NO.1)：
CTAAGAAAGTTGGGCGTTTTACGGCGTGACCGCCTCCGCGCTCCGGTGCGAGGTGTGTGCTACTACGCAGGGGAGGCTGCGGCGGGGTCGCCACTGCATTTCGGGGGCGGCTGGTGTGCCGTCCCCCAACACCGAGGCCCCCGGGGGGGCTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTTGCTTGTGCAACTCAGAGAAGAAATTCCGCCCGCTGGGCGTAATGCAAGAGAGTTTGGGGTCCCTGCGGCGGGCGCCTGGGTCCGGCGCCGGCGCGGGGGCAGGCGGCCGGGGCGTTCCCGCCGAGGCAACTGAGGTAAGGTTCACAGTGGGTTTGGGAGTTGTATAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTCACCCCTACGGAA
经形态学及分子生物学鉴定表明，该菌株为淡紫紫孢菌(Purpureocilliumlilacinum)，其分类地位为子囊菌门粪壳菌纲肉座菌目蛇形虫草科紫孢属，菌株号为JSNLBJ-001，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：13690，保藏日期为2017年3月10日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
实施例2
一种利用真菌诱导子进行白芨种苗快繁的方法，包括以下步骤：
(1)真菌诱导子的制备：淡紫紫孢菌JSNLBJ-001接种在PDA平板培养基上培养10天后用打孔器打孔制成菌饼，并将菌饼接种到预先分装、灭菌好的PDA液体培养基中，在摇床上(120r/min，27℃)震荡培养12天，待真菌充分发酵后，用搅拌机将发酵液和菌丝球粉碎成均一的混合液，并在121℃下灭菌20min，冷却后置4℃冰箱中保存备用。
(2)按照如下组份进行种苗快繁培养基的配置：将步骤(1)中的真菌诱导子50ml/L+N6基础培养基+花宝1号8g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+土豆50g/L+香蕉80g/L，在121℃下灭菌20min备用。土豆和香蕉是去皮后用料理机粉碎成泥状加入。
(3)白芨种子播种进行培养生产种苗：将白芨蒴果依次用70％酒精、0.1％升汞、无菌水进行消毒处理，在无菌条件下切开蒴果取出白芨种子，将种子均匀播撒在步骤(2)的培养基中，在温度22℃、光照1500Lx、光照时间8h/d的培养室内培养40天后，待种子萌发成2cm高的小苗后，将温度调整为28℃、光照调整为2500LX、光照时间调整为12h/d培养80天即得可移栽的成品组培苗。
实施例3
(1)真菌诱导子的制备：淡紫紫孢菌JSNLBJ-001接种在PDA平板培养基上培养8天后用打孔器打孔制成菌饼，并将菌饼接种到预先分装、灭菌好的PDA液体培养基中，在摇床上(120r/min，27℃)震荡培养15天，待真菌充分发酵后，用搅拌机将发酵液和菌丝球粉碎成均一的混合液，并在121℃下灭菌20min，冷却后置4℃冰箱中保存备用。
(2)按照如下组份进行种苗快繁培养基的配置：将步骤(1)中的真菌诱导子100ml/L+N6基础培养基+花宝1号8g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+土豆50g/L+香蕉80g/L，在121℃下灭菌20min备用。
(3)白芨种子播种进行培养生产种苗：将白芨蒴果依次用70％酒精、0.1％升汞、无菌水进行消毒处理，在无菌条件下切开蒴果取出白芨种子，将种子均匀播撒在步骤(2)的培养基中，在温度22℃、光照1500Lx、光照时间8h/d的培养室内培养40天后，待种子萌发成2cm高的小苗后，将温度调整为28℃、光照调整为2500LX、光照时间调整为12h/d培养80天即得可移栽的成品组培苗。
实施例4
白芨种苗快繁培养基中，真菌诱导子添加量为200ml/L，其他的过程同实施例2。
实施例5
以不接真菌诱导子为对照，种子播种90天后测定实施例1、2、3的种苗球茎平均大小，种苗平均株高及叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b含量。
表1
从表1中可知，由淡紫紫孢菌JSNLBJ-001制备而成的真菌诱导子添加到白芨组培快繁培养基中，能显著促进白芨种子萌发和生长，种子播种90天后，实施例1、2、3中的白芨已形成了较大的球茎，较高的株高，基本达到了组培苗移栽的要求，而对照球茎只有0.31cm，株高仅5.32cm，未达到可移栽的规格。从叶绿素含量来看，添加了真菌诱导子的培养基能显著提高叶绿素含量，进而促进其生长。
序列表
<110> 江苏农林职业技术学院
<120> 真菌诱导子、其制备方法及利用该真菌诱导子进行白芨种苗快繁的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 538
<212> DNA
<213> 淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)
<400> 1
ctaagaaagt tgggcgtttt acggcgtgac cgcctccgcg ctccggtgcg aggtgtgtgc 60
tactacgcag gggaggctgc ggcggggtcg ccactgcatt tcgggggcgg ctggtgtgcc 120
gtcccccaac accgaggccc ccgggggggc tcgagggttg aaatgacgct cgaacaggca 180
tgcccgccag aatgctggcg ggcgcaatgt gcgttcaaag attcgatgat tcactgaatt 240
ctgcaattca cattacttat cgcatttcgc tgcgttcttc atcgatgcca gaaccaagag 300
atccgttgtt gaaagttttg attcatttgt ttttgcttgt gcaactcaga gaagaaattc 360
cgcccgctgg gcgtaatgca agagagtttg gggtccctgc ggcgggcgcc tgggtccggc 420
gccggcgcgg gggcaggcgg ccggggcgtt cccgccgagg caactgaggt aaggttcaca 480
gtgggtttgg gagttgtata actcggtaat gatccctccg caggtcaccc ctacggaa 538

Claims (10)

1.一种真菌诱导子的制备方法，其特征在于，由淡紫紫孢菌制备而成，所述淡紫紫孢菌命名为淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)JSNLBJ-001，保藏编号为CGMCC NO：13690。
2.根据权利要求1所述的真菌诱导子的制备方法，其特征在于，包括：将所述的淡紫紫孢菌接种于培养基中进行发酵培养，发酵培养结束后将发酵液和菌丝粉碎后灭菌。
3.根据权利要求2所述的真菌诱导子的制备方法，其特征在于，所述的培养基为PDA液体培养基。
4.根据权利要求2所述的真菌诱导子的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为25～27℃，时间为10～15d。
5.一种根据权利要求1～4任一项所述制备方法制备得到的真菌诱导子。
6.一种包含权利要求5所述真菌诱导子的白芨种苗快繁的培养基。
7.根据权利要求6所述的白芨种苗快繁的培养基，其特征在于，所述真菌诱导子的浓度为50～200ml/L。
8.根据权利要求7所述的白芨种苗快繁的培养基，其特征在于，组成包括：N6基础培养基+所述的真菌诱导子+花宝1号4～10g/L+25～30g/L蔗糖+5～6.5g/L琼脂+50～80g/L土豆+80～100g/L香蕉。
9.一种利用真菌诱导子进行白芨种苗快繁的方法，其特征在于，包括：将白芨种子播撒于含权利要求5所述真菌诱导子的培养基中进行培养，得组培苗。
10.根据权利要求9所述的利用真菌诱导子进行白芨种苗快繁的方法，其特征在于，培养条件为：温度25±5℃、光照1500～2500Lx、光照时间8～12h/d、培养时间100～120天。
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